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生物化学实验教学内容

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生物化学实验

第一节基本要求

一、内容提要

基础生物化学实验内容,主要以植物材料为研究对象。实验项目包括糖类、脂类、蛋白质和氨基酸、核酸、酶、维生素的测定,既有定性又有定量。实验内容编排不求齐全,而力求原理阐述简明扼要,通俗易懂,方法可靠,操作具体详尽,重复性好,灵敏度高。实验方法涉及传统的滴定法以及分光光度法、层析法和电泳等现代生物化学实验技术。本实验指导可供高等农业院校农学类、生物技术以及相关专业的本、专科学生使用,也可供从事与生物科学有关的科研工作者阅读与参考。

在以惊人速度发展的生物科学中,生物化学是其中最活跃的分支学科之一,它已成为发展生命科学各分支学科和生物工程技术的重要基础。作为一门研究生命活动基本规律的科学,它又是一门实验科学。工业、农业、医药、食品、能源、环境科学等越来越多的研究领域都以生物化学理论为依据,以其实验技术为手段,生物化学已成为高等院校许多相关专业学生必修的专业基础课程。

根据高等农业院校农学类专业教学计划,基础生物化学课程是一门重要的专业基础课;并且又是实践性极强的应用学科。只有掌握扎实而广泛的基础知识和熟练的操作技能才算真正掌握好这门应用科学。因此,我们组织编写这本基础生物化学实验指导。

本实验指导主要是配合基础生物化学教材,供高等农业院校农学类、生物技术以及相关专业的学生使用。实验多以植物材料为主要研究对象;以生物大分子——碳水化合物、核酸、蛋白质和酶等为主要研究内容。实验方法涉及到分光光度法、层析、电泳等现代生物化学实验技术。在实验内容编排上,既有定性的又有定量的;实验教材由基础生物化学实验和附录两部分组成。实验部分列出的实验项目包括糖类、脂类、蛋白质和氨基酸、核酸、酶、维生素的测定,有些项目包括几种不同方法,每一实验方法分为目的、原理、实验材料、仪器和试剂、操作步骤、结果计算、注意事项、思考题及参考答案。

本实验指导从一定角度反映了我国生物化学研究技术目前的水平和状况,内容不求全,而力求其可靠性和方法性。在编写过程中,力求做到原理阐述简明扼要,通俗易懂,方法操作具体详尽,重复性好,灵敏度高,且注重培养学生严谨的科学态度,独立分析、解决问题的能力,为提高其良好的科研素质奠定基础。

本实验指导的出版是集体劳动的结晶。主要由在教学第一线多年从事基础生物化学理论与实验课教学与研究工作的教授、副教授和具有博士、硕士学位的中青年教师等共同编写。正是他们长期不懈的辛勤劳动以及在编写工作中给予的极大支持,才使本实验指导得以顺利出版。特别是陈祖洁教授始终关注本实验指导的编写进程,在百忙中审阅了全部稿件并提出许多宝贵意见。编者在此一并表示深深的谢意。

由于我们的经验和水平有限,加之时间较仓促,书中难免出现不妥甚至错漏之处,我们真诚希望广大读者在参考使用中不断向我们提供宝贵的批评和建议,以臻逐趋完善。

编者于山西农业大学2005.6.10

二、实验记录及实验报告

每次实验要做到课前认真预习,实验操作中仔细观察并如实记录实验现象与数据,课后及时完成实验报告。

1.课前预习

实验课前要将实验名称、目的和要求、实验内容与原理、操作方法和步骤等简单扼要地写在记录本中,做到心中有数。

2.实验记录

从实验课开始就要培养严谨科学作风,养成良好习惯。实验条件下观察到的现象应仔细地记录下来,实验中观测的每个结果和数据都应及时如实地直接记在记录本上,记录时必须使用钢笔或圆珠笔,并做到原始记录准确、简练、详尽、清楚。如称量试材样品的重量、滴定管的读数、分光光度计的读数等,都应设计一定的表格准确记下正确的读数,并根据仪器的精确度准确记录有效数字。例如,光密度值为0.050,不应写成0.05。每一个结果至少要重复观测两次以上,当符合实验要求并确知仪器工作正常后再写在记录本上。另外,实验中使用仪器的类型、编号以及试剂的规格、化学式、分子量、准确的浓度等,都应记录清楚,以便总结实验完成报告时进行核对和作为查找成败原因的参考依据。如果发现记录的结果有怀疑、遗漏、丢失等,都必须重做实验。

3.实验报告

实验结束后,应及时整理和总结实验结果,写出实验报告。按照实验内容可分为定性和定量两大类,实验报告的格式:实验序号,实验名称;

(1)目的和要求

(2)内容与原理

(3)主要仪器及试剂配制

(4)操作方法与实验步骤

(5)结果与讨论

定性实验报告中的实验名称和目的要求是针对该次实验课的全部内容而必须达到的目的和要求。在完成实验报告时,可以按照实验内容分别写原理、操作方法、结果与讨论等。原理部分应简述基本原理。操作方法(或步骤)可以流程简图的方式或自行设计的表格来表示。结果与讨论包括实验结果及观察现象的小结、对实验课遇到的问题和思考题进行探讨以及对实验的改进意见等。

定量实验报告中,目的和要求、原理以及操作方法部分应简单扼要的叙述,但是对于实验条件(试剂配制及仪器)和操作的关键环节必须写清楚。对于实验结果部分,应根据实验课的要求将一定实验条件下获得的实验结果和原始数据进行认真记录、整理、归纳、分析和对比,并尽量总结成各种图表,如原始数据及其处理的表格、标准曲线图以及比较实验组与对照组实验结果的图表等。另外,还应针对实验结果进行必要的说明和分析。讨论部分可以包括:关于实验方法(或操作技术)和有关实验的一些问题,如实验的正常结果和异常现象以及思考题进行探讨,对于实验设计的认识、体会和建议,对实验课的改进意见等。

第二节 实验内容、方法原理及操作要领

第一节 碳水化合物

实验一 还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法

一、目的

掌握还原糖和总糖测定的基本原理,学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。

二、原理

还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,其中乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同,可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来,对没有还原性的双糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计,在540nm 波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子水,所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1. 实验材料

小麦面粉;精密pH 试纸。 2. 主要仪器

(1)具塞玻璃刻度试管:20mL×11 (2)大离心管:50mL×2 (3)烧杯:100mL×1 (4)三角瓶:100mL×1 (5)容量瓶:100mL×3

(6)刻度吸管:1mL×1;2mL×2;10mL×1 (7)恒温水浴锅 (8)沸水浴 (9)离心机 (10)扭力天平 (11)分光光度计

COOH

OH

NO 2

O 2N

3,5-二硝基水杨酸(黄色)

还原糖

COOH

OH

NH 2

O 2N

加 热

碱 性

糖 酸

3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色)

+

+

3.试剂

(1)1mg/mL葡萄糖标准液

准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg,置于小烧杯中,加少量蒸馏水溶解后,转移到100mL 容量瓶中,用蒸馏水定容至100mL,混匀,4℃冰箱中保存备用。

(2)3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂

将6.3g DNS和262mL 2M NaOH溶液,加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中,再加5g 结晶酚和5g亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容至1000mL,贮于棕色瓶中备用。

(3)碘-碘化钾溶液:称取5g碘和10g碘化钾,溶于100mL蒸馏水中。

(4)酚酞指示剂:称取0.1g酚酞,溶于250mL 70%乙醇中。

(5)6M HCl和6M NaOH各100mL。

四、操作步骤

1.制作葡萄糖标准曲线

取7支20mL具塞刻度试管编号,按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂,配成不同葡萄糖含量的反应液。

表1 葡萄糖标准曲线制作

管号1mg/mL葡萄糖标准液

(mL)

蒸馏水(mL)DNS(mL)

葡萄糖含量

(mg)

光密度值

(OD540nm)

0 0 2 1.5 0

1 0.

2 1.8 1.5 0.2

2 0.4 1.6 1.5 0.4

3 0.6 1.

4 1.

5 0.6

4 0.8 1.2 1.

5 0.8

5 1.0 1.0 1.5 1.0

6 1.2 0.8 1.5 1.2

将各管摇匀,在沸水浴中准确加热5min,取出,冷却至室温,用蒸馏水定容至20mL,加塞后颠倒混匀,在分光光度计上进行比色。调波长540nm,用0号管调零点,测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标,葡萄糖含量(mg)为横坐标,在坐标纸上绘出标准曲线。

2.样品中还原糖和总糖的测定

(1)还原糖的提取

准确称取3.00g食用面粉,放入100mL烧杯中,先用少量蒸馏水调成糊状,然后加入50mL蒸馏水,搅匀,置于50℃恒温水浴中保温20min,使还原糖浸出。将浸出液(含沉淀)转移到50mL离心管中,于4 000r/min下离心5min,沉淀可用20mL蒸馏水洗一次,再离心,将二次离心的上清液收集在100mL 容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,混匀,作为还原糖待测液。

(2)总糖的水解和提取

准确称取1.00g食用面粉,放入100mL三角瓶中,加15mL蒸馏水及10mL 6M HCl,置沸水浴中加热水解30min(水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查)。待三角瓶中的水解液冷却后,加入1滴酚酞

指示剂,用6mol/LNaOH 中和至微红色,用蒸馏水定容在100mL 容量瓶中,混匀。将定容后的水解液过滤,取滤液10mL ,移入另一100mL 容量瓶中定容,混匀,作为总糖待测液。

(3)显色和比色

取4支20mL 具塞刻度试管,编号,按表2所示分别加入待测液和显色剂,空白调零可使用制作标准曲线的0号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。

表2 样品还原糖测定 管 号

还原糖待测液(mL )

总糖待测液(mL )

蒸馏水(mL )

DNS (mL )

光密度值(OD 540nm )

查曲线葡萄糖量

(mg ) 7 0.5 1.5 1.5 8 0.5 1.5 1.5 9 1 1 1.5 10

1

1

1.5

五、结果与计算:

计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值,在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数,按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。

还原糖(%)=

查曲线所得葡萄糖毫克数×

提取液总体积(ml ) 测定时取用体积(ml )

×100

样品毫克数

六、附 注

1.离心时对称位置的离心管必须配平。

2.标准曲线制作与样品测定应同时进行显色,并使用同一空白调零点和比色。 3.面粉中还原糖含量较少,计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。

七、思考题

1.3,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的? 2.如何正确绘制和使用标准曲线?

参考答案

1.植物中的总糖包括单糖、寡糖和多糖,单糖是还原糖,可直接测定。而没有还原性的寡糖和多糖,需用高浓度的酸在加热的条件下水解成有还原性的单糖,还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成一定比例关系,利用分光光度计,在540nm 波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需要加入

总糖(%)= 查曲线所得水解后还原糖毫克数×稀释倍数

×0.9×100

样品毫克数

一分子水,所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

2.标准曲线应在坐标纸上绘制,横坐标轴距坐标纸底边1.5~2cm ,标示出刻度和葡萄糖的毫克数;纵坐标轴距坐标纸左边1.5~2cm ,标示刻度和光密度值;曲线为过原点的直线,测定点均匀分布在直线的两侧;标准曲线只能在测试条件完全相同的情况下,用于确定样品中的物质含量。对于重复的测定,应取吸光度的平均值查标准曲线;测定数据不应记在标准曲线上。

实验二 还原糖含量测定——砷钼酸比色法

一、目的

植物体内的还原糖主要是葡萄糖、果糖和麦芽糖。它们在植物体内的分布,不仅反映植物体内碳水化合物的运转情况,而且也是合成其它成分碳架来源和呼吸作用的基质。此外,水果、蔬菜中含糖量的多少,也是鉴定其品质的重要指标。其它碳水化合物,如淀粉、蔗糖等,经水解也生成还原糖。因此,测定还原糖的方法在研究植物体内生理生化变化和测定植物体内碳水化合物方面都是很重要的。

二、原理

还原糖是具有羰基(>C=O )的糖,能将其它物质还原而其本身被氧化。

(1)还原糖在碱性条件及有酒石酸钾钠存在下加热,可以定量地还原二价铜离子为一价铜离子,产生砖红色的氧化亚铜沉淀,其本身被氧化。具体反应如下:

(2)氧化亚铜在酸性条件下,可将钼酸铵还原,还原型的钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用,生成一种蓝色复合物——砷钼蓝,其颜色深浅在一定范围内与还原糖的含量(即被还原的Cu 2O 量)成正比,用标准葡萄糖与砷钼酸作用,比色后做标准,就可测得样品还原糖含量。

Cu 2O + H 2SO 4

Cu +

2Cu + + MoO 42- + SO 42-2Cu 2++蓝色复合物

CuSO 4+2NaOH Na 2SO 4 + Cu(OH)2

三、实验材料、主要仪器和试剂

1.实验材料: 苹果、面粉等 2.主要仪器 (1)分光光度计 (2)水浴锅

O-CH-COONa O-CH-COOK

Cu +Cu 2O ↓

H-C-OH CH=O

HO-C-H H-C-OH H-C-OH 2OH + +H 2O H-C-OH COOH HO-C-H

H-C-OH H-C-OH 2OH

HO-CH-COONa

HO-CH-COOK

+2 HO-CH-COONa HO-CH-COOK

O-CH-COONa O-CH-COOK

Cu

+H 2O

Cu(OH)2 +

(3)具塞刻度试管:20mL×10

(4)刻度吸管:1 ml×1,2 ml×4,5 ml×3

(5)容量瓶:100 ml×2

(6)漏斗

(7)研钵

3.试剂

(1)铜试剂:

A、4%CuSO4?5H2O

B、称取24g无水碳酸钠,用850mL水溶于大烧杯中,加入2g含4分子结晶水的酒石酸钾钠,待全溶(应加热)后加入碳酸氢钠16g,再加入120g无水硫酸钠(加热),全溶及冷却后加水至900mL,沉淀1~2d,取上清液(要求严格时过滤)备用。

使用前将A与B按1∶9混匀即可使用。

(2)砷钼酸试剂:25g钼酸铵( NH4)6Mo7O24·4H2O溶于450mL蒸馏水中(加热溶解,但温度接近150℃时易分解),待冷却后再加入21mL浓H2SO4混匀。另将3g砷酸氢二钠(Na2HAsO4·7H2O)溶解于25mL蒸馏水中,然后加到钼酸铵溶液中,室温下放置于棕色瓶中可长期使用。

(3)200μg/mL标准葡萄糖原液:准确称取分析纯葡萄糖200mg,溶解定容到1000mL。

四、操作步骤

1.标准曲线的制作:

在一系列刻度试管中,分别加入200μg/mL标准葡萄糖0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5及0.6 mL,再顺序加入蒸馏水2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5及1.4 mL,配成浓度分别为0、10、20、30、40、50及60μg/mL的系列葡萄糖溶液。每试管加入铜试剂2mL,混匀后沸水浴中加热10min,立即冷却,再加入2mL砷钼酸试剂,振荡两分钟后稀释到20mL,用分光光度计在620nm波长下比色,测其光密度OD620nm (做一式两份)。

以糖浓度微克数为横坐标,光密度OD620nm为纵坐标,绘制标准曲线。

2.植物样品中还原糖的提取:

将样品洗净,吸干其表面水分,切碎混匀,称取1g放入研钵中,加入约0.5g石英砂,磨成匀浆,加水将样品由玻璃漏斗冲入100mL容量瓶中,加水达70~80mL,摇匀后置于80℃恒温水浴上浸提0.5h。

待上述样品冷却后,沉淀蛋白质,加入5%硫酸锌5mL,再慢慢滴入0.3mol/L Ba(OH)2 5mL,以沉淀蛋白质。振荡后静置,至上层出现清液后再加一滴Ba(OH)2,直至无白色沉淀时,向容量瓶加水至刻度。

3.还原糖含量的测定:

过滤上述已定容的样品液,取5mL滤液,再定容到100mL(此步视样品的含糖量而定)。取已稀释的溶液2mL,与标准葡萄糖显色法相同:加铜试剂2mL,煮沸10min,加砷钼酸试剂2mL,振荡2mL,定容到15ml,620nm波长下比色,记下光密度OD620nm(至少重复两次)。

五,结果计算

还原糖含量(%)=

G×稀释液倍数

W×106

式中:G ——从标准曲线上查得含糖量(μg ) W ——样品重(g ) 六、思考题

举例说明哪些是还原糖? 参考答案:

还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,其中果糖、乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖、淀粉和纤维素等是非还原糖。

第二节 脂 类

实验一 脂肪碘值的测定

一、目的

掌握测定脂肪碘值的原理和操作方法,了解测定脂肪碘值的意义。 二、原理

不饱和脂肪酸碳链上含有不饱和键,可与卤素(Cl 2,Br 2,I 2)进行加成反应。不饱和键数目越多,加成的卤素量也越多,通常以“碘值”表示。在一定条件下,每100g 脂肪所吸收碘的克数称为该脂肪的“碘值”。碘值越高,表明不饱和脂肪酸的含量越高,它是鉴定和鉴别油脂的一个重要常数。

碘与脂肪的加成反应很慢,而氯及溴与脂肪的加成反应快,但常有取代和氧化等副反应。本实验使用IBr 进行碘值的测定,这种试剂稳定,测定的结果接近理论值。溴化碘(IBr)的一部分与油脂的不饱和脂肪酸起加成作用,剩余部分与碘化钾作用放出碘,放出的碘用硫代硫酸钠滴定。

加成反应:

释放碘: IBr + KI KBr + I 2 滴定: I 2 + 2NaS 2O 3

2 NaI + Na 2S 4O 6

实验时取样多少决定于油脂样品的碘值。可参考表1与表2: 表1 样品最适量和碘值的关系 碘 值(g ) 30以下 30~60 60~100 100~140 140~160 160~210 样品数(g ) 约1.1

0.5~0.6 0.3~0.4 0.2~0.3 0.15~0.26 0.13~0.15 作用时间(h )

0.5

0.5

0.5

1.0

1.0

1.0

表2 几种油脂的碘值 名 称 亚麻子油 鱼肝油 棉子油 花生油 猪 油

牛 油

碘 值(g )

175~210

154~170

104~110

85~100

48~64

25~41

HC

CH

C C H H

Br

H +

三、试剂和器材

1.试剂

(1)溴化碘溶液

取12.2g碘,放入1 500mL锥形瓶内,缓慢加入1 000mL冰乙酸(99.5%),边加边摇,同时略温热,使碘溶解。冷却后,加溴约3mL。

注意:所用冰乙酸不应含有还原性物质。检查方法:取2mL冰乙酸,加少许重铬酸钾及硫酸,若呈绿色,则证明有还原性物质存在。

(2)0.1mol/L标准硫代硫酸钠溶液

取结晶硫代硫酸钠50g,溶在经煮沸后冷却的蒸馏水(无CO2存在)中。添加硼砂7.6g或氢氧化钠1.6g(硫代硫酸钠溶液在pH 9~10时最稳定)。稀释到2 000ml后,用标准0.1mol/L碘酸钾溶液按下法标定:

准确量取0.1mol/L碘酸钾溶液20mL、10%碘化钾溶液10mL和1mol/L硫酸20mL,混合均匀。以1%淀粉溶液作指示剂,用硫代硫酸钠溶液进行标定。按下面所列反应式计算硫代硫酸钠溶液浓度后,用水稀释至0.1mol/L。

KIO3 +5KI +3H2SO43K2SO4 +3I2 +3H2O

I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6

(3)纯四氯化碳

(4)1%淀粉溶液(溶于饱和氯化钠溶液中)

(5)10%碘化钾溶液

(6)花生油或猪油

2.器材

(1)碘瓶(或带玻璃塞的锥形瓶)

(2)棕色、无色滴定管各1支

(3)吸量管

(4)量筒

(5)分析天平

四、操作步骤

1.准确称取0.3~0.4g花生油2份,置于两个干燥的碘瓶内,切勿使油粘在瓶颈或壁上。加入10mL 四氯化碳,轻轻摇动,使油全部溶解。用滴定管仔细地加入25mL溴化碘溶液,勿使溶液接触瓶颈,塞好瓶塞,在玻璃塞与瓶口之间加数滴10%碘化钾溶液封闭缝隙,以免碘的挥发损失。在20~30℃暗处放置30min,并不时轻轻摇动。油吸收的碘量不应超过溴化碘溶液所含之碘量的一半,若瓶内混合物的颜色很浅,表示花生油用量过多,改称较少量花生油,重作。

2.放置30min后,立刻小心地打开玻璃塞,使塞旁碘化钾溶液流入瓶内,切勿丢失。用新配制的10%碘化钾10 mL和蒸馏水50mL把玻璃塞和瓶颈上的液体冲洗入瓶内,混匀。用0.1mol/L硫代硫酸钠溶液迅速滴定至浅黄色。加入1%淀粉溶液约1mL,继续滴定,将近终点时,用力振荡,使碘由四氯

化碳全部进入水溶液内。再滴定至蓝色消失为止,即达滴定终点。

另作2份空白对照,除不加油样品外,其余操作同上。滴定后,将废液倒入废液缸内,以便回收四氯化碳。计算碘值。

五、结果计算

碘值表示100 g脂肪所能吸收碘的克数,因此样品碘值的计算如下:

碘值= (A-B)×T×100

C

式中,A:滴定空白用去的Na2S2O3溶液的平均毫升数

B:滴定碘化后样品用去的Na2S2O3溶液的平均毫升数

C:样品的重量(g)

T:1mL 0.1mol/L硫代硫酸钠溶液相当的碘的克数

六、附注

(1)碘瓶必须洁净、干燥,否则油中含有水分,引起反应不完全。

(2)加碘试剂后,如发现碘瓶中颜色变浅褐色时,表明试剂不够,必须再添加10~15 mL试剂。

(3)如加入碘试剂后,液体变浊,这表明油脂在CCl4中溶解不完全,可再加些CCl4。

(4)将近滴定终点时,用力振荡是本滴定成败的关键之一,否则容易滴加过头或不足。如震荡不够,CCl4展会出现紫或红色,此时应用力振荡,使碘进入水层。

(5)淀粉溶液不宜加得过早,否则滴定值偏高。

七、思考题

1.测定碘值有何意义?液体油和固体脂碘值间有何区别?

2.滴定过程中,淀粉溶液为何不能过早加入?

3.滴定完毕放置一些时间后,溶液应返回蓝色,否则表示滴定过量,为什么?

参考答案

1.不饱和脂肪酸碳链上含有不饱和键,可与卤素(Cl2,Br2,I2)进行加成反应.不饱和键数目越多,加成的卤素量也越多,通常以“碘值”表示。在一定条件下,每100g脂肪所吸收碘的克数称为该脂肪的“碘值”。碘值越高,表明不饱和脂肪酸的含量越高,它是鉴定和鉴别油脂的一个重要常数。因此,液体油的碘值应高于固体脂的碘值。

2.淀粉溶液不宜加得过早,否则大量的I2与淀粉结合成蓝色物质,这一部分碘就不容易与Na2S2O3反应,由碘值计算公式可知,B值减小,因而使滴定值偏高。

3.这是由于空气氧化I-所引起的。如果溶液未变蓝,说明I-被空气氧化成I2后,继续与Na2S2O3发生反应,而不与淀粉反应生成蓝色,即Na2S2O3过量。

实验二粗脂肪含量的测定——索氏抽提法

一、目的

脂肪广泛存在于许多植物的种子和果实中,测定脂肪的含量,可以作为鉴别其品质优劣的一个指标。脂肪含量的测定有很多方法,如抽提法、酸水解法、比重法、折射法、电测和核磁共振法等。目前国内外普遍采用抽提法,其中索氏抽提法(Soxhlet extractor method)是公认的经典方法,也是我国粮油分折首选的标准方法。通过本实验的学习,掌握索氏抽提法测定粗脂肪含量的原理和操作方法。

二、原理

本实验采用索氏抽提法中的残余法,即用低沸点有机溶剂(乙醚或石油醚)回流抽提,除去样品中的粗脂肪,以样品与残渣重量之差,计算粗脂肪含量。由于有机溶剂的抽提物中除脂肪外,还或多或少含有游离脂肪酸、甾醇、磷脂、蜡及色素等类脂物质,因而抽提法测定的结果只能是粗脂肪。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1.实验材料

油料作物种子、中速滤纸

2.仪器:

(1)索氏脂肪抽提器(图1)或YG-Ⅱ型油分测定器

(2)干燥器(直径15~18cm,盛变色硅胶)

(3)不锈钢镊子(长20cm)

(4)培养皿

(5)分析天平(感量0.001g)

(6)称量瓶

(7)恒温水浴

(8)烘箱

(9)样品筛(60目)

3.试剂

无水乙醚或低沸点石油醚(A.R.)

四、操作步骤

1.将滤纸切成8cm×8cm,叠成一边不封口的纸包,用硬铅笔编写顺序号,按顺序排列在培养皿中。将盛有滤纸包的培养皿移入105±2℃烘箱中干燥2h,取出放入干燥器中,冷却至室温。按顺序将各滤纸包放人同一称量瓶中称重(记作a)、称量时室内相对湿度必须低于70%。

2.包装和干燥

在上述已称重的滤纸包中装入3g左右研细的样品,封好包口,放入105±2℃的烘箱中干燥3h,移至干燥器中冷却至室温。按顺序号依次放入称量瓶中称重(记作b)。

3.抽提

将装有样品的滤纸包用长镊子放入抽提筒中,注入一次虹吸量的1.67倍的无水乙醚,使样品包完全浸没在乙醚中。连接好抽提器各部分,接通冷凝水水流,在恒温水浴中进行抽提,调节水温在70~80℃之间,使冷凝下滴的乙醚成连珠状(120~150滴/min或回流7次/h以上),抽提至抽取筒内的乙醚用滤纸点滴检查无油迹为止(约需6~12h)。抽提完毕后,用长镊子取出滤纸包,在通风处使乙醚挥发

(抽提室温以12~25℃为宜)。提取瓶中的乙醚另行回收。

4.称重

待乙醚挥发之后,将滤纸包置于105±2℃烘箱中干燥2h,放入干燥器冷却至恒重为止(记作c)。

五、结果与计算

粗脂肪含量(%)= b-c

×100 b-a

式中:a:称量瓶加滤纸包重(g)

b:称量瓶加滤纸包和烘干样重(g)

c:称量瓶加滤纸包和抽提后烘干残渣重(g)

六、附注

(1)测定用样品、抽提器、抽提用有机溶剂都需要进行脱水处理。这是因为:第一,抽提体系中有水,会使样品中的水溶性物质溶出,导致测定结果偏高;第二,抽提体系中有水,则抽提溶剂易被水饱和(尤其是乙醚,可饱和约2%的水),从而影响抽提效率;第三,样品中有水,抽提溶剂不易渗入细胞组织内部,结果不易将脂肪抽提干净。

(2)试样粗细度要适宜。试样粉末过粗,脂肪不易抽提干净;试样粉末过细,则有可能透过滤纸孔隙随回流溶剂流失,影响测定结果。

(3)索氏抽提法测定脂肪最大的不足是耗时过长,如能将样品先回流1~2次,然后浸泡在溶剂中过夜,次日再继续抽提,则可明显缩短抽提时间。

(4)YG-Ⅱ型油分测定器容量大,适合于样品较多的选种鉴定工作使用,温度控制在70℃左右,8h可提取完毕。

(5)必须十分注意乙醚的安全使用。抽提室内严禁有明火存在或用明火加热。乙醚中不得含有过氧化物,保持抽提室内良好通风,以防燃爆。乙醚中过氧化物的检查方法是:取适量乙醚,加入碘化钾溶液,用力摇动,放置1min,若出现黄色则表明存在过氧化物,应进行处理后方可使用。处理的方法是:将乙醚放入分液漏斗,先以1/5乙醚量的稀KOH溶液洗涤2~3次,以除去乙醇;然后用盐酸酸化,加入1/5乙醚量的FeSO4或Na2SO3溶液,振摇,静置,分层后弃去下层水溶液,以除去过氧化物;最后用水洗至中性,用无水CaCl2或无水Na2SO4脱水,并进行重蒸馏。

七、思考题

1.如何利用残余法测定油料作物种子中的粗脂肪含量?

2.测定过程中为什么需要对样品、抽提器、抽提用有机溶剂都要进行脱水处理?

3.在实验过程中安全使用乙醚应注意哪些问题?

4.测定样品粒子粗细有什么要求?

参考答案

1.残余法测定油料作物种子中的粗脂肪含量,是用低沸点有机溶剂(乙醚或石油醚)回流抽提,除去样品中的粗脂肪,以样品与残渣重量之差,来计算粗脂肪含量。

2.进行脱水处理的原因有三:第一,抽提体系中有水,会使样品中的水溶性物质溶出,导致测定结果偏高;第二,抽提体系中有水,则抽提溶剂易被水饱和(尤其是乙醚,可饱和约2%的水),从而影响抽提效率;第三,样品中有水,抽提溶剂不易渗入细胞组织内部,结果不易将脂肪抽提干净。

3.抽提室内严禁有明火存在或用明火加热。乙醚中不得含有过氧化物,保持抽提室内良好通风,以防燃爆。

4.试样粗细度要适宜。试样粉末过粗,脂肪不易抽提干净;试样粉末过细,则有可能透过滤纸孔隙随回流溶剂流失,影响测定结果。

第三节核酸

实验一酵母RNA的提制

一、目的:

学习和掌握从酵母中提制RNA的原理和方法,从而加深对核酸性质的认识。

二、原理:

提取和制备RNA的首要问题是选RNA含量高的材料。微生物是工业上大量生产核酸的原料,其中RNA的提制以酵母最为理想,因为酵母核酸中主要是RNA(2.67~10.0%),DNA很少(0.03~0.516%),而且菌体容易收集,RNA也易于分离。此外,抽提后的菌体蛋白质(占干菌体的50%)仍具有很高的应用价值。

RNA提制过程首先要使RNA从细胞中释放,并使它和蛋白质分离,然后将菌体除去。再根据核酸在等电点时溶解度最小的性质,将pH调至2.0~2.5,使RNA沉淀,进行离心收集。然后运用RNA不溶于有机溶剂乙醇的特性,以乙醇洗涤RNA沉淀。

提取RNA的方法很多,在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。稀碱法利用细胞壁在稀碱条件下溶解,使RNA释放出来,这种方法提取时间短,但RNA在稀碱条件下不稳定,容易被碱分解;浓盐法是在加热的条件下,利用高浓度的盐改变细胞膜的透性,使RNA释放出来,此法易掌握,产品颜色较好。使用浓盐法提出RNA时应注意掌握温度,避免在20~70℃之间停留时间过长,因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用的温度范围,会使RNA因降解而降低提取率。在90~100℃条件下加热可使蛋白质变性,破坏磷酸二酯酶和磷酸单酯酶,有利于RNA的提取。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1.实验材料

活性干酵母;

pH0.5~5.0的精密试纸;

冰块。

2.仪器

(1)药物天平(2)三角瓶(100mL)(3)量筒(50mL)

(4)水浴锅(5)电炉(6)试管木夹

(7)离心管(8)离心机(4 000r/min)(9)烧杯(250mL, 50mL, 10mL)(10)滴管及玻棒(11)吸滤瓶(500mL)(12)布氏漏斗(60mm)

(13)表面皿(8cm);(14)烘箱;(15)干燥器;(16)紫外可见分光光度计。

3.试剂

(1)NaCl(化学纯)

(2)6mol/L HCl

(3)95%乙醇(化学纯)

四、操作步骤

1.提取

活性干酵母粉5g,倒入100mL三角瓶中,加NaCl 5g,水50mL,搅拌均匀,置于沸水浴中提取1h。

2.分离

将上述提取液取出,立即用自来水冷却,装入大离心管内,以3 500r/min离心10min,使提取液与菌体残渣等分离。

3.沉淀RNA

将离心得到的上清液倾于50mL烧杯中,并置于放有冰块的250mL烧杯中冷却,待冷至10℃以下时,用6mol/L HCl小心地调节pH至2.0~2.5。随着pH下降,溶液中白色沉淀逐渐增加,到等电点时沉淀量最多(注意严格控制pH)。调好后继续于冰水中静置10min,使沉淀充分,颗粒变大。

4.抽滤和洗涤

上述悬浮液以3 000r/min离心10min,得到RNA沉淀。将沉淀物放在10mL小烧杯内,用95%的乙醇5~10mL充分搅拌洗涤,然后在铺有已称重滤纸的布氏漏斗上用真空泵抽气过滤,再用95%乙醇5~10mL淋洗3次。由于RNA不溶于乙醇,洗涤不仅可脱水,使沉淀物疏松,便于过滤、干燥,而且可除去可溶性的脂类及色素等杂质,提高了制品的纯度。

5.干燥

从布氏漏斗上取下有沉淀物的滤纸,放在8cm表面皿上,置于80℃烘箱内干燥。将干燥后的RNA 制品称重。

6.含量测定

称取一定量干燥后的RNA产品配制成浓度为10~50μg/mL的溶液,在751型分光光度计上测定其260nm处的光密度值,按下式计算RNA含量:

RNA含量(%)= OD260nm

×

RNA溶液总体积(mL)

×100 0.024×L RNA称取量(μg)

式中:OD260nm 为260nm处的光密度值;L为比色杯的光径(cm);0.024为1mL溶液含有1μg RNA 的光密度值。

五、结果计算

根据含量测定的结果按下式计算提取率:

RNA提取率(%)= RNA含量(%)×RNA制品量

×100 酵母重(g)

六、思考题

1.RNA提制中注意事项是什么?

参考答案

1.主要注意事项为:避开核酸酶作用的温度范围20~70℃,防止RNA降解。同时在调pH值时,一定要缓慢小心,且要在低温下进行。此外,在抽滤洗涤时,要用乙醇洗涤,且不可用水洗,否则将导致RNA部分溶解而造成损失,降低RNA提取率。

附注:苯酚法提取酵母RNA

(一)原理

细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起,以核蛋白的形式存在。因此,提取RNA时要把RNA 与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfate, SDS)的缓冲液中,加等体积水饱和酚,通过剧裂振荡,然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相,被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相,或者在两相界面处形成凝胶层。本实验采用的0.15mol/L缓冲液系统可使大部分RNA-蛋白复合物解离,而DNA-蛋白复合物只有极少部分解离;用酚处理时DNA-蛋白复合物变性,在低温条件下从水相中除去,这样得到的RNA制品中混杂的DNA极少。用氯仿-异戊醇继续处理RNA 制品,可进一步除去其中少量的蛋白质。最后用乙醇使RNA从水溶液中沉淀出来。本法得到的RNA 不仅纯度高,而且多呈自然状态,可供继续研究之用。

(二)主要仪器和试剂

1.仪器

(1)台式高速离心机(10 000r/min)(2)水浴

(3)Eppendorf管(1.5mL)(4)紫外可见分光光度计

(5)冰箱或冷柜(0~4℃)(6)振荡器

(7)分析天平(精确至0.1mg)(8)真空干燥器

2.试剂(均为分析纯)

(1)SDS-缓冲液:0.3%SDS,0.1mol/L NaCl,0.05mol/L乙酸钠,用乙酸调到pH5.0。

(2)饱和酚液:重蒸苯酚用(1)溶液饱和。

(3)氯仿-异戊醇液:24﹕1(V/V)。

(4)含2%乙酸钾的95%乙醇溶液。

(5)无水乙醇

(6)乙醚

(7)溶菌酶(B.R.)(1mg/mL)

(三)操作步骤

1.取1g活性干酵母在研钵中研碎,加10mL SDS-缓冲液使成匀浆,洗入各Eppendorf管(略少于

管容积的一半),加溶菌酶0.1mL,混匀,室温静置10min,再加等体积饱和酚液,室温下剧烈振荡5min。

置冰浴中分层,在0~4℃低温环境下,10 000r/min离心10min。吸出上层清液,转入新的Eppendorf管,加等体积氯仿-异戊醇,室温下剧烈振荡2.5min,然后10 000r/min 离心5min。吸出上层清液,转入另一新Eppendorf管,加2倍体积95%乙醇(含2%乙酸钾),在冰浴中放置30min,使RNA沉淀。再以10 000r/min离心5min,弃上清液,沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次,即加乙醇或乙醚,迅速离心各1min,保留沉淀。倾去乙醚后,减压真空干燥,准确称重,记录。

RNA制品纯度的测定及RNA提取率的计算与浓盐法相同。

实验二地衣酚显色法测定RNA含量

一、目的

学习RNA含量的定量测定方法以及RNA快速定性检测方法,熟悉分光光度计使用原理及其操作。

二、原理

在三氯化铁及盐酸存在下,RNA与3,5-二羟基甲苯(地衣酚)反应,生成绿色物质,其最大光吸收值在670nm处。要说明的是:地衣酚反应特异性较差,凡戊糖均可与地衣酚反应,DNA及其他杂质也能给出类似的颜色。因此测定RNA时,要考虑DNA等杂质影响,可先测定DNA含量,再计算出RNA含量。

三、实验材料、主要仪器与试剂

1.实验材料

(1)RNA标准溶液:取标准RNA(预先经定磷法确定其纯度)配成100μg/mL的溶液。

(2)样品待测液:适当稀释,使RNA含量为50~100μg/mL。

2.地衣酚试剂

先称取100mg三氯化铁溶于100mL浓盐酸中(配制0.1%浓度的溶剂)备用。在使用前加入100mg 地衣酚配制成0.1%浓度的地衣酚试剂。

3.主要仪器

(1)分光光度计。

四、操作方法

1.标准RNA曲线的制作

取12支洁净干燥试管按下表取样并加入试剂:

管号RNA标准溶液(mL)H2O(mL)地衣酚试剂(mL)RNA含量(μg)

1,2 0 2.5 2.5 0

3,4 0.5 2.0 2.5 50

5,6 1. 0 1.5 2.5 100

7,8 1.5 1. 0 2.5 150

9,10 2.0 0.5 2.5 200

11,12 2.5 0 2.5 250

充分混匀后,于沸水浴中加热20min。自来水冷却后,测定OD670nm。以RNA含量为横坐标,OD670nm 为纵坐标,绘制标准曲线。

2.样品的测定

取样品溶液2.5mL,加入地衣酚试剂2.5mL,如前述方法测定OD670nm,从标准曲线查出RNA含量。

五、计算

样品中RNA浓度(μg/mL)= 样品测得的RNA(μg)

2.5(mL)

实验三三种腺苷酸分离鉴定——醋酸纤维素薄膜电泳法

一、目的

掌握醋酸纤维素薄膜电泳法分离带电颗粒原理;观察核苷酸类物质的紫外吸收现象。

二、原理

带电粒子在电场中向着与其自身带相反电荷的电极移动的现象,称为电泳。控制电泳条件(如pH 等),使混合试样中的不同组分带有不同的净电荷,各组分在电场中移动的速度或方向各不相同,从而达到分离各组分的目的,这就是电泳分析法。以醋酸纤维素薄膜作支持物进行电泳分析的方法称为醋酸纤维素薄膜电泳法。

在pH4.8电泳缓冲液条件下,带有不同量磷酸基团的AMP、ADP、ATP解离之后,带有负电荷量的顺序为:ATP>ADP>AMP,它们在电场中移动速度不同,从而得到分离。又利用核苷酸类物质的碱基具有紫外吸收性质,将分离后的电泳醋酸薄膜放在紫外灯下,可见暗红色斑点,参照标准样品在同样条件下的电泳情况,对混合试样分离后的各组分进行鉴定。

三、仪器与试剂

1.仪器

(1)电泳仪、电泳槽(平板式)

(2)紫外灯

(3)电吹风、医用镊子

(4)醋酸纤维素薄膜(8 cm×12cm)

(5)微量进样器(10μL或50μL)

2.试剂

(1)柠檬酸缓冲液(pH4.8):称取柠檬酸8.4g,柠檬酸钠17.6g,溶于蒸馏水,稀释到2000mL。

(2)标准腺苷酸溶液:用蒸馏水将纯AMP、ADP、ATP分别配成100mg/10mL溶液。其中AMP 需略加热助溶。置冰箱备用。

(3)混合腺苷酸溶液:分别取上述标准液AMP、ADP、ATP各1份等量混匀。置冰箱备用。

四、操作步骤

1.点样:将醋酸纤维素薄膜放入pH4.8柠檬酸缓冲液中,待膜完全浸透(约0.5h)后用镊子取出,

夹在清洁的滤纸中间,轻轻吸去多余的缓冲液,仔细辨认薄膜无光泽面,用微量进样器在无光泽面上点样。点样点距薄膜一端1.5cm,样点之间距离1.5cm。点样量为2~3μL,按少量多次原则分2~3次点完。

2.电泳:向两个电泳槽内注入pH4.8的柠檬酸缓冲液,缓冲液的高度约为电泳槽深度的3/4。(注意:两槽中电泳液面一致)。用宽度与薄膜相同的滤纸作“滤纸桥”连接醋酸纤维素薄膜和两极缓冲液。待滤纸全部被缓冲液浸湿后,将已点样薄膜的无光泽面向下贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上。

点样端置于负极方向,盖上电泳槽盖,接通电源,在电压降为10V/cm的条件下进行电泳,一小时后关闭电源,取出醋酸纤维素薄膜,用电吹风吹干。

3.鉴定:用镊子小心地将吹干的薄膜放在紫外灯下观察,用铅笔划出各腺苷酸电泳斑点,并标明各斑点的腺苷酸代号。

绘出三种标准核苷酸及样品的电泳图谱,以标准单核苷酸的迁移率作标准,鉴别试样中各组分。

五、附注

1.电泳前,一定要检查电极正负极与薄膜方向,确定负极接在薄膜的点样一端,因为样品是带负电荷,接通电源后,样品要在薄膜上向正极泳动;确定薄膜的无光泽面朝下。

2.点样时,要控制点样点的大小在直径为2~3mm,样点不可太大,否则电泳后观察结果不理想。

六、思考题

1.说明电泳分离腺苷酸的原理。

参考答案

1.电泳法分离的目标物质一定是带电的。腺苷酸是两性物质,其含氮碱基嘌呤与嘧啶使其具有碱性,而其磷酸基团赋予腺苷酸的酸性。在柠檬酸缓冲液pH4.8条件下,腺苷酸磷酸基团解离,使腺苷酸带负电,在电场中向正极泳动。AMP、ADP、ATP三种腺苷酸因磷酸基团的解离而分别带有2、3、4个负电荷,它们在电场中移动速度不同,因此经过一段时间电泳后,即可达到分离。

实验四植物DNA的提取与测定

一、目的

随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用,人们经常需要提取高分子量的植物DNA,用于构建基因文库、基因组 southern分析、酶切及克隆等,这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA的原理并掌握CTAB提取DNA的方法,进一步了解DNA 的性质。

二、原理

细胞中的DNA绝大多数以DNA-蛋白复合物(DNP)的形式存在于细胞核内。提取DNA时,一般先破碎细胞释放出DNP,再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质,最后用乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来。DNP与核糖核蛋白(RNP)在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大,利用这一特性可将二者分离。以NaCl溶液为例:RNP在0.14mol/L NaCl中溶解度很大,而DNP在其中的溶解度仅为纯水中的1%。当NaCl浓度逐渐增大时,RNP的溶解度变化不大,而DNP的溶解则随之不断增加。当NaCl 浓度大于1mol/L时,DNP的溶解度最大,为纯水中溶解度的2倍,因此通常可用1.4mol/L NaCl提取

DNA。为了得到纯的DNA制品,可用适量的RNase处理提取液,以降解DNA中搀杂的RNA。

关于植物总DNA的提取主要有两种方法:

1.CTAB法:

CTAB(十六烷基三甲基溴化铵,hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB):是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的,当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开,然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中,再加入乙醇使核酸沉淀,CTAB能溶解于乙醇中。

2.SDS法:

利用高浓度的阴离子去垢剂SDS(十二烷基磺酸钠,Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS)使DNA与蛋白质分离,在高温(55~65℃)条件下裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸,然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀,离心后除去沉淀,上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。

一般生物体的基因组DNA为107~109bp,在基因克隆工作中,通常要求制备的大分子DNA的分子量为克隆片段长度的4倍以上,否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端,导致酶切后有效末端太少,可用于克隆的比例太低,严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA的方法必须考虑两个原则:(1)尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质(如多酚、类黄酮等)、多糖等杂质,并防止和抑制内源DNase对DNA的降解。(2)尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

几乎所有的DNase都需要Mg2+或Mn2+为辅因子,故实现(1)尽量去除蛋白质的要求,需加入一定浓度的螯合剂,如EDTA、柠檬酸,而且整个提取过程应在较低温度下进行(一般利用液氮或冰浴)。为实现(2)需要在DNA处于溶解状态时,尽量减弱溶液的涡旋,而且动作要轻柔,在进行DNA溶液转移时用大口(或剪口)吸管。

提取的DNA是否为纯净、双链、高分子的化合物,一般要通过紫外吸收、化学测定、“熔点”(melting temperature,Tm)测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。本实验采用CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法鉴定。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1.实验材料

新鲜菠菜幼嫩组织、花椰菜花冠或小麦黄化苗等

2.主要仪器

(1)高速冷冻离心机

(2)751型分光光度计

(3)恒温水浴

(3)液氮或冰浴设备

(4)磨口锥形瓶

(5)核酸电泳设备

3.试剂(CTAB法)

(1)CTAB提取缓冲液:100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0),20 mmol/L EDTA-Na2,1.4mol/L NaCl(如表1),2% CTAB,使用前加入0.1%(V/V)的β-巯基乙醇。

表1 CTAB提取缓冲液配制

试剂*名称M.W. 配制1 000mL 配制500mL

Tris 121.14 12.114g 6.057g

EDTA-Na2372.24 7.4448g 3.7224g

NaCl 58.44 81.816g 40.908g

* 用HCl调pH值。

(2)TE缓冲液:10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA(pH8.0)。

(3)DNase-free RNase A: 溶解RNase A于TE缓冲液中,浓度为10mg/mL,煮沸10~30min, 除去DNase活性,-20℃贮存(DNase为DNA酶,Rnase为RNA酶)。

(4)氯仿-异戊醇混合液(24:1,V/V):240mL氯仿(A.R.)加10mL异戊醇(A.R.)混匀。

(5)3mol/L乙酸钠(NaAc,pH6.8):称取NaAc·3H2O 81.62g,用蒸馏水溶解,配制成200mL,用HAc调pH至6.5。

(6)95%乙醇

TE缓冲液,Tris-HCl(pH8.0)液,NaAc溶液均需要高压灭菌。

四、操作步骤

1.称取2~5g新鲜菠菜幼嫩组织或小麦黄花苗等植物材料,用自来水、蒸馏水先后冲洗叶面,用滤纸吸干水分备用。叶片称重后剪成1cm长,置研钵中,经液氮冷冻后研磨成粉末。待液氮蒸发完后,加入15mL预热(60~65℃)的CTAB提取缓冲液,转入一磨口锥形瓶中,置于65℃水浴保温,0.5~1h,不时地轻轻摇动混匀。

2.加等体积的氯仿/异戊醇(24:1),盖上瓶塞,温和摇动,使成乳状液。

3.将锥形瓶中的液体倒入离心管中,在室温下4 000r/min离心5min,静置,离心管中出现3层,小心地吸取含有核酸的上层清液于量筒中,弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。

4.根据需要,上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。

5.收集上层清液,并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入1~2倍体积预冷的95%乙醇,边加边用细玻棒沿同一方向搅动,可看到纤维状的沉淀(主要为DNA)迅速缠绕在玻棒上。小心取下这些纤维状沉淀,加1~2 mL 70%乙醇冲洗沉淀,轻摇几分钟,除去乙醇,即为DNA粗制品。

6.上述DNA粗制品含有一定量的RNA和其它杂质。若要制取较纯的DNA,可将粗制品溶于TE 缓冲液中,加入10mg/mL的RNase溶液,使其终浓度达50μg/mL,混合物于37℃水浴中保温30min除去RNA。重复步骤2~5的操作,可制得较纯的DNA制品。

7.将DNA制品溶于250μL的TE缓冲液中,完全溶解DNA样品。

8.加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH6.8)和2倍体积的95%乙醇,沉淀DNA,重复步骤5。最后,将DNA溶于250μL 的TE缓冲液中。

生物化学实验报告

生物化学实验报告 动物营养研究所 树润 2015.10.12 猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活性测定一.实验目地 1.通过实验了解活性物质的分离提取。 2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。 二.实验原理 超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白,是唯一以自由基为底物 的酶,具有清除自由基的功能酶,在酶分子上共价连接金属辅 基,因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。 该酶首次从牛红细胞中分离得到,是一种蓝色含铜蛋白,之后, 研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力,因此将其 命名为超氧化物歧化酶1-2。超氧化物歧化酶是一种能专一地清 除超氧离子自由基(O2-)的金属酶,它具有抗衰老、抗辐射、 抗炎抗癌等作用,因而在医药(如关节炎、红斑狼疮等疾病的 治疗3)、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业(SOD灵芝菌5 等)等方面具有了广泛的应用前景。 超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体的一种金属酶, 可催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和 O2。SOD催化下述反应:2H++2O2-→H2O2+O2。

超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同,可分为 Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体,呈 蓝绿色;Mn-SOD呈紫红色;Fe-SOD呈黄褐色。 SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料,从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法:邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。 该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定,酶活性单 位定义为:每毫升反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率 达50%的酶量定义为一个酶单位。 样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮 蓝G-250在游离状态下呈红色,与蛋白质结合呈现蓝色。在一 定围,溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比,可 用比色法测定,测定围1-1000μg。 三.实验试剂与器材 1.实验试剂 ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯 亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐 溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等 2.实验器材

生物化学实验习题及参考答案完整版

生物化学实验习题及参 考答案 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】

生物化学实验习题及解答 一、名词解释 1、pI; 2、层析; 3、透析; 4、SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳; 5、蛋白质变性; 6、复性; 7、Tm 值; 8、同工酶; 9、Km值; 10、DNA变性;11、退火;12、增色效应 二、基础理论单项选择题 1、用下列方法测定蛋白质含量,哪一种方法需要完整的肽键( ) A、双缩脲反应 B、凯氏定氮 C、紫外吸收 D、羧肽酶法 2、下列哪组反应是错误的() A、葡萄糖——Molish反应 B、胆固醇——Libermann-Burchard反应 C、色氨酸——坂口(Sakaguchi)反应 D、氨基酸——茚三酮反应 3、Sanger试剂是() A、苯异硫氰酸 B、2,4-二硝基氟苯 C、丹磺酰氯 D、-巯基乙醇 4、肽键在下列哪个波长具有最大光吸收() A、215nm B、260nm C、280nm D、340nm 5、下列蛋白质组分中,哪一种在280nm具有最大的光吸收() A、色氨酸的吲哚基 B、酪氨酸的酚环 C、苯丙氨酸的苯环 D、半胱氨酸的硫原子 6、SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量是根据各种蛋白质() A、在一定pH值条件下所带的净电荷的不同 B、分子大小不同 C、分子极性不同 D、溶解度不同 7、蛋白质用硫酸铵沉淀后,可选用透析法除去硫酸铵。硫酸铵是否从透析袋中除净,你选用下列哪一种试剂检查() A、茚三酮试剂 B、奈氏试剂 C、双缩脲试剂 D、Folin-酚试剂 8、蛋白质变性是由于() A、一级结构改变 B、亚基解聚 C、空间构象破坏 D、辅基脱落 9、用生牛奶或生蛋清解救重金属盐中毒是依据蛋白质具有() A、胶体性 B、粘性 C、变性作用 D、沉淀作用 10、有关变性的错误描述为()

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生物化学实验知识点整理 实验一 还原糖的测定、实验二 粮食中总糖含量的测定 1.还原糖测定的原理 3,5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原成棕色的氨基化合物,在550nm 处测定光的吸收增加量,得出该溶液的浓度,从而计算得到还原糖的含量 2.总糖测定原理 多糖为非还原糖,可用酸将多糖和寡糖水解成具有还原性的单糖,在利用还原糖的性质进行测定,这样就可以分别求出总糖和还原糖的含量 3.电子天平使用 4.冷凝回流的作用: 使HCl 冷凝回流至锥形瓶中,防止HCl 挥发,从而降低HCl 的浓度。 5.多糖水解方法: 加酸进行水解 6.怎样检验淀粉都已经水解: 加入1-2滴碘液,如果立即变蓝则说明没有完全水解,反之,则说明已经完全水解。 7.各支试管中溶液的浓度计算 8.NaOH 用量:HCl NaOH n n = 9.不能中途换分光光度计,因为不同的分光光度计的光源发光强度不同 10.分光光度计的原理:在通常情况下,原子处于基态,当通过基态原子的某辐射线所具有的能量(或频率)恰好符合该原子从基态跃迁到激发态所需的能量(或频率)时,该基态原子就会从入射辐射中吸收能量,产生原子吸收光谱。原子的能级是量子化的,所以原子对不同频率辐射的吸收也是有选择的。这种选择吸收的定量关系服从式/E h hc νλ?==。 实验证明,在一定浓度范围内,物质的吸光度A 与吸光样品的浓度c 及厚度L 的乘积成正比,这就是光的吸收定律,也称为郎伯-比尔定律 分光光度计就是以郎伯比尔定律为原理,来测定浓度 11.为什么要水解多糖才能用DNS 因为DNS 只能与还原糖溶液在加热的条件下反应生成棕红色的氨基化合物,不能与没有还原性的多糖反应。 12.为什么要乘以0.9 以0.9才能得到多糖的含量。 13.为什么要中和后再测? 因为DNS 要在中性或微碱性的环境下与葡萄糖反应 实验三 蛋白质的水解和纸色谱法分离氨基酸、实验四 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 1.纸色谱分离氨基酸分离原理 由于各氨基酸在固定相(水)和流动相(有机溶剂)中的分配系数不同,从而移动速度不同,经过一段时间后,不同的氨基酸将存在于不同的部位,达到分离的目的。 2.天然氨基酸为L 型 3.酸式水解的优点是:是保持氨基酸的旋光性不变,原来是L 型,水解后还是L 型,由于甘氨酸所有的R 基团是氢原子,所以它不是L 型

生物化学实验内容

《生物化学实验》内容 课程类型:制药工程专业必修 实验总学时:32课时 开设实验项目数:8个 适用对象:2017制药工程1、2班 实验教师:段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程,培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事求是的科学态度。 二、实验内容

三、成绩 包括实验时的表现(实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等,占50%)及实验报告的完成情况和完成质量(占50%),每个实验按总分为100分为满分进行打分,共8个实验,总评取平均值。 四、要求 (1)实验过程中同组人可以配合进行; (2)实验报告独立完成,同组人数据相同,不得抄袭他组数据;(3)实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做; (4)对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。

3.掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖,包括绝大部分的单糖、寡糖,常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体内可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括:热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水,不溶于60%以上乙醇,所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性,将植物磨碎,用热水将组织中的可溶性糖提取出来,结合实验二得到总糖浓度,已知溶液体积和原料重量,可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备:电子天平(精确到0.0g,配称量纸若干);可控温电 加热板或电炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿:研钵1套;100mL锥形瓶1个;25mL量筒1个;玻 璃棒1根;100mL烧杯2个;胶头滴管1支;过滤装置1套(铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个); 不锈钢刮勺1个;剪刀1把。此部分为每组所用,集中到小框里,放置各实验台上。 3.药品试剂:新鲜植物叶片;蒸馏水。 4.其他:9cm滤纸若干(与玻璃漏斗配套);纸巾若干;标签纸若

生化实验操作考核要点(新)

【实验操作考核要点】 一、目的要求 1.掌握组织样品的制备方法,了解其注意事项。 2.了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项,掌握其操作方法。 3.正确操作使用刻度吸管和可调微量移液器。 4.熟练运用溶液混匀的各种方法(视具体情况,采用合适的混匀方法)。 5.正确掌握溶液转移的操作。 6.正确操作使用分光光度计。 二、操作考核内容 按百分制计。 1.吸量管操作(20分); 2.可调式微量移液器操作(20分); 3.溶液混匀操作(视具体情况,采用合适的混匀方法)(15分); 4.溶液转移操作(10分); 5.分光光度计比色操作(25分)。 6.整体表现(10分)。 三、操作考核标准 (一)吸量管操作(20分,每项操作5分) 1.执管 要求右手拿吸量管,左手拿橡皮球,只能用食指而不能用拇指按压吸量管上口来调节吸取液量的刻度;吸液、排液整个操作过程吸量管应始终保持垂直。 2.坐姿 要求腰、背保持竖直,看刻度时眼睛保持平视。 3.吸取溶液 吸量管插入液面深度约0.5cm,不能一插到底,也不能插入过浅而吸进空气致使溶液进入橡皮球内;调控吸量管吸取液量的刻度时,吸量管尖应离开液面靠在容器内壁上。 4.排出液体

吸量管尖应靠上受纳容器内壁,让管内溶液自然流出。不能用橡皮球吹压,而且在流净后吸量管尖停靠受纳容器内壁至少3秒。 (二)可调式微量移液器操作(20分,每项操作5分) 1.设定容量值 转动加样器的调节旋钮,反时针方向转动旋钮,可提高设定取液量。顺时针方向转动旋钮,可降低设定取液量。在调整设定移液量的旋钮时,不要用力过猛,并应注意使取液器显示的数值不超过其可调范围。 2.吸液 (1)选择合适的吸头安放在取液套筒上,稍加扭转压紧吸嘴使之与套筒之间无空气间隙; (2)把按钮压至第一停点,垂直握持加样器,使吸头浸入液面下2~3毫米处,然后缓慢平稳地松开按钮,吸入液体,等一秒钟,然后将吸头提离液面,贴壁停留2-3秒,使管尖外侧的液滴滑落。 3.放液 (1)将吸头口贴到容器内壁底部并保持100°~40°倾斜; (2)平稳地把按钮压到第一停点,等一秒钟后再把按钮压到第二停点以排出剩余液体; (3)压住按钮,同时提起加样器,使吸头贴容器壁擦过,再松开按钮。按吸头弹射器除去吸头。 4.压放按钮时保持平稳;加样器不得倒转;吸头中有液体时不可将加样器平放。取液器吸嘴为一次性使用。实验完毕,将取液器读数调至最大量程值,竖立放于支架上。 (三)溶液的混匀(操作流程中下划实线的三处,每项操作5分,共15分)1.肝糖原的提取与鉴定操作中,肝匀浆上清液中加5ml 95%乙醇后的混匀最好用倾倒混匀,也可用滴管或吸量管吸、吹混匀,或用玻璃棒搅拌混匀。 2.肝糖原定量测定中,肝组织消化液沸水浴后全部转入100 ml容量瓶,加水至刻线后的混匀应采用倒转混匀。 3.肝糖原定量测定中,加蒽酮溶液后的混匀,可将试管倾斜约45o再作旋转混匀。因蒽酮溶液(浓硫酸配制)比重大于样品水溶液很多,一加入便沉于管

生物化学实验重点试题

一、解词 1、总氮量水中各种形态无机和有机氮的总量 2、酶的抑制作用是指在某个酶促反应系统中,某种低相对分子质量的物质加入后,导致酶活力降低的过程。 3、酶的最适温度酶催化活性最高时的温度 4、蛋白质的等电点每个蛋白都存在一个pH使它的表面净电荷为零即等电点 5、盐析增加中性盐浓度使蛋白质、气体、未带电分子溶解度降低的现象 6、蛋白质变性蛋白质在某些物理和化学因素作用下其特定的空间构象被改变,从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失6、酶的专一性酶对底物及其催化反应的严格选择性通常酶只能催化一种化学反应或一类相似的反应 7、激活剂能提高酶活性的物质大部分是离子或简单的有机化合物 8、抑制剂凡能使酶催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质 9、酶催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体 二、填空 1、球蛋白可在半饱和中性硫酸铵溶液中析出,清蛋白可在高盐浓度溶液中析出。 2、在PH3.0、和9.5时的电场中,卵清蛋白(PI4.6)移动方向分别为负移 动,正移动。 3、唾液淀粉酶的最适温度是37 4、还原糖与本乃狄试剂共热现象生成生成砖红色沉淀。 5、维生素C也称抗坏血酸,它具有很强还原性 6、用苔黑酚浓盐酸溶液可以鉴定核糖核酸 7、当溶液的PH低于蛋白质等电点时,蛋白质分子带正电荷;当溶液的 PH大于蛋白质等电点时,蛋白质分子带负电荷; 10.凯氏定氮法测定蛋白质含量消化终点颜色为清澈的蓝紫色色。 11.蛋白质变性的实质是空间结构被破坏。 12.常用的RNA提取方法有苯酚法、、高盐法等。 13、维持蛋白质亲水胶体稳定的因素是蛋白质颗粒表面的电荷层 和水化膜、 14、蛋白质在等电点时,主要以两性离子离子形式存在;当溶液的P H>PI 时,蛋白质分子以负离子形式存在;当溶液的P H<PI时,蛋白质分子带正离子形式存在。 15、蛋白质分子中氮的平均含量为 5.16% ,样品中的蛋白质含量常以测 氮量乘以 6.25 、即 6 。 三、选择 1、盐析法沉淀蛋白质的原理( ) A 与蛋白质结合成不溶性蛋白盐 B 次级键断裂蛋白质的构象改变 C 中和电荷,破坏水化膜 D 调节蛋白质溶液的等电点 2、以下哪项不是酶的特性() A 酶是生物催化剂,催化效率极高 B 易受Ph,温度等外界因素的影响 C 能加速化学反应但不改变反应平衡点 D 有高度特异性 3、RNA和DNA的最大紫外吸收值是在() A 280nm B 260nm C 510nm D 620nm 4、.凯氏定氮法使用的混合催化剂硫酸钾-硫酸铜配比为() A 1:3 B 5:1 C 3:1 D 1:1

最新生物化学实验参考答案资料

《生物化学实验Ⅰ》总复习思考题 部分是自己做的,部分是百度的,各位看官如果要借鉴请酌情考虑,后果自负。 ——江湖游子 1. 请掌握下列生物化学实验常用仪器的正确操作使用方法,并能回答以下问题: (1)离心机使用时为什么要平衡?普通离心机与高速离心机在平衡时有什么不同要求? 平衡是为了让转动物体重心正好在转轴上,如果不在,会对转轴产生很大作用力,有时整台机器会跟着晃动。这对机器损耗很大。转速越高的离心机不光重量很重,使用时还要特别放平衡,就连离心管里面的试液都要放置等量,离心管还要对称放入转子试管孔内,以确保转子平衡运行,而且在调节转速时,还要使用分段升速法。 (2)为什么用高速组织捣碎机进行动、植物组织捣碎时,需采用间歇式方式进行操作? 为了防止产热过高,破坏组织内的蛋白质。防止蛋白变性。 (3)用真空泵进行减压抽滤时,为什么要连接缓冲瓶? 防止负压产生,引起水泵里的水或油泵里的油倒吸,进入滤瓶中,污染滤液。 2.为什么肝糖元只能从刚宰杀的动物肝脏中获取?在提取肝糖元过程中,三氯乙酸、95%乙醇各起什么作用?糖元水解产物中如果存在提取中残留蛋白质时,在用班氏试剂检测水解产物,有什么影响! 动物死亡后,体内的细胞还能存活一段时间,由于进行细胞呼吸作用,肝细胞会消耗肝糖元,所以必须用新鲜的肝脏细胞。三氯乙酸是固定作用(蛋白质能被三氯乙酸沉淀);乙醇:糖元不溶于乙醇,可以提取糖元。班氏试剂使用时需要加热,而加热会时残留的蛋白质变性水解,对最终测得的水解产物颜色可能有影响。(水解的产生的氨气结合铜离子,是铜离子的氧化性失去,导致生产绛蓝色沉淀,实验将失败) 3.请阐述分光光度仪的主要部件及其功能;阐述紫外与可见光的光波长范围;在紫外与可见光范围内测定物质吸光度时,对光源与吸收池有何要求?光电管的功能是什么?为什么说光电管是分光光度仪最脆弱和最易损的部件? 光源(钨灯):发光。 单色器:把混合光波分解为单一波长光的装置。 吸收池:盛放待测流体(液体、气体)试样的容器。该容器应具有两面互相平行、透光且有精确厚度的平面。它藉助机械操作能把待测试样间断或连续地送到光路中,以便吸收测量的辐射(光)通量。 检测器:将单色器分出的光信号进行光电转换,电信号在工作站显示成出峰。 测量装置:通过测得的电流表·记录器·数字示值读书单元的数据来绘制吸收曲线。 紫外光:200至350nm 可见光波长:350至760nm 紫外测定:其应用波长范围为200~400nm的紫外光做光源,在低于350nm的紫外光区工作时,必须采用石英池或熔凝石英池。 可见光测定:用波长为400~850nm的可见光作光源,可以用玻璃池·石英池·熔凝池。 光电管的功能:光电转换,将光信号转化成电信号。 光电管容易产生光电管疲劳:所以不测定时必须将试样室盖盖好,使光路切断,以延长光电管的使用寿命。

生物化学实验练习题及参考答案[1]

生物化学实验 一、名词解释: 分配层析法电泳同工酶酶活性分光光度法层析技术比活力 二、填空题: 1. 测定蛋白质含量的方法有,,和。 2. CAT能把H2O2分解为H2O和O2,其活性大小以来表示,当CAT与H2O2反应结束,再用测定未分解的H2O2。 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以作为载体的一种区带电泳,这种凝胶是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成。化学聚合法一般用来制备_____________胶,其自由基的引发剂是,催化剂是______________;光聚合法适于制备大孔径的_________________胶,催化剂是______________。 4.层析技术按分离过程所主要依据的物理化学性质进行分类,可分成以下几种:_______________,_______________,_______________,_______________和________________。 5. 使用离心机离心样品前,必须使离心管__________且对称放入离心机。 6. 米氏常数可近似表示酶和底物亲合力,Km愈小,表示E对S的亲合力愈,Km愈大,表示E对S 的亲合力愈。 7. 分光光度计在使用之前必须预热,注意预热及样品槽空时必须_________(打开、合上)样品池翻盖。 8. CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一,其活性高低与植物的密切相关。 9. 纸层析实验中,____________形成固定相,____________流动相。 10. 聚丙烯酰胺凝胶是是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成的,在具有自由基团体系时,两者就聚合。引发产生自由基的方法有两种:和。11. 层析技术按按固定相的使用形式进行分类,可分成以下几种:_______________,_______________,_______________和________________。 三、问答题: 1、简述4种测定蛋白质含量的方法及其原理。 2、简述不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个不连续及三种物理效应。 3、试分析影响电泳的主要因素有哪些? 参考答案: 生物化学实验 一、名词解释: 1、电泳:指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。 2、同工酶:指催化同一种化学反应,但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。 3、分配层析法:用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同,而达到分离目的的一种实验方法。

生物化学实验

生物化学实验讲义 化学工程与技术学院 基础部

实验一酪蛋白的制备 一、目的 学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 二、原理. 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白,含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物,等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理,将牛乳的pH调至4.7时,酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物,除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 三、器材 1 、离心机2、.抽滤装置 3、精密pH试纸或酸度计 4、电炉 5、烧杯 6、温度计. 四、试剂与材料 1、牛奶2500mL 2、95%乙醇1200mL 3、无水乙醚1200mL

4、0.2mol/L pH 4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL 5、.乙醇—乙醚混合液2000mL 五、操作 1、将100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入 预热至40℃、pH 4.7的醋酸缓冲液100 mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3 000r/min)。弃去清液,得酪蛋白粗制品。 2、用水洗沉淀3次,离心10分钟(3000r/min), 弃去上清液。 3、在沉淀中加入30mL乙醇,搅拌片刻,将全部悬 浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次,抽干。 4、将沉淀摊开在表面皿上,风干;得酪蛋白纯晶。 5、准确称重,计算含量和得率。 含量:酪蛋白g/100mL牛乳(g%)

得率: 测得含量 100 % 理论含量 思考题 1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么? 实验二小麦萌发前 后淀粉酶活力的比较 一、目的 1.学习分光光度计的原理和使用方法。 2.学习测定淀粉酶活力的方法。 3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 二、原理 种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。 2(C6H10O5)n +nH2O nC12H22O11 麦芽糖有还原性,能使3,5---二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计测定。

生物化学实验报告

实验一糖类的性质实验 (一)糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 (一)α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸(硫酸、盐酸)作用下,脱水生成糠醛及糠醛衍生物,后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性,故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架,滴管 3、试剂 莫氏试剂:5%α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g,溶于95%酒精中,总体积达100 mL,贮于棕色瓶内。用前配制。 1%葡萄糖溶液100 mL 1%果糖溶液100 mL 1%蔗糖溶液100 mL 1%淀粉溶液100 mL %糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管,分别加入1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液、%糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂,充分混合。倾斜试管,小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL,慢慢立起试管,切勿摇动。 观察记录各管颜色。 (二)间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下,酮醣脱水生成羟甲基糠醛,后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢,只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时,才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架,滴管 3、试剂 塞氏试剂:%间苯二酚-盐酸溶液1000 mL,称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中,再用蒸馏水稀至1000 mL。 1%葡萄糖溶液100 mL 1%果糖溶液100 mL 1%蔗糖溶液100 mL 4、实验操作

12级生物化学实验2期末复习题-考试

12级生物化学实验2期末复习题-考试

生物化学实验(2)理论习题 一、名词解释题 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE):在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后,蛋白质亚基的点泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,而电荷因素可以被忽略。当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时,电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系,可以用来测定蛋白质亚基的分子量。 2、电泳:带电颗粒在电场作用下,向着与其电性相反的电极移动,称为电泳 3、层析分离技术:是一种物理的分离方法,利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别,使各组分以不同的程度分布在两个相中。 4、吸附色谱法:利用同一吸附剂对混合物中不同成分吸附能力的差异,从而使各成分达到分离目的的色谱法。 5、离子交换层析:以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。 6、分配层析:根据一种或多种化合物,在两种不相

融合的溶剂间的分配来分离物质的方法。 7、亲和层析:是利用生物活性物质之间的专一亲和吸附作用而进行的层析方法。是近年来发展的纯化酶和其他高分子的一种特殊的层析技术。 8、凝胶层析(凝胶色谱):混合物随流动相经过凝胶层析柱时,由于各组分流经体积的差异,使不同分子量的组分得以分离的层析方法。 9、电渗作用:指在电场作用下液体(通常是水)相对于和它接触的固定的固体相作相对运动的现象。 10、担体:担体是一种化学惰性的,多孔性的固体微粒,能提供较大的惰性表面,使固定液以液膜状态均匀地分布在其表面。 11、死时间:从进样到惰性气体峰出现极大值的时间称为死时间.。 12、保留时间:被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间,也即从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间,称为此组分的保留时间。 13、高效液相色谱法:,以液体为流动相,采用高压输液系统,将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,在柱内各成分被分离后,进入检测器进行检测,

生化大实验实验报告材料

生化大实验 实验报告 姓名: 学号: 专业: 班级: 实验班级: 单位: 指导老师:

实验1 多酚氧化酶(PPO)的分离提取 一、实验原理: 多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌,它是植物组织广泛存在的一种含铜氧化酶,位于质体、微体,可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节,属于末端氧化酶的一种。 植物受到机械损伤和病菌侵染后,PPO催化酚与O2氧化形成为醌,使组织形成褐变,以便损伤恢复,防止或减少感染,提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用,所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外,多酚氧化酶也可以与细胞其他底物氧化相偶联,起到末端氧化酶的作用。 蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同,通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出,且大分子蛋白质不能通过透析膜。 二、实验目的: 通过本项实验,学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法,掌握相关的仪器设备的正确使用的方法,以及蛋白质的提取分离的系统技术。 三、材料与试剂: 1.材料:马铃薯(两小组共称200g) 2.试剂:0.03M磷酸缓冲液pH 6.0(含0.02M巯基乙醇,0.001M EDTA,5%甘油,1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制是配x10倍的浓缩液1000ml;固体硫酸铵;0.03M磷酸缓冲液pH 6.0(含0.02M巯基乙醇,0.001M EDTA,0.005M MgCl2) 3.设备:试管与试管架;烧杯、玻璃棒;移液管、滴管等;试剂瓶;透析袋;过滤纱布;植物组织匀浆机;pH计和pH试纸;高速冷冻离心机; 四、操作步骤: 1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块,加入300ml缓冲液A,两者按1:1(W/V)比例匀浆1min; 2.用两层纱布将所得的浆液过滤; 3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min; 4.上清液两组平分,每组150ml,加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min; 5.取上清液定容至150ml,加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min,倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min; 6.将所得溶液倒入透析袋中,用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。 五、结果和分析: 实验所得的初酶液颜色为浅黄色,颜色浅,主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少,从而最大程度的保留了PPO的活性;经过一个夜晚的透析,得到了澄清的略带黄色的液体,这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。 六、讨论与结论: 1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速,防止酚类充分暴露在空气中被氧化; 2.实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净; 3.加入硫酸铵固体时一定要小心缓慢,同时伴有玻璃般的搅拌,在溶解蛋白的过程中避免溶液局部盐离子浓度过大,使蛋白变性,并注意用量的计算,第二步加入的时候起点浓度是40%而不是0,否则会加入过量,影响实验的结果; 4.透析时,提前检查透析袋是否完整,避免透析时出现孔洞导致样品丢失。

生物化学实验方法手册

生物化学实验方法手册 Markus R Wenk National University of Singapore, Singapore Aaron Zefrin Fernandis National University of Singapore, Singapore A Manual For Biochemistry Protocols 2007,127pp. Paperback ISBN 978-981-270-066-7 Markus R Wenk等编 该书是生物医学研究手册丛书的第三卷,其前两卷分别是《初级哺乳动物细胞培养手册》和《生物医学研究中的显微镜技术》,后续还将推出《生物材料及骨架编织技术手册》和《知识产权管理手册》,这五卷均由世界科学出版社出版。 本手册共分为6章,各章内容分别是:1.蛋白纯化;2.蛋白分析;3.脂肪分析;4.哺乳动物细胞培养;5.显微镜学; 6.分析与鉴定。作者希望这本手册不仅仅是将各种生物化学实验方法的简单罗列,更希望读者能够通过这本手册掌握生

物化学实验技巧进而理解这些方法背后的原理。这本手册将给广大读者带来一个全景式的生物化学,尤其对于那些初次踏入生物化学领域的读者,选择这本手册会是一个不错的开始。 这本手册的编者都是科研一线人员,所编著的方法实用且前沿,并且详尽地介绍了生物化学中可能会使用的实验方法。 本手册适合从事生物化学、分子生物学的相关人员,在实验中它是一本不错的参考工具。 程恩隽,博士生 (国家纳米科学中心) Chengenjun, DoctoralCandidate (National Center for Nanoscience and Nanotechnology ,China)

生物化学实验内容

《生物化学实验》容 课程类型:制药工程专业必修 实验总学时:32课时 开设实验项目数:8个 适用对象:2017制药工程1、2班 实验教师:段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程,培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事的科学态度。 二、实验容

包括实验时的表现(实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等,占50%)及实验报告的完成情况和完成质量(占50%),每个实验按总分为100分为满分进行打分,共8个实验,总评取平均值。 四、要求 (1)实验过程中同组人可以配合进行; (2)实验报告独立完成,同组人数据相同,不得抄袭他组数据; (3)实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做; (4)对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。 3.掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖,包括绝大部分的单糖、寡糖,常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括:热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水,不溶于60%以上乙醇,所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性,将植物磨碎,用热水将组织中的可溶性

糖提取出来,结合实验二得到总糖浓度,已知溶液体积和原料重量,可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备:电子天平(精确到0.0g,配称量纸若干);可控温电加热板或电 炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿:研钵1套;100mL锥形瓶1个;25mL量筒1个;玻璃棒1根; 100mL烧杯2个;胶头滴管1支;过滤装置1套(铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个);不锈钢刮勺1个;剪刀1把。此部分为每组所用,集中到小框里,放置各实验台上。 3.药品试剂:新鲜植物叶片;蒸馏水。 4.其他:9cm滤纸若干(与玻璃漏斗配套);纸巾若干;标签纸若干。每个洗 手池常规配置烧杯刷、毛巾、洗手液。 四、实验操作 取新鲜植物叶片,洗净表面污物,用滤纸吸去表面水分。称取0.5g,剪碎,加入5~10ml蒸馏水,在研钵中磨成均浆,转入锥形瓶中,用蒸馏水少量多次冲洗研钵,洗出液也转入锥形瓶中,塑料薄膜封口,于沸水中提取30min,提取液冷却后过滤到100ml容量瓶中,同法残渣再提取2~3次,将提取液合并至容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度。贴好标签,保存至冰箱中,用于实验二。 五、实验结果与讨论 1、观察产品颜色是否与理论相符,若不符合,分析原因。 2、结合实验二结果计算含量 六、实验注意事项 (1)若有干扰,可滴加饱和中性醋酸铅以除去溶液中的蛋白质,乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质,若色素较多可脱脂。 (2)加热时应小心,避免灼伤皮肤。 七、思考题 1、可溶性糖在植物物质代中的作用。

生物化学实验习题及参考答案

生物化学实验习题及参考答案

生物化学实验习题及解答 一、名词解释 1、pI:指氨基酸的正离子浓度和负离子浓度相等时的pH值,用符号pI表示。 2、层析:按照在移动相和固定相(可以是气体或液体)之间的分配比例将混合成分分开的技术。 3、透析:通过小分子经过半透膜扩散到水(或缓冲 液)的原理,将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。 4、SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳:在去污剂十二烷基硫 酸钠存在下的聚丙烯酰氨凝胶电泳。SDS-PAGE 只是按照分子的大小,而不是根据分子所带的电荷大小分离的。 5、蛋白质变性:生物大分子的天然构象遭到破坏导 致其生物活性丧失的现象。蛋白质在受到光照,热,有机溶济以及一些变性济的作用时,次级键受到破坏,导致天然构象的破坏,使蛋白质的生物活性丧失。 6、复性:在一定的条件下,变性的生物大分子恢复成具有生物活性的天然构象的现象。

7、Tm 值:核酸分子变性过程中,紫外吸收达到最大增量一半时的溶解温度。 8、同工酶:能催发相同的反应类型但其理化性质及免疫学性质不同的酶。 9、Km值:反应速度为最大反应速度一半时的底物 浓度。是酶的特征物理学常数之一。近似表示酶与底物的亲和力。 10、DNA变性:DNA双链解链,分离成两条单链的现象。 11、退火:既DNA由单链复性、变成双链结构的过 程。来源相同的DNA单链经退火后完全恢复双 链结构的过程,同源DNA之间`DNA和RNA之 间,退火后形成杂交分子。 12、增色效应:当双螺旋DNA熔解(解链)时,260nm 处紫外吸收增加的现象。 二、基础理论单项选择题 1、A; 2、C; 3、B; 4、A; 5、A; 6、B; 7、B; 8、C; 9、D;10、A;11、A;12、D;13、A; 1、用下列方法测定蛋白质含量,哪一种方法需要完整的肽键?()

生物化学实验内容

《生物化学》实验教学大纲 课程类别:专业基础 适用专业:本科临床学专业 课程总学时:实验学时:32 实验指导书:生物化学与分子生物学实验教程 开课实验室名称:生化实验室 一、目的和任务 生物化学是一门在分子水平上研究生命现象的学科,也是一门重要的实验性较强的基础医学课程.随着医学的发展,该学科已渗透到医学的各个领域。生物化学实验技术已被广泛地应用于生命科学各个领域和医学实验的研究工作。生物化学实验是生物化学教学的重要组成部分,它与理论教学既有联系,又是相对独立的组成部分,有其自身的规律和系统。我们根据国家教委对医学生物化学课程基本技能的要求,开设了大分子物质的常用定量分析法、酶活性分析、电泳法、层析技术、离心技术及临床生化,使学生对生物化学实验有一个比较系统和完整的概念,培养学生的基本技能和科学思维的形成,提高学生的动手能力。 二、基本要求 1.通过实验过程中的操作和观察来验证和巩固理论知识,加深学生对理论课内容的理解。 2.通过对实验现象的观察,逐步培养学生学会观察,比较,分析和综合各种现象的科学方法,培养学生独立思考和独立操作的能力。 3.通过对各类实验的操作和总结,培养学生严谨的科学态度。 4.进行本学科的基本技能的训练,使学生能够熟练各种基本实验方法和实验技术的操作。 三、考试方法及成绩评定方法 四、说明 实验教材及参考书: 1.揭克敏主编:生物化学与分子生物学实验教程(第2版)。科学出版社,2010 参考资料: 1..袁道强主编:生物化学实验(第1版)。化学工业出版社,2011 五、实验项目数据表

2)要求:0:必修1选修 3)类型:0:演示1:验证2:综合3:设计 4)每组人数:指教学实验项目中一次实验在每套仪器设备上完成实验项目的人数。 六、各实验项目教学大纲 实验一蛋白质的沉淀反应 【预习要求】 预习四个小实验的具体实验原理和操作内容。 【实验目的】 1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识; 2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 【实验内容】 (一)蛋白质的盐折 1. 原理 大量中性盐类如硫酸铵((NH4)2SO4)、硫酸钠(Na2SO4)和氯化钠(NaCl)等加入到蛋白质溶液后,可引起蛋白质颗粒因失去水化膜和电荷而沉淀。各种蛋白质分子的颗粒大小和电荷数量不同,用不同浓度中性盐可使各种蛋白质分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中沉淀。当硫酸铵浓度达到饱和时血清中的白蛋白使沉淀下来。盐析沉淀蛋白质时能保持蛋白质不变性,加水稀释降低盐浓度,能使沉淀的蛋白质重新溶解,并保持其生物活性。因此,利用盐析法可达到分离提纯蛋白质的目的。 2. 操作步骤 ①取小试管1支、加入5%鸡蛋清溶液20滴,饱和硫酸铵溶液20滴,充分摇匀后静置5min,记录结果。

生物化学实验复习题库

生物化学实验复习题库 1、卵磷脂的提取原理: 卵磷脂在脑、神经组织、肝、肾上腺和红细胞中含量较多,蛋黄中含量特别丰富。卵磷脂易溶于醇、乙醚等脂溶剂,可利用这些脂溶剂提取。本实验用95%乙醇提取卵磷脂,用蒸汽浴分离乙醇和卵磷脂 2、卵磷脂的提取原理鉴定新提取得到的卵磷脂为白色蜡状物,与空气接触后因所含不饱和脂肪酸被氧化而呈褐色。卵磷脂中胆碱基在碱性条件中分解成三甲胺,三甲胺有特异的鱼腥臭味,可鉴别。 3、糖的颜色反应莫氏试验: 糖经无机酸(浓硫酸、浓盐酸)脱水产生糠醛或糠醛衍生物,后者在浓无机酸作用下,能与а-萘酚生成紫红色缩合物。因为糠醛或糠醛衍生物对此均呈阳性反应,故不是糖类的特异性反应,但可用来鉴定糖的存在。 4、糖的颜色反应塞氏试验: 酮糖在浓酸的作用下,脱水生成5-羟甲基糠醛,后者与间苯二酚作用,呈红色反应;有时亦同时产生棕红色沉淀,此沉淀溶于乙醇,成鲜红色溶液。此反应是酮糖的特异性反应,醛糖在同样条件下成色反应缓慢,只有在糖浓度高或煮沸时间长时,才微弱的阳性反应。在实验条条件下蔗糖有可能水解而呈阳性反应。塞氏试验可鉴别酮糖的存在。 5、何谓纸层析法? 纸层析是最简单的液一液相分配层析。滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时,大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附,因此,纸及其饱和水为层析的固定相,与固定相不相混溶的有机溶剂为层析的流动相。 因为不同的氨基酸在相同的溶剂中溶解度不同,所以利用在滤纸上迁移速度不同分离氨基酸 6.何谓Rf值?影响Rf值的主要因素是什么

Rf为氨基酸的比移值。Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶液前沿的距离 影响纸层析迁移率Rf值的主要因素:1、样品本身的性质和结构;2、溶剂的性质;3、PH 值;4、温度;5、滤纸性质。 7.怎样制备扩展剂? 8.层析缸中平衡溶剂的作用是什么? 9.牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 牛奶含有半乳糖、蛋白质、脂肪成分。蛋白质中的酪蛋白通过等电点沉淀,再通过离心而获得,糖类小分子由于处于清液中而分离,沉淀物中所含有的脂肪通过有机溶剂抽提而去除,最终得到纯白色、晶状酪蛋白。 方法:取新鲜牛乳,加入PH4.7的醋酸缓冲液,40度下沉淀析出酪蛋白,然后洗涤,醇醚吸水至干燥得粉末称重,计算提取率。步骤:保温→调PH→沉淀→离心→洗涤→干燥→称量 10.何谓蛋白质的等电点?有何实用意义? 蛋白质的等电点:指氨基酸的正离子浓度和负离子浓度相等时的pH值,用符号pI表示。 蛋白质同氨基酸一样为两性电解质,调节蛋白质的PH可使蛋白质带正电或带负电;在pI 时溶解度最低,在外加电场中蛋白质分子既不向正极移动也不向负极移动。 11、蛋白质变性与沉淀的关系。 沉淀可以是由蛋白质变性从而产生沉淀,也可以是由于盐析。蛋白质变性是指光照,热,有机溶济以及一些变性剂(如重金属盐)的作用时蛋白质的空间结构被破坏,使得蛋白质丧失活性,该过程不可逆。盐析是指向蛋白质的溶液中加入轻金属盐,使得蛋白质沉淀析出,这是由于加入盐降低了蛋白质得溶解度而析出,该过程可逆,加水蛋白质又会溶解。二者本质上是不同的。

生化实验报告模版

生物化学实验报告 姓名:郭玥 学号: 3120100021 专业年级: 2012级护理本科 组别:第8实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心

【实验报告第一部分(预习报告内容):①实验原理、②实验材料(包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材)、③实验步骤(包括实验流程、操作步骤和注意事项);评分(满分30分):XX】 实验目的:1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 实验原理:1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别, 可分离纯化各种蛋白质。 3、盐析法:盐析法是在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度或达饱和状态,可 使蛋白质在水中溶解度降低,从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后,由 于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质,致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃 至消失。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变,蛋白质表面的电荷 大量被中和,更加导致蛋白质溶解度降低,蛋白质分子之间聚集而沉淀。

4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆 的交换,利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 5、醋酸纤维素薄膜电泳原理:血清中各种蛋白质的等电点不同,一般都低于pH7.4。 它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷,在电场中向正极移动。由于血清中 各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同,因而在醋酸纤维素薄膜上电 泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白(Albumin)、α1-球蛋白、α 2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 实验材料:人混合血清葡聚糖凝胶(G-25)层析柱 DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液 醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸 1%BaCl 溶液氨基黑染色液 2 漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液 电泳仪、电泳槽 实验流程:盐析(粗分离)→葡聚糖凝胶层析(脱盐)→DEAE纤维素离子交换层析(纯化)→醋酸纤维素薄膜电泳(纯度鉴定) 实验步骤: (一)盐析+凝胶柱层析除盐:

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