GST pull-down assay
白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。
GST 和免疫共沉淀的区别
GST pull-down一般指用一个带GST tag的重组蛋白，与目的蛋白进行孵育，最后用结合GST的Beads拉下相互作用复合物。
co-IP一般是用某一蛋白的抗体，在细胞裂解液中与相应的蛋白结果，用Protein A/G将抗原抗体复合物拉下，最后在拉下的复合物中检测目的蛋白的实验。
二者都是用于检测蛋白相互作用的实验。区别是pull-down一般是验证in vitro 相互作用；co-IP一般用于检测细胞水平的in vivo相互作用。
特殊的，也有人在重组蛋白水平，利用抗原抗体的反应，来进行pull-down实验。但这种方法文献里用得很少，而且，该属于pull-down还是co-IP，本人没看到明确定义。
个人认为应该属于pull-down。
电子经纬仪操作步骤 经纬仪是测量工作中的主要测角仪器，由照准部、度盘、基座等部分组成。经纬仪根据度盘刻度和读数方式的不同，分为游标经纬仪，光学经纬仪和电子经纬仪。目前我国较为普遍使用的是电子经纬仪，游标经纬仪和光学经纬仪已逐渐淘汰。 下图为经纬仪各部件组成名称：
经纬仪的安置： 1 、架设仪器： 三脚架调成等长并使架头高度与观测者身高适宜，打开三脚架，使架头大致水平，将经纬仪固定在三脚架上，拧紧连接螺旋，置于测站点之上。 2 、对中： 对中就是使仪器的中心与测站点位于同一铅垂线上。用双手各提一条架脚前后、左右摆动，同时使架头大致保持水平状态，眼观对中标志（激光或十字丝交点）与测站点重合，同时使架头大致保持水平 状态，放稳并踩实架脚。
3 、整平： 整平的目的是使仪器竖轴铅垂，水平度盘水平。根据水平角的定义，是两条方向线的夹角在水平面上的投影，水平度盘一定要水平。（1）粗平：伸缩脚架腿，使圆水准气泡居中。同时检查对中标志是否偏离地面测站点。如果偏离了，旋松三角架上的连接螺旋，平移仪器基座使对中标志精确对准测站点的中心，拧紧连接螺旋并使圆水准气泡居中。 （2）精平：旋转照准部，使其水准管与基座上的任意两只脚螺旋的连线方向平行（图a）。双手同时相向转动两只脚螺旋，使水准管气泡居中；然后将照准部旋转90°(图b),旋转第三只脚螺旋，使气泡居中；如此反复进行，直到水准管在任何方向，气泡均居中为止。 4 、瞄准与读数: 首先将望远镜对向明亮的背景或天空，旋转目镜使十字丝变清晰；然后旋转照准部和望远镜，通过望远镜上的粗瞄准器大概瞄准目标，并将照准部和望远镜制动螺旋制紧；再旋转照准部和望远镜的微动螺旋照准目标，注意检查并消除视差。最后进行读数。
GST 表达融合蛋白 载体 pGEX-KG 大小：5006bp ，氨苄青霉素抗性（Amp r ），IPTG 诱导表达 酶切位点：BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、 HindIII 994 GST 分子量： 构建pGEX-KG-YFG 重组质粒 1、分析所感兴趣的基因（your favorite gene, YFG ） Primer Premier 5.0软件，分析YFG 含有哪些酶切位点，注意是否与pGEX-KG 载体的多克隆位点有重合 2、确定合适的双酶切位点
3、设计PCR上、下游引物 Primer Premier 5.0软件，设计PCR上、下游引物 酶切位点外最多含6个碱基 3’端不是A，最好是G或C，但是不推荐使用GC或CG结尾 3’端至少保证有10个碱基完全配对 得分（Rating）大于70 [注意] 上游引物：是否添加适当碱基，确保不打乱开放阅读框 下游引物：添加终止密码子（UAA、UAG、UGA） 4、引物合成及保存 合成：上海生工生物工程技术服务有限公司（Email：beijing@https://www.doczj.com/doc/064208885.html,，Tel：81767586）；纯化方法：柱层析or聚丙烯酰胺凝胶电泳？；价格1.30/碱基保存：贮存浓度：100pmol/μl（100μM），工作浓度：10pmol/μl（10μM），-20°C保存 5、PCR扩增YFG
模板：质粒10ng/μl稀释少量-20°C保存 引物：10pmol/μl（10μM）-20°C保存 Taq酶：NEB Quick-Load Taq 2×Master Mix 扩增片段小于2.0kb 反应条件 （1）预变性94°C 5 min （2）变性94°C 30 s （3）退火待定30 s （4）延伸72°C 待定 （5）重复2-5 25-30个循环 （6）补平缺口72°C 10 min （7）暂存10°C [注意] 退火温度：参考4（G+C）+2（A+T）－4（互补碱基），参考Ta Opt（Primer Premier 5.0）延伸时间：Taq酶：1kb/min 循环数小于30，减少错配 琼脂糖电泳检测PCR产物 0.8%有效分离范围：10~0.8kb；1.0%有效分离浓度7~0.5kb 50ml TAE加入5μl EB母液（5mg/ml） 100V，30-45min 拍照或者紫外灯下切胶回收 6、构建pGEX-KG-YFG 酶切：双酶切PCR产物、pGEX-KG 回收：PCR产物直接回收、pGEX-KG电泳之后切胶回收 连接：pGEX-KG 50ng、插入片段150ng 转化铺平板：Amp r 挑单克隆：Amp r（四个菌落足够了） 鉴定：小提质粒酶切or菌体PCR 7、转化BL21（DE3）pLysS菌株检测GST融合蛋白的表达 （1）冰上融化BL21（DE3）pLysS感受态细胞（天根） （2）2 ml离心管中，加入25μl BL21+ 3μl质粒（300-500ng），混匀（质粒≤感受态1/10）（3）冰上放置30min （4）42°C，90s
第三节经纬仪的使用 一、安臵仪器 安臵仪器是将经纬仪安臵在测站点上，包括对中和整平两项内容。对中的目的是使仪器中心与测站点标志中心位于同一铅垂线上；整平的目的是使仪器竖轴处于铅垂位臵，水平度盘处于水平位臵。 1．初步对中整平 （1）用锤球对中，其操作方法如下： 1）将三脚架调整到合适高度，张开三脚架安臵在测站点上方，在脚架的连接螺旋上挂上锤球，如果锤球尖离标志中心太远，可固定一脚移动另外两脚，或将三脚架整体平移，使锤球尖大致对准测站点标志中心，并注意使架头大致水平，然后将三脚架的脚尖踩入土中。 2）将经纬仪从箱中取出，用连接螺旋将经纬仪安装在三脚架上。调整脚螺旋，使圆水准器气泡居中。 3）此时，如果锤球尖偏离测站点标志中心，可旋松连接螺旋，在架头上移动经纬仪，使锤球尖精确对中测站点标志中心，然后旋紧连接螺旋。 （2）用光学对中器对中时，其操作方法如下： 1）使架头大致对中和水平，连接经纬仪；调节光学对中器的目镜和物镜对光螺旋，使光学对中器的分划板小圆圈和测站点标志的影像清晰。 2）转动脚螺旋，使光学对中器对准测站标志中心，此时圆水准器气泡偏离，伸缩三脚架架腿，使圆水准器气泡居中，注意脚架尖位臵不得移动。 2．精确对中和整平
（1）整平 先转动照准部，使水准管平行于任意一对脚螺旋的连线，如图3-7a 所示，两手同时向内或向外转动这两个脚螺旋，使气泡居中，注意气泡移动方向始终与左手大拇指移动方向一致；然后将照准部转动90°，如图3-7b 所示，转动第三个脚螺旋，使水准管气泡居中。再将照准部转回原位臵，检查气泡是否居中，若不居中，按上述步骤反复进行，直到水准管在任何位臵，气泡偏离零点不超过一格为止。 （2）对中 先旋松连接螺旋，在架头上轻轻移动经纬仪，使锤球尖精确对中测站点标志中心，或使对中器分划板的刻划中心与测站点标志影像重合；然后旋紧连接螺旋。锤球对中误差一般可控制在3mm 以内，光学对中器对中误差一般可控制在1mm 以内。 对中和整平，一般都需要经过几次“整平—对中—整平”的循环过程，直至整平和对中均符合要求。 二、瞄准目标 （1）松开望远镜制动螺旋和照准部制动螺旋，将望远镜朝向明亮背景，调节目镜对光螺旋，使十字丝清晰。 （2）利用望远镜上的照门和准星粗略对准目标，拧紧照准部及望远镜制动螺旋；调节物镜对光螺旋，使目标影像清晰，并注意消除图3-7 经纬仪的整平
GST融合蛋白的纯化步骤 一、制取细胞的裂解物： 1.每100ml培养物的细胞沉淀悬于4ml PBS缓冲液; 2.加入溶菌酶至最终浓度1mg/ml，冰上或冷藏放置30min; 3.用针筒将10ml0.2%TritonX-100强行注入细胞裂解物中，剧烈震动数次混匀； 4.加入DNase和RNase至终浓度5ug/ml,4℃震动并温育10min; 5.4℃3000g(5000r/min)离心30min; 6.上清转移到一只新试管，加入DTT至终浓度为1mmol/L; 二、纯化GST融合蛋白： 1.细胞裂解物与50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，每100ml细胞培养物加2ml树脂，于室温下轻摇30min; 2.混合物于4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 3.沉淀中加入10倍标准体积的PBS,颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白； 4.4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 5.重复步骤3和4两次； 6.结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，也可用凝血酶，肠激酶或Xa因子切割，释放靶蛋白； 三、用谷胱甘肽洗脱洗脱融合蛋白： 1.沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min,洗脱树脂上结合的蛋白； 2.4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清移至新管中; 3.重复步骤a和b两次，合并3次的上清； 四、蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶细胞： 1.在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶，肠激酶或Xa因子。每毫升树脂加入50单位1mlPBS 的蛋白酶，颠倒离心管数次混匀，室温下震荡2～16h,用小规模实验确定精确时间； 2.4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清小心移至新管中; 3.10%SDS-PAGE分析每一步（细胞抽提，洗涤和洗脱）样品的蛋白质组成。 五、谷胱甘肽琼脂糖树脂的处理： 1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆； 2.取部分匀浆放入15ml聚丙烯管（每100ml细菌培养物需要2ml匀浆）； 3.4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清; 4.在树脂中加入10倍柱床体积的冷的PBS,颠倒数次，混合匀浆，4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清； 5.每毫升树脂加入1ml冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，悬浮冰上放置待用。 查询关键词：GST融合蛋白的纯化步骤，GST蛋白纯化步骤，蛋白纯化 试验用的生化试剂，本公司均可以提供，如有需要，请联系我们，我们将为您提供最满意的服务。
经纬仪使用及操作的步骤（光学对中法） 1、架设仪器： 将经纬仪放置在架头上，使架头大致水平，旋紧连接螺旋。 2、对中： 目的是使仪器中心与测站点位于同一铅垂线上。可以移动脚架、旋转脚螺旋使对中标志准确对准测站点的中心。 3、整平： 目的是使仪器竖轴铅垂，水平度盘水平。根据水平角的定义，是两条方向线的夹角在水平面上的投影，所以水平度盘一定要水平。 粗平：伸缩脚架腿，使圆水准气泡居中。 检查并精确对中：检查对中标志是否偏离地面点。如果偏离了，旋松三角架上的连接螺旋，平移仪器基座使对中标志准确对准测站点的中心，拧紧连接螺旋。 精平：旋转脚螺旋，使管水准气泡居中。 4、瞄准与读数： ①目镜对光：目镜调焦使十字丝清晰。 ②瞄准和物镜对光：粗瞄目标，物镜调焦使目标清晰。注意消除视差。精瞄目标。 ③读数： 调整照明反光镜，使读数窗亮度适中，旋转读数显微镜的目镜使刻划线清晰，然后读数。 现在很多都是使用全站仪,全站仪的使用（以拓普康全站仪为例进行介绍）介绍: （1）测量前的准备工作
1）电池的安装（注意：测量前电池需充足电） ①把电池盒底部的导块插入装电池的导孔。 ②按电池盒的顶部直至听到“咔嚓”响声。 ③向下按解锁钮，取出电池。 2）仪器的安置。 ①在实验场地上选择一点，作为测站，另外两点作为观测点。 ②将全站仪安置于点，对中、整平。 ③在两点分别安置棱镜。 3）竖直度盘和水平度盘指标的设置。 ①竖直度盘指标设置。 松开竖直度盘制动钮，将望远镜纵转一周（望远镜处于盘左，当物镜穿过水平面时），竖直度盘指标即已设置。随即听见一声鸣响，并显示出竖直角。 ②水平度盘指标设置。 松开水平制动螺旋，旋转照准部360，水平度盘指标即自动设置。随即一声鸣响，同时显示水平角。至此，竖直度盘和水平度盘指标已设置完毕。注意：每当打开仪器电源时，必须重新设置和的指标。 4）调焦与照准目标。 操作步骤与一般经纬仪相同，注意消除视差。 （2）角度测量 1）首先从显示屏上确定是否处于角度测量模式，如果不是，则按操作转换为距离模式。 2）盘左瞄准左目标A,按置零键，使水平度盘读数显示为0°00′00〃，顺时针旋转照准部，瞄准右目标B，读取显示读数。
分子克隆第三版有详细介绍，结合其中的示意图很容易理解 GST融合蛋白沉降技术利用了GST对谷胧甘肤偶联球珠的亲和性，从非相互作用蛋白的溶液中纯化相互作用蛋白。GST融合的探针蛋白从细菌中表达和纯化，并平行制备细胞裂解液(可被35S标记或非标记)，再将GST融合蛋白探针和细胞裂解液在谷胧甘肤琼脂糖球珠存在下混合并孵育，以使蛋白结合。GST融合探针蛋白和任何结合分子被离心收集，获得的混合物经洗涤后，用过量游离的谷胧甘肤洗脱或直接在SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸。蛋白质经SDS-PAGE分离后进行下一步的western印迹、放射自显影及蛋白质染色分析。GST沉降技术对探测蛋白在溶液中的相互作用特别有用，而这种相互作用在膜的分析中可能是检测不到的。 GST沉降实验通常有两种应用:确定融合(或探针)蛋白与未知(或靶)蛋白间 新的相互作用(Kaelin et al. 1991, Grlinick and Chao 1996),以及证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用(例子请见Posern et al. 199$, Grgureaich et al. 1999, Hunteret al. 1999, Sun et al. 1999)。这两种实验的设计和实施都有所不同。
GST pull down 是一种在体外研究蛋白质相互作用的方法，基本原理是这样的：假定A蛋白和B 蛋白可能有相互作用，我们就将其中一个蛋白比如A蛋白融合GST标签，然后将GST-A和B以及能特异结合GST的Sephrose 4B beads 孵育一定时间，然后充分洗涤未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳，然后进行放射自显影（如果两个蛋白通过体外翻译并且S35标记的话），就可以看见GST-A和B分别对应的条带，表明GST-A和B因相互作用而被GST-A pull down，如果没有相互作用，就只有GST-A相对应的一条带。我们实验室就是这么做的，当然也有细菌表达GST-A蛋白，而B蛋白通过细胞裂解液中得到，电泳后直接western blot检测。 1、首先你的目的是“要检测这两种蛋白是否与寄主细胞之间存在相互作用”，也即是说要寻找这两种蛋白的相互作用蛋白---在寄主细胞表面，也就是说你要寻找的相互作用蛋白是膜蛋白，对吗？pulldown似乎不是达到你目的的最佳办法，因为你首先要提膜蛋白。而膜蛋白一般都疏水，量少，好像难以pulldown----缓冲液系统不适合。我想，你真正的目的是检测寄主细胞表面是否有你这两个蛋白的受体或配体，细胞ELISA应该可以胜任这个目的。其他方法你可以在查查看？ 2、如何保证你融合蛋白（细胞提取物）的尽可能大的活性，只有一条：快速、低温纯化。即，要保证你纯化过程尽量低温，时间尽量短，得到蛋白后立刻冻纯-70。当然，你还是有必要做下你蛋白活性到底丧失有多快。 3、如果你还是执意要做pulldown，最好还是直接买珠子，试剂盒太贵了，不划算。
经纬仪的操作步骤 1、HR—右旋（顺时针）水平角，HL—左旋（逆时针）水平角。 2、经纬仪的操作步骤（光学对中法） 1 、架设仪器： 将经纬仪放置在架头上，使架头大致水平，旋紧连接螺旋。 2 、对中： 目的是使仪器中心与测站点位于同一铅垂线上。可以移动脚架、旋转脚螺旋使对中标志准确对准测站点的中心。
3 、整平： 目的是使仪器竖轴铅垂，水平度盘水平。根据水平角的定义，是两条方向线的夹角在水平面上的投影，所以水平度盘一定要水平。 粗平：伸缩脚架腿，使圆水准气泡居中。 检查并精确对中：检查对中标志是否偏离地面点。如果偏离了，旋松三角架上的连接螺旋，平移仪器基座使对中标志准确对准测站点的中心，拧紧连接螺旋。 精平：旋转脚螺旋，使管水准气泡居中。 4 、瞄准与读数： ①目镜对光：目镜调焦使十字丝清晰。 ②瞄准和物镜对光：粗瞄目标，物镜调焦使目标清晰。注意消除视差。
精瞄目标。 ③读数： 调整照明反光镜，使读数窗亮度适中，旋转读数显微镜的目镜使刻划线清晰，然后读数。 现在很多都是使用全站仪，全站仪的使用（以拓普康全站仪为例进行介绍）介绍: （1）测量前的准备工作 1）电池的安装（注意：测量前电池需充足电） ①把电池盒底部的导块插入装电池的导孔。 ②按电池盒的顶部直至听到“咔嚓”响声。
③向下按解锁钮，取出电池。 2）仪器的安置。 ①在实验场地上选择一点，作为测站，另外两点作为观测点。 ②将全站仪安置于点，对中、整平。 ③在两点分别安置棱镜。 3）竖直度盘和水平度盘指标的设置。 ①竖直度盘指标设置。 松开竖直度盘制动钮，将望远镜纵转一周（望远镜处于盘左，当物镜穿过水平面时），竖直度盘指标即已设置。随即听见一声鸣响，并显示出竖直角。 ②水平度盘指标设置。
GST融合蛋白的纯化 诱导和收集菌体 在一定的诱导条件下IPTG诱导蛋白的合成。18～25℃的低温条件下培养可以使大部分蛋白融合蛋白可溶性表达，并保持较高的活性。IPTG浓度一般为 0.1～1.0mM。 5000rpm 5min离心收集菌体。 亲和层析柱的制备 取存放谷胱甘肽琼脂糖的瓶子颠倒数次，使其混匀，取1.5ml混合液加入层析柱中，加10ml 20％乙醇，使琼脂糖在柱中自然沉降。 将20％乙醇流尽后，加10ml PBS清洗柱子，待管中PBS液面刚好没过凝胶时，套上滴口的套子，待用。 每100ml菌液的菌体用4ml PBS（加1％Triton-100、蛋白酶抑制剂）悬浮。 在冰水中超声波破碎细胞（1分钟/次×5次，每次间隔1分钟）。 将裂解液分装至小管，4℃10000rpm离心5分钟。 收集上清液，加DTT至终浓度为1mM。 0.45um过滤后加入亲和层析柱。 室温下使混合液自然通过层析柱，保留0.5ml过滤液做PAGE电泳检测用。 用10ml PBS洗柱子3遍，每次临近结束时收集洗涤液0.5ml测OD值。 配制10mM的还原型谷胱甘肽溶液，即洗脱液3ml（0.009g溶于3ml 50mM Tris-Cl溶液中）。 用洗脱液洗脱GST融合蛋白，每管0.5ml接收洗脱液。 测各管洗脱液蛋白浓度。 PAGE电泳检测纯度。 亲和层析柱的再生：用0.04M NaOH洗10ml×3次，用10ml PBS平衡后，加20％乙醇储存于4度。或者按照beads使用说明书上的方法再生。 如果洗脱液中的还原型谷胱甘肽对实验有影响时，需用分子筛去除。 如果需要不带标签的蛋白，则蛋白被柱子吸附后，用蛋白酶进行切割；或者用分子筛过滤后，在筛子上进行酶切。
水 准 测 量 基本知识 1.水准测量原理 工程上常用的高程测量方法有几何水准测量、三角高程测量、GPS 测高及在特定对象和条件下采用的物理高程测量，其中几何水准测量是目前高程测量中精度最高、应用最普遍的测量方法。 如图2-1所示，设在地面A 、B 两点上竖立标尺（水准尺），在A 、B 两点之间安置水准仪，利用水准仪提供一条水平视线，分别截取A 、B 两点标尺上读数a 、b ，显然 A B H a H b +=+ A 、 B 两点的高差h AB 可写为 AB h a b =- A 点高程H A 已知， 求出 B 点高程 B A AB H H h =+ 我们规定A 点水准尺读数a 为后视读数，B 点水准尺读数b 为前视读数。 图 2-1 如果A 、B 两地距离较远时，可以用连续水准测量的方法。中间可设置转点TP （临时高程传递点，须放置尺垫），如图2-2所示 11h a =， 333h a b =-，……， n n n h a b =-。 123......AB n i h h h h h h =+++=∑
于是，可以求得A 、B 之间的高程差 AB i i h a b =-∑∑ B 点高程 B A AB H H h =+. 图 2-2 2.水准仪介绍： 水准仪是提供水平视线的仪器，按精度分，水准仪通常有DS 05、DS 1、DS 3等几种。其中“D ”和“S ”分别为“”和“水准仪”首字汉语拼音的首字母，而下标是仪器的精度指标，即每千米测量中的偶然误差（以mm 为单位）。目前常用的水准仪从构造上可分为两大类：利用水准管来获得水平视线的“微倾式水准仪”和利用补偿器来获得水平视线的“自动安平水准仪”。此外，还有一种新型的水准仪——“电子水准仪”，它配合条形码标尺，利用数字化图像处理的方法，可自动显示高程和距离，使水准测量实现了自动化。 水准仪主要由望远镜、水准器、基座三部分组成。 （1） DS 3微倾式水准仪 1.仪器介绍
制备细胞裂解物： 1.每100ml培养物的细胞沉淀悬于4ml PBS; 2.加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上放置30min; 3.用针筒将10ml 0.2%Triton X-100强行注入细胞裂解物中，剧烈震动数次混匀； 4.加入DNase和RNase至终浓度5ug/ml,4℃震动温育10min; 5. 4℃3000g(5000r/min)离心30min; 6.上清转移到一只新试管，加入DTT至终浓度为1mmol/L; 纯化融合蛋白： 7.细胞裂解物与50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，每100ml 细胞培养物加2ml树脂，于室温下轻摇30min; 8混合物于4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 9.沉淀中加入10倍标准体积的PBS,颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白； 10. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 11.重复步骤9和10两次； 12.结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，也可用凝血酶，肠激酶或Xa因子切割，释放靶蛋白； 用谷胱甘肽洗脱洗脱融合蛋白： a.沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min,洗脱树脂上结合的蛋白； b. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清移至新管中; c.重复步骤a和b两次，合并3次的上清； 蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶细胞： a.在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶，肠激酶或Xa因子。每毫升树脂加入50单位荣誉1mlPBS的蛋白酶，颠倒离心管数次混匀，室温下震荡2～16h,用小规模实验确定精确时间； b. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清小心移至新管中; 13.10%SDS-PAGE分析每一步（细胞抽提，洗涤和洗脱）样品的蛋白质组成。 谷胱甘肽琼脂糖树脂的处理： 1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆； 2.取部分匀浆放入15ml聚丙烯管（每100ml细菌培养物需要2ml匀浆）； 3. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清; 4.在树脂中加入10倍柱床体积的冷的PBS,颠倒数次，混合匀浆，4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清； 5.每毫升树脂加入1ml冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，悬浮冰上放置待用。
经纬仪的基本操作为：对中、整平、瞄准和读数。 （一）对中 对中的目的是使仪器度盘中心与测站点标志中心位于同一铅垂线上。操作步骤为： 张开脚架，调节脚架腿，使其高度适宜，并通过目估使架头水平、架头中心大致对准测站点。 从箱中取出经纬仪安置于架头上，旋紧连接螺旋，并挂上锤球。如锤球尖偏离测站点较远，则需移动三脚架，使锤球尖大致对准测站点，然后将脚架尖踩实。 略微松开连接螺旋，在架头上移动仪器，直至锤球尖准确对准测站点，最后再旋紧连接螺旋。 （二）整平 整平的目的是调节脚螺旋使水准管气泡居中，从而使经纬仪的竖轴竖直，水平度盘处于水平位置。其操作步骤如下： 1．旋转照准部，使水准管平行于任一对脚螺旋[如图3-7A ]。转动这两个脚螺旋，使水准管气泡居中。
2．将照准部旋转90°，转动第三个脚螺旋，使水准管气泡居中[如图3-7B] 图3-7 整平 3．按以上步骤重复操作，直至水准管在这两个位置上气泡都居中为止。使用光学对中器进行对中、整平时，首先通过目估初步对中（也可利用锤球），旋转对中器目镜看清分划板上的刻划圆圈，再拉伸对中器的目镜筒，使地面标志点成像清晰。转动脚螺旋使标志点的影像移至刻划圆圈中心。然后，通过伸缩三脚架腿，调节三脚架的长度，使经纬仪圆水准器气泡居中，再调节脚螺旋精确整平仪器。接着通过对中器观察地面标志点，如偏刻划圆圈中心，可稍微松开连接螺旋，在架头移动仪器，使其精确对中，此时，如水准管气泡偏移，则再整平仪器，如此反复进行，直至对中、整平同时完成。 瞄准 瞄准目标的步骤如下： 1．目镜对光：将望远镜对向明亮背景，转动目镜对光螺旋，使十字丝成像清晰。
主题：GST-pulldown 概述： GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术，近年来越来越受到广大学者的青睐。 其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白，“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。 目的： 体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。 原理： 利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。
步骤： １.Glutathione琼脂糖珠预处理； ２.GST融合蛋白挂柱：取适GST-融合蛋白与已经处理过的beads置于管中，4℃，摇床孵育过夜； ３.孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4℃，离心,上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上； ４.把转染目的基因的细胞裂解在细胞裂解液里（含蛋白酶抑制剂），最大转速4℃离心，收集上清液； ５.将细胞裂解液上清加入beads； ６.加上SDS上样缓冲液； ７.SDS-PAGE，Western Blot或者质谱仪分析。 流程图：
在这里经纬仪操作方法步骤详解图解添加日志标题 经纬仪操作方法步骤详解图解 步骤图解 1、连接螺旋:旋紧连接螺旋， 将仪器固定在三脚架上。 2、调节三脚架:将三脚架打开， 调节高度适中，三条架腿分别 处于测站周围。如果地面松软， 应将架腿踩实。 3、光学对中器:调节光学对中 器的目镜和物镜，使地面清晰 成像。
4、脚螺旋:调节脚螺旋，将仪器精确整平。 5、水平制动螺旋:旋紧水平制动螺旋，照准部被固定。望远镜无法在水平方向内转动。 6、水平微动螺旋:水平制动螺旋旋紧后，旋转水平微动螺旋，照准部在水平方向内微微转动。 7、竖直制动螺旋:旋紧竖直制动螺旋，望远镜被固定在支架上无法转动。
8、目镜调焦螺旋:转动目镜调焦螺旋，使十字丝清晰。 9、水平度盘反光镜:调整水平度盘反光镜，读书窗内数字明亮。 10、竖直度盘反光镜:调整竖直度盘反光镜，使读数窗内读数明亮。 11、读数显微镜：调节读数显微镜，使读书清晰。
12、配盘手轮:调整配盘手轮， 改变水平度盘读数。 水准仪操作步骤方法详解图解 发布: 2009-10-06 09:32 | 作者: admin | 查看: 4次水准仪操作步骤方法详解图解 步骤图解 1、安放三角架:调节三脚架腿至适当 高度，尽量保持三脚架顶面水平。如 果地面松软，应将架腿踩入土中。 2、连接螺旋:旋紧连接螺旋， 将水准仪和三脚架连接在一 起。
3、脚螺旋:调节脚螺旋，使圆水准气泡居中。 4、制动螺旋:旋紧制动螺旋，望远镜被固定。 5、水平微动螺旋:在制动螺旋旋紧后，调节水平微动螺旋，望远镜在水平方向内微小转动。 6、目镜调焦螺旋:调节目镜调焦螺旋，使十字丝清晰成像。
GST融合蛋白纯化方法 1目的片段接入pGEX载体； 2涂板，挑单克隆，摇菌至OD600≈1.0，加入IPTG（终浓度1 mM）诱导6－8 h； 3收菌，每升菌液约以50 mL PBS重悬，加入1%Triton X-100（v/v），1％β-巯基乙醇（v/v），PMSF（终浓度1 mM）； 以下步骤均在冰上操作： 4超声破碎菌体，15000 g，10min离心取上清，在上清中加入适量GST-beads，轻轻晃动令其吸附蛋白1 h； 5 2000 g，3min离心弃上清； 6加入至少10倍体积PBS，轻摇至beads悬浮于溶液中，2000 g，3 min离心弃上清； 7重复步骤6 两次； 8加入1 mL GST Elution Buffer，轻摇10 min； 92000 g，3 min离心，收集上清； 10重复步骤8-9至少两次； 11 SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，Bradford法检测蛋白浓度； 12将蛋白置于-20℃保存。 P.S. 大量提取前应取少量菌液，改变IPTG浓度，诱导温度，诱导时间等，以确定蛋白表达的最适条 Thrombin cleavage (using thrombin produced by Amersham) 1. Thrombin cleavage of eluted fusion protein bound to Sepharose * Mix 50 μl of thrombin (< 10 cleavage U/ml) solution and 950 μl of 1 x PBS for each ml of Glutathione Sepharose bed volume Add thrombin protease mixture to Glutathione Sepharose pellet Gently shake or rotate the suspension at r.t. for 2-16 h Centrifuge the suspension at 500 x g for 5’ to pellet the beads and carefully transfer the eluted fraction to a clean tube. 2. Thrombin cleavage of eluted fusion protein. Add 10 μl of thrombin solution (10 cleavage units) per mg fusion protein. If the amount of fusion protein in the eluate has not been determined, add 80 μl (80 U) of thrombin for each ml of Glutathione Sepharose bed volume from with the fusion protein was eluted. Mix gently and incubate at r.t. (22-25C) for 2-16 h. Once digestion is complete, GST can be removed by first removing glutathione by extensive dialysis (2,000 vol/ml) against 1 x PBS followed by batch purification.
电子经纬仪操作步骤经纬仪是测量工作中的主要测角仪器，由照准部、度盘、基座等部分组成。经纬仪根据度盘刻度和读数方式的不同，分为游标经纬仪，光学经纬仪和电子经纬仪。目前我国较为普遍使用的是电子经纬仪，游标经纬仪和光学经纬仪已逐渐淘汰。 下图为经纬仪各部件组成名称： 经纬仪的安置： 1 、架设仪器： 三脚架调成等长并使架头高度与观测者身高适宜，打开三脚架，使架头大致水平，将经纬仪固定在三脚架上，拧紧连接螺旋，置于测站点之上。 2 、对中： 对中就是使仪器的中心与测站点位于同一铅垂线上。用双手各提一条架脚前后、左右摆动，同时使架头大致保持水平状态，眼观对中标志（激光或十字丝交点）与测站点重合，同时使架头大致保持水平状态，放稳并踩实架脚。 3 、整平： 整平的目的是使仪器竖轴铅垂，水平度盘水平。根据水平角的定义，是两条方向线的夹角在水平面上的投影，水平度盘一定要水平。 （1）粗平：伸缩脚架腿，使圆水准气泡居中。同时检查对中标志是否偏离地面测站点。如果偏离了，旋松三角架上的连接螺旋，平移仪器基座使对中标志精确对准测站点的中心，拧紧连接螺旋并使圆水准气泡居中。
（2）精平：旋转照准部，使其水准管与基座上的任意两只脚螺旋的连线方向平行（图a）。双手同时相向转动两只脚螺旋，使水准管气泡居中；然后将照准部旋转90°(图b),旋转第三只脚螺旋，使气泡居中；如此反复进行，直到水准管在任何方向，气泡均居中为止。 4 、瞄准与读数: 首先将望远镜对向明亮的背景或天空，旋转目镜使十字丝变清晰；然后旋转照准部和望远镜，通过望远镜上的粗瞄准器大概瞄准目标，并将照准部和望远镜制动螺旋制紧；再旋转照准部和望远镜的微动螺旋照准目标，注意检查并消除视差。最后进行读数。 5、水平角测量 在建筑工程施工中，经纬仪主要用于水平角测量，下面只简单介绍一下经纬仪测量水平角的基本步骤： 如图所示： （1）安置经纬仪置于o点，精确调平仪器，使经纬仪处于水平角度测量模式，照准第一个目标A，制动。 （2）按置零键，设置A方向的水平度盘读数为0°00′00"。 （3）顺时针旋转望远镜，照准第二个目标B，制动。此时显示的水平度盘读数即为两方向间的水平夹角β。 竖直角的测量与水平角的测量方法一致，数值也同时显示，若要测量竖直角按上述方法操作，同时读取竖直角即可。 全站仪操作步骤
收稿日期:2007-12-22;修回日期:2008-01-11 作者简介:吴 爽(1979-),女,硕士,助教,教学和研究方向,细胞生物学,E 2mail:wushuang 21977@https://www.doczj.com/doc/064208885.html,;通迅作者:耿建国(1955-),男,博士,研究员,研究方向,细胞粘连与迁移。 GST 2talin1融合蛋白的原核表达及纯化 吴 爽 1,2 ,耿建国 2 (1广东药学院基础学院组织胚胎教研室,广州 510006;2中科院生化细胞研究所分子细胞生物学实验室,上海 200031) 摘 要:应用PCR 方法扩增talin1的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX 24T 21中,获取人源的GST 2talin1融合蛋白,为下阶段深入的研究talin1的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础。经酶 切、序列鉴定,选择正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),I PTG 诱导表达,用Glutathi one Sephar ose 4B 柱纯化,western bl ot 鉴定。克隆得到了一个2400bp 的talin1的c DNA 片断,重组质粒目的DNA 测序正确,纯化出分子量约为12116k D 的融合蛋白。用基因工程方法使GST 2talin1重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST 2talin1融合蛋白。 关键词:talin;P 2选凝素;GST 2融合蛋白;亲和层析中图分类号:Q51 文献标识码:A 文章编号:1008-9632(2008)03-0033-03 P -选凝素(P -selectin )是一种由细胞产生的粘附分子(adhesion molecules ),存在于细胞表面,能够介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合。其在炎症反应、凝血机制、甚至在某些肿瘤转移等方面发 挥重要作用[1] 。一直以来P 2selectin 受到许多研究者的青睐。P 2selectin 分子的特性到目前为止,人们已有较丰富的研究。本实验室以P 2selectin 的cyt op las m ic domain 为饵从人白细胞cDNA 文库中筛选到几个基因,经测序可知其中之一为talin1(从第1672个氨基酸残基到蛋白末端)。因此本试验利用重组DNA 技术,获得talin1的cDNA,构建了GST 2talin1融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白,为进一研究talin1与P 2selectin 是否存在相互作用及相互作用机制,奠定了基础。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 菌株、质粒 人源talin1的cDNA 及融合表达 载体pGEX 24T 21为实验室保存。DH5 α及BL21大肠杆菌感受态购自上海申能博采生物公司。1.1.2 生化试剂和分子生物学试剂 引物由上海生工生物有限公司合成,限制性内切酶、T 4DNA 连接酶购自Pr omega 公司,1kb DNA Marker 、DNA 片断快速纯化及回收试剂盒购自北京鼎国生物技术公司,PCR 试剂购自日本T AK ARA 公司,氨苄青霉素为上海华舜生 物公司产品。1.2 方法1.2.1 目的基因的扩增及纯化 根据已公布的人源talin1的cDNA 序列设计talin1的引物,上游引物T1的序列为5′23′at cag tag gaa ttc atg cg gga cct aga cca gg;下游引物T2的序列为5′23′ga agt cat ctc gag gtg ctc atc tcg aag ctc tg,在上下游引物中分别加入EcoR I 和XhoI 酶切位点。PCR 反应总体积为50 μL,包括ddH 2O 4015μL 、10×buffer 5μL 、4dNTP 1μL 、上下游引物各1μL 、模板1μL 、La Taq 酶015μL 。反应条件为:94℃2m in,94℃50s 、56℃50s,72℃2m in,72℃5m in,共35个循环。所获得的PCR 产物以1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将目的条带切下,用DNA 片断快速纯化回收试剂盒回收。1.2.2 pGEX 24T 212talin1重组质粒的构建 将纯化的PCR 产物和pGEX 24T 21载体用EcoR I 和XhoI 双酶切后,分别回收酶切产物。取回收后的talin1片断815 μL,载体片断015μL,10×T 4DNA 连接酶buffer 1μL,T 4DNA 连接酶013μL,16℃连接过夜。1.2.3 重组质粒的筛选和鉴定 将连接产物全量转 化入DH5 α感受态细菌,在含有氨苄青霉素(Amp )的LB 上37℃筛选培养过夜。次日挑取单个菌落,培养12h 后小量抽取质粒,用EcoR I 和XhoI 双酶切,筛选阳性重组质粒并送上海英骏生物技术有限公司测序。 3 3
经纬仪及角度测量 第一节 角度测量原理 角度测量包括水平角测量和竖直角测量，是测量的三项基本工作之一。角度测量最常用的仪器是经纬仪。水平角测量用于计算点的平面位置，竖直角测量用于测定高差或将倾斜距离改算成水平距离。 一、水平角测量原理 水平角是地面上一点到两目标的方向线投影到水平面上的夹角，也就是过这两方向线所作两竖直面间的二面角。用β表示，角值范围0o～360 o。如图3-1所示，设A 、B 、C 是任意三个位于地面上不同高程的点，B 1A 1、B 1C 1为空间直线BA 、BC 在水平面上的投影，B 1A 1与B 1C 1的夹角β就是为地面上BA 、BC 两方向之间的水平角。 为了测出水平角的大小，可以设想在B 点的上方水平地安置一个带有顺时针刻画、注记的圆盘，并使其圆心O 在过B 点的铅垂线上，有一刻度盘和在刻度盘上读数的指标。观测水平角时，刻度盘中心应安放在过测站点的铅垂线上，直线BA 、BC 在水平圆盘上的投影是om 、on ，此时如果能读出om 、on 在水平圆盘上的读数m 和n ，那么水平角β就等于m 减去n ，即n m -=β。 因此，用于测量水平角的仪器必须有一个能读数的度盘，并能使之水平。为了瞄准不同方向，该度盘应能沿水平方向转动，也能高低俯仰。当度盘高低俯仰时，其视准独应划出一竖直面，这样才能使得在同一竖直面内高低不同的目标有相同的水平度盘读数。 经纬仪就是根据上述要求设计制造的一种测角仪器。 图3-1 水平角测量原理 图3-2 竖直角测量原理 二、竖直角测量原理 竖直角是同一竖直面内视线与水平线间的夹角。角值范围为-90°～+ 90°。视线向上倾斜，竖直角为仰角，符号为正。视线向下倾斜，竖直角为俯角，符号为负。 竖直角与水平角一样，其角值也是度盘上两个方向读数之差。不同的是竖直角的两个方向中必有一个是水平方向。任何类型的经纬仪，制作上都要求当竖直指标水准管气泡居中，望远镜视准轴水平时，其竖盘读数是一个固定值。因此，在观测竖直角时，只要观测目标点一个方向并读取竖盘读数便可算得该目标点的竖直角，而不必观测水平方向。
GST标签蛋白纯化的GSH磁珠 产品组分 储存方法 保存于20%乙醇中，2-8℃保质期一年。切勿冻存。 (1). 还原型谷胱甘肽容易氧化，Elution Buffer要求现配现用；(2). 不同的GST融合蛋白与磁珠结合的强弱程度不同，对大部分的GST融合蛋白，使用含有10 mM还原性谷胱甘肽的Elution Buffer即可洗脱目标蛋白。对少数结合能力较强的GST融合蛋白，可以适当延 长洗脱时间，增加洗涤次数，或提高Elution Buffer中还原型谷胱甘肽的浓度。 (3). Binding Buffer和Elution Buffer中可以添加1~5mM EDTA，1~10mM DTT，0.1~1% Triton X-100，0.1~1% Tween 20等，以 提高目标蛋白的稳定性。A. 大肠杆菌、酵母等细胞内表达蛋白：表达细胞用适量Binding Buffer稀释，加入蛋白酶抑制剂（如Biotool Cat.# B14001）；冰浴 超声裂解细胞，即为粗蛋白样品。如果样品过于粘稠，可根据需要在 粗样品中加入适量核酸酶，在冰上放置30min，以降解核酸。另外，如果目标蛋白含量较低，建议将粗蛋白样品进行离心操作。 B. 胞外表达蛋白：取胞外表达上清，用等量Binding Buffer稀释平衡 ，即为粗蛋白样品。 C. 动物细胞胞内表达蛋白：取适量动物细胞，用适量PBS洗涤1次，弃上清；用适量含1%(v/v) Triton X-100或1%(v/v) NP-40的Binding Buffer重悬；加入蛋白酶抑制剂（如Biotool Cat.# B14001）；置于冰上10min，即为粗蛋白样品。一般情况下，磁珠的使用量是由用户根据目标蛋白产量和磁珠载量信息计算获得。例如：采用大肠杆菌表达某目标蛋白，250 mL发酵液收获1g湿重的菌体，通过预实验估算其目标蛋白产量为5～10mg，则需要取10 mL 10%(v/v)的磁珠悬液用于目标蛋白的纯化，以下即以此为例进行详细说明。 本手册提供以下三种样品的处理方法： 目标蛋白与磁珠的结合性能将直接影响目标蛋白的纯化效率，各种缓冲液配制也将在一定程度上影响目标蛋白的回收率和纯度。因此，在较大规模蛋白纯化之前，用户应该自行设计实验，筛选出适合目标蛋白的缓冲液，包括结合缓冲液(Buffer A )和洗脱缓冲液(Buffer B)。 以下提供一个较强结合力的GST标签蛋白的纯化流程，以供参考。 实验方法 1. 缓冲溶液配制 2. 样品处理 3. 磁珠预处理 A. Binding Buffer : 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2HPO 4, 1.8 mM KH 2 PO 4, pH 7.4 B. Elution Buffer : 50 mM Tris- HCl, 10 mM GSH, pH 8.0. Preparation Method: Add 0.307g GSH to 100 mL 0.1 M Tris- HCl, then adjust pH to 8.0 with 0.1 M HCl and add deionized water to a total volume of 100 mL.注： 1. Buffer Preparation 2. Sample Preparation 3. Magnetic beads pretreatment 4. Protein Binding 5. Washing 6. Elution 7. After treatment of magnetic beads 8. Regeneration of magnetic beads Magnetic Beads Cells/bacterium Target protein Other proteins Magnetic Separator Collect Supernatant Pipette Repeat Binding buffer Washing buffer Elution buffer 12 3