农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(1):32~36
*基金项目：国家重点基础研究发展计划（973）项目（No.2006CB102105）和北京市自然科学基金项目(No.5042017)资助。
**通讯作者。Author for correspondence.研究员，博导，主要从事动物分子遗传学研究。Tel:010-********,E-mail:
·研究论文
·小尾寒羊高繁殖力候选基因的研究*
周文然1,储明星2**,孙少华1,方丽2,叶素成2
(1.河北农业大学动物科技学院,保定071001；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100094)
摘要：采用PCR-SSCP 技术检测抑制素α（inhibin α，
）
基因5'调控区和外显子1在高繁殖力绵羊品种（小尾寒羊）以及低繁殖力绵羊品种（中国美利奴绵羊、考力代绵羊和南非肉用美利奴绵羊）中的单核苷酸多态性，同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。小尾寒羊、
中国美利奴绵羊和考力代绵羊在基因5'调控区发生了1处碱基突变（316C →T ），
南非肉用美利奴绵羊没有发生这种突变；突变纯合型（BB ）和突变杂合型（AB ）小尾寒羊平均产羔数分别比野生型（AA ）多1.45只（
<0.01）和0.90只（<0.01）。小尾寒羊和考力代绵羊在基因外显子1中发生了1处碱基突变(877T →C)，中国美利奴绵羊
和南非肉用美利奴绵羊没有发生这种突变；突变纯合型（DD ）和突变杂合型（CD ）小尾寒羊平均产羔数分别比野生型（CC ）多
1.32只
（<0.01）和0.77只（<0.01）。研究结果初步表明基因可能是影响小尾寒羊高繁殖力的一个主效基因或是与之
存在紧密遗传连锁的一个分子标记。
关键词：绵羊；高繁殖力；抑制素α亚基基因；PCR-SSCP 中图分类号：S188
文献标识码：A 文章编号：1006-1304(2007)01-0032-05
A Candidate Gene for Prolificacy of Small Tail Han Sheep
ZHOU Wen-ran,CHU Ming-xing 2**,SUN Shao-hua 1,FANG Li 2,YE Su-cheng
2
nucleotide polymorphisms of 5'regulatory region and exon 1of the inhibin α
gene were detected in high fecundity breed (Small Tail Han sheep)and low fecundity breeds （Chinese Merino sheep,Corriedale sheep and South African Mutton Merino sheep ）by PCR-SSCP.Sequencing revealed a mutation （316C →T ）in 5'region of
gene in Small Tail Han sheep,
Chinese Merino sheep and Corriedale sheep,not in South African Mutton Merino sheep.In Small Tail Han sheep,Chinese Merino sheep,Corriedale sheep and South African Mutton Merino sheep,frequency of genotype AA was 0.58,0.98,0.96,1.00,frequency of genotype AB was 0.40,0.02,0.04,0.00,frequency of genotype BB was 0.02,0.00,0.00,0.00,respectively.The ewes with mutation homozygous genotype BB or mutation heterozygous genotype AB had 1.45(<0.01)or 0.90(<0.01)lambs more than those with wild type AA in Small Tail Han sheep,respectively.Sequencing revealed a mutation （T →C ）at 877bp of exon 1of
gene in
Small Tail Han sheep and Corriedale sheep,not in Chinese Merino sheep and South African Mutton Merino sheep.In Small Tail Han sheep,Chinese Merino sheep,Corriedale sheep and South African Mutton Merino sheep,frequency of genotype CC was 0.74,1.00,0.89,1.00,frequency of genotype CD was 0.25,0.00,0.11,0.00,frequency of genotype DD was 0.01,0.00,0.00,0.00,respectively.The ewes with mutation homozygous genotype DD or mutation heterozygous genotype CD had 1.32(<0.01)or 0.77(<0.01)lambs more than those with wild type CC in Small Tail Han sheep,respectively.These results preliminarily show that the gene
is a major gene that influences the prolificacy in Small Tail Han sheep or a molecular genetic marker closely linkaged with
it.
sheep ；prolificacy ；inhibin αgene ；PCR-SSCP
抑制素(inhibin ，INH)是一种由性腺分泌的二聚
糖蛋白，Mason (1985)已鉴别出两种抑制素，
具有共同的α亚基和不同的β亚基（βA 和βB ）。绵羊抑制素α亚基（inhibin α，）基因已被定位到染
色体2q41→q43(Brunner .,1995)。性腺是体内抑制素的主要来源，抑制素能有效抑制垂体促卵泡素
第1期周文然等:小尾寒羊高繁殖力候选基因的研究
表1PCR 扩增的引物序列
Table 1Sequences of primers used in PCR amplification
1)对应于GenBank U16237的位置。1)Locations are corresponding to in U16237GenBank.
引物Primer 引物1Primer 1引物2Primer 2引物3Primer 3引物4Primer 4
序列(5'→3')Sequence
F:GACACAGCTGGAGAACAAGAG R:AGGGAGACAGAGCAAGCCAG F:CTGGCTTGCTCTGTCTCCC R:CTGAGCCTTATCTCCCACTC F:GAGTGGGAGATAAGGCTCAG R:GAAGCCACATAGCTCCCCTG F:CAGGGGAGACTATGTGGCTTC R:CTGCAGCCGGAAAAAGGATG
扩增区域Amplified region
5'调控区5'regulatory region 外显子1Exon 1位置1)/bp Location 34～221（188）202～427（226）428～656（229）637～908（272）
的合成与分泌(Medhamurthy .,1987;Voglmayr
.,1992;Woodruff .,1996)，还能影响精子的发生(Sarvamangala ,1983)。基因与女性
卵巢早衰显著相关(Marozzi
.,2002;Shelling .,2000)，对绵羊产羔数有显著影响(Hiendleder
,1996a;Jaeger 和Hiendleder,1994)。可见，
抑制素显著影响哺乳动物的繁殖。
山东小尾寒羊平均产活羔数为2.61，中国美利奴绵羊的平均产羔数为1.17～1.28，考力代绵羊的
平均产羔数为1.21～1.30(《中国羊品种志》
编写组，1989)。本研究以高繁殖力绵羊品种（小尾寒羊）以及
低繁殖力绵羊品种
（中国美利奴绵羊、考力代绵羊、南非肉用美利奴绵羊）为实验材料，采用单链构象多态（single strand conformation polymorphism ，SSCP ）方法对抑制素α亚基基因的5'调控区以及外显子1进行单核苷酸多态性（single nucleotide polymor-phism,SNP ）检测，以比较该基因在不同绵羊品种中
的多态性，
并对其SSCP 多态性的DNA 片段进行测序比较分析，旨在寻找与产羔数相关的遗传标记，为绵羊高繁殖力的标记辅助选择提供科学依据。
1材料和方法
1.1实验材料
具有第1胎和第2胎产羔数记录的小尾寒羊124只母羊血样采自山东省嘉祥种羊场；考力代绵羊
28只母羊、
南非肉用美利奴绵羊30只母羊血样采自山西省晋城市沁水示范牧场；中国美利奴绵羊60只母羊血样采自新疆生产建设兵团农八师紫泥泉种羊场。颈静脉采血，所采血样均为10mL ／只，用柠檬酸葡萄糖抗凝，-20℃冻存。用酚氯仿抽提法提取基因组DNA ，溶于TE buffer (10mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),1mmol/L EDTA (pH 8.0))，4℃保存。1.2主要试剂
DNA 聚合酶、dNTP 、pGEM-T Easy 载体、
DNA 片段回收纯化试剂盒、
质粒提取纯化试剂盒等均购自北京鼎国生物技术有限公司。1.3引物设计和PCR 扩增
根据Thompson
(1994)发表的牛抑制素α亚基基因5'调控区以及外显子1共908bp 的序列(GenBank 登录号U16237)设计4对引物，其中前3
对引物扩增绵羊抑制素α亚基基因5'调控区，
引物4扩增绵羊抑制素α亚基基因外显子1。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。引物序列见表1。
PCR 扩增反应总体积为25μL,其中50ng/μL DNA 模板3μL ，10×缓冲液2.5μL ，2mmol/L dNTP 2.5μL ，20mmol/L 的Mg 2+1.5～2.0μL,引物添加量
见表2，DNA 聚合酶为1U 。引物2、
3反应条件：94℃预变性8min ；94℃变性45s,62℃退火45s ，72℃延伸45s ，33个循环；最后72℃延伸10min ，4℃保存。引物1、4的PCR 扩增采用了Touchdown PCR 程序。引物1的Touchdown 程序为：94℃预变性8min ；94℃变性45s ，退火温度从
65℃开始，每2个循环降1℃，降至57℃，57℃退
火,17个循环，退火45s ，各循环72℃延伸45s ，最后72℃延伸8min ；4℃保存；引物4的Touchdown 程序为：94℃预变性8min ；94℃变性45s ，退火温度从63℃开始，每2个循环降1℃，降至57℃，57℃退火,23个循环，退火45s ，各循环72℃延伸45s ，最后72℃延伸8min ；4℃保存。产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。1.4SSCP 分析
取2μL PCR 产物置于PCR 管中，加5μL 上样缓冲液（98%甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯氰、10mmol/L EDTA （pH 8.0）和10%甘油），离心混匀，98℃变性10min ，迅速插入冰中，放置5
min ，使之保持变性状态。
变性后PCR 产物在非变性33
农业生物技术学报2007年
聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel，PAG）中电泳。置于4℃冰箱中电泳14h后银染显色。用AlphaImager TM2200and1220Documentation and Analysis Systems(Alpha Innotech Corporation,San Leandro,CA,USA)拍照和分析。电泳条件见表2。
表24对引物的PCR-SSCP分析条件
Table2The conditions of PCR-SSCP analysis for
four pairs of primers
1.5克隆测序
对SSCP分析后不同基因型纯合体的PCR产物用DNA片段快速纯化回收试剂盒纯化，回收后的DNA片段用pGEM-T Easy载体连接，并转化大肠杆菌（）DH5α菌株，酶切鉴定后在PE377测序仪上测序。测序反应由北京鼎国生物技术有限公司完成。
1.6数据统计分析
配合下列模型进行最小二乘方差分析，比较小尾寒羊产羔数在基因型之间的差异（对引物2和引物4基因型单独进行分析）：
其中：为产羔数的记录值；μ为群体均值；
为第个场年季的固定效应；为第个胎次的固定效应；为第种基因型的固定效应；为随机残差效应。用SAS（6.12版本）的GLM(general linear model)过程完成。
2结果
2.1PCR扩增
所设计的4对引物用于PCR扩增都获得了特异性的产物，片段长度与预期大小一致，并且没有非特异性扩增条带，可以直接进行SSCP分析。4对引物的扩增结果见图1。
2.2SSCP检测
对4对引物扩增的PCR产物分别进行SSCP 分析，发现引物1和引物3扩增片段没有多态性，引物2和引物4扩增片段有多态性。引物2扩增片段有3种基因型，分别定义为AA、AB和BB（图2），引物4扩增片段也有3种基因型，分别定义为CC、CD和DD（图3)。
图1.4对引物的PCR产物电泳结果
Fig.1.PCR products of four pairs of primers
1and2,primer1；3and4,primer2；5and6,primer3；7and8,primer4；
M,SD002DNA marker.
图2.引物2对不同绵羊品种扩增片段的SSCP分析Fig.2.SSCP analysis of PCR amplification using primer2in
different sheep breeds
1and2,AB genotype;3and5,AA genotype;4and6,BB genotype.
图3.引物4对不同绵羊品种扩增片段的SSCP分析Fig.3.SSCP analysis of PCR amplification using primer4in
different sheep breeds
1,2and5,CD genotype;3,CC genotype;4,DD genotype.
2.3序列分析结果
取引物2的AA和BB两种基因型的PCR产物进行克隆测序，结果发现AA型与GenBank U16237序列一致，定义为野生型，而在BB型的测序图中发现第316bp处有一个C→T的单碱基突变（图4）。
取引物4的CC和DD两种基因型的PCR产物进行克隆测序。将CC型定义为野生型，DD型与CC型相比在第877bp处有一个T→C的单碱基突变(图5)。
引物
Primer
引物终浓度/mmol/L Primer working concentration Mg2+终浓度/mmol/L
Mg2+working concentration 聚丙烯酰胺凝胶交联度Acr:Bis
聚丙烯酰胺凝胶浓度/% Concentration of PAG
电压/V Voltage 引物1
Primer1
1.8
1.5
29∶1
10
160
引物2
Primer2
1.5
1.8
29∶1
12
170
引物3
Primer3
1.5
1.5
29∶1
12
170
引物4
Primer4
1.8
2.0
49∶1
10
140
34
第1期周文然等:小尾寒羊高繁殖力候选基因的研究
图4.基因引物2的AA 和BB 基因型316bp 处突变的测序峰图
Fig.4.Sequences of AA and BB genotypes of
mutation at 316bp of
gene
2.4不同绵羊品种基因型频率和等位基因频
率分析
对小尾寒羊、
中国美利奴绵羊、考力代绵羊和南非肉用美利奴绵羊进行了
基因型检测，计算了不同绵羊品种的基因型频率和等位基因频率，
统计结果见表3。
2.5
基因引物2和引物4不同基因型的小尾寒羊产羔数的最小二乘均值及标准误
基因引物2和引物4不同基因型的小尾
寒羊产羔数的最小二乘均值及标准误见表4。
图5.基因引物4的CC 、DD 基因型877bp 处突变的测序峰图
Fig.5.Sequences of CC and DD genotypes of mutation
at 877bp of
gene
由表4可知，对于引物2，突变纯合型
（BB ）和突变杂合型（AB ）小尾寒羊平均产羔数分别比野生型（AA ）多1.45只（<0.01）和0.90只（<0.01），B 等位基因与小尾寒羊高产羔数呈显著正相关。对于
引物4，突变纯合型（DD ）和突变杂合型（CD ）小尾寒羊平均产羔数分别比野生型（CC ）多1.32只（
<0.01）和0.77只（<0.01），D 等位基因与小尾寒羊高产羔数呈显著正相关
。
表34个绵羊品种
基因的等位基因频率和基因型频率
Table 3Allele and genotype frequencies of INHA gene in four sheep breeds
括号内的数字是个体数。The numbers in the brackets are the related genotype individuals.
引物2Primer 2
引物4Primer 4
品种数量等位基因频率基因型频率数量等位基因频率基因型频率Breed N Allele frequency Genotype frequency N Allele frequency Genotype frequency
A
B AA AB BB
C
D CC CD DD 小尾寒羊
Small Tail Han sheep 中国美利奴绵羊Chinese Merino sheep 考力代绵羊Corriedale sheep 南非肉用美利奴绵羊
South African Mutton Merino sheep
124
60
28
30
0.78
0.99
0.98
1.00
0.22
0.01
0.02
0.00
0.58(72)0.98(59)0.96(27)1.00(30)
0.40(50)0.02(1)0.04(1)0.00(0)
0.02(2)0.00(0)0.00(0)0.00(0)
120
60
28
30
0.87
1.00
0.95
1.00
0.13
0.00
0.05
0.00
0.74(89)1.00(60)0.89(25)1.00(30)0.25(30)0.00(0)0.11(3)0.00(0)
0.01(1)0.00(0)0.00(0)0.00(0)
3讨论
3.1绵羊基因的多态性
在绵羊中，已发现具有遗传多态性(Hiendleder .,1996b;Jaeger 和Hiendleder,1994)。本研究在基因5'调控区发现1处碱基突变(316C →T)，只在高繁殖力的小尾寒羊中发现突
变纯合基因型BB ；在基因外显子1中发现1
处碱基突变(877T →C)，也只在高繁殖力的小尾寒羊
中发现突变纯合基因型DD 。这是否预示这些突变纯合基因型与绵羊高产羔数呈正相关，值得在增加
绵羊品种数、
扩大样本数、进行标记与产羔性能关联分析等方面作进一步研究。3.2基因与绵羊产羔数的关系
鉴于抑制素在FSH 反馈调节中的作用以及在卵巢内起生长因子的作用，抑制素基因被提出作为
35
农业生物技术学报
2007年
繁殖性能的候选基因（薛昱等，2004）。Hiendleder (1996a)报道基因对绵羊产羔数有显著影响，391只Merinolandschafe 母羊1585窝产羔数动物模型分析显示该基因替代效应达到0.08只羔羊。Jaeger 和Hiendleder(1994）对1000次产羔记录的初
步统计分析表明
对绵羊产羔数具有显著的基因效应。本研究结果初步表明基因可能是影响小尾寒羊高繁殖力的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的一个分子标记，可以用于对绵羊产羔数的辅助选择。
表4
不同基因型小尾寒羊产羔数的最小二乘均值及标准误
Table 4Least squares mean and standard error for litter size of different genotypes of
gene in Small Tail Han sheep
同一引物具有不同字母肩标的平均值间差异极显著(<0.01)。Least square means with the different superscripts for the same pair of
primer differ significantly (<0.01).
引物Primer 引物2Primer 2
引物4Primer 4
基因型Genotype AA AB BB CC
CD DD
样本数No.of samples 7250289301
最小二乘均值及标准误Least squares mean ±standard error 1.45±0.15b 2.35±0.25a 2.90±0.32a 1.63±0.13b 2.40±0.17a 2.95±0.29a
参考文献
Brunner R M,Goldammer T,Hiendleder S,Jager C and Schwerin https://www.doczj.com/doc/0a4744162.html,parative mapping of the gene coding for inhibin-α(
)to chromosome 2in sheep and cattle （J ）.,1995,6(4):309～311
Hiendleder S,Lewalski H,Jaeger C,Pracht P and Erhardt G.Nucleotide sequence of ovine [alpha]-inhibin ()genes
and evaluation of RFLP marker effects on reproductive
performance （J ）.,1996a,27(Suppl.2):
91～92
Hiendleder S,Leyhe B,Jaeger C,Erhardt G and Wassmuth R.Molecular
characterization
of
ovine
α-,
βA -and
βB -inhibin/activin alleles （J ）
.1996b,113:363～372
Jaeger C and Hiendleder S.Cosmid cloning and characterization of the coding regions and regulatory elements of the ovine α-(
),βA -(
)and βB -inhibin ()genes （J ）.
,1994,25(Suppl.2):33
Marozzi A,Porta C,Vegetti W,Crosignani P G,Tibiletti M G,Dalpra L and Ginelli E.Mutation analysis of the inhibin αgene in a cohort of Italian women affected by ovarian failure （J ）.
,2002,17(7):1741～1745
Mason A J,Hayflick J S,Ling N,Esch F,Ueno N,Ying S Y,Guillemin R,Niall H and Seeburg P https://www.doczj.com/doc/0a4744162.html,plementary DNA sequences of ovarian follicular fluid inhibin show precursor structure and homology with transforming growth factor-beta （J ）.
1985,318(6047):659～663
Medhamurthy R,Carruthers T D and Manns J G.Effects of bovine follicular fluid inhibin on serum gonadotrophin
concentrations in ewes during oestrus （J ）.
，1987,81(1):91～98
Sarvamangala B S,Krishnan K A,Jayaraman S and Sheth A R.Effect of chronic administration of inhibin and testosterone on spermatogenesis in adult male rats (J).
，1983,10(3):233～238
Shelling A N,Burton K A,Chand A L,van Ee C C,France J T,Farquhar C M,Milsom S R,Love D R,Gersak K,Aittomaki K and Winship I M.Inhibin:A candidate gene for premature ovarian failure （J ）.,2000,15(12):
2644～2649
The Editorial Section of The Sheep and Goat Breeds in China (《中国羊品种志》编写组).The Sheep and Goat Breeds in China （M ）.Shanghai:Shanghai Science and Technology Press,1989.50～52,70～73,80～81(in Chinese)
Thompson D A,Cronin C N and Martin F.Genomic cloning and sequence analyses of the bovine alpha-,beta A-and beta B-inhibin/activin genes.Identification of transcription factor AP-2-binding sites in the 5'-flanking regions by DNase I foot-printing （J ）.,1994,226(3):751～764
Voglmayr J K,Jolley D,Vale W,Willoughby D,Moser A,So C K,Chen C L and Bardin C W.Effects of follicle-stimulating hormone on inhibin release by different testicular compart-ments in the adult ram （J ）.1992,47(4):573～581
Woodruff T K,Besecke L M,Groome N,Draper L B,Schwartz N B and Weiss J.Inhibin A and inhibin B are inversely cor-related to follicle-stimulating hormone,yet are discordant during the follicular phase of the rat estrous cycle,and inhibin A is expressed in a sexually dimorphic manner （J ）.
1996,137(12):5463～5467
Xue Y(薛昱),Chu M X(储明星)and Zhou Z X(周忠孝).Ad-vances on inhibin genes （J ）.
(Beijing)(遗传)，
2004，26(5):749～755(in Chinese with English abstract)
36