湖南大学
硕士学位论文
甘油发酵生产1，3-丙二醇的菌种筛选及培养基优化研究
姓名：张志强
申请学位级别：硕士
专业：环境工程
指导教师：刘云国
20090420
摘要
ｌ，３一丙二醇（１，３－ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ，简写为１，３一ＰＤＯ）是一种重要的化工原料，可以作为单体来生产聚酯、聚醚、聚酰胺等聚合物，市场空问巨大。尤其是以１，３一丙二醇为单体合成的聚酯材料Ｐ，ｒＴ，因具有良好的弹性、耐污染性、良好的着色性和良好的生物降解性等受到越来越多的关注，也为ｌ，３一丙二醇的大规模生产展示了美好的前景，从而使１，３一丙二醇的研究与开发越来越受到人们的重视。在能源日益紧缺的今天，研究以可再生资源为原料生产生物柴油，对环境污染小，副产物甘油用于微生物转化法生产ｌ，３一丙二醇具有积极的现实意义。随着发展中国家植物油产量的大幅度提高和在化工中的大量使用，甘油在世界市场上将逐步过剩并且价格下降，使开发利用生物技术将甘油作为底物转化为高价格的产品（如１，３一丙二醇）成为瞩目的焦点。
本实验采用的粗甘油来自利用光皮树制取生物柴油的副产物。光皮树制取生物柴油的过程中将大量产生甘油，为了更好的利用甘油，将其转化为高价格的产品（如ｌ，３一丙二醇），本实验从光皮树林土壤中诱集分离筛选得到８株形态特征不同的菌体。通过摇瓶培养后进行气相色谱测定得到一株效果较好的发酵甘油生产１，３一丙二醇细菌ｓｘ７。
对菌体ｓｘ７进行形态特征观察、生理生化等实验发现该菌为革兰氏阳性菌，无芽孢，兼性厌氧菌，接触酶阴性。再根据精氨酸产氨，淀粉水解、明胶液化和生长条件等实验初步判定该菌为肠道细菌。
将该肠道细菌ｓｘ７进行好养培养９６ｈ、厌氧培养９６ｈ、先好氧后厌氧（各４８ｈ）培养，发现在完全厌氧的条件下，该菌产量为最高，为１７．１８９／Ｌ，转化率为５２．００９６。为了使得该菌株歧化甘油生产ｌ，３一丙二醇的产量得到提升，对其培养条件中微量元素、有机盐、无机盐、发酵ｐＨ、培养时间、培养温度等进行了系统研究。确定最佳发酵培养基是：甘油４０．ＯＯｇ／Ｌ，ＫＨｚＰ０４０．５０ｇ／Ｌ，ＫｚＨＰＯ。?３Ｈ：０１．００ｇ／Ｌ，（ＮＨ。）。Ｓ０４３．００ｇ／Ｌ，ＣａＣｌｚ?２ＨｚＯ０．０２ｇ／Ｌ，ＣａＣＯ。２．ＯＯｇ／Ｌ，酵母粉３．ＯＯｇ／Ｌ，微最元素溶液４ｍｌ／Ｌ，Ｆｅ。ＳＯ。５．ＯＯｍｇ／Ｌ，ＭｇＳ０４?７Ｈ：００．０５９／Ｌ。该菌株１，３－ＰＤＯ产量为２５．０３９／Ｌ，对甘油的转化率达至ｗ］７５．７６％。较之优化前，产量提升了７．８５９／Ｌ，转化率提升了２３．７６％。
关键词：１，３一丙二醇；甘油；肠道细菌；培养基优化
甘油发酵生产ｌ，３一丙二醇的菌种筛选及培养基优化研究
由于其成本较高，是其它二醇的十几倍以至几十倍，工业用途相对也较少，并未受到人们的重视。２０世纪９０年代中期，工业上成功的开发出了以１，３～丙二醇为原料的新型聚酯材料聚对苯二甲酸丙二醇酯（ＰＴＴ），ＰＴＴ具有良好的加工性能、电气性能、机械性能和尺寸的稳定性，保持了ＰＥＴ纤维的优良的抗皱性和耐化学性，其强度能够满足纺织要求。此外，它还具有优良的柔软性、抗日光性、耐污性、低静电性、低吸水率等。其优良的性能和潜在的易回用性使其在服饰材料、地毯材料、工程塑料、薄膜材料等领域具有非常广阔应用前景。国家化纤部门己将发展ＰＴＴ纤维列入合成纤维产品结构调整规划中。
在甘油生物转化为ｌ，３一丙二醇的生产成本中，原料占有较高的比重，利用廉价光皮树副产物甘油作为原料将会较大的降低原料成本，使发酵法生产１，３一丙二醇在生产条件、生产成本及环境保护等方面与化学法相比均具有较强的优势，从而具有更强的市场竞争力。本文对不同的培养基条件下发酵甘油生产１，３一丙二醇进行了研究，考察了不同培养基条件下发酵甘油对肠道菌厌氧发酵生产ｌ，３一丙二醇的影响。
１．２１，３一丙二醇的技术发展史及生产情况
１．２．１１，３一丙二醇的技术发展史
１９４８年，美国Ｓｈｅｌｌ公司就申请了以丙烯醛水合路线合成ｌ，３一丙二醇的专利，并在２０世纪六七十年代，将此专利进行了产业化实施。
１８８１年，Ｆｒｅｕｎｄ发现巴斯德梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）能发酵甘油产生ｌ，３一丙二醇。
ｌ９９１年，ＰＴＴ聚酯产品在欧洲实现工业化生产，当时１，３一丙二醇的价格为￥３０／ｋｇ。
ｌ９９５年，德国Ｄｅｇｕｓｓａ公司成功的开发出以丙烯醛为原料合成１，３一丙二醇的工艺。其成本与乙二醇大致相当，并在比利时建成２０００吨／年中试装置；并于１９９６年兴建５万吨／年的工业化生产装置，其产品用于生产新型聚酯纤维ＰＴＴ和聚酯涂料。
ｌ９９６年，荷兰的Ｓｈｅｌｌ公司以环氧乙烷为原料生产出成本较低的１，３一丙二醇；我国科研单位从这一年开始关注ｌ，３一丙二醇的生产技术发展。
ｌ９９７年我幽丌始同ＤｕＰｏｎｔ等圈外公ｒｄ进行技术转让谈判，但遭到拒绝。
ｌ９９８年，Ｄｅｇｕｓｓａ公司计划生产ｌ，３一丙二醇９０００吨／年，Ｓｈｅｌｌ公司计划在原有的年产３６００吨的基础上扩大到７．２力．吨／年，美国ＤｕＰｏｎｔ公司也准备建一个年产５力．吨的ｌ，３～丙二醇生产厂‘４１；我国可以向固外企业高价进Ｖ１ｌ，３一丙二醇，
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国内大型石化公司也开始看好ＰＴＴ聚酯项目‘５１，这促使国内一批科研单位开始研发ｌ，３一丙二醇。
１９９９年，荷兰Ｓｈｅｌｌ公司在美国路易斯安那州建立产能为７．２万ｔ／ａ的１，３一丙二醇生产装置‘６１。
２０００年美国杜邦公司开发出ＰＴＴ并且注册了商品名为Ｓｏｒｏｎａ。
２００１年，美国ＤｕＰｏｎｔ公司在生物法技术研究上取得突破，实现了通过采用廉价有机物作为转化底物直接生产１，３一丙二醇，并进入中试阶段。
２００２年，荷兰Ｓｈｅｌ１公司和ＳＧＦ公司合资在加拿大蒙特利尔建立了产能为９．０７万吨／年的ＰＴＴ生产装置；我国实现１，３一丙二醇工业化生产，首家生产企业是山东邹平铭兴化工有限公司，采用石化路线（ＥＯ法），投产时规模仅１６０吨／年。
２００３年，美国ＤｕＰｏｎｔ宣称将通过生物转化法将１，３一丙二醇产品大规模生产。
２００５年，９月末黑龙江辰能生物工程有限公司与清华大学签订了“发酵法生产１，３一丙二醇工业性试验技术开发合同书’’，从１０月份起公司技术人员赴湖南益阳同清华大学和河南天冠集团共同进行１，３一丙二醇项目的工业性放大试验。
２００６年底，我国湖南海纳百川生物工程公司建成了３００万吨／年的工业化生产装置。
１．２．２１，３．丙二醇的生产情况
１．２．２．１国外１，３一丙二醇的生产状况
德国Ｄｅｇｕｓｓａ公司
世界上最主要的专业化学品公司德国Ｄｅｇｕｓｓａ公司自ｌ９９５年成功开发由丙烯醛合成１，３一丙二醇的工艺后成为用这种方法申请专利最多的公司¨。８１。目前，德国Ｏｅｇｕｓｓａ公司由丙烯醛水合、氢化制备１，３一丙二醇的方法、技术己基本成熟，他们也在德国Ｗｅｓ－ｓｅｌｉ１公司建设了ｌ套０．９万吨／年的生产装置。
荷兰Ｓｈｅｌｌ公司
荷兰Ｓｈｅｌ１公司首先实现了ＰＴＴ的商品化。该公司用环氧乙烷为原料开发成功低成本的ｌ，３一丙二醇生产方法，并建成了ｌ０力．吨／年的生产装置。近年来成为国际上１，３一丙二醇最大的生产厂家。产品主要是用于生产“Ｃｏｍｅｍ”品牌ＰＴＴ聚酯。再者，荷兰Ｓｈｅｌ１公司进行了新的ｌ，３一丙二醇工艺试验，传统方法是通过环氧乙烷羰基化反Ｊ邂生成３一羟基丙醛中问体，然后加氢得到１，３一丙二醇。但是由于３一羟基丙醛（ＨＰＡ）会发生自缩聚反应瓶产生副产物，从而降低ｌ，３一丙二醇的收率，Ｓｈｅｌｌ公司通过研究发现以甲基一３一羟基丙酸盐进行加氢即可成ｌ，３一丙二醇，且收率较高。据Ｓｈｅｌｌ公司预测，到２０ｌＯ年，包括非纤维应用在内的全球ＰＴＴ需求量将达到ｌ００万吨／年‘钔。
甘油发酵生产１，３－丙二醇的菌种筛选及培养基优化研究
美国ＤｕＰｏｎｔ公司
美国Ｄｕｐｏｎｔ公司与世界第二大工业酶生产商Ｇｅｎｅｎｃｏｒ国际有限公司申请了许多可以发酵碳源为底物，用基因工程菌直接生产１，３一丙二醇的专利并取得了一些进展。根据美国咨询公司ＣＯＮＤＵＸ的一项规划化，近几年内ＰＴＴ年产将达到百万吨，１，３一丙二醇需求量也会因此大大增加。ＤｕＰｏｎｔ公司主要采用单糖（葡萄糖或
果糖）或多糖（纤维素、淀粉）等碳水化合物作碳底物，在合适条件下使一种碳底物与含有编码的一种活性甘油脱水酶、或二酶脱水酶的基因的微生物接触转化为１，３一丙二醇。２００１年，ＤｕＰｏｎｔ公司在生物法技术研究上取得突破，实现了采用廉价有机物作为转化底物，直接生产１，３一丙二醇，并进入中试阶段。２００３年，
ＤｕＰｏｎｔ宣称将通过生物转化法大规模生产１，３一丙二醇产品。
另外，据悉ＤｕＰｏｎｔ公司生产ＰＴＴ原料来自德国纬塞林，基于石化路线生产的１，３一丙二醇。新的基于淀粉（糖）发酵法生产ｌ，３一丙二醇的生物发酵催化路线工艺已开发成功，ＤｕＰｏｎｔ公司与ＴａＴｅ＆Ｌｙｌｅ公司（英国）、Ｇｅｎｅｎｃｅｒ国际公司（美
国）合作投产了谷物而不是石油生产ｌ，３一丙二醇的中型装置。以谷物用生物发酵法制造ＰＴＴ的总费用比以石油化工厂产品制造的要便宜２５％。１套中型装置位于美国伊诺斯州德卡杜尔的ＴａＴｅ＆Ｌｙｌｅ公司谷物的加工厂内。在新的发酵工艺中，由
磨碎的潮湿谷物发酵得到的葡萄糖经２步转化成ｌ，３一丙二醇。
，英国戴维（Ｄａｖｙ）工艺技术公司（ＤＰＴ）．戴维（Ｄａｖｙ）工艺技术公司（ＤＰＴ）和韩国三星先进技术研究院联合生产１，３一
丙二醇，是采用改进后的先进工艺，三星的专利技术用环氧乙烷均相加氢、酯化生成羟基酯中间体，中间体再用ＤＰＴ公司加氢和精制技术使之转化为ｌ，３一丙二醇，所得产品纯度超过聚酯树脂要求值。
Ｆ１本化学技术ＤＰＴ公司
同本化学技术ＤＰＴ公司受韩国三菱公司委托，开发了ｌ，３一丙二醇的生产工艺。ＤＰＴ以自己的加氢及精制技术，以现有的聚酯树脂作原料生产ｌ，３一丙二醇。１．２．２．２国内１。３一丙二醇的生产状况
山东铭兴化工有限公司
２００２年投资兴建，是浙江大学联合化学反应１：程研究所的中试基地。采用环氧乙烷法生产１，３一丙二醇，于２００２年实现工业化，由此首次实现了３５００吨／年的１，３一丙二醇的国产化产品。但当时的年产最仅大约１６０吨左右。
黑龙江石油化学研究院
黑龙江石油化学研究院，采用改性的阳离了树脂催化剂进行丙烯醛水合反应
生产１，３一丙二二醇。丙烯醛的选择率和３－ＨＰＡ的选择性均可达到８５％以上；在固定的床反应器中，以Ｎｉ／Ａ１２０３为催化剂，３一ＨＰＡ的转化率和ｌ，３一丙二醇的选择性均大于９９％，目前正在进行中试。
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上海石化公司研究院
上海石化公司研究院也采用改性阳离子树脂作催化剂进行丙烯醛水合反应；而加氢反应催化剂则采用改性ＲａｎｅｙＮｉ在釜式反应器中进行３－ＨＰＡ加氢反应，３－ＨＰＡ的转化率和１，３一丙二醇的选择性均大于９９％。
１．３微生物发酵法岐化甘油生产１，３一丙二醇的研究进展
在１００多年前，人们就知道１，３．丙二醇能从甘油发酵的来。微生物发酵甘油生产ｌ，３．丙二醇的研究始于２０世纪７０年代中期，那时ＲｕｃｈＦＥ等【ｌｏ】（１９７４）就对甘油在肺炎克雷伯氏菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）中的代谢规律进行了研究，并于１９７５年报道了在该菌种中存在两条独立的甘油代谢途径。在此后的大约２０年中，人们主要集中在甘油代谢关键酶的研究上，而对甘油厌氧发酵的研究却仅仅始于２０世纪８０年代末９０年代初期。那时，由于生物油脂的价格降低，导致人们大量的使用脂肪分解的方法来生产工业上使用的脂肪酸，从而也导致脂肪分解的副产物．甘油的大量积累过剩，甘油在国际市场上的价格也随之走低。在这种情况下，欧共体国家为了缓解甘油过剩的压力，不得不积极地进行甘油转化的研究，当时，甘油转化１，３．丙二醇的研究被赋予极大地热情。１９８２年和１９８７年的Ｆｏｒａｇｅ与Ｆｏｒｓｂｅｒｇ【ＩＩ】分别对Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｅｎｕｍｏｎｉａｅ和Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａａｃｅｔｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ发酵ｌ，３．丙二醇的厌氧特性和影响因素进行了研究¨２。。Ｈｅｙｎｄｒｉｃｋｘ（１９９１）和Ｄａｂｒｏｃｋ（１９９２）等分别对巴氏梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｐａｓｔｅｕｉａｎｕ）的厌氧发酵进行了报道。ＢｉｅｂｌＨ（１９９１）和ＧｕｎｚｅｌＢ（１９９１）率先发表了丁酸梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）厌氧发酵甘油生产ｌ，３．丙二醇的学术论文【ｌ３。１４Ｊ。迄今为止的十多年里，微生物学专家们主要围绕发酵菌种的分离、选育、及发酵条件等方面进行研究，并对ｌ，３一丙二醇厌氧发酵的机理、抑制因素、营养需求等多方面进行了报道。
１．３．１甘油生产现状
甘油，英文名ｇｌｙｃｅｒｉｎ或ｇｌｙｃｅｒｏｌ，是一种重要的化工原料。其生产方法主要有三种，一为天然油脂皂化／酶催化水解：二为化学合成：三为发酵法生产１１５１。在多数发达国家甘油的来源主要是前两种方法，特别是在欧洲，由于天然脂肪价格与石油裂解物的价格相比较低，导致工业上大量使用的脂肪酸，较多地采用脂肪分解的方法来生产这些脂肪酸，也致使脂肪分解的副产品一甘油在市场上大量过剩。随着欧洲利用过剩的菜子油和豆油为原料生产生物柴油（其主要副产物甘油）获得推广应用，已逐步成为廿油主要的来源。因此，在欧洲甘油来源主要靠第一种方法，即油脂皂化／酶催化水解。
舀：我国则三种方法并存，尤其是发酵法更为领先。以江南大学（原无锡轻工学院）为代表的利用耐高渗酵母用淀粉质原料发酵法生产甘油，并建立了我国发酵
甘油发酵生产１，３－丙二醇的菌种筛选及培养幕优化研究
甘油研究基地，其生产水平处于国际领先地位【ｌ６１。目前，该学院选育的ＷＬ－２００２—５菌种是国内能产甘油的耐高渗酵母的优良菌株，在含糖２５％左右的发酵液中产甘油高达１２％以上，总糖转化率可达５０％，生产强度３０９／（Ｌ．ｄ），达到国际领先水平。其研制的蒸馏设备与载体蒸馏技术，在甘油和残糖比为１：ｌ的情况下，提取率可达８０％以上，且残渣的清洗也较容易。发酵法生产甘油，操作简单，对设备无特殊要求，发酵工艺路线成熟。现在，生产强度更高达３５０９／（Ｌ．ｄ），发酵后期不消耗甘油或少消耗甘油的优良菌株又在江南大学诞生，并已申请国家专利。但目前由于我国甘油市场不景气，大部分甘油生产厂处于停产、半停产状态，因而各种方法生产的甘油价格都基本持平，但由于发酵甘油有特殊的应用领域，如食品、药品行业，从工艺和应用角度考虑，仍以发酵法为首选。
１．３．２甘油代谢菌种
现已发现，自然界中能够以甘油为底物转化为１，３．丙二醇的菌种主要有肠道细菌的克雷伯氏肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、产气克雷氏菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、弗氏柠檬酸菌（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ），乳酸菌属的短乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉｂｒｅｖｉｓ）和布氏乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉｂｕｃｈｎｅｒｉ），梭菌属的丁酸梭状芽孢杆菌
（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）和巴氏梭状芽孢杆菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｐａｓｔｅｕｉａｎｕ），其中
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｂｕｔｙｒｉｃｕｍ是研究最深入的［１７－１８】。甘油作为上述微生物的唯一碳源和能源物质，经过微生物代谢后除目的产物ｌ，３～丙二醇外，还有乙酸、乙醇、丁酸、２，３一丁二醇、乳酸、琥珀酸等副产物，但浓度相对较低。发酵的底物、产物及副产物都能抑制微牛物的生长。克雪伯杆菌和丁酸梭状芽抱杆菌具有较高的甘油耐受力，发酵速度较快，克雷伯杆菌与弗氏柠檬酸杆菌属于兼性菌，而丁酸梭状芽抱杆菌则要求严格的厌氧条件。虽然克雷伯杆菌与弗氏柠檬酸杆菌是转化１，３一丙二醇的良好菌种，但由于它们属于条件致病菌，故在实际应用上应有严格的操作规范，防患于末然。
ｌ，３一丙二醇的转化率、生产强度及最终发酵浓度足考察ｌ，３一丙二醇生产菌的主要指标。表卜２是几种微生物菌种发酵生产ｌ，３一丙二醇的结果比较。
由表卜２可以看到，克雷伯杆菌与柠檬酸菌相比，ｌ，３一丙－二醇的转化率要低，它的转化率只有０．６２ｍｏｌ／ｍｏｌ（丙二醇／甘油），而柠檬酸菌则有Ｏ．６４ｍｏｌ／ｍｏｌ（丙二醇／甘油）。但克雷伯杆菌发酵更迅速，因而克雷伯杆菌的１，３一丙二醇的生产强度要比柠檬酸菌的高。州时克雷伯杆菌对甘油的耐受力为柠檬酸菌的二倍。利用批式和批式流加发酵，克雷伯杆菌和丁酸梭状芽抱卡Ｔ菌可以使ｌ，３一丙二醇的最终浓度达到５０—６０９／Ｌ，其转化率可达０．５５—０．６５ｍｏｌ丙二醇／ｍｏｌ甘油，生产强度在
卜２．５９／（Ｌ．ｈ）。１，３一丙■醇的最终浓度的大小主要取决】ｊ菌种对底物、产物及副产物的耐受程度及一些关键酶的活性，丁酸梭状芽抱杆菌突变株可以使ｌ，３一丙：：
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醇的最终浓度达到７０９／Ｌ。连续发酵可以提高生产强度到５－６９／（Ｌ．ｈ），但发酵液中１，３一丙二醇的浓度不到批式发酵的一半【１９‘２０】，对于同一株菌采用连续发酵和批式
发酵，选择适宜的发酵条件可能相差不大。Ｐｆｌｕｇｍａｃｈｅｒ等用弗式柠檬酸菌采用固
定化细胞技术将生产强度提高到８．２９／（Ｌ．ｈ），但获得的１，３一丙二醇的浓度较低１２¨，Ｒｅｉｍａｎｎ用丁酸梭状芽抱杆菌采用连续发酵中空纤维膜错流过滤返回细胞的方法，
将生产强度提高到２１９／（Ｌ．ｈ），１，３一丙二醇的含量达至Ｉ］２６．５９／Ｌ，但它存在一个致
命的弱点是膜容易出现污染和堵塞【２２ｌＭｅｎｚｅｌ等用克雷伯杆菌采用连续发酵取得
了较好的效果，１，３一丙二醇的浓度达到４８．５９／Ｌ，生产强度为８．８９／（Ｌ．ｈ）［２３】。
表卜１微生物生产１，３一丙二醇的实验结果比较
Ｔａｂｌｅ１－１Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｒａｉｎｓ
转化率生产强
ｌ。３一丙二副产品
菌种培养方式（ｍ０１／ｍ０１度作者
醇（ｇ／Ｌ）＞５％
）ｇ／（Ｌ．ｈ）
连续１８．９０．６１１．８８Ｅｏｒｓｂｅｒｇ（１９８７）
连续１９．８０．７０５．９５乙酸、
Ｓａｉｎｔ—Ａｍａｎｓｅｔ批式流加４６．００．７ｌ丁酸
ａ１．（１９９４）Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ批式流加５２．６０，６６２．４０
批式３４．９０．５４０．７２Ｐｆｌｕｇｍａｃｈｅｒ
丁酸Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ批式流加６５．００．５７１．２１
（１９９４）
乙酸、ＳｔｒｅｅｋＳｔｒａＫ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ连续６．２．００．５０３．８２
乙醇（１９８７）
Ｈｏｍａｎｎｅｔａ１．批式２８．２０．６４１．３３
（Ｉ９９０）
批式２５．９０．４８０．７８乳酸Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ
细胞循环７．１０．４３０．１６ａｎｄＶｅｒｈｏｆｆ
Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｌ
辅助发酵８．３６０．６１０．１４（１９９１）
乙酸、
Ａｂｂａｄ—ＡｎｄａｉＯＵＳ同定床１６．４０．５７８．２乙醇、
Ｓｉｅｔａ１．（１９９５）
乳酸
Ｘ．ｐｎｅｕｍｏｎａｉｅ连续１８．６０．５７５．０２乙酸、
１ａｇ（１９９０）
乙醇、
批式５６．３０．５６２．２７Ｇｕｋｅｒｌｚｅｌ（１９９１）
乳酸
乙酸、Ｔｒａｎ—Ｄｉｎｈｅｔ批式流加５１．０Ｏ．６２１．４０
乙醇ａ１．（１９８７）
什油发酵生产１，３－丙二醇的菌种筛选及培养基优化研究
Ｃｈｅｎｅｔａ１．批式流加５９．５０．５４１．５７
（２００３）
Ｍｅｎｚｅｌｅｔａ１．连续３５．２—４８．５０．５７—０．６９４．９－８．８
（１９９７）
乙酸、ＰｅｔｉｄｅｍａｎｇｅｅｔＣ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍＥ５批式流加６５．Ｏ０．５４
丁酸ａｌ
￡ｂｕｔｙｒｉｅｕｍ４７．６０．６２２．０乙酸、Ｒｅｉｍａｎｎ，
批式流加
ｃ．ｂｕｔ．ｍｕｔａｎｔｅ７０．４０．９８１．５丁酸Ｂｉｅｂｌ（１９９６）１．３．３甘油转化生产１，３一丙二醇的途径
１，３一丙二醇是一种典型的甘油发酵产物，并未发现其可由其他有机底物厌氧转化而来【１，１２Ｊ。甘油作为惟一碳源和能源沿着氧化和还原途径发生歧化反应，氧化途径中产物与糖类发酵产物一致，并产生供细胞生长所必需的ＡＴＰ，在某些产物形成的同时释放还原力ＮＡＤＨ。：还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生成ｌ，３一丙二醇拉制。微生物厌氧代谢甘油途径如图１－３。还原途径包括两步反应：第一步，由依赖于辅酶Ｂ，：的甘油脱水酶催化甘油脱水生成３一羟基Ｉ大ｊ醛；第二步，由１，３一丙二醇氧化还原酶催化３一羟基丙醛还原生成１，３一丙二醇１２５。２６１。氧化途径中生成丙酮酸的反应在各菌中是相同的，丙酮酸的去向则因微生物种类而异。在肠道细菌中，丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解为乙酰ＣｏＡ和ｌ｝ｊ酸，甲酸往往又会分解为ＣＯ：和Ｈ：。乙酰ＣｏＡ在经乙酞磷酸形成乙酸的过程中尘成过量的ＡＴＰ，而在经乙醛形成乙醇的两步反应中要消耗２摩尔还原力。在不控制ｐＨ值的条件下，丙酮酸也可能经ａ一乙酰乳酸产生３一羟基丁醇并最终转化为２，３一丁二醇。此外，
肠道细菌发酵甘油的产物中还有乳酸和琥珀酸１２７－２９】。在丁酸梭菌中，有两个典型的氧化途径产物：乙酸和丁酸。丁酸由两分子乙酞ＣｏＡ氧化２个ＹＡＤｔ！！后的一连串反应生成，伴随着ＡＴＰ的产生【３引，在巴斯德梭菌中丁醇成为氧化途径的主要产物，也有少量的乙醇产生１３¨。另外，如果假设平均细胞生物量组成为Ｃ．Ｈ：０：Ｎ，甘油比生物量更为还原，故细胞生长也可为ｌ，３～丙二醉生成提供还原力。
１ｒ油发酵生产ｌ，３一丙二醇的菌种筛选及培养幕优化研究
１．４生产ｌ，３．丙二醇的发展前景
我国是世界上最大的聚酯生产国，也是最大的聚酯消费国。新型优质聚酯材料已经在地毯、织物、无纺布、薄膜和热塑性工程材料方面展示了良好的应用前景，而且其更多的新功能还正在开发中。因此，开发生产高性能的聚酯材料在我国有着广阔的发展前景。就其生产来看，微生物法以其原料易得，可利用再生资源，对环境友好而展示其美好的发展前景。可以预料，随着人们对环境意识的增强以及一次性资源面临枯竭的危险，世界人口和环境压力的增加，生物法生产１，３一丙二醉将越来越显示出其强大的发展后劲和广阔的发展空间。
据预测，至ｌＪ２０１０年，全球包括非纤维应用在内的ＰＴＴ需求量将超过１０万ｔ／年，相应的，１，３一丙二醇的需求量也会迅速增加。目前，我国只有北京、上海等少数化学厂生产１，３～丙二醇，但产量很小。除此之外，清华大学、大连理工大学等大学和研究所也对ｌ，３一丙二醇的微生物生产进行了研究，希望得到一种有效可行的方法对１，３一丙二醇进行大量生产。就目前的技术水平而言，我国与国外的发展有一定的差距，但我国也有了～些自已的研究进展，我们应当抓住机遇，为大规模产业化提供有力的技术支撑。
１．５课题研究的内容
本论文的重点是通过甘油诱集、平板筛选从土壤中分离筛选出一株歧化甘油产１，３一丙二醇细菌，并对筛选出的目的菌株进行培养基优化。
本论文主要从以下两个方面进行了研究：
１．歧化甘油生产１，３一丙二醇菌种的筛选
运用诱集、平板筛选从土壤中分离筛选出一株歧化甘油产１，３一丙二醇细菌，通过测定生物量、菌种鉴定、气柏色谱仪检测和高碘酸氧化法等指标考察其歧化甘油生产ｌ，３一丙二醇效果，找到理想高效的歧化甘油生产ｌ，３．丙二醇菌种。从而为人们更好利用甘油提供参考。
２．对筛选出的目的菌种进行培养基的优化
对分离筛选出的歧化甘油高产ｌ，３一丙二醇菌种进行培养基优化实验，通过对微生物发酵产甘油的各种影响因素的控制和定量分析，寻求一种最佳的培养目的菌株的方法，并达到高产ｌ，３一丙■醇的目的。
硕上学位论文
第二章目的产物１，３一丙二醇的理化性质及生产方法２．１１，３．丙二醇的理化性质及用途
２．１．１．１，３．丙二醇的物理性质
１，３一丙二醇又被称为丙二醇或者１，３一二羟基丙烷。英文名称为１，３－ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ或者１，３一ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ，是一种无色无味，具咸味和吸湿性的粘稠液体，易溶于水，乙醇，醚类和甲酰胺，微溶于氯仿和苯，是一种可燃、低毒性物质。其主要物理性质见表卜ｌ
表２－１１，３一丙二醇的主要物理性质
Ｔａｂｌｅ２－１ｔｈｅｐｈｙｓｉｃｓｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆ１．３－ｐｒｏｐａｎｅｄｉ０１
分子式Ｃ。Ｈ。０。结构ＣＨ：ＯＨＣＨ：ＣＨ：ＯＨ
分子量７６．１０相对密度（水＝１）１．０５（２５。Ｃ）
熔点（℃）
相对蒸气密度（空气＝１）
闪点（℃）
折射率（２０℃）
蒸发热（ｂ．ｐ）一２７
２．６
７９
１．４３９２
１８４６．８ｋＪ／ｍｏｌ
体积膨胀系数（２０℃－４０℃）沸点（℃）２１０－２１１
饱和蒸气压（ｋＰａ）０．１３（６０。Ｃ）
自燃温度（℃）
表面张力（ＯｏＣ）
介电子常数
（２０℃）
０．６１×１０ｑ
４００
４７．４３×１０ｑＮ／ｍ
３．５×１０—４
２．１．２１，３一丙二醇的化学性质
既具有单醇的性质，又具有二醇的性质。其主要化学性质与１，２一丙二醇（１，２－ＰＤ）相类似，高温下与羧酸缩合成酯。与异氰酸盐及酸性氯化物生成聚氨酯。与１，２一丙二醇不同的是１，３一丙二醇只有两个端羟基有反应活性，且反应活性相同。１，３一丙二醇在酸性催化剂作用下，与醛或酮反应生成二氧杂环乙烷，这是一种广泛应用的有机无机溶剂。在氧化铝催化下，１，３一丙二醇可生成乙醇、丙二酸等。其中ｌ，３一丙二醇最重要的性质就是与二酸反应生成聚酯和聚氨酯。
甘油发酵生产１，３一丙二醇的菌种筛选及培养幕优化研究
２．１．３１，３．丙二醇的用途
ｌ，３一丙二醇（１，３－ＰＤＯ）是一种重要的化工原料，可直接用于防冻剂，是多种增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂的合成原料。也广泛应用与食品、油墨、涂料、印染、化妆品和制药等行业，并且可以替代１，４一丁二醇和新戊二醇等中间体用于生产多醇聚酯以及作为碳链延伸剂ｔ３２１。ｌ，３一丙二醇最主要的用途是合成新型聚酯ＰＴＴ的原料［３３１。Ｉ，３一丙二醇和对苯二甲酸（ＰＴＡ）可以合成聚酯ＰＴＴ（对苯二甲酸丙二醇酯），是一种高性能、易加工的新型热塑性聚酯材料。ｌ，３一丙二醇的三个亚甲基所具有的“奇碳效应’’使得ＰＴＴ分子形成了天然螺旋状的纤维结构，从而具有良好的回弹性。ＰＴＴ还具有良好的染色性能和膨松性能，能够满足高弹力且手感柔软的纺织品市场需求；ＰＴＴ纤维可常压印染并具有良好的抗污垢性能、抗磨损性能和抗静电性能，可以代替尼龙作为制造地毯的新型材料；ＰＴＴ具有很好的抗冲击强度和尺寸稳定性，比对苯二甲酸丁二醇酯（ＰＢＴ）具有更好的使用性能，比对苯二甲酸乙二醇酯（ＰＥＴ）具有更好的成型加工性能１３４１，在工程塑料领域也具有巨大的应用潜力。ＰＴＴ的优良性能决定了其广阔的市场前景，它的诸多优良性能使它被评为美国１９９８年六大石化新产品之一。尽管ＰＴＴ在１９４１年就在实验室制备出来，但是直到ｌ９９５年才由荷兰Ｓｈｅｌｌ公司首先公开宣称ＰＴＴ的商品化，商品名为“Ｃｏｒｔｅｒｒａ”Ｅ３５｜。为此，美国化学学会于２０００年３月２８日对开发ＰＴＴ的Ｓｈｅｌｌ公司Ｃｏｒｔｅｒｒａ小组的』ｉ位化学家和化学工程师给予发明奖。由于以ｌ，３～丙二醇为原料生产的聚酯既提高了产品性能，又减轻了环境污染，因此，１，３一丙二醇的生产和应用成为当前圈际上合成纤维上维材料开发的热点，其大规模生产将引发化纤产品结构的根本性调整。ｌ，３一丙二醇可与己二酸、癸二酸缩聚，制成相应的聚酯薄膜，这种薄膜具有生物降解性，埋在土壤中可在自然界微生物作用下逐步分解。１，３一丙二醇还可以与作为合成油漆的原料，由此合成的油漆具有很好的弹性和硬度，可用丁：蛇管外层涂料、罐头油漆和粉未喷涂等。其品质优良，目前只有价格昂贵的二醇类（主要是１，６一己二醇）才能与之媲比。在药物合成领域，ｌ，３一丙二醇已用于维生素Ｈ的合成。近年ｌ，３一丙二醇作为有机合成原料越来越受到重视。
２．２１，３一丙二醇的合成方法
目前，ｌ，３．丙二醇的￡Ｌ产方法主要有化学合成法和微生物发酵法【３６‘３８】。在化学合成生产中已具备商ｑ扛化的方法有环氧乙烷法和丙烯醛法【３９１。
２．２．１丙烯醛水合法１４０舶Ｊ
德幽Ｄｅｇｕｓｓａ公司丌发了以丙烯醛为原料生产ｌ，３一丙二醇的一［业化路线，并
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申请了专利。其反应方程式为：
丙烯醛水合得到３－ＨＰＡ，然后加氢制得１，３一丙二醇。
ＣＨ：＝ＣＨＣＨＯ＋Ｈ：Ｏ—ＨＯＣＨ：ＣＨ：ＣＨＯ＋Ｈ２一ＨＯＣＨ。ＣＨ：ＣＨ。ＯＨ
丙烯醛路线反应条件比较温和，技术难度也不大，加氢工艺成熟，对设备要求不高，符合我国国情。但丙烯醛本身也是一种重要的有机中间体，而且属于剧毒易燃易爆物品，难以储存和运输。其制取过程如下：
丙烯醛水合制３－ＨＰＡ：
丙烯醛水合制备３－ＨＰＡ，最早采用无机酸作催化剂，但其生产率低，选择性差，并伴有副反应发生。丙烯醛遇酸容易发生缩合或聚合反应，生成二丙酸醚等，为解决这些问题，Ｄｅｇｕｓｓａ公司采用弱酸性离子交换树脂作为催化剂来提高３－ＨＰＡ的选择性，丙烯醛水合的转化率和选择性都可以大幅度提高。美国专利中提出了一种含有磷酸基的酸性鳌合型阳离子交换树脂一ＮＨ—ＣＨ。－ＰＯ。１４：作催化剂，在反应温度５０—８０℃的条件下，可使丙烯醛转化率保持在８５％一９０％，３－ＨＰＡ选择性可达８０％－８５％，Ｄｅｇｕｓｓａ公司Ａｒｎｔｚ等采用弱酸性离子交换树脂用少量钠、镁、铝离子改性，如含０．５３％Ｎａ，０．０６％Ｍｇ，０．３％ＡＩ的离子交换树脂催化剂，在釜式反应器中于５０℃反应４ｈ，丙烯醛的转化率达８８．９％～９０．５％，３一ＨＰＡ选择性为８０．４％－８２．８％。但催化剂使用２００ｈ后，反应转化率和选择性开始降低，为此，Ｄｅｇｕｓｓａ公司和Ｈｏｅｃｈｓｔ公司相继研究和开发了无机载体的酸性催化剂。
Ｄｅｇｕｓｓａ公司使用表面积为５０ｃｍ２／ｇ的ＴｉＯ：或Ｙ—Ａｌ。Ｏ：，为载体，经Ｈ。ＰＯ。或ＮａＨ：ＰＯ．溶液浸透处理，得到Ｔ卜０一Ｐ结构的活性催化剂，用固定床反应器，在反应压力Ｏ．卜２ＭＰａ，反应温度５０—７０℃，进料空速Ｏ．５ｈ叫的条件下，丙烯醛水合转化率为５０％，３－ＨＰＡ选择性可达８１％左右，这一催化剂体系易制备，载体稳定，适用温度高，可再生使用。Ｈｏｅｃｈｓｔ公司采用ＺＳＭ一５分子筛为活性组分，制得的催化剂在丙烯醛质量分数ｌ８％一１９％，反应温度８０℃，在固定床反应装置上连续运转１５００ｈ，催化剂活性几乎不变，丙烯醛平均转化率４４．３％，３一ＩＩＰＡ选择性平均为８７．７％，如丙烯醛质量分数降为ｌ２％时，则丙烯醛转化率为４６％，３一ＨＰＡ选择性达９１．７％。另外，还可采用丙酸一三乙胺缓冲液催化剂水合，控制缓冲液ｐｈ＝４，丙烯醛液体空速为０．５一，丙烯醛转化率为４５％，３－ＨＰＡ选择性为８５％。
以上文献表明，丙烯醛水合反应的温度一般控制在５０－７０℃，温度太低会影响丙烯醛转化率，温度太高又会影响催化剂寿命，并且加快副反应的发生，水合反应的时Ｉ、ＨＪ一般较长，约４ｈ，这是转化率和选择性互相平衡的结果，水合反应后得到的３一ＩＩＰＡ，经浓缩除去未反应的丙烯醛（可回收利用）后，３－ＨＰＡ可催化加氢制１，３一丙二醇，水合反应催化体系不会影响后续加氢反应催化剂活性。
甘油发酵生产１，３－丙二醇的菌种筛选及培养基优化研究
３－ＨＰＡ氢化制ｌ，３一丙二醇：
３－ＨＰＭＪＮ氢反应一般采用改进活性的Ｎｉ催化剂，如：Ｎｉ－Ａ１。０。或Ｐｔ附于ＴｉＯ：载体或活性碳上作催化剂，反应温度控制在３０—１８０℃，Ｈ２压力１０．１－１５．２ＭＰａ，常采用分段加热，即先在３０—８０℃下氢化，加氢转化率控制在７５％－８５％，然后再在１１０－１５０℃下氢化，这样既可保证３一ＨＰＡ有近１００％的转化率和选择性，也有利于保证所得１，３一丙二醇的质量。美国Ｓｈｅｌｌ公司采用含Ｎｉ５０％的Ｎｉ／ＳｉＯ：／Ａ１。０。催化剂，在压力６．９ＭＰａ，温度５０一８０℃，３－ＨＰＡ质量分数３．０％一２２．６％的条件下加氢，３－ＨＰＡ的转化率达１００％，ｌ，３一丙二醇的选择性可大于１００％，这说明催化剂可使部分高沸物转化成１，３一丙二醇。
Ｄｅｇｕｓａｓ公司的专利中选中用雷尼镍为催化剂，在反应压力１３．５ＭＰａ，温度７５℃下进行３一ＨＰＡ的加氢反应，３－ＨＰＡ的转化率在９９％以上，１，３－ＰＤＯ的选择性在９９．５％以上，但由于雷尼镍的机械强度低，不适合于釜式反应过程，反应后需要使催化剂与反应产物分离，且回收的催化剂不能重复使用，因此限制了雷尼镍在工业规模生产中的应用。Ｈｏｅｃｈｓｔ公司采用含钼的雷尼镍催化剂，在反应压力
１．７３－５．５２～ｔＰａ，反应温度４０－９０℃，３一ＨＰＡ质量分数为２０％的加氢反应条件下，反应１５－８５ｍｉｎ，３一ＨＰＡ转化率为９５％，１，３一丙－二醇选择性最高可达１００％。
Ｄｅｇｕｓｓａ公司在３一ＨＰＡ氢化制１，３一丙二醇工艺中选用负载铂的ＴｊＯ。催化剂，进行３一ＨＰＡ的加氢反应，当以负载２％铂的Ｔｉ０。为催化剂，在反应温度６０℃，反应压力９．ＯＭＰａ，０．８５ｈ叫空速条件下进行加氢反应时，３－ＨＰＡ的转化率在９９％以上，１，３一丙二醇的选择性在９８．５％以上。然而，由于钉和铂等金属昂贵，不利于降低催化剂的成本，因此３一ＨＰＡ的加氢反应主要采用以镍为活性组分的催化剂。Ｄｅｇｕｓｓａ公司的ＨＡＳＳ等１９９４年申请的专利，ｌ，３一丙二醇的生产工艺选用Ｎｉ／Ａｌ：Ｏ。／Ｓｉ０：（Ｎｉ含量在
３０％左右）为催化剂，在反应温度５５℃，空速Ｏ．８ｈ一的条件下，进行３－ＨＰＡ的加氢反应，反应的转化率为９６．５％，ｌ，３一丙二醇选择性为９８％，但以镍为活性组分的加氢催化剂进行３一ＨＰＡ的加氢反应时还存在加氢压力偏高，反应空速低的不足，同时，丙烯醛制取ｌ，３一丙二醇工艺中，常常含有大于ｌ％的羰基化合物（如丙醛），这些羰基化合物会影响ＰＴＴ的质量，必须除去。Ｄｅｇｕｓｓａ公司采用含３０％Ｎｉ的Ｎｉ／Ａ１。Ｏ。／ＳｉＯ：催化剂，或Ｐｔ／Ｔｉ０：（含２％Ｐｔ）催化剂，在压力３．４—１０ＭＰａ，空速０．６一１．０ｈ－Ｉ，反应温度５０－７０℃／５５－ｌ４０℃２段加氢后，羰基化合物可降至０．０１％以下，达到合成ＰＴＴ的质量要求。
Ｄｅｇｕｓｓａ公司由丙烯醛生产ｌ，３一丙二醇的工艺流程如图２—１所示。