单克隆抗体纯化的研究进展
唐佳佳,李小兵,刘国文,孔涛,刘磊,杨威,王哲
(吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春130062)
摘要:单克隆抗体在现代生物检测领域和医疗领域起着越来越重要的作用。而不管是何种抗体,来源于哪种形式,在用于检测和治疗之前都需进行纯化,纯化的方法因抗体种类和用途不同而不同。大致可分为沉淀法和色谱法两大类,作者就各种不同方法的应用范围及纯化结果的纯度、活性回收率、纯化周期、每批可纯化样品量、纯化成本等方面进行了比较和讨论。
关键词:单克隆抗体;纯化;沉淀技术;色谱技术
中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1671-7236(2011)02-0076-04
抗体是一种功能多样的实验室必备检测试剂,如免疫组化、免疫印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附试验(ELISA)等都要用到抗体。单克隆抗体主要来源于杂交瘤细胞培养上清和免疫动物的腹水,不论抗体是何种形式的来源,在使用之前都应进行纯化。单克隆抗体的纯化方法大致可分为沉淀法和色谱法两大类,沉淀法一般操作简单,省时省力,回收率高,但纯度有限;色谱法相对而言操作较繁琐,但是所获抗体纯度较高,可以满足精密试验对抗体的需要。所以应根据需要来选择抗体纯化的方法。
1沉淀技术
沉淀技术的原理是不同蛋白质其疏水性不同,而提高盐浓度时,其疏水性会增加,使蛋白质沉淀而分离。目前常用的沉淀技术主要有硫酸铵(AS)沉淀法、辛酸(CA)沉淀法、辛酸硫酸铵法(CA-AS)沉淀法、优球蛋白沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法5种。
1.1AS沉淀法AS沉淀法是根据免疫球蛋白在30%~50%饱和硫酸铵浓度范围内会形成沉淀而与其它蛋白质杂质分离而设计的;该方法具有可稳定抗体、去除大部分白蛋白和转铁蛋白、抗体活性损失小、样品可以被浓缩等优点,但是纯度不高,需要结合其它方法进一步纯化,该方法适用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化各种不同类型的抗体。在采
收稿日期:2010-08-12
作者简介:唐佳佳(1987-),女,湖南人,硕士,研究方向:动物营养代谢病。
通信作者:王哲(1950-),男,吉林人,教授,博导,从事动物营养代谢病与中毒病研究。E-mail:w an gzhe500518@so-
https://www.doczj.com/doc/016312980.html,
基金项目:国家/8630资助项目(2007AA10Z440;2007AA10Z426)。用,AS沉淀时需注意两点:1某些mAb经AS沉淀后抗体的活性会有所降低或丧失;o在采用AS固体进行沉淀时,局部的浓度过高会引起其它杂蛋白的共沉淀而影响抗体的纯度。
1.2CA沉淀法CA沉淀法的原理是一定浓度的CA可以使腹水中B和A球蛋白、白蛋白等杂蛋白沉淀下来,使抗体保留于上清液中而得以分离;该方法的优点是可以减少抗体聚合,保持抗体活性;缺点是抗体不被浓缩,需利用超滤或硫酸铵作进一步浓缩,回收率低。该技术适用于IgG1、Ig G2a、Ig G2b和Ig M亚类的纯化,而对于IgG3及IgA类抗体辛酸会使它们产生不可逆沉淀而使抗体失活。
1.3CA-AS联合沉淀技术CA-AS法可以在偏酸条件下沉淀血清或腹水中除Ig G外的蛋白质,适合于提纯IgG1和IgG2b,不能用于Ig M和IgA的纯化;该方法操作简单方便,抗体回收率和产率均高,抗体活性损失小。周玉等(2006)分别采用CA-AS、AS和DEAE离子交换层析法对小鼠腹水Ig G 进行了纯化效果的比较,结果表明,CA-A S法提取Ig G的纯度为67.5%,高于AS法(43.2%),低于DEAE法(100%);CA-AS法提取IgG的回收率为51.2%,远高于DEAE(8.9%),略低于AS法(63.8%),而通过ELISA法进行的抗体活性研究结果表明,CA-AS法优于AS法。
1.4优球蛋白沉淀法优球蛋白沉淀法适用于Ig G3和IgM型单抗的提取,1988年,Gar cia-Gor-i zalez调查发现,用该法纯化的抗体活性几乎保持不变,对IgG3单抗的回收率高于90%,对IgM单抗的回收率为40%~90%。
1.5聚乙二醇(PEG)沉淀法PEG沉淀法原理: PEG具有强极性,产生极强的亲水性,夺取水分子,
导致抗体分子析出;该方法常用于IgM的纯化, PGE沉淀可使IgM达到较高的纯度(大于90%)和回收率(大于80%);Ig G回收率较高(大于70%),但纯度较低(30%~40%),通常需加一步阴离子交换层析来提高抗体的纯度。
2色谱技术
色谱技术(Chro mato graphy)又称层析技术,利用混合物各组分理化性质上的差异,如吸附力、溶解度、分配系数、带电性、分子大小和亲和力等,使各组分以不同程度分布在2个相中,其中一个为固定相,另一个为流动相,当混合物随流动相通过固定相时,由于各组分受固定相的阻力和流动相的推力不同,而使各组分移动速度各异,以达到分离的目的。
2.1离子交换色谱法离子交换色谱法(ion ex-chang e chro matography,IEC)纯化抗体的原理是根据抗体蛋白在不同pH条件下所带电荷不同,分别与带相反电荷的介质表面结合后,通过改变洗脱液的pH或盐离子浓度而将其洗脱下来,从而与杂蛋白分离的一种色谱法。阴、阳离子交换剂都可以用于抗体的纯化。阴离子交换层析(catio n-ex change chr omatogr aphy,CEX)主要采用吸附)洗脱模式,由于DNA、宿主细胞蛋白质、脱落的Pro tein A配基和内毒素均带负电,与阳离子介质结合力弱而被除去。CEX主要适用于纯化IgG。Zhou等采用CEX法,用pH-离子强度混合梯度洗脱模式纯化单抗,以乙酸钠溶液130(pH 5.0)~190mm ol/L(pH 6.0)2梯度洗脱,单抗的纯度为99.56%,回收率为98.6%,抗体浓度高(9mg/mL)。阳离子交换层析(anion-exchange chromatog raphy,AEX)主要采用穿流模式,即杂质保留在柱上,而目标抗体穿过层析柱,可以在低pH条件下去除病毒及DN A杂质, Andreas等采用AEX法,以Fr actogelóEM D SO-3 (M)和Fractog elóEM D SE H icap(M)为阳离子交换剂对其纯化抗体条件进行了摸索,结果发现,在一定合适pH抗体回收率分别为98%和95%,但在低pH洗脱条件下,该方法易引起抗体的失活。此外,阴阳双层交换离子法也可用于抗体的纯化。
2.2Protein A亲和色谱Protein A是金黄葡萄球菌细胞壁的一种蛋白质成分,它是单一的多肽链,分子质量为42000u,分为5个片段,每个片段都具有和Ig G的Fc片段结合的活性。Pro tein A能与大部分哺乳动物的IgG反应,不同属种的抗体对Pro-tein A的亲和力不同。因此,据此可将Pr otein A作为配基结合在各种软凝胶上用于分离IgG亚类。其优点有选择性好,一步纯化所得抗体的纯度大于99%;可浓缩抗体,洗脱液的抗体浓度大于10g/L;可有效灭活病毒;适用于所有人源的(非Ig G3)抗体和Fc融合蛋白,减少缓冲液的种类和用量;该方法是目前应用最普遍的单克隆抗体纯化方法之一。但由于Protein A是具有生物活性的物质,Chen等(2008)发现Pro tein A层析与传统化学配基相比也存在一些问题:Protein A凝胶价格昂贵,是普通色谱介质的10倍;抗体在低pH条件下洗脱,易形成高分子聚合物和沉淀;脱落的Protein A配基会与抗体一起被洗脱,影响抗体的安全性;层析使用周期短;易被存在样品中的蛋白酶水解,从而降低分离效果;缺乏有效的清洗方法,由于在碱性环境下不稳定,因此不能用一般的氢氧化钠原位法清洗。针对这些问题,近几年也研发很多改进型的Pr otein A 色谱,如GE公司生产的M abSelect-SuRe,该层析法更加耐碱且配基脱落率低。由于至今仍然无法克服Pro tein A配基脱落及价格昂贵的问题,许多研究者都在寻找Protein A的替代品。
2.3Protein G亲和色谱Protein G是一种从链球菌中提取的细菌细胞壁蛋白,Pr otein G不仅与免疫球蛋白的恒定区相结合,且与白蛋白、A2-巨球蛋白相结合,这使得用Pro tein G亲和色谱提纯抗体,无法除去体系中存在的白蛋白和巨球蛋白。目前,采用基因修饰的方法表达出来的Pr otein G可以克服上述缺点。
2.4免疫亲和色谱免疫亲和色谱是根据抗原和抗体结合形成特异性抗原)抗体复合物的特性而设计的。将可溶性抗原偶联到不溶性介质上,使之固定化,并填装入适宜的层析柱中,将含相应抗体的样品加入柱中,抗体与抗原特异性结合,其他蛋白质组分流出。改变缓冲液的pH和离子强度,就可以使抗体和偶联在介质上的抗原分开而被洗脱下来,从而得到纯净的抗体。免疫亲和色谱法是分离抗体非常有效的方法,但由于抗原是一种昂贵的生物活性物质,限制了该方法的大规模使用。
2.5组氨酸亲和色谱组氨酸的性质比较独特,具有弱疏水性、咪唑环为弱电性,可与许多种蛋白质发生亲和作用。将组氨酸通过己胺基键合在琼脂糖凝胶上时,组氨酸与IgG的结合常数Ka为4.2@105 L/mol,符合亲和层析的要求,常用于纯化IgG, Yakup等(2004)用该法纯化IgG,效果较好。由于组氨酸不需要特殊的三级结构来维持生物活性,因此较一般的蛋白层析来说更加稳定,是一种简单、有
效、方便、廉价的分离纯化IgG的方法,但是其特异性选择性不高。
2.6羟基磷灰石(H AT或H T)色谱法羟基磷灰石[Ca5(PO4)3OH]是一种磷酸钙结晶,表面有许多带正电荷的Ca2+离子和带负电荷的PO3-4离子,还有可形成氢键的OH基团。其特点是不能与小分子结合,能与带电荷的生物高分子结合,这种结合具有很强的亲和力,常可在高盐浓度或有去污剂、变性剂存在的条件下结合,被结合的高分子又可在接近中性的条件下通过磷酸盐的浓度梯度被洗脱。因此用于抗体的纯化,常能达到其他层析材料所不能达到的分离效果。血清蛋白中的抗体蛋白与H AT结合力最强,用pH6.8,10~300mmo l/L磷酸钠缓冲液梯度洗脱,小鼠腹水中的Ig G或IgM均为最后洗脱峰,纯度可达90%以上。由于洗脱条件接近生理条件,所得纯化M cAb的活性也较高。
2.7凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱(gel filtr ation chr omatogr aphy,GFC)是利用凝胶粒子为固定相,根据样品中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相色谱法。由于抗体与杂质蛋白的分子质量差别较大,实际纯化中可以用GFC来纯化抗体。其缺点是样品处理量小;而其原理仅为空间排阻效应,对于分子质量接近的蛋白质分子分离能力较弱,需与其它方法联合使用。
2.8疏水作用色谱疏水作用色谱(hydrophobic interaction chromatog raphy,H IC)以蛋白质表面偶联疏水性基团的疏水性吸附剂为固定相,根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱色谱法。抗体分子表面有许多非极性氨基酸,它们密集在一起形成疏水区,因此抗体分子也能用疏水作用色谱进行纯化。但是由于不同疏水区与不同盐浓度结合和洗脱的条件不同,因此对纯化条件需进行仔细优化;另外H IC对白蛋白有较强吸附作用,通常需与其它分离方法联合使用。
2.9疏水电荷诱导色谱疏水电荷诱导色谱(hy-dro phobic char ge induction chrom ato graphy, H CIC)是20世纪90年代末期由Burton和H ar-ding提出并命名的一种纯化技术,其原理是由具有pH依赖行为的双模式、可离子化的配基(如吡啶)所决定的,在pH6~9的中性及微碱性范围内配基是不带电的,表现出疏水的特性而与疏水性较强的蛋白相结合,当流动相的pH下降到一定范围后,配基和蛋白质都带有正电荷,由于同相电荷的排斥作用,蛋白质便被洗脱下来而得以分离。H CIC在抗体纯化方面具有许多优点:原样品可以不经处理直接纯化;价格相对便宜;洗脱条件温和;纯化效果好。很多研究者认为是一种理想的可取代Protein A和Pro tein G亲和层析的抗体纯化方法。Boschetti等(2002)研究了其对于不同来源抗体的纯化效果,抗体纯度高达98%。而Sanchay ita等(2006)经调查也表明,经H CIC纯化的抗体用SDS-PAGE法检测,其纯度为75%~99%。Chen等(2008)报道了以巯基乙基叱咤树脂(mercapto-Ethy-l pyr idine, MEP)为固定相,用H CIC纯化单克隆抗体,与传统的H IC相比,H CIC能大幅提高单克隆抗体纯化的效率。
2.10固定化金属离子亲和色谱(IM AC)IMAC 利用样品中暴露的蛋白质残基(组氨酸、赖氨酸、色氨酸等)和固定于介质上的金属离子(铜、锌、钻、镍等)之间的相互作用不同的原理而将蛋白质进行分离;该方法尤其适用于抗体的纯化,因为它具有以下优点:配基简单且高度稳定、吸附量大、分离条件温和。H ar i和M arecek分别于2000年和2004年采用该方法对Ig G进行了纯化;但该方法要求所纯化的抗体蛋白有组氨酸、赖氨酸等能与金属离子进行结合的氨基酸残基。
2.11亲硫吸附色谱亲硫吸附色谱(thiophilic adso rption chrom ato graphy,T AC)是利用固定相表面所含的硫官能团与蛋白质含硫部分相互作用的原理而设计的层析法,在单克隆抗体的纯化中也得到了应用。其优点有容量大、纯化快速、柱稳定性好、通用性强,适用于各种不同的种属、不同类型及亚类的单克隆抗纯化。N oper等以硅胶为亲硫吸附剂基质,纯化了大鼠和小鼠的不同亚类的单克隆抗体,纯化时间仅为10min,每克固定相的容量为20 mg蛋白质,柱稳定性好,不同样品300次操作后柱效无明显改变,但小鼠Ig M与固定相的吸附较弱;认为该方法有可能取代Protein A和Protein G色谱,成为抗体纯化的一种通用方法。
3其它方法
3.1沸石法沸石法(zeolite)是一种铝矽酸盐结晶物质,其化学式为Na x[(AlO2)x(SiO2)y]# 2H2O。钠离子、钾离子、铵离子等阳离子及带电的蛋白质在带负电的沸石多孔结构内能处于平衡状态,其纯化抗体的原理与阳离子交换层析相似,因为沸石本身也是一种阳离子交换剂,所以当蛋白质的等电点高于缓冲液中pH时,蛋白质就会吸附到带
负电荷的沸石结构内,然后用高浓度的盐与蛋白质竞争阳离子结合位点,而使蛋白质分离。沸石有很高的机械强度,不会有干缩湿胀反应,能在高温下灭菌,能快速处理大量蛋白质样品而对流速没有限制,缓冲平衡时间及再生时间短,便宜。H uang等(1998)采用Zeolite A法,分别用钠离子、钾离子、铵离子为阳离子交换剂对小鼠腹水等生物样品进行纯化,其中钾离子Zeolite A纯化效果最好。
3.2非层析抗原特异性吸附法非层析抗原特异性吸附法的原理为抗原抗体特异性吸附,但与免疫亲和层析法不同,它是一种非层析技术。它通过将目标抗体与具有多个抗体结合位点的抗原形成二聚体、三聚体或多聚体环状物,然后根据分子质量的不同用化学方法使环状物沉淀,最后将抗体释放而使抗体纯化。与层析法相比该方法具有以下优点:1纯化出来的抗体具有2个Fab结合位点,所以抗体活性强;o该法操作简便、快速、廉价;?该法产量高,纯度高。Basar等(2009)首次使用该方法对小鼠腹水IgGDNP和IgGDg n进行纯化,其产量均高于80%,纯度大于95%;但是该方法也有一个缺陷,即抗原必需具有多个抗体结合位点。
3.3组合法不同纯化方法的组合及不同的操作顺序均会影响抗体的纯化,合理的组合会大大提高抗体的纯度和产量。马乱冰等采用IM AC和GFC 两步串联纯化鼠抗人CD28单抗2F5,结果显示抗体纯度大于90%,总回收率为70%,纯化的单抗在体外对人外周血T细胞(peripheral blood T cells, PBT C)具有明显的促增殖作用,表明抗体活性良好。Ishihara等采用Protein A亲和色谱-AEX-CEX三步法纯化人源性单抗(hmAbs),并根据其氨基酸序列预测色谱的洗脱条件,包括Pr otein A亲和色谱的洗脱pH、AEX的流动相pH和CEX的洗脱盐浓度,结果hmAbs的纯度为97%~99%。陈华等(2006)用盐析与疏水电荷诱导层析相结合的方法纯化单克隆抗体,其抗体纯度大于90%,总回收率为65%,生物活性好。
4结语
上述介绍的各种方法是目前对抗体纯化较成熟且较为常用的方法,可根据不同的目的和试验条件,采用比较合适的方法对所制备的单克隆抗体进行纯化。单克隆抗体在生物学和医学领域的应用越来越广,寻找和研究更为有效的单克隆抗体纯化方法有助于将抗体应用于多科学研究中,从而推动生物医学和生命科学向前发展。
参考文献
1Bilgicer B,Th om as S W,et al.A n on-ch romatographic m ethod for the purification of a bivalently active monoclon al IgG antibody from biological flu ids.J Am Chem Soc,2009,131(26):9361~ 9367.
2Bos chetti E.Antibody s eparation by hydroph ob ic charge indu c-tion chr om atography.T rends Biotechn ol,2002,20(8):333~ 337.
3C hen J,Tetrault J,et al.C om parison of standard and new gener-ation h ydrophobic interaction ch romatography res ins in th e mon-oclonal antibody purification process.J Ch rom atogr A,2008, 1177(2):272~281.
4Dan iela Todorova-Balvaya,Olivier P,M ustapha B,et al.Immo-bilized m eta-l ion affinity chromatography of human antibodies and their proteolytic fragments.J ou rnal of Chr om atography B, 2004,808(1):57~62.
5Garcia-Gonzalez M,Bettinger S,et al.Purification of murin e IgG3and IgM m on oclonal antibodies by euglob ulin precipitation.
J Imm unol M eth ods,1988,111(1):17~23.
6Gh os e S,Hub bard B,et al.Protein in teractions in hydr oph obic charge in duction ch rom atography(H CIC).Biotechnol Prog, 2005,21(2):498~508.
7H ari P R,Willi P,Chandra P,et al.Adsorption of hu man IgG on Cu2+-immobiliz ed cellulose affinity membrane:preliminary study.J ou rnal of Biomedical M aterials Res earch,2000,50(2): 110~113.
8Liu X,Song H.Developmen t and application of thiophilic adsorp-tion ch romatography for antibody purification.Se Pu,2006,24
(1):88~92.
9M arecek F.Is olation of immun oglobulins by thiophilic adsorption chromatog raphy.Ceska S lov Farm,2004,53(6):280~284.
10S anchayita G,Brian H,S teven M C.Evaluation and comparison of alternatives to Protein A chromatograph y M im etic and hydro-ph ob ic charge induction chromatog raphic station ary phase.Jour-nal of Chromatograp hy A,2006,1122:144~152.
11S tein A,Kiesew etter A.Cation exch ange chr om atography in antibody pu rification:pH screenin g for optimised binding and
H CP rem oval.J Chromatogr B Analyt T echnol Biomed Life S ci,
2007,848(1):151~158.
12Valerie B,Joy J,W inzerling,et al.Rapid on e-step pu rification of goat im munoglobulins by immobiliz ed metal ion affinity chro-matograp hy.Journal of Immun ological M ethods,1995,181(2): 225~232.
13Yakup A M,Emine Y,G lay B.Preparation and ch aracter isation of surfaces pr operties of poly(hydroxyeth ylmeth acrylate-co-m ethacrylolyamido-histidin e)memb ran es:application for purif-i cation of human immun oglobulin G.J ou rnal of C hromatography B,2004,807:315~325.
14Yu Y C,H uang,et al.Purification of antibodies from protein m ixtures and mous e ascites fluid using Zeolite X.Biotechnol Prog,1998,14(2):332~337.
蛋鸡骨骼肌卫星细胞分离培养及鉴定
郑素月1,樊宝良1,2,张庆桥1
(1.河北工程大学农学院,河北邯郸056038;2.河北农业大学动物科技学院,河北保定071001)
摘要:采用组织块分离法从蛋鸡鸡胚腿部肌肉组织中体外培养获取鸡骨骼肌卫星细胞,对培养的细胞进行了传代、冻存和复苏研究,同时从分子表达水平对分离培养的卫星细胞进行了鉴定,建立了一套鸡骨骼肌卫星细胞分离、传代、冻存和复苏的方法。特异基因表达鉴定结果表明,该方法分离得到的细胞能够表达卫星细胞特异的标志基因P ax7,而肌细胞分化基因M y oD、M y ogenin未表达,说明获得的肌卫星细胞纯度较高,尚未进行肌细胞的分化。
关键词:蛋鸡;骨骼肌;卫星细胞;培养;鉴定
中图分类号:Q813文献标识码:A文章编号:1671-7236(2011)02-0080-04
骨骼肌卫星细胞是骨骼肌中位于肌细胞膜和基膜之间的具有增殖分化潜力的肌源性干细胞,负责骨骼肌的生长和骨骼肌的损伤修复。最早于1961年由Mauro在蛙骨骼肌中发现。Bischoff(1975)首次从大鼠骨骼肌中分离出来并进行体外培养。此后,随着对其研究的不断深入,人们逐渐认识到卫星细胞具有使受损肌肉再生的潜能。肌卫星细胞作为组织工程的种子细胞用于修复瘫痪的肌肉,对恢复肌肉的动力功能有广阔的前景和应用价值(Dasar-athy等,2004)。目前,卫星细胞已从吐绶鸡、羊、牛、猪、狗及人的骨骼肌中也相继分离出来,但在蛋鸡的骨骼肌中分离报道较少。本研究采用组织分离
收稿日期:2010-08-12
作者简介:郑素月(1969-),女,河北人,副教授,博士,从事微生物与生物技术研究。
通信作者:樊宝良(1966-),男,河北人,教授,博士,从事动物遗传与育种研究。E-mail:fan b1119@https://www.doczj.com/doc/016312980.html, 基金项目:河北省自然科学基金(C2008000713);国家863计划项目(2007AA100504)。法培养了大量优质的鸡骨骼肌卫星细胞,并进行了传代、冻存和复苏,同时从分子表达水平对鸡骨骼肌卫星细胞进行了鉴定,建立了一套较完备、快速的鸡骨骼肌卫星细胞的培养和鉴定方法,旨在为鸡骨骼肌卫星细胞的进一步应用研究及该卫星细胞系的建立奠定基础。
1材料与方法
1.1材料及试剂
1.1.1鸡胚18胚龄SPF蛋鸡种蛋,品种为大午京白939,购自河北某种禽有限公司。
1.1.2试剂T ransZol Up试剂盒和反转录TransScript TM Two-Step RT-PCR SuperMix(TRANS)试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司;去除基因组DNA试剂购自宝生物工程(大连)有限公司; PCR扩增试剂购自天根生化科技(北京)有限公司;细胞培养用DMEM和胎牛血清购自美国GIBCO 公司。
1.2方法
1.2.1鸡卫星细胞的分离和培养取18日胚龄大
Progresses on Purification of Monoclonal Antibody
TANG Jia-jia,LI Xiao-bing,LIU Guo-w en,KONG Tao,LIU Lei,YANG Wei,WANG Zhe (Animal Science and V eter ina ry M edicine Colleg e o f Jilin U niv ersity,Chang chun130062,China)
Abstract:M onoclo nal antibody play an impo rtant ro le in the f ields of modern bioinstrumentation and medical tr eat.Reg ard-less of the subty pes and the forms of sauce,any antibody should be purified befo re being used t o detect and therapy.T he meth-ods of pur ification are different by the kinds and purpose of antibodies.T hey can be div ided into tw o ty pes,sediment ation and chromat og raphy.T his paper r eview these methods by the range of applicat ion,purit y of o ut put,coefficient o f recover y,cycle of purification,batch of samples and cost.
Key words:monoclonal antibody;pur ificatio n;sedimentation;chromat og raphy
单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针
对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
抗抑郁药药理学研究进展 摘要：由于市场经济所带来的快节奏，人类的精神、心理等方面的压力越来越大，抑郁症的发病率不断上升，目前已成为世界第四大疾患。随着对抑郁症发病机制的深入研究，抑郁症也越来越被人们所认识，药物治疗逐渐成为治疗抑郁症的主要方法。就现代药物治疗抑郁的药理学研究进展进行了综述。 关键词：抗抑郁药；抑郁症；研究进展 抑郁症(depression)是一种常见的情感障碍性精神疾病，其临床表现为情绪低落、悲观、睡眠障碍等，严重者常出现自杀冲动，是世界上最易致残的疾病之一。据WHO统计，各种类别抑郁症的患病率已占全球人口的3%～5%，到2020年，抑郁症可能成为仅次于心脏病的第二大疾病。抑郁症的治疗方法很多，以往主要给予心理治疗，近20年来，随着对抑郁症病因学研究的进展，逐步确立了药物治疗的主导地位。现就抑郁症的药物药理学研究进展进行综述。 1 单胺氧化酶抑制剂(MAOIs) 单胺氧化酶抑制剂异丙烟肼是第一个用于治疗抑郁症的药物，为异烟肼的异丙基衍生物。其主要机理是通过抑制MAO活性，减少中枢神经系统内单胺类神经递质的降解，从而产生抗抑郁作用。此后相继有很多类似的化合物用于临床治疗，主要有超苯丙胺、苯乙肼、异卡波肼等。但这类药物不良反应较多，是心血管病人和老年患者的禁药，所以国内逐渐停用。吗氯贝胺是第三代具有选择性的MAOI，疗效相同于TCAs，安全性高，无传统MAOI的不良反应，不需要限制饮食酪胺的含量。其t1/2短，但每日用药2次就能达到临床疗效。 2 三环类抗抑郁药(TCAs) 由于这些药物结构中都有2个苯环和1个杂环，故统称为三环类抗抑郁症药。三环抗抑郁剂是紧接MAOIs之后的另一类抗抑郁药，主要有丙咪嗪、阿米替林、多虑平、氯丙咪嗪等。TCAs的抗抑郁作用主要是通过抑制中枢神经突触间隙NE和5-HT再摄取，增加这些物质在突触间隙的含量，使病人精神振奋，情绪提高。自20世纪50年代末使用至今，其抗抑郁作用经受了考验，即使与新型抗抑郁药相比，它的疗效也是值得肯定的，目前主要用于重度抑郁症。 3 四环类抗抑郁药 四环结构与三环没有什么本质不同，但它对NA的作用明显大于5-HT，这是其它品种所没有的特点。代表药物为米安色林(manseri-ne)、马普替林(maprotiline)。其中，马普替林为选择性NE再摄取抑制剂，有强大的抗抑郁作用，用于治疗重度抑郁症，疗效良好。米安色林能选择性阻断突触前膜α-肾上腺素受体，可安全地用于老年人和心脏病人，对抑郁性神经症疗效较好。
单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫
单克隆抗体药物研究新进展 单克隆抗体药物，俗称“生物导弹”，是一种具备疾病治疗靶向性治疗的药物，该种药物针对一些对应疾病的治疗具备极强的治疗针对性，往往可以取得较为有效的治疗效果，其整体所占市场份额也比较大。该领域的药品已经慢慢成为一种治疗疾病的主流药物，随着相关研究人员的不断研究推进，其整体呈现一种不断拓宽化的发展。本文从单克隆抗体药物整体的市场情况、靶点及技术三个方面进行全面的研究探索。 标签：治疗性抗体；上市抗体药物；靶点；技术综述 抗体药物的第一次应用是于十九世纪，采用血清疗法针对患者进行相关治疗，在这个阶段人们对抗体药物的认知停留在使用有效的阶段；随着医疗实力的不断发展，直到1975年杂交瘤技术之后，才逐步实现了抗体的更为全面的认知及大规模量产的过程。现阶段随着社会的不断发展，疾病种类也越来越多，治疗起来也越来越麻烦，在这样一种大的背景下，单克隆抗体药物的全面研究和使用，有效的帮助患者进行疾病的靶向治疗和恢复。 一、抗体药物的市场情况 抗体药无是一种具备靶向性，能实现与靶抗原特异性结合来实现对疾病针对性治疗的药物，该种药物在进行使用的过程中，对患者的病症能做到针对性的治疗，具备治疗过程中的安全性治疗及快速准确性治疗。该种药物常常作用与一些恶性肿瘤及免疫性疾病的治疗。因为这些疾病都具备一定的治疗难度，故此药物的出现，可以有效的实现对症治疗，帮助患者进行相关疾病的缓解，因为这样的一种原因，导致在进行相关应用的过程中，该种药物得到了巨大的发展[1]。现阶段，单克隆抗体药物已经成为一种在市场上占据巨大份额的药物，其具备巨大的经济效益，同时帮助患者进行各种疾病的治疗和恢复，其整体已经成为针对疾病进行治疗的有效思路及理论。针对该种药物的扩展，主要是针对一些靶向性进行全面的研究，研究出新的靶点，制造出更多针对更多病症的单克隆抗体药物。 二、靶点研究进展 单克隆抗体药物具备一对一的治疗针对性，其靶点的把控是针对疾病治疗的重要点。世界范围之内，针对新靶点的研究如火如荼。针对热点靶点的研究，主要通过分析世界范围内患者的病症及发病几率进行全面的分类研究，研究出一些有效且具备普遍性的靶点，全面促进单克隆抗体药物的研究和发展。其现阶段世界主要研究靶点分以下几类。 （一）PD-1、PD-L1 PD-1是一种存在于T细胞表面的免疫抑制跨膜蛋白，主要针对癌症进行相关治疗，其主要作用有两点：1.针对慢性感染炎症进行相关限制；2.针对癌症中
单克隆抗体的制备技术和纯化及鉴定 一、实验目的： 单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。 二、实验原理： 骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA 的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。 三、试剂与器材： 细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。 四、操作方法： 1、抗原制备； 一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。 A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为～，间隔３～５周再同样注射一次，
１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原～，３～４天后，杀死小鼠取脾做融合用。 B. 颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠，以１％浓度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。有人认为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。 2、免疫动物； 目前应用最广的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠为好。就品系而言以Balb/ c小白鼠应用最广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来。Balb/c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以8~12周龄为宜。 大白鼠也可，能产生较多量的单克隆抗体。现在已经在小鼠杂交瘤的基础上，发展了小鼠－大鼠，小鼠－人以及人－人杂交瘤技术。 免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一。 正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生×107~×107种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。 B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。有人认为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合，而免疫以后7~8天，虽然是抗体产生的高峰时期，但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。故一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。 3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备； 脾细胞制备 (1) 免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠，拉颈或用CO2处死小白鼠。 (2) 将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。
浅谈单克隆抗体药物 摘要：单克隆抗体药物是生物医药领域中最耀眼的明珠。该类药物具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，代表了药品治疗领域的最新发展方向，在肿瘤、自身免疫性疾病的治疗手段不断升级过程中，单抗药物扮演着不可替代的角色，已经成为全球靶向治疗药物的主流。在刚刚兴起的细胞免疫治疗中，单抗药物同样是位列第一的品类，单抗产业是目前乃至未来医药行业中极具投资价值的细分行业。本文从单克隆抗体简介，常见的单克隆抗体药物、国内外单克隆抗体药物的研发现状，及对单抗药物的展望几个方面做一简介。 关键词：单克隆抗体单抗药物研发现状 1单克隆抗体 抗体是由B淋巴细胞转化而来的浆细胞分泌的，每个B淋巴细胞株只能产生一种它专有的、针对一种特异性抗原决定簇的抗体。这种从一株单一细胞系产生的抗体就叫单克隆抗体，简称单抗。这些抗体具有相同的结构和特性。抗体与特异性表达的肿瘤细胞表面蛋白质结合，从而阻碍蛋白质的表达，起到抗肿瘤作用。抗体还可使B淋巴细胞产生免疫反应，诱导癌细胞凋亡。早期单抗为鼠源性单抗,易被人体免疫系统识别，应用受到限制。后来采用基因工程的方法生产人源或人鼠嵌合型单抗，广泛应用于临床。 2常见的单克隆抗体药物 2.1利妥昔单抗（Rituximab）-美罗华-CD20单抗 第一个被美国食品药物管理局（FDA）批准用于临床治疗的单抗，是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，能特异性地与CD20结合，导致B淋巴细胞溶解的免疫反应，抑制其增殖，诱导成熟B淋巴细胞凋亡和提高肿瘤细胞对化疗的敏感性。90%以上的B淋巴细胞淋巴瘤细胞均有CD20表达，不表达于非定向干细胞或浆细胞。本药可使耐药淋巴瘤细胞对VP-16、顺铂重新敏感，用于CD20表达的复发或化疗耐药的惰性B淋巴细胞淋巴瘤，有效率46%。利妥昔单抗+CHOP 方案为治疗弥漫大B淋巴细胞淋巴瘤标准方案，可使全完缓冲（CR）率、生存时间明显延长[2-3]。 2.2曲妥珠单抗-赫赛汀-HER-2单抗 为重组DNA人源化的抗p185蛋白（癌基因）单克隆抗体-IgG抗体。进入人体后能选择性地与由细胞核内表皮生长因子2基因调控的p185糖蛋白结合。本
单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合
2009年第1期畜牧兽医科技信息国兽医科学,2007,37(1):29-32 [9]李余动,等.胶体金免疫层析法快速检测氯霉素残留[J].中国食品卫生杂志,2005,17(5):416-419 [10]张明,等.免疫胶体金法检测磺胺甲恶唑残留的研究[J].中国兽药 杂志,2006,40(4):17-24 [11]邓省亮,等.胶体金免疫层析法快速检测黄曲霉毒素B1的研究 [J].食品科学,2007,28(2):232-236 [12]Sun Xiulan,et al.Preparation of gold-labeled antibody probe and its use in immunochromatography assay for detection of aflatoxin B1[J].International Journal of Food Microbiology ，2005，99(2):185-194 [13]赖卫华,等.应用胶体金试纸条快速检测赭曲霉毒素A 的研究[J]. 食品科学,2005,26(5):204-207 [14]Timo Klewitz,et al.Immunochromatographic assay for determina tion of botulinum neurotoxin type D[J].Sensors and Actuators B:Chemical,2006,113(2):582-589 1975年德国学者Kohler 和英国学者M ilstein 发明了杂交瘤技术。他们成功地将骨髓瘤细胞和产生抗体的B 淋巴细胞融合为杂交瘤细胞，这种合成的杂交瘤细胞稳定、有致瘤性、能产生抗体，其分泌的抗体是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体，故称之为单克隆抗体(简称单抗)。自从鼠源单抗之后，单抗历经了鼠源性抗体、嵌合抗体、 人源化抗体、人源性抗体4个发展阶段。近年来随着分子生物学和细胞生物学的发展，单克隆抗体的应用已日益普及，单抗理论几乎应用到生物学研究的每一个区域。单克隆抗体制备技术的发展也就显得尤为重要。1 单克隆抗体的研究进展 1.1鼠源性单抗自单克隆抗体制备技术问世以来，制备单抗的一般程序基本相同，从超免疫的供体中即抗原免疫的小鼠，获取脾细胞，再与骨髓瘤细胞融合，最后对单个细胞进行克隆，培养出能分泌单抗的克隆细胞。目前生产的单抗大多是鼠源性的，但其在临床应用方面还存在着很大的弊端，主要是鼠源单抗与NK 等免疫细胞表面Fc 段受体亲和力弱,产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)作用较弱，而且它与人补体成分结合能力低,对肿瘤细胞的杀伤能力较弱，并且鼠源性抗体在人血循环中的半衰期短，它发挥AD-CC 作用的时间较短； 其次鼠单克隆抗体还具有免疫原性，使宿主易引起过敏反应。这样一方面降低了单抗的效价，另一方面又会给病人带来严重的后果。因此鼠源性单克隆抗体还应进一步改善才能广泛应用于临床。 1.2嵌合抗体抗体的恒定区是抗体分子结构中免疫原性 最强的部位，而决定抗体特异性的是抗体的可变区。从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig 恒定区的基因连 接,再插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。也就是将鼠源性单抗在保留其抗原结合活性的基础上，尽可能的去除鼠源化部分或代之以人源化片断，减少了鼠源性抗体的免疫原性，从而尽可能的减少单抗的异源性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。但是这种抗体仍保留了30%的鼠源性，可诱发人抗小鼠反应(HAM A)。 1.3人源化抗体由于嵌合抗体异源性仍然很大，因此需要对鼠源抗体进行人源化改造，进一步人源化的方法很多,主要是重构抗体和表面重塑技术。重构抗体就是互补决定区(complementarity determining region,CDR)移植，将鼠抗体的CDR 移植到人抗体的相应部位，这样人源化程度可达90%以上，目前该方法是人源化单抗最常用、最基本的方法。而表面重塑技术，即将鼠抗体框架区表面氨基酸的残基(surface amino acid residues,SAR)进行人源化改造。该方法是仅替换与人抗体SAR 差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换。 1.4人源性抗体虽然人源化抗体解决了鼠抗体的免疫原 性等问题，但生产人源化抗体仍有很大的困难；人源化过程需大量繁复、昂贵的电脑模拟，需取代不同的氨基酸以恢复选择性和亲和力，工作量非常大，并且它总还含有少量鼠源性成分。完全的人源性抗体才是用于治疗的理想抗体，目前它主要通过3种途径来研制：噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术和转基因小鼠制备人源性抗体。1.4.1 噬菌体抗体库技术 噬菌体抗体库技术是迄今发展 最成熟、 应用最广泛的抗体库技术。其基本原理是将蛋白分子或肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA 中,与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白,从而使该异源分子呈现于噬菌体表面。通过这种方式,形成了一个收藏上亿个以体外方式制得的不同抗体的基因数据库,使从任何真实的抗原中迅速分离高度相似的同族抗体成为可能。分离得到的抗体可用于 单克隆抗体及其应用的研究进展 孔 维1，杨文辉2 （1.东北农业大学动物医学院，哈尔滨150001；2.哈尔滨北方森林动物园，哈尔滨150300） 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000作者简介：孔维（1979～），湖南平江人，硕士研究生 专论与综述 9
单克隆抗体技术 第一节单克隆抗体的研制 一、单克隆抗体的概念 抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学实验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞地单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）、杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的着名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT 培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。 这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样的。 （二）、基本程序和方法 杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。 在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，
单克隆抗体的制备、纯化及鉴定 一、实验目的： 单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。 二、实验原理： 骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。 三、试剂与器材： 细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。 四、操作方法： 1、抗原制备； 一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。 A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。
药物化学有关抗抑郁药的研究进展 盖聪昊 摘要：随着社会的发展，人们的生活水平也在提高，但是由于工作或者家庭等因素影响，抑郁症患者的患病人数也不断增加，而抑郁症造成的死亡人数也在直线攀升。目前，抑郁症已成为世界第四大疾病，成为全球性严重问题。[1]然而，抑郁症的病因尚不清楚。有说法认为与脑内单胺类的功能失调有关。由于缺乏脑内神经末梢突出前部释放的5-羟色胺和去甲肾上腺素类神经介质，造成精神失常，同时，当去甲肾上腺素功能低下时，机体会表现出抑郁症。因此，抗抑郁症药物可以通过调节肾上腺素和5-羟色胺含量治疗抑郁症。现今，抗抑郁药物根据作用机制可分为四类：①单胺氧化酶抑制剂②5-羟色胺重摄取抑制剂③去甲肾上腺素重摄取抑制剂④α2 肾上腺素受体阻断剂。本文将若干抗抑郁药物的研究成果及市场调研情况进行了筛选和整理，对抗抑郁药物的研究进展及现今抗抑郁药的市场情况进行综合分析。 关键词：精神疾病，抗抑郁药物，研究进展，构效关系，病理机制 1、单胺氧化酶抑制剂（MAOI） 单胺氧化酶抑制剂是最早用于抑郁症治疗的药物，在20世纪五十年代被发现，在当时被广泛使用并取得一定成效。其中大多数为肼类，具体有异烟肼、苯乙肼、异卡波肼等。但由于此类药物都含有肼结构，毒性较强，有较大副作用，临床表现为急性肝脏萎缩，高血压危象等。因而逐渐退出市场。苯乙肼与异卡波肼现今尚临 床用于恐惧症[2] 1.1代表药物 1.1.1吗氯贝胺 吗氯贝胺的化学名称为4-氯-N-[2-（4-吗啉基）乙基]苯甲酰胺，由异丙醇重结晶得到的白色结晶性粉末，mp.138~139℃。合成方法是以吗啉与丙烯酰胺反应，再经次氯酸钠降解得到4-（2-氨基）乙基吗啉。再用对氯苯甲酸和氯甲酸乙酯反应形成酸酐后，与4-（2-氨基）乙基吗啉酰胺反应所得。 吗氯贝胺是特异性MAO-A的可逆性抑制剂，临床对精神运动性迟滞的抑郁患者适用,对用TCA无效的抑郁症、非典型性抑郁症和伴焦虑的老年患者也有疗效,也能改善睡眠质量[3]。该药杜绝了肼类药物的肝脏毒性，且不良反应较轻，停药24小时内即可恢复MAO活性。是MAO-A抑制剂类药物的代表药物。 1.2.2托洛沙酮 托洛沙酮也是一类新型结构的特异性MAO-A 可逆性抑制剂，可以选择性抑制单胺氧化酶活性，阻 断5-羟色胺和去甲肾上腺素代谢。。此药口服吸收快， 给药30min即可达到血液浓度高峰。
论人源化单克隆抗体的研究进展 *** （生物工程一班生命科学学院 ***大学哈尔滨 150080） 摘要：自从单克隆抗体问世至今已广泛应用与临床治疗，然而鼠源性单克隆抗体在临床治疗中会产生人抗鼠抗体反应，从而使鼠源性单克隆抗体的应用受到极大限制。随着基因工程技术和抗体工程技术的迅速发展，人源性单克隆抗体开始快速发展而逐渐代替鼠源性单克隆抗体。本文将就人源化单克隆抗体的构建以及其在临床治疗方面的应用进行综述。 关键词：单克隆抗体人源化临床治疗 Theory humanized monoclonal antibody research progress *** (The 1st class of Bioengineering , College of Life Science, *** University, Harbin, 150080) Abstract: Since the advent of monoclonal antibody has been widely applied in clinical treatment, but the mouse source sex monoclonal antibodies in clinical treatment will produce people resistance to mouse antibody response, so that the rat source sex monoclonal antibody application are highly limited. Along with the genetic engineering technology and the rapid development of antibody engineering technology, humanized sex monoclonal antibody began to rapid development and gradually replaces the rat source sex monoclonal antibody. This paper will review humanized monoclonal antibody construction and the application of clinical treatment in this article. Keywords: monoclonal antibody humanized clinical treatment 1975年。Kohler和Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经免疫的小鼠脾细胞融合，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞机能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术[1]，此后单抗药物开始迅速发展并广泛应用于临床。1982年，Philip Karr 将第一株抗独特型单抗(anti- ld) 应用于B细胞淋巴瘤的临床治疗并取得成功[2]，使得治疗性抗体的研究很快成为生物医药的热点，许多以单克隆抗体为研究对象的公司相继成立。然而，鼠源性单克隆抗体应用于人类有较强的免疫原性，能诱发人抗鼠抗体( Human ant-i mouse antibody, HAMA) 反应，引起强烈的免疫排斥反应[3]，而且鼠源性单克隆抗体不能有效地激活人体的生物效应功能，因此限制了其临床应用。这使研究学者意识到研制鼠源性单克隆抗体人源化或完全的人源性抗体才有可能减少或避免HAMA反应并提高疗效。然而反复实验证明, 杂交瘤技术不能提供稳定分泌人抗体的细胞株。直到80年代末期，随着分子生物学研究的深入，在抗体基因工程研究领域相继出现了一
单克隆抗体的制备及其应用研究进展 燕珊珊 摘要:单克隆抗体技术的突破为医学和生物学的基础研究开创了新纪元。基因工程抗体技术的发展更为疾病治疗、临床试验和科研方面做出巨大贡献。此外，抗体还可能执行除目前所具有之外的更多功能。本文将就单克隆抗体的制备及其应用研究进展进行论述。 关键词:单克隆抗体；基因工程；小鼠骨髓瘤细胞；细胞杂交瘤技术；噬菌体；临床应用 抗体是机体免疫系统的重要效应分子，从第一代多克隆抗体（polyclonalantibody,PcAb）到第二代单克隆抗体的成功制备，人们投入了大量的临床应用研究，对医学和生物学的发展发挥了巨大的作用。 单克隆抗体（monoclonal antibodies，mAbs）技术的突破为医学和生物学的基础研究开创了新纪元。基因工程抗体技术的发展更为疾病治疗、临床试验和科研方面做出巨大贡献。目前，制备mAbs 的方法中比较成熟的主要有以下几种：1. 抗原特异性的B 淋巴细胞杂交瘤技术；2. 人-鼠嵌合抗体制备技术； 3.噬菌体展示技术获得的抗原特异性人源性抗体；4. 转基因小鼠制备的人mAbs；5.核糖体展示技术。
通过这些方法，我们利用相应抗原靶向构建治疗性抗体，从而达到预防、治疗疾病的目的，促进生物制药学的发展。以下主要是对抗体制备技术的发展及其应用研究进展进行综述。 1 鼠源性抗体 1975 年，Kohler 和Milstein[1] 将小鼠骨髓瘤细胞和经绵阳红细胞免疫的小鼠脾细胞融合，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞既能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。由免疫B细胞-浆细胞、瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞系可分泌单一、特异性、纯化的抗体，且能在选择培养基中生长、无限增值、分裂，同时在选择培养基作用下，利用代谢缺陷补救机理筛选出同时具有两种细胞特征的细胞克隆。这种经过反复克隆而挑选出来的融合细胞所产生的抗体称为单克隆抗体(McAb)。它在分子结构、氨基酸序列以及特异性等方面都是一致的。淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等。至今，科学家们已经建立众多鼠源性mAbs 来诊断和治疗多种人类疾病。然而作为在人体内的应用，鼠源单抗尚存在一些问题。鼠源性抗体作为异种蛋白应用于人体可引起免疫反应，产生人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody,HAMA）[2]，很大程度上限制了mAbs 的临床应用。此外，鼠源性mAbs 不能与人类抗体FcRn 结合[3]。为了克服以上这些问题，近年，随着分子生物学的发展，人们已有可能通过抗体工程技术制备人-鼠嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
单克隆抗体 一、单克性抗体的制备 1、免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生效应B淋巴细胞的过程。 2、将准备好的骨髓瘤细胞与效应B淋巴细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇或灭活的病毒。在聚乙二醇或灭活的病毒作用下，各种效应B淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。 3、选择性培养选择性培养的目的是筛杂交瘤细胞。在选择性培养基上未融合的骨髓瘤细胞、未融合的淋巴细胞，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞才能在选择性培养基存活，杂交瘤细胞既能无限增殖，又能分泌特异性抗体 4、杂交瘤细胞的克隆化培养和抗体阳性检测。选择性培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。 5、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内培养法和体外培养法。 (1)体内培养法；用注射器抽取腹水，从中可获得大量单克隆抗体。 (2)体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。从培养液中获取所需要的单克隆抗体。 二、单克性抗体的特点 特异性强、灵敏度高、能大量制备 三、杂交瘤细胞的特点 杂交瘤细胞既能无限增殖，又能分泌特异性抗体 四、单克隆抗体制备过程中有三个筛选过程 1、从脾脏中筛选出多种效应B细胞。 2、在特定的培养基中筛选杂交瘤细胞 3、进行克隆化培养和抗体阳性检测，筛选出能产生特定抗体并能无限增殖的杂交瘤细胞。 五、单克隆抗体应用的基本原理是：抗原——抗体的的特异性结合。 六、单克隆抗体的主要应用 1、作为诊断试剂：单克隆抗体最广泛的应用就是作为诊断试剂。由于单克隆抗体纯度高、特异强，能准确地识别抗原物质的细微差别，并能与一定抗原特异性结合。 2、用于治疗疾病和运载药物。把抗癌细胞的单克隆抗体放射性同位素、化学药物或细胞毒素结合制成生物导弹。利用抗原——抗体的的特异性结合，借助单克隆抗体的导向作用，能将药物定向带到癌细胞所在部位，在原位杀死癌细胞，不损伤正常细胞、药剂量少、疗效高、毒副作用小。
单克隆抗体分离纯化中的离子交换层析介质 离子交换层析介质在生物技术制药中应用广泛。可以设计层析工艺中的各个步骤中使用，如：捕获，中度纯化、精细纯化等步骤。在抗体纯化工艺中广泛使用的三步法：protein A捕获-阳离子交换-阴离子交换。 2.1.阳离子交换CEX层析介质 在抗体纯化工艺中，CEX一般使用吸附模式（Bind-and-Elute BE）。阳离子交换可以去除HCP、脱落的Protein A以及部分高分子量的聚体等杂质。Protein A 的PI在5.1；而单克隆抗体的PI一般在4-9，大部分在PI超过6.0。更改上样的pH 可以使脱落的Protein A的或Protein A的降解片段在流穿中去除，也可在上样后 的中间清洗步骤中去除。文献报道阳离子交换的载量（Protein A捕获洗脱样品） 在几十mg/ml 以上。并且收率较高均>98%. Sp Sepharose FF 是在生物制药中使用非常广泛的一类阳离子交换介质。琼脂糖为生物兼容性层析介质，这类介质是纯化工艺中初步分离粗的混合物的首选。此时良好的分辨率与高流速的结合是非常重要的。这些介质的常规线流速是100至400cm/h。 2.2.阴离子交换AEX层析介质 阴离子交换在抗体纯化工艺中可以去除DNA、病毒、Protein A脱落、内毒素、部分聚体以及酸性的HCP。 在抗体工艺中AEX层析一般采用流穿模式（Flow-through FT），既上样过 程中抗体在穿透峰，杂质吸附在层析介质上。对于PI比较高的抗体分子，pH在7-8.0左右时，抗体流穿。而DNA、内毒素以及病毒等可以吸附在层析介质上。文献报道，阴离子交换的载量在140mg/ml 以上。根据抗体的性质，选择适当的pH，在低电导下，抗体流穿。典型的结果：收率99%，DNA<10pg，protein A<10ppm. Q Sepharose FF 是在生物制药中使用非常广泛的一类阳离子交换介质。琼脂糖为生物兼容性层析介质，这类介质是纯化工艺中初步分离粗的混合物的首选。此时良好的分辨率与高流速的结合是非常重要的。这些介质的常规线流速是100至 400cm/h。
抗抑郁药研究进展及评价 宁波市康宁医院周东升 随着现代生活的节奏加快，人们抑郁情绪较多出现，世界卫生组织将抑郁症确定为世界第四大疾病，并预测到公元2020 年，其将上升为全球第二大疾病，但令人意想不到的是，仅仅过了6-7 年时间，抑郁症现已上升为世界第二大疾病 (仅次于心脑血管病之后) 。这样使得抗抑郁药具有广阔的市场前景。抗抑郁药对抑郁症的治疗有着不可替代的重要作用，超过2/3 的抑郁症患者通过抗抑郁药的治疗可以取得一定的效果。通过研究抗抑郁药的进展，对目前市场上应用的主要抗抑郁药的种类以及药效进行阐述，同时对各种抗抑郁药的药理、用法以及不良反应进行总结，对其研究前景进行展望，希望能对医院的相关治疗提供参考，并借此抛砖引玉，为相关领域学者的研究提供启发。相信通过本章学习，可以加深对抗抑郁药了解以及掌握，可以合理地应用其优点达到治疗病患的目的，并避免抗抑郁药的一些缺点， 达到抗抑郁药的经济适用，不但可以为患者减轻经济负担，同时可有效避免卫生资源的浪费。 在国外，抑郁症与焦虑症药物销量合计已占中枢神经药物市场份额的45%，而抑郁药与精神分裂症治疗剂合计占世界精神病药物的80%。综观我国，由于诊断技术落后于西方同行以及国内百姓对此病认识不足，人们即使得了抑郁症也很少会主动去医院治疗。所以，目前国内抑郁症病人的治疗比例仍只有10%左右，远远落后于世界抑郁症病人的治疗率。由此可见，抗抑郁药在我国有着良好的市场发展空间。 第一节：抑郁障碍及抗抑郁药简述 1抑郁障碍的治疗目标 (1) 提高抑郁障碍的显效率和临床治愈率，最大限度减少病残率和自杀率。成功治疗
的关键在于彻底消除临床症状，减少复发风险。长期随访发现，症状完全缓解(HAM住7)的思者复发率为13%，部分缓解(HAMD减分>50%)的患者复发率为34％。 (2) 提高生存质量，恢复社会功能，达到真正意义的治愈，而不仅是症状的消失。 (3) 预防复发：抑郁为高复发性疾病(>50% )。据报道，环境、行为和应激可以改变基因表达。抑郁复发可影响大脑生化过程，增加对环境应激的敏感性和复发的风险。药物虽非病因治疗，却可通过减少发作和降低基因激活的生化改变而减少复发，尤其对于既往有发作史、家族史、女性、产后、慢性躯体疾病、生活负担重、精神压力大、缺乏社会支持和物质依赖的高危人群。 2抑郁障碍的药物治疗 2.1药物的治疗原则抗抑郁药是当前治疗各种抑郁障碍的主要药物，能有效解除抑郁心境及伴随的焦虑、紧张和躯体症状，有效率约60%?80%。根据对抑郁障碍的基本知识和多年临床实践，抗抑郁药的治疗原则是： (1) 诊断要确切。 (2) 全面考虑患者症状特点、年龄、躯体状况、药物的耐受性、有无合并症，因人而异地个体化合理用药。 (3) 剂量逐步递增，尽可能采用最小有效量，使不良反应减至最少，以提高服药依从性。 (4) 小剂量疗效不佳时，根据不良反应和耐受情况，增至足量(有效药物上限)和足够 长的疗程(>4?6周)。 (5) 如仍无效，可考虑换药，换用同类另一种药物或作用机制不同的另一类药。应注意氟西汀需停药5周才能换用MAOIs,其他SSR需2周。MAOlS亭用2周后才能换用SSRIs (6) 尽可能单一用药，应足量、足疗程治疗。当换药治疗无效时，可考虑两种作用机制不同的抗抑郁药联合使用。一般不主张联用两种以上抗抑郁药。 (7) 治疗前向患者及家人阐明药物性质、作用和可能发生的不良反应及对策，争取他们的主动配合，能遵嘱按时按量服药。 (8) 治疗期间密切观察病情变化和不良反应并及时处理（9）根据心理-社会-生物医学模式，心理应激因素在本病发生发展中起到重要作用，因此，在药物治疗基础上辅以心理治疗，可望取得更佳效果。 （10）积极治疗与抑郁共病的其他躯体疾病、物质依赖、焦虑障碍等。