多肽简介
目录
一、合成原理
二、固相合成的特点及主要问题
三、多肽合成化学技术介绍
四、多肽合成中肽键形成的基本原理
五、多肽合成方法之酰基叠氮物法
六、多肽合成方法之酸酐法
七、多肽合成方法之对称酸酐法
八、多肽合成方法－N-羧基内酸酐法
九、多肽合成方法之碳二亚胺法
十、多肽合成方法之混合酸酐法
十一、氨基酸保护基有哪些
十二、多肽缩合试剂
十三、多肽合成常见问题及解答
十四、多肽类产品制剂研究现状
附：氨基酸的代码
附2：氨基酸分类
附3：其他知识
一、合成原理
当前化学合成多肽的方法主要有两种，即 Fmoc法和 t Boc法；由于 Fmoc 法比 tBoc法存在更多优势，所以现在较流行的是 Fmoc 法。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，合成方向是从 C 端（羧基端）向 N 端（氨基端）进行；过去多肽合成大多是在液相中进行，现在大多采用固相合成，从而大大的降低了每步产品提纯的难度；为了防止副反应的发生，合成树脂和添加的氨基酸的侧链都是预先被保护的，只有羧基端是游离的，并且在反应之前必须先用化学试剂活化它。
具体合成步骤如下：
1 、去保护： Fmoc 保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂（如：哌啶piperidine ）去除氨基的保护基团。（如图1）
图1
2 、激活和交联：下一个氨基酸的羧基被一种激活剂所激活并溶解，激活的单体与游离的氨基在缩合剂的作用下缩合，形成肽键。（如图2）
图2
3 、循环：这两步反应反复循环直到整条肽链合成完毕。
4 、裂解和脱保护：根据肽链所含的残基不同，用不同的裂解溶剂从柱上洗脱下来，其保护基团被一种脱保护剂（ TFA ）洗脱和脱保护。
二、固相合成的特点及主要问题
固相合成法对于肽合成的显著的优点：简化并加速了多步骤的合成；因反应在一简单反应器皿中便可进行，可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失；固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤未完成中间的纯化，避免了液相肽合成中冗长的重结晶或分离步骤，可避免中间体分离纯化时大量的损失；使用过量反应物，迫使个别反应完全，以便最终产物得到高产率；增加溶剂化，减少中间的产物聚焦（固相载体上肽链和轻度交联的聚合链紧密相混，彼此产生一种相互的溶剂效应，这对肽自聚集热力学不利而对反应适宜）。固相合成的主要存在问题是固相载体上中间体杂肽无法分离，这样造成最终产物的纯度不如液相合成物，必需通过可靠的分离手段纯化。
三、多肽合成化学技术介绍
多肽化学已经走过了一百多年的光辉历程，1902年，Emil Fischer首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢当时合成采用了苯甲酰，乙酰保护，脱去相当困难，而且容易导致肽链断裂。直到1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基（Z）来保护α-氨基，该保护基可以在催化氢化或氢溴酸的条件下定量脱除，多肽合成才开始有了一定的发展。到了20世纪50年代，随着越来越多的生物活性多肽的发现，大大推动了有机化学家们对多肽合成方法以及保护基的研究，因此这一阶段的研究成果也非常丰富，人们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素（oxytocin），胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现也提供了实验和理论基础。也就是这个阶段，Fred Sanger发明了氨基酸序列测定方法，并为此获得了1958年的Nobel化学奖。还是他后来发明了DNA 序列检测方法，并于1980年再次获得了Nobel化学奖，成为到目前为止唯一获得两次Nobel化学奖的科学家。1963年，Merrifield提出了固相多肽合成方法（SPPS），这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出来，就由于其合成方便，迅速，现在已经成为多肽合成的首选方法，随后的发展也证明了该方法不仅仅是一种合成方法，而且也带来了有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科，固相有机合成（SPPS）。当然，Merrifield也因此荣获了1984年的Nobel
化学奖。也正是Merrifield，他经过了反复的筛选，最终屏弃了苄氧羰基（Z）在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基（BOC）用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，其可以在酸性条件下定量的脱除，反应也非常迅速，在30min就可以反应完全。由于叔丁氧羰基（BOC）方法中，氨基酸侧链的保护基团大多基于苄基（Bzl），因此也称为BOC-Bzl策略。同时，Merrifield在20世纪60年代末发明了第一台全自动多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124个氨基酸）。随后的多肽化学研究主要集中在固相合成树脂，多肽缩合试剂，氨基酸保护基的研究。1972，Lou Carpino 首先将9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，到了20世纪80年代取代了叔丁氧羰基（BOC），成为了固相多肽合成中的首选合成方法。该方法中氨基酸的侧链大多基于叔丁基（But），因此，也称为FMOC-But策略。同时，在多肽合成树脂，缩合试剂以及氨基酸保护，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。
进入21世纪，随着蛋白质组学的研究深入，对于多肽化学的要求不仅仅是合成方法，而更多的集中在多肽标记与修饰方法，以及蛋白结构与功能模拟多肽的合成以及长肽或蛋白合成。
多肽化学合成方法，包括液相和固相两种方法。液相合成方法现在主要采用BOC和Z两种保护方法，现在主要应用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催产素等，其相对与固相合成，具有保护基选择多，成本低廉，合成规模容易放大的许多优点。与固相合成比较，液相合成主要缺点是，合成范围小，一般都集中在10个氨基酸以内的多肽合成，还有合成中需要对中间体进行提纯，时间长，工作量大。固相合成方法现在主要采用FMOC和BOC两种方法，它具有合成方便，迅速，容易实现自动化，而且可以比较容易的合成到30个氨基酸左右多肽。
四、多肽合成中肽键形成的基本原理
一个肽键的形成（生成一个二肽），从表面上看是一个简单的化学过程，它指两个氨基酸组分通过肽键（酰胺键）连接，同时脱去水。在温和反应条件下，肽键的形成是通过活化一个氨基酸（A）的羧基部分，第二个氨基酸（B）则亲核进攻活化的羧基部分而形成二肽（A－B）。如果羧基组分（A）的氨基未保护，
肽键的形成则不可控制，可能开有成线性肽和环肽等副产物，与目标化合物A －B混在一起。所以，在多肽合成过程中，对不参与肽键形成的所有官能团必须以暂时可逆的方式加以保护。
因此，多肽合成－即每一个肽键的形成，包括三个步聚：
第一步，需要制备部分保护的氨基酸，氨基酸的两性离子结构不再存在；
第二步，为形成肽键的两步反应，N－保护氨基酸的羧基必须先活化为活性中间体，随后形成肽键。这一耦合反应既可作为一步反应进行，也可作为两个连续的反应进行。
第三步，对保护基进行选择性脱除或全脱除。尽管全部脱除要等到肽链全部组装完成后才能进行，但为了继续肽合成，选择性脱除保护基也是必需的。
由于10个氨基酸（Ser、Thr、Tyr、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Ser和Cys）含有需要选择性保护的侧链官能团，使肽合成变得更加复杂。因为对选择性的要求不同，所以必须区分临时性和半永久性保护基。临时性保护基用于下一步要反应氨基酸的氨基或羧基官能团的暂时保护，在不干扰已经形成的肽键或氨基酸侧链的半永久性保护基才脱除，有时也在合成过程中脱除。
在理想状态下，羧基组分的活化和随后的肽键形成（耦合反应）应为快速反应，没有消旋或副产物形成，并应用等摩尔反应物以获得高产率。但遗憾的是，还没有一种能满足这些要求的化学耦合方法相比，适用于实际合成的方法很少。在肽合成过程中，参与多种反应的官能团常常与一个手性中心相连（甘氨酸是唯一的例外），存在发生的消旋的潜在危险。
多肽合成循环的最后一步，保护基要全部脱除。除了在二肽的合成中需要全脱保护以外，选择性脱除保护基对于肽链延长具有非常重要的意义。合成策略要深思熟虑地规划，依战略选择，可以选择性脱除Nα－氨基保护基或羧基保护基。“战略”一词这里是指单个氨基酸的缩合反应顺序。一般来说，在逐步合成和片段缩合之间是有区别的。在溶液中进行肽合成（也指“常规合成”），对困难序列，多数情况下，用肽链逐步延长法只能合成较短的片段。要合成更长的肽时，目标分子必须分割成合适的片段，并确定在片段缩合过程中，它们能使能C端差向异构化程度最小。在单个片段逐步组装完成后，再连接产生目标化合物。肽合成战术包括选择最恰当的保护基组合和最佳的片段偶联方法。
最初的固相多肽合成（SPPS）只是肽和蛋白质逐步合成法的一种变化，其概念是将增长的肽链连接到一个不溶性的聚合物载体上，由Robert Bruce Merrifield在1963年首次报道。今天，为纪念他1984年获得诺贝尔奖而称之为Merrifield。在聚合物载体上，也可以进行片段缩合反应。
五、多肽合成方法之酰基叠氮物法
早在1902年，Theodor Curtius就将酰基叠氮物法引入到肽化学中，因此它是最古老的缩合方法之一。在碱性水溶液中，除了与酰基叠氨缩合的游离氨基酸和肽以外，氨基酸酯可用于有机溶剂中。与其他许多缩合方法不同的是，它不需要增加辅助碱或另一等当量的氨基组分来捕获腙酸。
长期以来，一直认为叠氮物法是唯一不发生消旋的缩合方法，随着可选择性裂解的氨基酸保护基引入，该方法经历了一次大规模的复兴。该方法的起始原料分别是晶体状的氨基酸酰肼或肽酰肼64,通过肼解相应的酯很容易得到。在－10℃的盐酸中，用等当量的亚硝酸钠使酰肼发生亚硝化而转化为叠氮化物,依次洗涤、干燥，然后与相应的氨基组分反应。有些叠氮化物可用冰水稀释而沉淀出来。
二苯磷酰基叠氮化物（DPPA）也可以用于酰基叠氮化物的合成。Honzl-Rudinger方法采用亚硝酸叔丁作为亚硝化试剂，并且使叠氮缩合反应可在有机溶剂中进行。因酰基叠氮化物的热不稳定性，缩合反应需在低温下进行。当温度较高时，Curtius重排，即酰基叠氮转化为异氰酸酯的反应成为一个主要的副反应，最终导致生成副产物脲。由于反应温度低（如4℃）而导致反应速率相当慢，使得肽缩合反应通常需要几天才能完全。
对于较长的N端保护的肽链，酯基的肼解一般比较困难，因此，使用N保护肼衍生物是一种选择。在肼基的选择性脱除后，按倒接（backing-off）策略组合的肽片段可以用于叠氮缩合。
如前所述，虽然叠氮法一直被认为是消旋化倾向最小的缩合方法，但在反应中，过量的碱会诱发相当大的消旋。因此，在缩合反应期间要避免与碱接触，例如，氨基组分的铵盐应采用N，N－二异丙胺或N－烷基吗啉代替三乙胺来中和。虽然有上述局限性，但该方法仍很重要，尤其对于片段缩合而言，因为该方法具有较低的异构化倾向，适用于羟基未保护丝氨酸或苏氨酸组分，同时，Nˊ保护
的肼衍生物还具有多种用途。
六、多肽合成方法之酸酐法
在多肽合成中，最初考虑应用酸酐要追溯到1881年Theodor Curtius对苯甲酰基氨基乙酸合成的早期研究。从氨基乙酸银与苯甲酰氯的反应中，除获得苯甲酰氨基乙酸外，还得到了BZ-Glyn-OH(n=2-6)。早期曾认为，当用苯甲酰氯处理时，N－苯甲酰基氨基酸或N－苯甲酰基肽与苯甲酸形成了活性中间体不对称酸酐。
大约在70年后，Theodor Wieland利用这些发现将混合酸酐法用于现代多肽合成。目前，除该方法外，对称酸酐以及由氨基酸的羧基和氨基甲酸在分子内形成的N－羧基内酸酐（NCA,Leuchs anhydrides）也用肽缩合。最后应该提到，不对称酸酐常常参与生化反应中的酰化反应。
七、多肽合成方法之对称酸酐法
Nα－酰基氨基酸的对称酸酐是用于肽键形成的高活性中间体。与混合酸酐法相反，它与胺亲核试剂的反应没有模棱两可的区域选择性。但肽缩合产率最高，为50%（以羧基组分计）。
虽然由对称酸酐氨解形成的游离Nα－酰基氨基酸可以和目标肽一起，通过饱和碳酸氢钠溶液萃取回收，但在最初，这种方法的实用价值极低。对称酸酐可以用Nα－保护氨基酸与光气，或方便的碳二亚胺反应制得。两当量的Nα－保护氨基酸与－当量的碳二亚胺反应有利于对称酸酐的形成，对称酸酐可以分离出来，也可不经纯化而直接用于后面的缩合反应。基于Nα－烷氧羰基氨基酸的对称酸酐对水解稳定，可采用类似上述纯化混合酸酐的方法进行纯化。
由于Boc-保护氨基酸的商品化和合理的价格，在肽链的逐步延长中，使用对称酸酐法日益受到重视。虽然可以买到晶状的对称酸酐，但原位制备仍然是一种不错的选择。（原位制备就是反应不用经处理,直接投下一步）
－N-羧基内酸酐法
多肽合成方法－
八、多肽合成方法
Hermann Leuchs在1906看发现，在N－羧基内酸酐（NCA）中，氨基酸的羧基活化和酰基保护同时发生。因此，在德国文献中，又称之为Leuchs－酸酐。原则上，该类衍生物应具备理想的前提条件以应用于多肽合成。
丙氨酸-N－羧基内酸酐
第一个N－羧基内酸酐（1,3－氧氮杂环戊烷－2,5－二酮）是从N－（乙氧羰基）氨基酸酰氯消除氯乙烷而得到的。制备该类衍生物的一个好方法是游离氨基酸与光气反应，相应的氨基甲酰氨为中间体。然而，痕量的水就能使N－羧基内酸酐发生聚合，因为最初形成的氨基甲酸自动脱去羧基得到游离胺，此游离胺是发生进一步开环反应的亲核试剂。因此，NCA方法在肽合成中的应用一直受到限制，直到1966年才探索出正确的反应条件，可以在水性介质中用N－羧基内酸进行有条件的肽合成。在低温和pH值为10.2的条件下，N－羧基内酸酐能迅速酰化氨基酸和肽。在pH值增加到10.2时，同时加入下一种N－羧基内酸酐，开始下一轮缩合。为减少中间体肽氨基甲酸酯和氨基组分间的羧酸酯的交换，必须剧烈搅拌反应混合物。精确控制pH值是另一个前提条件（氨基酸要求在pH 值为10.2－10.5，肽要求在pH值为10.2），因为当pH值大于10.5时，产生副产物乙内酰脲。
N－羧基内酸酐的硫类似物即N-硫代羧基内酸酐（N－thiocarboxy anhydrides,NTA）也可以用于肽合成，因为硫代氨基甲酸酯具有较高的稳定性。酰化反应可以在pH值低到9－9.5时进行，因而可以防止可能的水解转化为乙内酰脲。NCA/NTA方法尤其适用于不需要分离反应中间体的片段缩合。三官能团氨基酸（除赖氨酸和半胱氨酸）不需要侧链保护。采用该方法已组合了核糖核酸酶S－蛋白的几个片段，之后采用叠氮物法可得到完整的S－蛋白。
最近，NCA方法再一次引起极大的关注，归功于已制备出氨基甲酸酯保护的N－羧基内酸酐（urethane-protected N-carboxy anhydrides,UNCA），并用于肽合成。在非质子溶剂中和三级碱存在的条件下，利用合适的试剂，可以将NCA 的环上氮原子酰化，引入Boc、Z或Fmoc基团，得到相应的产物。从大多数
氨基酸可获得UNCA晶体，并在无水条件下稳定存在。UNCA对亲核试剂表现出高反应活性，在常用于肽固相和液相合成的大多数无水溶剂（除醇以外）中，高速形成所需肽键。二氧化碳是唯一的副产物，并且没有发生寡聚或聚合的危险，因为在缩合反应后，增长中的肽链氨基端仍然被氨基甲酸乙酯保护着。
最近又报道了N－三苯甲基和N－苯基勿甲基保护的NCA。
九、多肽合成方法之碳二亚胺法
碳二亚胺类化合物可用于氨基和羧基的缩合。在该类化合物中N，Nˊ－二环己基碳二亚胺（DCC）相对便宜，而且可溶于肽合成常用的溶剂。在肽键形成期间，碳二亚胺转变为相应的脲衍生物，N，Nˊ－二环己基脲可以从反应液中沉淀出来。显然，碳二亚胺活化后的活性中间体氨解和水解速率不同，使肽合成能在含水介质进行。经几个课题组的大量研究，确立了以碳二亚胺为缩合剂的肽缩合反应机理，羧酸根离子加成到质子化的碳二亚胺，形成高活性的O－酰基脲；虽然还没有分离出这个中间体，但通过非常类似的稳定化合物推断了它的存在。O－酰基脲与氨基组分反应，产生被保护的肽和脲衍生物。或者，与质子化形式处于处于平衡状态的O－酰基异脲,被第二个羧酸酯亲核进攻，产生对称的氨基酸酐和N，Nˊ－二取代脲。前者与氨基酸反应得到肽衍生物和游离氨基酸。在碱催化下，使用DCC的副反应使酰基从异脲氧原子向氮原子转移，产生N－酰基脲，它不再发生进一步的氨解。不仅过量的碱可催化O－N的酰基转移，而且碱性的氨基组分或碳二亚胺也可催化该副反应。
另外，极性溶剂有利于这一反应途径。
十、多肽合成方法之混合酸酐法
有机羧酸和无机酸皆可用于混合酸酐的形成。然而，仅有几个得到了广泛的实际应用，多数情况下，采用氯甲酸烷基酯。过去频繁使用的氯甲酸乙酯，目前主要被氯甲酸异丁酯所替代。
由羧基组分和氯甲酸酯起始形成的混合酸酐，其氨解反应的区域选择性依赖依赖于两个互相竞争的羰基的亲电性和（或）空间位阻。在由N保护的氨基酸羧酸盐（羧基组分）和氯甲酸烷基酯（活化组分，例如源于氯甲酸烷基酯）形成
混合酸酐时，亲核试剂胺主要进攻氨基酸组分的羧基，形成预期的肽衍生物，并且释放出游离酸形式的活性成分。当应用氯甲酸烷基酯（R1＝异丁基、乙基等）时，游离的单烷基碳酸不稳定，立即分解为二氧化碳和相应的醇。然而，对于亲核进攻的区域选择性，也有一些相反的报道，产物为氨基甲酸酯和原来的N保护氨基酸组分。
为了形成混合酸酐，将N保护的氨基酸或肽分别溶于二氯甲烷、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、乙酸乙酯或DMF中，用等当量的三级碱（N－甲基哌啶、N －甲基吗啉、N－乙基吗啉等）处理。然后，在－15℃－－5℃，剧烈搅拌的同时加入氯甲酸烷基酯以形成不对称酸酐（活化）。经短时间活化后，加入亲核性氨基酸组分。如果作为铵盐使用（需要更多的碱），必须避免碱的过量使用。如果严格按照以上的反应条件，混合酸酐法很容易进行，是最有效的缩合方法之一。Benoiton和他的同事对混合酸酐的稳定性，减少副产物氨基甲酸酯和消旋等方面进行了深入研究，由此进一步了解了反应机理，并提高了该方法的缩合效率，目前该方法已获得广泛应用。通过研究过量氨基甲酸酯产生的原因,尤其是在异亮氨酰基和缬氨酰基的情况下，发现以二氯甲烷为溶剂和N－甲基哌啶作为三及碱能防止这一主要副反应。混合酸酐对水解有较高稳定性，因此，可以用水洗涤有机相来纯化混合酸酐。从氯甲酸烷基酯制得的混合酸酐的稳定性依赖于使用的烷基。由Boc-、Z-和Fmoc-的保护氨基酸和氯甲酸异丙酯制得的混合酸酐能够被分离纯化，比从氯甲酸乙酯或氯甲酸异丁酯获得的混合酸酐更稳定。当没有合适的亲核试剂时，混合酸酐在有机溶剂中的分解起始于环化，生成2－烷氧基－5（4H）－恶唑酮，同时释放出二氧化碳和醇R2－OH，副产物为对称酸酐和酯。在混合酸酐缩合法的实际应用中，有以下几方面需要注意：虽然含水的DMF对于混合酸酐的形成和随后的缩合反应是一个好的溶剂，但是，正如在Z-Gly-Xaa-OH(Xaa=Ala,Leu,Val,Phe)与H－Val-OEt的反应中所遇到的，它促进消旋的程度比使用四氢呋喃或卤化试剂为溶剂时要高得多。氯甲酸异丙酯优氯甲酸乙酯或异丁酯。有趣的是，在DMF或N－甲基吡咯烷酮中，氯甲酸乙酯活化比氯甲酸异丁酯活化引起的消旋更少。尽管如此，从氯甲酸乙酯制取的混合酸酐，以三乙胺作为三级碱在目前几乎没有实用价值。最初，分别在Nα－甲基磺酰基、Nα－三苯甲基、Nα－三氟乙酰基保护的氨基酸活化中观察到混合酸酐法的副
反应。
有时特戊酸（2,2－二甲基丙酸）被推荐作为活化基，用于混合酸酐的合成，对于N α－酰基保护的天冬酰胺尤其如此。类似地，这种不对称酸酐由N α－酰基氨基酸和特戊酰氯制得，并且与氨基亲核试剂反应的产率高。特戊酸叔丁基的强+I 效应降低了它的羰基的亲电性，同时还因为空间位阻的影响，使亲核试剂在活化的氨基酸上发生预期的区域选择性进攻。从机理上考虑，这里也要提到酰基磷翁盐作为活性中间体在肽缩合中的应用。
十一十一、、氨基酸保护基有哪些
常见3种氨基保护基结构
20种常见氨基酸，根据侧链可以分为几类：脂肪族氨基酸（Ala ，Gly ，Val ，Leu ，Ile ，），芳香族氨基酸（Phe ，Tyr ，Trp ，His ），酰胺或羧基侧链氨基酸（Asp ，Glu ，Asn ，Gln ），碱性侧链氨基酸（Lys ，Arg ），含硫氨基酸（Cys ，Met ），含醇氨基酸（Ser ，Thr ），亚氨型基酸（Pro ）。
多肽化学合成中氨基酸的保护非常关键，直接决定了合成能够成功的关键。因为常见的20中氨基酸中有很多都是带有活性侧链的，需要进行保护，一般要求，这些保护基在合成过程中稳定，无副反应，合成结束后可以完全定量的脱除。 合成中需要进行保护的氨基酸包括：Cys ，Asp ，Glu ，His ，Lys ，Asn ，Gln ，Arg ，Ser ，Thr ，Trp ，Tyr 。
需要进行保护的基团：羟基，羧基，巯基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp 也可以不保护，因为吲哚性质比较稳定。当然在特殊的情况下，有些氨基酸也可以不保护，象Asn ，Gln ，Thr ，Tyr 。
十二十二、、多肽缩合试剂
目前多肽合成中，主要采用羧基活化方法来完成接肽反应，最早使用的是将氨基酸活化为酰氯、叠氮、对称酸酐以及混合酸酐的方法，但是由于这些条件下，存在氨基酸消旋，以及反应试剂危险以及制备比较复杂，逐渐被后来的缩合试剂取代。
按照其结构可以分为两种：缩合试剂主要有：碳二亚胺型，鎓盐型
（Uronium）。
（1）碳二亚胺型
碳二亚胺型主要包括：DCC，DIC，EDC.HCl等。
DIC活化反应机理
采用DCC进行反应，由于反应中生成的DCU，在DMF中溶解度很小，产生白色沉淀，所以一般不用在固相合成中，但是由于其价格便宜，在液相合成中，可以通过过滤除去，应用仍然相当广泛。
EDC.HCl因为其水溶解性的特点，在多肽与蛋白的连接中使用比较多，而且也相当成功。但是该类型的缩合试剂的一个最大的缺点，就是如果单独使用，会有比较多的副反应，但是研究表明如果在活化过程中添加HOBt，HOAt等试剂，可以将其副反应控制在很低的范围。
（2）鎓盐型
鎓盐型缩合试剂反应活性高、速度快，现在使用非常广泛，主要包括：HBTU，TBTU，HATU，PyBOP等。该试剂使用过程中需要添加有机碱，如，二异丙基乙胺（DIEA），N-甲基吗啉（NMM），该试剂加入后，才能活化氨基酸。
十三十三、、多肽合成常见问题及解答
多肽是复杂的大分子 , 因此每条序列在物理和化学特性上都是独特的，有些多肽合成很困难 , 另有些多肽虽然合成相对容易 , 但纯化困难；最常见的问题是许多肽不溶于水溶液 , 因此在纯化中 , 这些疏水肽必须溶于非水溶剂中或特殊的缓冲液 , 而这些溶剂或缓冲液很可能不适合应用于生物实验系统 , 因此研究人员不能使用该多肽达到自己的目的 , 因此下面是对于研究人员设计多肽的一些建议。
1. 如何保存合成的多肽？
多肽在-20℃很稳定，特别是冷冻干燥并保存在干燥器中，在将它们暴露于空气之前， 冷冻干燥多肽可以放于室温。这将是湿度影响减少，当无法冷冻干燥时，最好的方法是以小的工作样量存放。
对于含Cys, Met or Trp 的多肽，脱氧缓冲剂对其溶解必不可少，因为这种多肽可易空气氧化， 在封瓶前，慢慢流过多肽的氮气或氩气也会降低氧化作用。含Gln 或Asn 的多肽也容易降解，所有这些肽与不含这些有问题解苷的那些肽相比，生命期有限。
2. 多肽的溶解性怎样？都溶于哪些溶剂？
大多数肽的首选溶剂是超纯抽气水。稀乙酸或氨水分别对于碱性或酸性多肽的溶解很重要。这些方法不溶的多肽， 需要DMF （二甲基甲酰胺）、脲、guanidinium （胍盐）、chloride （氯化物）或acetonitrile （乙腈）来溶解，这些溶剂可能某些实验有副作用。所以我们建议设计多肽时要加注意。
残基Ala, Cys , Ile, Leu, Met, Phe 和Val 将全增加多肽的溶解难度。
3. 多肽的保存如何操作？
包装1mg或更少的多肽按净重包装，声明的小瓶重不含相关抗离子和水。例如，氨基酸分析决定的肽含量是80%，在1mg样品中，那么瓶中毛重是1.25mg。
大量的多肽以毛重算。标出的重量含相关抗离子和水，例如，25mg样品中肽百分比为90%，那么，实际肽量为25mg×90%=22.5mg
不要把肽含量和纯度搞混了。肽的纯度可能是100%，而肽含量相关带电基团（如Arg, Lys ）的抗离子量和肽亲水性决定。这是合成肽的本身特性。
所有产品应存于冰箱，最好为-20℃。多数肽以此方法可以存放几年不变。
溶液肽远比冻干形式不稳定，溶液应为中性pH(pH5-7), -20℃保存的，为避免样品的反复冻融，最好分成小样存放。一份样品融冻后未用完，应扔掉，细菌降解有时会成为溶液肽的麻烦，为克服此，肽应溶于无菌水，或肽溶液用0.2μM滤膜过滤。
4. 如何重建多肽重建过程如何操作？
多数肽溶于无菌蒸溜水。初次溶解时，要注意使初始浓度比要求浓度大，如果多肽仅有限溶解性，这便允许加入其它溶解剂或缓冲盐。
如果多肽在水中的溶解性有限，有几种选择可帮助溶解：
对碱性肽用稀乙酸（含Arg , Lys , His）
酸性肽用稀氨水（含Asp, lu）
对极疏水的肽用10%有机修饰物（acetonitrile , Methanol）
极不溶的肽用DM50或DMF
guanidine hydrochloride或脲的浓溶液也很有用，与上述方法合用，声处理也是溶解多肽的有效手段
5如何降低肽链合成的难度？
a. 减少序列长度
由于肽的长度增加会导致粗产物纯度降低, 小于15 个残基的肽比较容易得到较高纯度的初产物，当肽链长度增加到20 个残基以上时, 正确产物的量就是一个主要考虑的问题。在许多实验中, 降低残基数低于20 往往能得到更好的实验结果。
b. 减少疏水性残基数
疏水性残基占明显优势的肽，尤其在距 C 端7-12 个残基的区域，常常引起合成困难。这通常被认为是由于合成中形成 b 折叠片，这样会产生不完全配对。用 1 个或几个极性残基置换或加入Gly 或Pro 以打开肽结构可能会有帮助。
c. 减少“困难”残基
有多个Cys 、Met 、Arg 、Try 残基通常难于合成。Ser 通常可作为Cys 的非氧化替换。
6、如何增强肽链的可溶性？
?改变N 端或 C 端
对于酸性肽( 即pH 值为7 时带负电荷), 我们推荐乙酰化(N 端乙酰化, C 端保持自由羧基), 以增加负电荷。而对于碱性肽( 即pH 值为7 时带正电荷), 我们推荐氨基化(N 端自由氨基, C 端氨基化), 以增加正电荷。
?缩短或加长序列
某些序列含有大量疏水氨基酸, 如Trp 、Phe 、Val 、Ile 、Leu 、Met 、Tyr 和Ala 等, 当这些疏水残基大于50% 通常难于溶解。为了增加肽的极性, 加长序列可能会有帮助。另外一种选择是通过减少疏水残基的方法降低肽链的长度以增加极性。肽链极性越高, 就越有可能溶于水。
?加入可溶性残基
对于某些肽链而言, 加上一些极性氨基酸能改善可溶性。我们推荐给酸性肽的N 端或C 端加上Glu-Glu 。给碱性肽的N 端或C 端加上Lys-Lys 。如果不能加入带电荷基团, 可以将Ser-Gly-Ser 加到N 端或 C 端。但是, 肽链的两端不能改变时, 该方法则不可行。
?通过置换一个或多个残基改变序列
肽链的可溶性可通过改变序列内某些残基来改善。通常单个残基的替换就能显著改善其疏水性, 而这种改变通常是较为保守的, 如用Gly 代替Ala 。
?通过选用不同“框架”来改变序列
如果能用某个序列来制备许多长度一定的相互串连或重叠的多肽, 则可以用改变各个多肽起始点的方法来实现改变序列的目的。其原理是: 在同一多肽的亲
水和疏水残基间创造新的更好的平衡, 或将同一多肽内的“困难”残基( 比如 2 个Cys) 放进两个不同的多肽而不是集于同一分子内。
特殊氨基酸残基对肽链特性影响的一些要点
对于由遗传密码编码的二十种氨基酸及蛋白质中常见的其他氨基酸, 按其特性可以用几种方法进行分类。下面列出了最常见的氨基酸的三字母代码和单字母代码，以及不同的分类方法。
十四、多肽类产品制剂研究现状
（军事医学科学院生物工程研究所方宏清）
多肽类产品制剂研究面临的主要问题是多肽的稳定性不好，体内半衰期短和生物膜透过性差。以下综述了多肽类药物不稳定的原因；提高多肽稳定性的方法；多肽类制剂货架时间的确定；多肽类产品的分析手段；多肽类药物的控释研究；多肽的非注射途径给药研究。最后还提出了多肽类药物制剂研究的展望。
随着生物技术的发展，多肽作为药物在临床上的应用越来越广泛，相应的制剂学研究也日益受到重视。与传统的小分子有机药物相比，多肽具有稳定性差，体内半衰期短和不易通过生物膜等特点。
1 多肽的稳定性研究
1.1 引起多肽不稳定的原因
（1）脱酰胺反应在脱酰反应中，Asn/Gln 残基水解形成Asp/Glu。非酶催化的脱酰胺反应与环境条件和多肽的结构有关。提高pH值、升高温度都有利于脱酰胺的进行。在-Asn-Gly-结构中的酰胺基团更易水解，位于分子表面的酰胺基团也比分子内部的酰胺基团易水解。
（2）氧化多肽溶液易氧化的主要原因有两种，一是溶液中有过氧化物的污染，二是多肽的自发氧化。在所有的氨基酸残基中，Met、Cys和His、Trp、Tyr 等最易氧化。氧分压、温度和缓冲溶液对氧化也都有影响。
（3）水解多肽中的肽键易水解断裂。由Asp参与形成的肽键比其它肽键更易断裂，尤其是Asp-Pro和Asp-Gly 肽键。
（4）形成错误的二硫键二硫键之间或二硫键与巯基之间发生交换可形成错误的二硫键，导致三级结构改变和活性丧失。
（5）消旋除Gly外，所有氨基酸残基的α碳原子都是手性的，易在碱催化下发生消旋反应。其中Asp残基最易发生消旋反应。
（6）β-消除β-消除是指氨基酸残基中β碳原子上基团的消除。Cys、Ser、Thr、Phe、Tyr 等残基都可通过β-消除降解。在碱性pH下易发生β-消除，温度和金属离子对其也有影响。
（7）变性、吸附、聚集或沉淀变性一般都与三级结构以及二级结构的破坏有关。在变性状态，多肽往往更易发生化学反应，活性难以恢复。在多肽变性过程中，首先形成中间体。通常中间体的溶解度低，易于聚集，形成聚集体，进而形成肉眼可见的沉淀。
蛋白质的表面吸附是其贮存、使用过程中遇到的另一个令人头痛的问题，如RL-2（由编号为RL-2的短芽孢杆菌(Bacillus brevls)产生的生物高分子,经研究发现是一种对高岭土悬液有较高絮凝活性的阴离子型絮凝剂。）在进行灌注时会吸附在管道表面，造成活性损失。
1. 2提高多肽稳定性的途径
（1）定点突变通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能增加多肽稳定性的残基，可提高多肽的稳定性。
（2）化学修饰多肽的化学修饰方法很多，研究最多的是PEG修饰。PEG 是一种水溶性高分子化合物，在体内可降解，无毒。PEG与多肽结合后能提高热稳定性，抵抗蛋白酶的降解，降低抗原性，延长体内半衰期。选择合适的修饰方法和控制修饰程度可保持或提高原生物活性。
（3）添加剂通过加入添加剂，如糖类、多元醇、明胶、氨基酸和某些盐类，可以提高多肽的稳定性。糖和多元醇在低浓度下迫使更多的水分子围绕在蛋白质周围，因而提高了多肽的稳定性。在冻干过程中，上述物质还可以取代水而与多肽形成氢键来稳定多肽的天然构象，而且还可以提高冻干制品的玻璃化温度。
此外表面活性剂如SDS、Tween、Pluronic,能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀。
（4）冻干多肽发生的一系列化学反应如脱酰胺、β-消除、水解等都需要水参与，水还可以作为其它反应剂的流动相。另外，水含量降低可使多肽的变性温度升高。因此，冻干可提高多肽的稳定性。
1. 3多肽类药物制剂的存放时间测定
对动力学行为符合Arrhenius公式的药剂，可利用加速实验确定存放时间，但要求反应活化能是独立于温度的常数。通常认为基于Arrhenius公式的稳定性预测不适合多肽制剂，这是因为在地行蛋白质药物加速实验时有三个问题难以解决：（1）多肽的降解途径较多，各途径活化能不同，升高温度会改变多肽降解的主要方式；（2）温度会改变多肽的构象，从而改变降解反应的活化能；（3）对冻干制品，若实验温度高于玻璃化温度（Tg），固体制剂将由玻璃态变为粘塑性状态，化学反应速率将急剧增加，从高于Tg获得的数据就不能外推到低于Tg 时的情况。但是，如果能解决上述问题，利用加速实验进行稳定性预测就可以成为评价多肽药物制剂的有效工具。
Yoshioka等人通过加速实验确定了六种多肽制剂在于25C存放的有效时间，结果表明与实测结果基本接近。这说明在一定条件下可用加速实验估算多肽制剂的货架时间，特别是在研究初期，用加速实验可节省大量时间和物力。但是，最终货架时间的确定还是需要采用留样观察法。
1．4多肽类产品制剂的分析手段
多肽类产品制剂研究常用的分析手段有：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等到电聚焦电泳法、凝胶过滤层析法、反相液相层析法、紫外光谱法、荧光光谱法、红外光谱法、圆二色性光谱法、量热法以及生物活性测定法。这里仅介绍药物制剂研究中常用的一种方法——量热法（Calorimetry）。
量热法是通过测定样品在受热过程中的放热和吸热过程中的放热和吸热行为来研究样品在受热过程中的放热和吸热行为来研究样品中各组份的相互作用及状态变化的一种方法，常用的是差示扫描量热法（Differential Scanning C alorimetry）。该方法广泛用于多肽的热稳定性分析、各种添加剂对多肽结构的影响、多肽与配基之间的相互作用等研究，还用于测定冻干物品的玻璃化温度和共熔点。例如Chan等用DSC研究了添加剂对rhDNase溶液热变性的影响。蛋白质浓度为10mg/ml,扫描速率为1.2℃/min。测得rhDNase在纯水中的Tm=67.4℃，Hm=18.0J/g。加入Ca2+有利于rhDNase的热稳定，加入Mg2+、Mn2+则不利于rhDNase的稳定。当CaCl2浓度为20~100mmol/L时，Tm=76.4℃，Hm=20~22J/g。CaCl2和乳糖对rhDNase的稳定有复合作用。同时加50mmol/L CaCl2和100mg/ml
乳糖，可使rhDNase的Tm值提高到76.4℃，Hm值到21.9J/g。Chang等用DSC 测定了rhL-lra制剂的玻璃化温度、反玻璃化温度和共熔点。冷冻蛋白制剂的各种物理变化，如玻璃化、反玻璃化和共熔点都会影响冻干过程。根据测定结果，作者确定了冻干温度和升温速度，仅用6个小时就完成冻干过程。
2 多肽类产品的缓释制剂研究
多肽类产品在血液中的半衰期一般很短，静脉注射后很快就被清除或降解，因此需要经常给药，给病人带来较多不便。为了减少给药次数可采用缓释或控释技术：（1）在注射液中加入高分子聚合物（如透明质酸），提高粘度、延缓药物扩散速度；（2）将多肽包裹在脂质体中，使多肽从脂质体中缓慢释放出来；（3）将多肽包裹在固体微粒中，使多肽从微粒中缓慢释放出来。
在上述方法中研究最多的是微粒递释系统，适于制备微粒的生物可降解材料有：聚乳酸、丙交酯和乙交酯共聚物（PLCA）、聚已内酯、聚氨基酸、聚原酸酯、聚酐、聚腈基丙烯酸烷基酯。
多肽的微囊大多采用聚酯材料，特别是用PLGA。PLGA微粒释放蛋白质的典型曲线分三相：起始爆释相、扩散控释相和分解控释相。起始爆释是指位于微粒表面或进表面的蛋白质在几小时内的快速释放。扩散控释是蛋白质通过微粒中孔道扩散释放。为了获得连续释放，扩散控释相必须与分解控释相重叠，聚合物分解形成的孔隙使包裹的蛋白质连续释放，而主要的困难是降低起始爆释，增加药物载量。
已用该法制备了许多肽和多肽的微粒剂型，如LHRH、TRH、Insulin、GH、SOD、TNF、IFN、IL-2、EPO等。其中LHRH类似物leuprolide（亮丙瑞林）的微粒制剂可控制释放药物长达一个月，并于1988年首先在法国上市，随后又在欧美40个国家上市，1993年起在我国销售。美国Genetech公司的研究人员也成功地制备了连续释放一个月的rhGH和IFN-γ微囊制剂。
3 非注射给药途径研究
多肽类药物分子量大，脂溶性差，难以透过生物膜，一般只能注射给药。但注射给药、尤其是那些需要频繁给药的药物，对病人来说是及其不便的。因此有必要进行多肽的非注射给药途径研究。
文献报道的多肽非注射给药研究途径有：鼻腔、肺部、眼、舌下、口服、直
肠、阴道、皮肤等，其中研究最多的是鼻腔给药、肺部给药和口服给药。
3.1鼻腔给药
鼻腔部位存在丰富的毛细血管和淋巴管，鼻腔上皮与血管壁紧密相连，上皮细胞间间隙较大，具有较高的渗透性，能避免肝脏的首过效应，鼻腔部位蛋白酶含量也比胃肠中少。低分子量的药物极易被吸收进入血液循环。对分子量较大的多肽，如降钙素、胰岛素、G-CSF、EPO等，在合适的吸收促进剂帮助下，也可被吸收，但生物利用度较低。鼻腔给药的方式有滴鼻给药发和喷雾给药法，采用后一方法可获得相对较高的生物利用度。目前降钙素（32肽）已有鼻腔递释制剂在欧洲、日本及美国上市，尽管其绝对生物利用度不足1%。1990年在美国上市的Nafarelin（十肽）鼻腔喷雾剂，其生物利用度也仅2.8%。
3.2肺部给药
人肺的吸附表面积有140m2，血流量达5000ml/min，蛋白酶活性相对于胃肠道较低，不存在肝脏首过效应。肺泡壁比毛细血管壁还要薄，通透性好。动物实验表明一些多肽药物经肺给药后生物利用度相当高，可达20%~50%。但某些多肽易被肺中蛋白酶降解，还有一些多肽在形成气溶胶微粒时会变性。哪一种多肽适合于经肺给药需逐例分析研究。
选用合适的给药装置将药物输送至肺泡组织是肺部释药的关键。粉雾剂将是肺部递释的主要剂型。理想的粉雾剂应是：粉末处方组分在低流速和低压力差时，大部分药物粒子能够解聚，进入粉雾气流中；吸入装置则易产生流速较高的湍流。目前多肽的肺部给药还在研究阶段，除Pulmozyme（作用于肺部）外，还没有一种多肽药物的肺部递释制剂上市。
3.3口服给药
口服给药是最受人们欢迎的给药途径，多肽类药物也不例外。但是正常情况下，大多数肽类药物很少或不能经胃肠道吸收。其原因主要有：（1）多肽分子量大，脂溶性差，难以通过生物膜屏障；（2）胃肠道中存在着大量肽水解酶和蛋白水解酶可降解多肽；（3）吸收后易被肝脏消除（首过效应）；（4）存在化学和构象不稳定问题。目前人们研究的重点放在克服两个障碍上，即如何提高多肽的生物膜透过性和抵抗蛋白酶降解这两个方面。
使用吸收促进剂来提高生物膜通透性是目前研究中采用的主要方法。文献报