草莓不同器官中microRNA 表达差异研究
李
贺1，印东升2，王志刚2，黄飞飞1，常琳琳1，张志宏1*
（1沈阳农业大学园艺学院，2辽宁省农业科学院花卉研究所，沈阳110161）
摘
要:MicroRNA （miRNA ）在植物的生长发育过程中起着重要作用。以CTAB 法提取的总RNA 为模板，通过设计
茎环反转录引物，利用实时RT-PCR 技术对草莓根系、花托、茎尖和叶片4种器官中的6种miRNA 进行了表达差异研究。以草莓叶片中6种miRNA 的表达量为1，差异表达结果显示miR164在草莓花托中高度表达，达到6.615，明显高于根系（0.485）、茎尖（0.371）和叶片（1.000）；miR172在茎尖和花托中的表达量都较低，分别为0.029和0.020，在根系中的表达量更低，只有0.0008454；miR167在根系中表达也很低，只有0.053；miR156，miR159和miR165在4种草莓器官中的表达差异不明显。这些结果为进一步验证miRNA 基因在草莓植株生长发育过程中的作用奠定了基础。
关键词:草莓；MicroRNA ；Real time RT-PCR ；表达；器官中图分类号：S668．4
文献标识码：A
文章编号：1009－9980(2009)05－632－06
Study on the difference in expression profiles of microRNA among dif -ferent organs of strawberry
LI He 1，YIN Dong-sheng 2，WANG Zhi-gang 2，HUANG Fei-fei 1，CHANG Lin-lin 1，ZHANG Zhi-hong 1*
（1College of Horticulture ，Shenyang Agricultural University ，Shenyang ，Liaoning 110161China ；2Institute of Floriculture ，Liaoning Acade -
my of Agricultural Sciences ，Shenyang ，Liaoning 110161China ）
Abstract ：MicroRNA （miRNA ）plays an important role in plant growth and https://www.doczj.com/doc/039253338.html,ing total RNA extracted by CTAB method as templates ，the expression profiles of 6miRNA in root ，receptacle ，shoot tip and leaf of strawberry were stud -ied by real-time RT-PCR through stem-loop RT primers.When the relative quantity of 6miRNA in strawberry leaf was as 1，the result of different expression showed that the highest expression in receptacle was miR164，reaching 6.615，obviously higher than the quantity in root （0.485），shoot tip （0.371）and leaf （1）.While the expression of miR172in shoot tip and re -ceptacle were 0.029and 0.020，lower than that in leaf.The lowest expression of miR172was in root ，only 0.0008454，the same as miR167，only 0.053.No obvious difference in expressions of miR156，miR159and miR165was found in 4kinds of strawberry organs.
Key words :Strawberry ；MicroRNA ；Real time RT-PCR ；Expression ；Organ
microRNA （miRNA ）是一类来自真核生物自身
基因组的非编码小分子RNA （Non -coding small
RNA ），是由其前体（Pre-miRNA ）经过酶的切割产生的，长度多数为19～25nt [1-3]。植物miRNA 的报道始于2002年[4]，其功能主要在转录后水平上通过介导mRNA 靶分子的切割或降低靶分子的翻译来调节植
物基因的表达[5－6]，从而调控植物器官的形态建成、生长发育、激素分泌与信号转导以及植物对外界环境胁迫因素的应答能力[7－8]。
随着miRNA 研究的不断深入，人们发现一些植物
miRNA 具有明显的序列保守性特点[9]，如miR156、miR159、miR167等在拟南芥、水稻、大豆等植物上是相当保守的[10－11]，其中miR159家族存在于10种不同的陆地植物中[12]。另外，miRNA 的表达还具有明
显的组织特异性[13]，如miR171在拟南芥的花序和花组织中高水平表达，而在茎、叶组织中却没有表达的迹象[4]。关于研究miRNA 表达的方法主要有克隆测序、RNA 印记以及RNA 酶保护分析（RNase protec -
收稿日期：2008－11－03
接受日期:2009－05－04
基金项目：国家自然科学基金（30671432）；教育部新世纪优秀人才支持计划；沈阳农业大学青年教师科研基金作者简介：李贺，女，讲师，主要从事果树育种及生物技术研究。Tel:024-********，E-mail:lihe1978721@https://www.doczj.com/doc/039253338.html,
觹通讯作者。Author for correspondence．Tel:024-********，E-mail:zhangz@https://www.doczj.com/doc/039253338.html,
果树学报2009，26（5）:632～637
Journal of Fruit Science
表1RT-PCR和定量PCR的引物序列和探针序列Table1Primers and probes used to perform RT-PCR and quantitative RT-PCR of miRNAs
名称Name 序列（5′→3′）Sequence(5′to3′)
miR165 miR172 miR167 miR159 miR164 miR156 18SrRNA RT-primer
PCR primer
Probe
RT-primer
PCR primer
Probe
RT-primer
PCR primer
Probe
RT-primer
PCR primer
Probe
RT-primer
PCR primer
Probe
RT-primer
PCR primer
Probe
PCR primer
Probe
ctcaactggtgtcgtggagtccggcaattcagttgaggggggatg
Forward:acactccagctgggtcggaccagg
Reverse:aactggtgtcgtggag
FAM-ttcagttgaggggggatg-TAMRA
ctcaactggtgtcgtggagtccggcaattcagttgagatgcagca
Forward:acactccagctgggagaatcttga
Reverse:aactggtgtcgtggag
FAM-ttcagttgagatgcagca-TAMRA
ctcaactggtgtcgtggagtccggcaattcagttgagtagatcat
Forward:acactccagctgggtgaagctgcc
Reverse:aactggtgtcgtggag
FAM-ttcagttgagtagatcat-TAMRA
ctcaactggtgtcgtggagtccggcaattcagttgagtagagctc
Forward:acactccagctgggtttggattga
Reverse:aactggtgtcgtggag
FAM-ttcagttgagtagagctc-TAMRA
ctcaactggtgtcgtggagtccggcaattcagttgagtgcacgtg
Forward:acactccagctgggtggagaagca
Reverse:aactggtgtcgtggag
Reverse:aactggtgtcgtggag
FAM-ttcagttgagtgcacgt-TAMRA
ctcaactggtgtcgtggagtccggcaattcagttgaggtgctcac
Forward:acactccagctgggtgacagaaga
Reverse:aactggtgtcgtggag
FAM-ttcagttgaggtgctcac-TAMRA
Forward:gtagtcatatgcttgtct
Reverse:gaatgatgcgtcgccagcacaaagg
FAM-cagaagtcgggatttgttgc-TAMRA
tion assay，RPA）等，近来通过设计茎环结构逆转录引物进行实时定量PCR（real-time quantitative PCR）检测miRNA表达的方法也被建立起来[14-15]。到目前为止，人们已在拟南芥、水稻、玉米[16]、小麦[17]、烟草[18]、苜蓿[19]、杨树[20]、苔藓[21]以及园艺植物番茄[22]，苹果[23]等物种中检测到miRNA的表达。
草莓（Fragaria×ananassa）是一种无性繁殖的多年生草本植物，目前国内外未见任何关于草莓miR-NA表达的报道。作者利用实时RT-PCR技术系统研究了草莓不同器官中6种保守miRNAs（miR165、miR172、miR167、miR159、miR164和miR156）的表达，旨在为进一步揭示miRNA基因在植物生长发育过程中的重要作用奠定基础。
1材料和方法
1.1植物材料
草莓栽培品种丰香（Toyonoka）露地栽培于沈阳农业大学草莓试验园，常规栽培管理，在花期采集花托、叶片、根系和茎尖，-70℃保存，用于总RNA的提取。
1.2试剂
dNTPs（2.5mmol·L-1），反转录酶AMV（5U·μL-1），RNase抑制剂（40U·μL-1），RNase-free DNase Ⅰ（5U·μL-1），DL2000DNA ladder，DNA凝胶回收试剂盒，pMD19-T载体购自TaKaRa公司；Taq DNA
聚合酶（5U·μL-1），50bp DNA ladder，定量PCR试剂2.5×realMaster Mix（P/N:FP203）购自天根公司；其他药品为国产分析纯。
1.3引物
从miRNA数据库（https://www.doczj.com/doc/039253338.html,/）下载模式植物拟南芥中6种保守miRNAs的序列（miR165:5′-UCGGACCAGGCUUCAUCCCCC-3′、miR172:5′-AGAAUCUUGAUGAUGCUGCAU-3′、miR167:5′-UGAAGCUGCCAGCAUGAUCUA-3′、miR159:5′-UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA-3′、miR164:5′-UGGAGAAGCAGGGCACGUGCA-3′、miR156:5′-UGACAGAAGAGAGUGAGCAC-3′，参照Chen等[14]引物设计方式，自行设计了扩增草莓中6种miRNAs的引物和探针（表1）。同时根据Gen-Bank中草莓18S rRNA序列信息（登录号：X15590.1），选择保守区域，利用Primer5.0软件自行设计了扩增草莓中18S rRNA的引物和探针（表1），这些引物和探针的合成由TaKaRa公司完成，使用浓度为10μmol·L-1。1.4总RNA提取方法
总RNA的抽提采用Chang等[24]的方法，增加DNA酶解步骤，即第2次沉淀用300μL DEPC水溶解，加入8μL DNaseⅠBuffer，3μL RNase-free DNaseⅠ，1μL RNase抑制剂，37℃水浴4h。氯仿/异戊醇抽提1次后，无水乙醇沉淀，最后用30μL DEPC水溶解沉淀，然后在1.0%的琼脂糖凝胶上检测总RNA的完整性，用DU800核酸蛋白分析仪（Beckman Coulter，USA）检测核酸的纯度。
1.5RT-PCR
采用表1中引物完成RT-PCR反应。RT反应体积为20μL，在0.2mL反应管中先加入总RNA，RT 引物和dNTPs，混匀后65℃变性5min，然后迅速放到冰水混合物中冷却，之后再加入反转录酶AMV，反转录酶缓冲液和RNase抑制剂等。通过16℃30 min；20℃30s，42℃30s，50℃1s，60个循环；85℃10min完成反转录反应。
反转录结束后取2μL cDNA进行常规PCR反应，反应体积20μL，反应程序为95℃10min；55℃注:FAM，6-羧基-荧光素，用来做荧光报告基团；TAMRA，6-羧基-4-甲基若丹明，用来做荧光猝灭基团。
Note:FAM,6-carboxy-fluorescein,reporter fluorophore;TAMRA，6-carboxy-tetramethylrhodamine,quencher fluorophore.
5期李贺等:草莓不同器官中microRNA表达差异研究633
果树学报26卷
图2采用茎环引物的RT-PCR 策略及扩增片段
A.RT-PCR 策略；
B.根系中的扩增片段；
C.花托中的扩增片段；
D.茎尖中的扩增片段；
E.幼叶中的扩增片段；1.miR165；2.miR156；3.miR164；4.miR167；5.miR159；6.miR172
Fig.2Schematic showing stem-loop RT-PCR miRNA assays and amplified fragments
A.RT -PCR scheme ；
B.Amplified products from root ；
C.Amplified products from receptacle ；
D.Amplified products from shoot tip ；
E.Amplified products from leaf ；1.miR165；2.miR156；3.miR164；4.miR167；5.miR159；6.miR172
2min ；95℃1s ，65℃1min ，35个循环；最后72℃延
伸5min 。用含EB （0.5μg ·mL -1）的2.5%的琼脂糖凝
胶电泳检测扩增产物。
1.6实时定量RT-PCR
使用ABI 公司的7500定量PCR 仪，96孔板和
光学膜完成定量PCR 反应。反应体积为20μL ，包括
1μL cDNA （RNA 为100ng ），8μL 2.5×Mix ，1μL 增
强子，正向PCR 引物1μL ，反向PCR 引物1μL ，探
针0.5μL ，剩余体积用超纯水补足至20μL 。每个反应重复3次。定量PCR 反应程序：95℃10min ；95
℃1s ，60℃1min ，40个循环。以18S rRNA 基因作为管家基因，清水模板为阴性对照，采用2-△△Ct 法计算相对表达量的高低。Ct 即循环阈值，表示每一个
反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。△Ct=目的基因的平均Ct 值-管家基因的平均
Ct 值。△△Ct=△Ct （样本1）-△Ct （样本2）。1.7PCR 产物的克隆和测序
利用DNA 凝胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回
收扩增片段，与pMD19-T 载体连接，然后转化大肠杆菌JM109感受态细胞。通过蓝白斑筛选PCR 鉴定阳性克隆，测序工作委托上海生工公司进行。结合
https://www.doczj.com/doc/039253338.html, 公布的miRNA 序列对测序
结果进行分析。
2
结果与分析
2.1
草莓不同器官中总RNA 的分离
采用CTAB 法成功地从草莓不同器官中分离出
总RNA ，1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，28S 和18S rRNA 谱带清晰（图1），A260/A280比值在
1.99～
2.06，能够成功用于常规PCR 和定量PCR 等
后续研究。
2.2草莓不同器官中miRNA 的RT-PCR 鉴定
miRNA 很短，仅有约21个核苷酸，而PCR 引物的长度一般也在20个核苷酸左右，因此无法直接扩增，通过设计RT 茎环引物（表1和图2-A ），利用它的3′端有8个核苷酸同miRNA 的3′端互补，接下来的7个核苷酸与其自身5′端互补。PCR 反应过
程中，3′端反向引物为与RT 茎环引物部分序列完全一致的通用引物（表1:5′-aactggtgtcgtggag-3′），5′端PCR 引物包含10个目标miRNA 的5′端核苷酸，这样miRNA 有3个核苷酸是不包括在引物序列中的。因此，通过PCR 产物的克隆测序来鉴定是否含有该种miRNA 。采用这种策略，成功地对草莓根系、花托、茎尖和幼叶4种器官中的6种miRNAs 进行了扩增，结果表明，针对miR165，miR156，
miR164，miR167，miR159和miR172这6种miR -NAs ，以总RNA 为模版，均得到了一条大小约75bp
的扩增片段（图2-B ～E ）。通过对PCR 产物进行克隆
图1
草莓不同器官中总RNA 的电泳图谱
M.50bp DNA ladder ；1.根系；2.花托；3.茎尖；4.叶片
Fig.1Electrophoresis of total RNA extracted from different
strawberry organs
M.50bp DNA ladder ；1.Root ；2.Receptacle ；3.Shoot tip ；4.Leaf
20001000500250100
bp 28s rRNA 18s rRNA
M
1
2
3
4
B C D E
100123456M
bp 50501001005010050
634
5期李贺等:草莓不同器官中microRNA 表达差异研究图4
草莓4种器官中miRNAs 的差异表达
a.根系；
b.花托；
c.茎尖；
d.叶片
Fig.4The different expression of miRNAs from four kinds of strawberry organs
a.Root ；
b.Receptacle ；
c.Shoot tip ；
d.Leaf
图3定量PCR 策略及探针序列
A.定量PCR 策略；
B.探针序列；FAM ，6-羧基-荧光素，用来做荧光报告基团（R ）；TAMRA ，6-羧基-4-甲基若丹明，用来做荧光猝灭基团（Q ）
Fig.3Schematic showing real-time PCR miRNA assays and probe sequences
A.Q-RT-PCR scheme ；
B.probe sequence ；FAM ，6-carboxy-fluorescein ，reporter fluorophore （R ）；TAMRA ，6-carboxy-tetramethylrhodamine ，quencher fluorophore （Q ）
测序后发现，75bp 序列中包括了相应miRNA 的完整序列。
2.3草莓不同器官中miRNA 的定量PCR 分析取上述RT 反应的1μL cDNA 利用图3-A 策
略进行定量PCR 反应。从表1和图3-B 能够清楚地看出，探针序列是茎环反转录引物序列的一部分。其中5'端前10个核苷酸完全一致（ttcagttgag ），后8个核苷酸是对应的miRNA 的3'端的反向互补序列。这种定量PCR 策略（图3-A ）是以荧光探针为基础，
其两端分别标记一个荧光发射基团（R ）和一个荧光淬灭基团（Q ）。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测系统检测不到荧光信号。当
PCR 扩增时，Taq 酶的5'→3'外切酶活性将探针酶
切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条
DNA 链，就有一个荧光分子的形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物的形成完全同步，从而实现定
量。
采用引物探针法，以草莓幼叶中6种miRNAs 的表达量为1，系统比较了4种器官中6种miRNAs 的相对表达量，结果发现（图4）:在4种草莓的器官中均检测到了6种miRNAs 的表达。其中miR156，
miR159和miR165在4种器官中的表达差异不大，
而miR164在花托中的表达量（6.615）明显高于根系
（0.485）、茎尖（0.371）和幼叶（1.000）。miR172只在幼叶中有较高的表达量（1.000），在茎尖（0.029）和花托（0.020）中都较低，在根系中更低，只有0.0008454。
miR167在根系中表达也很低，只有0.053。
由于模板的浓度越高，扩增曲线起峰越早，模板的浓度越低，扩增曲线起峰越晚，稀释倍数相同，扩
原初相对表达量
R a w R Q （R e l a t i v e Q u a n t i t a t i o n ）
检测的miRNAs Detector miRNAs
1.401.201.000.800.600.400.200.00
a
b c d a
b c d
a
b c d miR165
miR165
miR165
7.00
6.00
5.004.003.002.001.000.00
原初相对表达量R a w R Q （R e l a t i v e Q u a n t i t a t i o n ）
a
b c d a
b c d
a
b c d miR156
miR159
miR164
检测的miRNAs Detector miRNAs
635
果树学报26卷
增曲线Ct值间隔一致。因此，为了进一步验证草莓4种器官中6种miRNAs的相对表达量的准确性，我们将4种器官中的RNA的使用量按照10倍梯度稀释，系统比较了miR159和miR165在4种器官中的表达差异。当RNA的使用量依次为100ng、10 ng、1ng和0.1ng时，在每一种器官中针对一种miRNA，4种浓度梯度稀释所形成的4条扩增曲线之间拥有基本一致的Ct值间隔。RNA使用量的每一个级别，miR159和miR165在4种器官中具有相同的差异表达趋势，表明了试验结果的准确性和可靠性。
3讨论
3.1引物探针
一直以来，人们多采用Northern印记的方法检测不同物种中miRNA的表达[17，25]。近来，定量PCR 的方法被应用在miRNA表达量的研究上，这种方法要比Northern印记具有更高的灵敏性[14-15]。本文通过设计引物探针成功地利用定量PCR的方法检测了草莓不同器官中miRNA的表达，6种miRNAs在4种草莓器官中的表达存在差异，多次重复和梯度稀释试验充分验证了差异的准确性。由于每一个引物探针的序列是由10个完全一致的核苷酸和8个miRNA的3'端的反向互补序列组成，因此，检测几种miRNA就需要几条引物探针，这样导致试验的费用比较昂贵。基于每一条探针序列中都有10个完全一致的核苷酸，因此，我们直接设计了一条只包括这10个核苷酸的引物探针（图3B：FAM-ttcagttgag-TAMRA），它能同时检测多种miRNAs，目前正利用该探针进行草莓、苹果等多个物种中多种miRNAs 的表达研究。
3.2miRNAs在草莓不同器官中的差异表达
miR164家族能通过调节具有NAC功能域的转录因子（NAM/ATAF/CUC/NAC）基因家族中的CUC1（CUP SHAPED COTYLEDON1）、CUC2和CUC3来实现对植物的花瓣数量以及花器官边缘细胞与顶端分生组织细胞分化的调控[26-28]。Laufs等[27]研究指出miRNA通过对CUC基因的调控来影响拟南芥花分生组织边界的大小，降低拟南芥中miR164水平，就会导致花器官产生不正常的发育，边界扩大。而本研究也发现，miR164在花托中的表达量明显高于其他器官，达到6.615，因此，我们认为miR164在花托中的高表达是草莓花器官正常发育所需要的。
研究显示，miR172通过调控靶标AP2（APETA-LA2）和AP2-like基因来调节植物开花的时间和花的形态[29-30]，其中AP2在拟南芥花发育的ABC模型中属A类基因，在包括所有花器官轮的整个植株中都有表达。本研究在草莓初花期的叶片、生长点、萼片、花瓣、雄蕊、花托以及根系等器官中均检测到了miR172的表达（数据本文未列出）。Axtell等[12]在研究拟南芥不同组织器官中miRNAs表达差异时显示，miR172在根中的表达量要略低于在叶片中的表达量，这与本研究中miR172在草莓根系中表达量很低，而在幼叶中表达水平很高的结果不完全一致。
miR165能作用于第Ⅲ类带有同型亮氨酸拉链结构域（classⅢHD-Zip）和KANAD1基因家族成员，其中PHB，PHV，REV，KAN1，KAN2和KAN3能调节叶片、花器官和维管组织细胞的极性分化，从而影响植物形态的建成[31-32]。本研究通过定量PCR方法在草莓的4种器官中都检测到了miR165的表达，相对表达量差异不是很大，miR156和miR159也一样，有待进一步的功能验证的研究。
4结论
研究通过设计茎环反转录引物，利用实时RT-PCR技术成功地检测了草莓4种器官中6种miR-NAs的表达差异，发现miR164在草莓花托中高度表达，miR172在根系中表达量很低，miR156和miR159等在草莓4种器官中的表达差异不明显，这些结果为进一步验证miRNA基因在草莓植株生长发育过程中的重要作用奠定基础。
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636
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