第20卷第3期2010年5月
江苏大学学报(医学版)
Journa l o f Jiangsu U n i ve rsity(M ed ici ne Ed iti on)
V o.l 20N o .3M ay 2010
伤寒沙门菌调节因子Uhp A 的功能研究
李君辉1
,罗 哲1
,谢新民1
,李安平2
,杜 鸿2
,生秀梅2
,黄新祥
2
(江苏大学1.生命科学研究院; 2.基础医学与医学技术学院生物化学研究室,江苏镇江212013)[摘 要] 目的:探讨伤寒沙门菌调节因子U hpA 的功能。方法:用载体pBAD 介导回补uhpA 至伤寒沙门菌uhpA 基因缺陷变异株,用q RT-PCR 观察cy s M 和tre B 基因表达,用表达载体pET-22b 原核表达U hp A 蛋白,用凝胶阻滞试验观察U hp A 蛋白与cy s M 和tre B 启动子区域DNA 片段的结合。结果:成功构建p BAD uhpA 重组质粒,在uhpA 缺陷变异株中回补uhpA 基因后,c y s M 和tre B 的表达明显恢复,但U hpA-H is6蛋白与cy s M 和tre B 的启动子区域DNA 片段无明显结合。结论:伤寒沙门菌U hp A 在高渗应激条件下能促进硫代谢及海藻糖代谢相关基因表达,且可能为间接作用。
[关键词] 伤寒沙门菌;U hp A;凝胶阻滞;基因表达调节
[中图分类号] R 378.2 [文献标志码] A [文章编号] 1671-7783(2010)03-0185-05
[基金项目]国家自然科学基金资助项目(30570088)
[作者简介]李君辉(1983)),男,江苏镇江人,硕士研究生;黄新祥(通讯作者),教授,博士生导师,E-m a i :l hux i nx @yahoo .com.hk
R esearch of the functi on of the regul ator UhpA in
Salm onell a enteri ca serovar Typhi
LI Jun-hui 1
,LUO Zhe 1
,X I E X in-m in 1
,LI An-p ing 2
,DU H ong 2
,SHE NG X iu-m ei 2
,H UANG X in-x iang
2
(1.S chool ofL ife S ci en ce ;2.Depart m en t of B i oche m i stry ,S chool ofM edical Science and Laborat oryM ed ici ne ,J i angs u Un i versity ,Zhen jiang
J i angs u 212013,Ch i na)
[A bstract] Objective :To explore the functi o n of the regu lator UhpA i n Sal m onella enterica serovar Typh.i M et hods :A reco m binant p las m id pB AD uhpA conta i n i n g the uhpA gene w it h its o wn pr o m o ter w as transferred into the uhpA de leted mutant o f S.entericar serovar Typh.i qRT-PCR w as perfor m ed to obser ve the expression of cy s M and treB .UhpA prote i n w as expressed by a reco m binant plas m i d pET-22b uhpA in E.coli .The gel sh ift assays w as perfo r m ed to exp l o re t h e co mb i n ation bet w een UhpA and the pro m o ter reg ion of cy s M and tre B .R esults :Reco m binant p l a s m id pBAD uhpA was successf u ll y constructed .A fter co m p le -m enti n g uhpA gene i n the uhpA de l e ted m utan,t the expression of cys M and treB w as obv i o usly restored .G el sh ift assays sho w ed thatUhp A prote i n cou l d not bind the pro m ote reg ion of cy s M and treB .Conc l u sion :A t up -sh ift high os m o tic treat m en,t t h e U hpA m ay pro m ote the expressi o n of genes involved i n the m etabo lis m of su lf u r and trehalose i n d irectly .
[Key w ords] Sal m onella en terica serovar Typh;i UhpA;gel shift assay ;gene expression regulati o n 伤寒沙门菌(Sal m onella enterica serovar Typh i)是沙门菌属中一种人类严重的肠道致病菌,已成为一种重要的原核生物基因表达与信息调控研究的模式菌[1]
。沙门氏菌在感染的过程中,必须适应新环境(渗透压、酸性环境、巨噬细胞吞噬、抗菌肽等),对不同环境的调节主要由细菌多种双组分调节系统
(t w o -co m ponent regu latory syste m )来介导[2]
。目前在沙门氏菌和埃希菌(E scherichia coli )中已发现数
十种双组分调节系统。
UhpB /U hpA 作为一种双组分调节系统,调控转运蛋白UhpT 的表达,从而有助于细菌利用外界环
境中的6-磷酸葡萄糖作为碳源或能量来源[3]
。我们最近的基因芯片相关分析表明,uhpA 基因缺陷变异株在高渗应激条件下相对于野生株有一系列基因的表达发生了明显的下调,而且这些基因大多与硫代谢相关。这提示在高渗应激条件,uhpA 基因可能
参与硫代谢途径的调控[4-5]。为了深入地研究U hpA 的功能,我们在uhpA基因缺陷变异株中回补uhpA 基因,通过qRT-PCR观察其对下调基因表达的影响,同时表达UhpA蛋白,通过凝胶阻滞试验,分析Uhp A对于硫代谢途径的相关基因是直接还是间接调控。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株和质粒菌株:伤寒沙门菌野生株G I-FU10007,uhpA-(伤寒沙门菌野生株G I F U10007剔除uhpA基因),uhpA-(pBAD)(uhpA-含pBAD/gó质粒),uhp A-(pB AD uhpA)(uhpA-含pB AD uhpA)、大肠埃希菌E.coli DH5A,E.coli TG1,E.coli J M109, E.coli J M109(pET-22b uhpA)(E.coli J M109含pET-22b uhpA)
质粒:pBAD/g III,pET-22b(两质粒用于蛋白表达,Am p抗性),pB AD uhp A(pBAD/gó含uhpA基因及其启动子区域),pET-22b uhpA(pET-22b含uhpA 基因)
1.1.2主要试剂限制性核酸内切酶Bam H?, Sal?,N co?,T4DNA连接酶,ExTaq,pfuTaq,无RNA 酶的DNA酶?,TA克隆试剂盒均为Ta K a Ra(大连)公司产品;琼脂糖,胶回收试剂盒均为Pro m ega公司产品;蛋白纯化系统,总RNA提取试剂盒为Q iagen 公司产品;反转录试剂盒SuperScri p tó(Inv itrogen 公司);GS M缓冲液根据相关文献配制[6]。
1.1.3主要仪器PCR扩增仪2700(AB I);凝胶成像系统Gene Gen i u s B io i m ag i n g Syste m(B i o-Rad);电转化仪Gene Pulsero II(B i o-Rad);核酸检测仪Spectrophoto m eter ND-1000(N anoDrop);荧光定量PCR仪(Corbett);垂直平板电泳仪(B io-Rad)。
1.1.4引物合成本文所用引物均由上海生工生物技术公司合成,引物序列见表1。
表1引物序列
Tab1Sequ ences of pr i m ers i n th is study
引物名称引物序列用途F a(N co?)AT CC ATGGGGTAAGTGCTTTTG CCG uhpA回补株制备Fb(Sal?)GC GTCGACTTACCAA CCGTCAAACA uhpA回补株制备cy s M P a GAA C AAACCATCGGCAATAC qRT-PCR
cy s M Pb CAACAGCTTCATGCGATAAC qRT-PCR
t reB P a CGCTTTATGATTTTTTATGG qRT-PCR
t reB Pb TCAATA CTAAATACGCCGAA qRT-PCR
uhpA-上游(N de?)CCG CATATGATTACCGTTGCCCTTAT U hpA蛋白表达uhpA-下游(X ho?)ATA CTCGAGCC AA CCGTCAAA CATG C U hpA蛋白表达cy s D-上游GCTTGTG C AGGAAGGATAAAG凝胶阻滞实验cy s D-下游GCTGCTACTTCACGGATAATG凝胶阻滞实验
t reB-上游TCACTGTCGATCCTGGTCATG凝胶阻滞实验
t reB-下游GAGTAATGCAGTGGCTCA CCG凝胶阻滞实验
1.2方法
1.2.1uhpA缺陷变异株中回补uhpA基因分别在uhp A基因上、下游设计引物Fa与Fb并在5c端加Nde?,Xho?酶切位点,以伤寒沙门菌野生株基因组DNA为模板,用高保真DNA聚合酶pfu扩增目的基因,将纯化后的PCR产物与载体pBAD/gó同时用Nde?,Xho?双酶切,酶切产物用酚仿-乙醇法纯化后用T4DNA连接酶22e过夜连接。连接产物用热休克法转化至大肠埃希菌TG1,筛选疑似阳性克隆并用Nde?,X ho?双酶切和PCR分析鉴定,并经基因序列分析验证(由上海英骏生物技术公司完成)。将构建成功的重组载体pBAD uhpA转入uhpA 缺陷变异株,将其命名为uhpA回补株uhpA-(pB AD uhp A),同时将空pB AD/gó载体导入uhpA 缺陷变异株作为对照株uhpA-(pBAD)。
1.2.2细菌培养及总RNA提取挑取S.Typhi G I-FU10007,uhpA-(pBAD uhpA)和uhpA-(pBAD)单菌落接种于1m l等渗LB培养液中,37e振荡(250r/
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m in)培养过夜,以1B 100分别转接于20m l 等渗LB 培养液中,LB 培养液中均加入了0.2%的L -阿拉伯糖,37e 振荡(250r /m in)培养4h 至对数生长期,再加入终浓度为300mm ol/L 的NaC l 培养30m in 。冰上放置15m in 后离心(4000r /m i n ,10m in ,4e )收集菌体。用总RNA 提取试剂盒提取细菌总RNA,并用无RNA 酶的DNA 酶?(37e 20m in ,80e 15m in)消化残量DNA 。用核酸检测仪检测RNA 浓度,同时取1L l 进行琼脂糖凝胶电泳,分析RNA 的质量。-70e 保存RNA 备用。1.2.3 qRT-PCR 采用上述方法提取和处理细菌总RNA,取4L g 总RNA,用N8随机引物,按照反转录试剂盒操作进行反转录。从筛选的差异表达基因中,选取2个差异基因,用特异性引物进行qRT -PC R,观察基因表达。qRT-PC R 采用SYBR Green 并按文献[6]进行,用基因组DNA 梯度稀释制作相应的标准曲线,据样品测定的初步结果确定标准品浓度范围。采用基因特异性引物进行扩增,扩增产物长度cy s M 为265bp ,treB 为290bp ,序列信息见表1。
1.2.4 U hpA 蛋白的表达纯化分别在uhpA 基因上、下游引物的5c 端加上Nde ?和Xho ?酶切位点,去除基因本身的终止子,利用载体上H is6后面的终止子,使表达的U hpA 蛋白C -末端带有H is6标签。以伤寒沙门菌野生株基因组DNA 为模板,用高保真DNA 聚合酶pfu 扩增目的片段,将纯化后的PCR 产物与回补载体pET-22b 同时用Nde ?,X ho ?双酶切,酶切产物用酚仿-乙醇法纯化后,用T 4DNA 连接酶22e 过夜连接。连接产物用热休克法转化至大肠埃希菌TG1。提取疑似阳性克隆的质粒,用Nde ?,X ho ?双酶切和PCR 分析鉴定,并经DNA 序列分析验证(由上海英骏生物技术公司完成)。将构建成的重组质粒转入大肠埃希菌J M 109。挑取重组质粒转化株单菌落接种于1m l 等渗LB 培养液中,37e 振荡(250r/m i n )培养过夜,以1B 100分别转接于20m l 等渗LB 培养液中,37e 振荡(250r/m in)培养4h 至对数生长期。加入终浓度为0.01mmo l/L 的I PTG ,26e 振荡(250r/m in)培养8h ,离心(4000r /m in ,10m i n ,4e )收集菌体,加入裂解液并用超声破菌,取上清用镍柱按产品说明纯化U hpA 蛋白。
1.2.5 凝胶阻滞试验 据NCB I 公布的伤寒沙门菌Ty 2基因组序列信息,设计特异性引物cys D ,
tre B ,设计引物位置为转录起始点上游约250bp ,下
游约50bp,总长度约300bp ,以伤寒沙门菌G I -FU10007为模板,扩增出cys D 基因以及tre B 基因启动子区域。用酚仿-乙醇法纯化PC R 产物,取1~2
L g PCR 产物与不同浓度的Uhp A 蛋白混合,加入相应体积的GS M 缓冲液,使三者反应总体积为20L ,l 30e 孵育15m i n 。选取198bp 的真核生物PCR 产物作为阴性对照,8%的丙烯酰胺胶电泳分离条带,
溴化乙啶染色[8]
。2 结 果
2.1 uhpA 回补株的构建
为进一步研究UhpA 功能,本研究在uhp A 缺陷变异株中回补uhp A 基因,以伤寒沙门菌野生株基因组DNA 为模板,用特异引物扩增目的片段,全长841bp ,包括uhpA 的启动子,编码区域及终止子。将纯化后的扩增产物与载体pB AD /g ó定向连接,构建成pBAD uhpA 重组质粒。DNA 序列分析显示重组区域无碱基突变,表明pBAD uhpA 重组质粒构建成功。进而将pB AD uhpA 重组质粒和空质粒pB AD /g ó分别导入uhpA 缺陷变异株,构建成uhpA 回补株和对照株。2.2 qRT-PCR 分析cy s M 和treB 基因的表达
本研究选取半胱氨酸合成酶编码基因cys M 和6-磷酸海藻糖水解酶编码基因tre B 作为代表,用qRT-PCR 观察分析Uhp A 对硫代谢与海藻糖代谢相关基因表达的调节作用。标准曲线以cy s M 为例(图1)。结果显示高渗应激30m i n 后,伤寒沙门菌uhpA 缺陷株的cy s M 和treB 的表达明显低于野生株,在回补株中两者的表达水平有明显恢复,而对照株中则无此现象(图2)。
图1 伤寒沙门菌基因标准品浓度及样品浓度与
CT 值之间的线性关系
F i g 1 L i n ear relationsh i p b et w een CT value and
con cen trati on of the standard preparati on s and sa mp le
2.3 UhpA 蛋白表达
为了进一步研究UhpA 对硫代谢及海藻糖相关
187
第3期 李君辉,等.伤寒沙门菌调节因子U hp A 的功能研究
基因是直接调控还是间接调控,本文设计凝胶阻滞试验,以分析U hpA 能否与cys M 和tre B 的启动子区域DNA 片段结合,因此首先需通过原核表达获取Uhp A 蛋白。将构建成功的重组表达质粒pET -22b uhpA 转入大肠埃希菌J M 109,加入终浓度为0.01mm ol/L I PTG,26e 诱导表达Uhp A 蛋白,经SDS-PAG 电泳分析显示(图3),表达的UhpA 蛋白部分为可溶性,由于设计表达的蛋白C -末端带有组氨酸(H i s 6)标签,因此通过镍柱纯化获得了可溶性Uhp A
蛋白。
2.4 凝胶阻滞试验结果
为了观察UhpA 能否与硫代谢及海藻糖相关基
因的启动子区域DNA 片段结合,本研究采用凝胶阻滞试验,将treB 启动子区域的PCR 产物和cy s D 启动子区域的PC R 产物分别与不同浓度的UhpA 蛋白以及作为对照用的适量的来自于真核生物DNA
片段,在GS M 缓冲液中30e 孵育15m i n 后进行非
变性PAG 电泳,结果(图4)发现,Uhp A 蛋白与tre B,cys D 启动子区域无明显结合。结果提示,UhpA 对tre B,cy s D 等基因的调控可能为间接作用。
1,2,3,4,5对应加入的UhpA 蛋白量分别为0,2,4、6和8L g ;图上方
条带为tre B 启动子区域特异性DNA 片段(图4a)或c ys D 启动子区域特异性D NA 片段(图4b ),下方条带为来自于真核生物的DNA 片段作为阴性对照
图4 凝胶阻滞试验结果F i g 4 R esu lts of gel s h ift assay
3 讨 论
伤寒沙门菌是一种经消化道感染的重要人类致病菌,可造成全身系统性感染。UhpB /Uhp A 双组分调节系统是沙门菌的一种十分重要的双组分调节系统,调控转运蛋白UhpT 的表达,而有助于利用外界环境中的6-磷酸葡萄糖作为碳源或能量来源[3]
。
基因表达谱研究发现伤寒沙门菌在高渗应激15m i n
后,uhpA 与uhpB 基因表达有明显上调
[7]
,推测Uh -pA 在高渗应激条件下或能参与对其他基因的表达调控。
我们最近在制备伤寒沙门菌uhpA 基因缺陷变异株后,利用伤寒沙门菌基因组芯片分析uhpA 基因缺陷变异株与野生株在高渗应激30m in 后的转录谱,发现两者之间只有21个基因的表达出现差异,且这些基因在uhpA 基因缺陷变异株中相对于野生株全部表现为下调,其中cy s J,cy s D ,cy s P ,cys W ,cy -s U,cy s A,cys C,cy s K ,cys H ,sop D 这10个基因下调最为明显。令人惊奇的是,细菌利用外界环境中的无机硫参与半胱氨酸生物合成途径的基因全部下调,它们是cy s J,cy s D ,cy s P ,cys W ,cy s U,cy s A ,cys C,cys K ,cys H ,cy s N ,cy sI ,cy s M
[4]
。之前的研究已经报道参与
半胱氨酸生物合成途径的基因受Lys R 类型的转录激活因子CysB 和Cb1调控
[8-9]
。cys B 在革兰阴性
菌中是一个高度保守的基因,cb 1编码的蛋白参与有机硫的转运和脱磺酸基作用。值得注意的是,在伤寒沙门菌中乙酰丝氨酸是CysB 与Cb1调节因子
不可缺少的诱导物[10-11]
。我们的实验显示在高渗应激30m in 后,UhpA 显现出同CysB 与Cb1被乙酰丝氨酸激活后类似的功能。另外,作为已经被证实
188 江苏大学学报(医学版) 第20卷
的受UhpB/U hpA双组分调节系统直接调控的UhpT,在高渗应激30m in后并没有明显的变化,有可能是因为环境中没有6-磷酸葡萄糖的刺激。另外,在这21个基因中,也包含了参与海藻糖代谢的tre B和treC基因[4]。因此,Uhp A很可能在高渗应激条件下通过半胱氨酸生物合成途径参与了硫代谢。
为了进一步观察和研究UhpA对氨基酸和糖代谢相关基因的表达调节功能,本研究首先利用重组质粒对uhp A基因缺陷变异株回补uhpA基因,选用参与半胱氨酸生物合成的cys M基因和参与海藻糖代谢的tre B基因作为代表,用qRT-PC R特异性分析cy s M和treB基因表达,结果进一步证实,在高渗应激下伤寒沙门菌Uhp A确实可以促进半胱氨酸生物合成和海藻糖代谢相关基因的表达。
为了分析UhpA促进基因表达是直接作用还是间接作用,我们利用原核表达并纯化获得UhpA蛋白,选择参与无机硫代谢的cys D基因与参与海藻糖代谢的tre B基因的启动子区域,进行凝胶阻滞实验,发现U hpA不能直接结合于两者的启动子区域,结果提示UhpA促进半胱氨酸生物合成和海藻糖代谢相关基因的表达可能为间接作用。UhpA作为UhpB/UhpA双组分调节系统中的反应调节蛋白,通常认为在菌体中当其磷酸化后才能影响靶基因表达,但也有研究报道当双组分调节系统反应调节蛋白的浓度达到一定水平时,即使其不发生磷酸化,也能作用于下游基因[12]。由于本次研究没有进行磷酸化Uhp A蛋白相关的试验,所以目前尚不能完全肯定UhpA的这种间接作用。
总之,本次研究结果表明,伤寒沙门菌中U hpA 在高渗应激条件下对硫代谢及海藻糖代谢相关基因的表达发挥调控作用,且有可能为间接调控。
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[收稿日期]2010-02-26[本文编辑]陈海林
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第3期李君辉,等.伤寒沙门菌调节因子U hp A的功能研究
伤寒、副伤寒沙门菌感染 伤寒、副伤寒沙门菌感染主要是通过消化道传播，少部分也可通过微生物或感染性材料的胃肠道外接种传播。伤寒由伤寒沙门菌引起，副伤寒由副伤寒甲、乙、丙沙门菌引起。沙门菌还可引起胃肠炎和败血症。伤寒沙门菌进入消化道后，未被胃酸杀灭的细菌进入小肠，在肠腔内碱性环境、胆汁和营养物质的适宜条件下繁殖。伤寒沙门菌入侵肠黏膜，经淋巴管进入肠道淋因组织及肠系膜淋巴结继续繁殖，再由胸导管进入血流，引起第一次菌血症。此阶段属潜伏期，患者无症状。伤寒沙门菌随血流进入肝脾、胆囊、骨髓等组织器官内继续大量繁殖，再次进入血流引起第二次菌血症，释放内毒素，产生临床症状（相当于初期）。（腹痛）病程第2～3 周，伤寒沙门菌继续随血流播散全身，经胆囊进入肠道，大量细菌从粪便排出。来自胆囊的伤寒沙门菌，部分通过小肠黏膜，再次入侵肠道淋巴组织，使原已致敏的肠道淋巴组织产生严重炎症反应，加重肠道病变。在所有肠道病原感染中，伤寒沙门菌（Salmonella typhi）感染是最严重的，伤寒沙门菌内毒素是重要的致病因素。但伤寒持续发热的发生机制则主要是由于病灶中的单核-吞噬细胞和中性粒细胞释放内源性致热原所致。随着机体免疫反应，尤其是细胞免疫作用的发展，细胞内伤寒沙门菌逐渐被消灭，病变亦逐渐愈合，患者随之恢复健康。少数患者在病愈后，由于胆囊长期保留病菌而成为慢性带菌者。副伤寒致病机制与伤寒类似。 从临床表现上看伤寒的潜伏期为7~23d ，一般为10~14d。病程第1 周，起病大多缓慢。发热，常伴全身不适、乏力、食欲减退、咽痛和咳嗽等。病情逐渐加重，体温呈梯形上升，可在5~7d 内高达39~40℃。病程第2~3周常出现伤寒的典型表现，如高热、稽留热持续10~14d；出现明显食欲不振、腹部不适、腹胀、便秘、腹泻等消化道症状；尚可出现精神恍惚、表情淡漠、呆滞、反应迟钝、听力减退等神经系 统症状，重者可出现谵妄、昏迷、病理反射等中毒性脑病表现；常有相对缓脉或有重脉； 肝脾肿大；部分患者于病程7~13d 皮肤出现淡红色玫瑰疹。肠出血、肠穿孔等并发症较多在本期出现。病程第3~4周体温出现波动，并开始逐步下降。病程第 5 周体温恢复正常， 食欲好转，通常在 1 个月左右完全康复。 副伤寒甲、乙潜伏期为2~15d ，一般在8~10d 。起病时可有急性胃肠炎症状，如腹痛、呕吐、腹泻等。2~3d 后出现发热等伤寒临床表现，胃肠炎症状减轻。弛张型发热较多见，每天波动大，热程较短（副伤寒甲平均3 周，副伤寒乙2 周），毒血症状较轻，但胃肠症状明显（副伤寒乙尤为多见）。玫瑰疹出现转早、较多、较大，颜色较深。 副伤寒丙临床表现复杂，起病急，体温上升快，不规则热型，常伴寒战。主要表现为败血症型，其次为伤寒或胃肠炎型。热程一般约2~3 周。 二、细菌的生物学特性 伤寒、副伤寒甲乙丙均属于肠杆菌科、沙门菌属，为革兰氏阴性直杆菌，大小
文献综述： 鼠伤寒沙门氏菌试验（Ames试验） 摘要：食品安全无论如何怎样强调都不会过分，迅速而准确地检测致癌物质是食品安全问题的重要方面。美国科学家Dr. Bruce Ames及其同事创立了一种方法，叫鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验），它是利用一组组氨酸营养缺陷型菌株加入待测物在有或没有微粒体活化系统条件下，发生回复突变的特征鉴定化学物质的诱变活性，现已成为初步筛选化学物潜在致突变的首选方法。 关键词：鼠伤寒沙门氏菌试验；基本原理；一般步骤；应用及其研究进展； 1 前言 污染物对人体的潜在危害，引起人们的普遍关注。世界上已发展了百余种短期快速测试法，检测污染物的遗传毒性效应。美国科学家Dr. Bruce Ames等经十余年努力，于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验（亦称Ames试验）已被世界各国广为采用。该法比较快速、简便、敏感、经济，且适用于测试混合物，反映多种污染物的综合效应。 众多学者有的用Ames试验检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌性；有的用Ames试验检测水源水和饮用水的致突变性（比如，美国派斯净水器就通过了Ames 试验），探索较现行方法更加卫生安全的消毒措施；或检测城市污水和工业废水的致突变性，结合化学分析，追踪污染源，为研究防治对策提供依据；有的检测土壤、污泥、工业废渣堆肥、废物灰烬的致突变性，以防止维系生命的土壤受致突变物污染后，通过农作物危害人类；检测气态污染物的致突变性，防止污染物经由大气，通过呼吸对人体发生潜在危害；用Ames 试验研究化合物结构与致变性的关系，为合成对环境无潜在危害的新化合物提供理论依据；检测农药在微生物降解前后的致突变性，了解农药在施用后代谢过程中对人类有无隐患；还有用Ames试验筛选抗突变物，研究开发新的抗癌药等等[1]。 2 定义 2.1 回复突变（Reverse mutation） 细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。 2.2 基因突变（Gene mutation） 在化学致突变物作用下细胞DNA中碱基对的排列顺序发生变化。 2.3 碱基置换突变（Base substitution mutation） 引起DNA链上一个或几个碱基对的置换。 碱基置换有转换(transition)和颠换(transversion )两种形式。 转换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘧啶所替代，或一个嘌呤被另一嘌呤所代替。 颠换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘌呤所替代，或一个嘌呤被另一嘧啶所代替。 2.4 移码突变（Frameshift mutation） 引起DNA链上增加或缺失一个或多个碱基对。 2.5 鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验（Salmonella typhimurium/reverse mutation assay） 利用一组鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型试验菌株测定引起沙门氏菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的组氨酸缺陷型(his-)转变为原养型(his+)回复突变的试验方法。 3 原理 鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养
沈阳儿童医院PICU 2020-05-11
医院污物种类 根据医院用品的危险性分类及其消毒、灭菌的原则 医院日常清洁、消毒、灭菌工作 病理性放射性 化学性 各种感染性 创伤性 药剂 爆炸性 一般生活性
患儿女，2个月15天，以“发热、腹泻4天”为主诉入院。 病例简介 查体 患儿于入院前4天总有无明显有瘾出现发热，体温最高39.2℃，无寒战及抽搐，口服“对乙酰氨基酚”体温可降至 37.5℃，间隔月6-7小时反复发热，伴有腹泻，每日排7-8次黄绿色粘液变，口服“琥乙红霉素”0.1克，日2次，“电解质泡腾片”随服，“酪酸梭菌二联活菌散”500mg，日2次，治疗4天病情无好转，入院当天大便可见血丝，再次来我院，急诊以“细菌性痢疾”为诊断收入院，患儿病后精神状态一般，有鼻塞，偶有喉中痰鸣，无咳嗽及喘息，人工喂养，配方奶 120ml/次，无呕吐及腹胀，尿量略少 T：36.9℃，P：154次/分，R：44次/分，BP：94/46mmHg,意识清楚，状态反应可，全身皮肤无黄染，皮肤弹性可，无皮疹及出血点，全身浅表淋巴结无肿大。前囟平坦，2.0*2.0cm，对光反射 灵敏，无鼻扇，口唇粘膜略干燥、无发绀，口腔粘膜光滑，眼部粘膜充血，颈软无抵抗，无三凹征，双肺叩诊轻音，双肺呼吸音粗糙，心前区无隆起，心尖搏动范围正常，心浊音界无扩大，心率：154次/分，节律齐，心音有力，心前区可闻及2/6级收缩期杂音，无心包摩擦感，腹部略膨隆，柔软，无压痛，无包块，肝下界在中线肋缘下1cm，质地软，脾肋下未触及。肠鸣音4次/分。 现病史
根据医院用品的危险性分类及其消毒、灭菌的原则 治疗 2020-04-29本院便常规：白细胞（高倍视野>40个/HPF）红细胞（高倍视野20-25个/HPF），潜血阳性。血常规：白细胞计数：11.9*109/L， 中性粒细胞百分比54.5%，淋巴细胞百分比31.5%，CRP 14.36mg/L。胸部正侧位DR：双肺纹理增强、左下肺纹理模糊，双肺透光度良好，双肺门不大。 入院后肠道菌群：细菌总数较正常减少，G+杆菌明显减少，G-杆菌减少，G+球菌增加，印象诊断：II度菌群失调。2020-05-01脑脊液常规：外观无色透明液体，潘氏蛋白定性阴性，脑脊液细胞计数2*106/L，脑脊液生化：脑脊液蛋白0.26g/L，脑脊液氯化物122.1mmol/L，脑脊液葡萄糖 2.90mmol/L。脑脊液图片：未见细菌。头部MRI：双侧颞额蛛网膜下腔增宽，枕大池大。血培养：沙门菌属某些种菌，头孢曲松、环丙沙星敏感。 入院后予头孢米诺静滴、干扰素泵吸抗感染治疗，有鼻塞及喉中痰鸣，予布地奈德、特步他林泵吸局部抗炎，口服微生态制剂调节肠道菌群，口服蒙脱石散保护肠道粘膜，口服补液盐频服、静脉补液支持治疗。第2病日患儿仍有发热，发热峰值下降、发热间隔延长，第3日，便培养：沙门菌属某些种菌，血培养阳性，复查血培养，完善腰穿除外颅内感染。第4病日，日内体温最高37.5℃，予物理降温可降至正常。第4病日，患儿睡眠时偶有喉鸣音，补充诊断：先天性喉喘鸣，自备维生素AD口服。第6病日，热退，复查血常规及CRP等炎性指标。 辅助检查
沙门菌属和志贺菌属检验 步骤和方法 1 .形态观察 (1)革兰染色：沙门菌属细菌为革兰阴性细长杆菌。志贺菌属细菌为革兰阴性杆菌，散在分布。 (2)观察鞭毛染色标本片：镜下可见沙门菌属细菌具有周鞭毛。志贺菌属细菌无鞭毛。 2?菌落观察 (1)沙门菌属：将本菌接种在SS MAC平板上经35 'C孵育18?24h。由于本菌不分解乳糖并产碱，故在SS和MAC 平板上形成无色、半透明、光滑湿润、凸起的小菌落，产生H2S的菌落可在SS平板上形成中心带黑褐色的小菌落。 (2)志贺菌属：将本菌接种在SS和MAC平板上经35C孵育18?24h。由于志贺菌不分解乳糖，宋内志贺菌某些菌株可迟缓发酵乳糖，故其在SS平板和MAC平板上形成无色透明的、中等大小的菌落。除宋内志贺菌菌落外均为光滑型菌落。 3.生化反应氧化酶试验：方法同大肠埃希菌。沙门菌属和志贺菌属细菌氧化酶试验均为阴性。初步试验鉴定：挑取志贺菌和沙门菌的单个菌落分别接种在KIA、MIU和硝酸盐培养基上，经35C孵育18?24h，同时做触酶试验。其结果见表2—4。 最终鉴定：须做全面生化反应和血清学试验。 4 .血清学试验 (1)志贺菌属的分型鉴定：凡生化反应符合志贺菌属者均需做血清学鉴定。取1环志贺菌四种多价血清于载玻片 一端，再取少许待测菌与之混合，同时在玻片另一端取待测菌与生理盐水混合对照。结果：对照呈均匀混浊，待检菌 与志贺菌四种多价血清混合后，数分钟内出现肉眼可见的颗粒状凝集物即为阳性。继之用 A B、C D群最常见的单价 血清凝集定种。 结果判断、解释和报告： ①分离培养未见可疑菌落或经鉴定不符合志贺菌属鉴定依据者可报告“未分离到志贺菌属细菌”。 ②经分离鉴定后符合鉴定依据者，可报告“分离岀XX志贺菌”，若进一步做多种生化反应及因子血清分型后，可报告：“分离岀XX志贺菌X型”。 (2)沙门菌属的分型鉴定：如果生化反应及形态学检查疑为沙门菌，可选用沙门菌的多价诊断血清进行玻片凝集。 首先选用A?F组多价“ O诊断血清做玻片凝集试验。在试验时应以生理盐水作对照。血清凝集试验在5?10min内不 岀现凝集者可确定为阴性。但若生化反应比较典型，应考虑选用Vi凝集试验。若凝集，则用无菌生理盐水将菌洗下， 制成浓厚的悬液，加热100 C、30min，再与A?F组多价“ O诊断血清做凝集试验。若与A?F组多价“ O血清发生凝集，应再与沙门菌单价因子血清分别做玻片凝集试验，以确定该菌株属于哪一组。一般先选用本地区检岀率最高菌型的相应血清做玻片凝集反应。 若已确定哪一沙门菌种后，再分别先用H因子血清检查第I相抗原，然后检查第H相抗原，最后确定该菌种属 于哪一型沙门菌。 结果判断、解释和报告： ①分离培养未发现可疑菌落或经鉴定不符合沙门菌属细菌鉴定依据者，可报告“未分离岀沙门菌”。 ②生化反应符合沙门菌、玻片凝集试验结果阳性，可初步报告为：“分离到XX沙门菌”，或“X群沙门菌”。 5 ?肥达试验 （1）原理：用已知的伤寒沙门菌O H抗原，甲、乙型副伤寒沙门菌的H抗原（PA、PB）与肠热症患者血清做定量
作者简介：陈国怀，医学生物学工程师，主要从事诊断试剂生产和检定工作。 通讯作者：席仲兴，E-mail：xiyue8342181@sina．com ·论著· 甲型副伤寒沙门菌培养条件的优化 陈国怀，曹玲，罗广，刘晓，刘大东，金红燕，陈刚，席仲兴 兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心，甘肃兰州730046 摘要：优化甲型副伤寒沙门菌的培养条件，提高菌体产量。方法通过单因素及正交试验，对影响甲型副伤寒沙门菌生长的培养温度、NaCl浓度和pH等条件进行优化。结果甲型副伤寒沙门菌在NaCl浓度0．75%、温度35?、pH6．5时菌体产量最高。结论通过对甲型副伤寒沙门菌培养条件进行优化，获得较高的菌体产量，为后期诊断试剂盒的开发奠定了基础。 关键词：甲型副伤寒沙门菌；优化培养 中图分类号：Ｒ378．2+4文献标志码：A DOI：10．13309/j．cnki．pmi．2014．04．006 Optimization on growth condition of Salmonella paratyphoid A CHEN Guo-huai，CAO Lin，LUO Guong，LIU Xiao，LIU DA-dong，JIN Hong-yan，XI Zhong-xing Lanzhou Institute of Biological Products Co．Ltd．，Center for Gansu Provincial Vaccine EngineeringＲresearch， Lanzhou730046，Gansu Provionce China Corresponding author：XI Zhong-xing，E-mail：xiyue8342181@sina．com Abstract：Objective To optimize the growth condition of Salmonella paratyphoid A．Methods To study the effect for temperature，pH and NaCl concentration on the growth of Salmonella paratyphoid A by using the method of orthogonal d esign．Ｒesults The optimal culture condition of Salmonella paratyphoid A is NaCl concentration0．75%，temperature3 5?and pH6．5．Conclusion The optimal culture condition of Salmonella paratyphoid A is successfully achieved in this investigation． Key words：Salmonella paratyphoid A；Optimization for cultivation 肠热症是由伤寒沙门菌（Typhoidal salmonello-sis）和副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi）引起的严重肠道传染病。 在近年流行病调查结果显示，甲型副伤寒沙门菌引起的疾病所占比例逐渐升高，中国每年均有不同程度的甲型副伤寒流行及暴发［1］，需要及时采用相应的诊断试剂盒进行诊断，而诊断菌液的生产需要大规模培养菌体，副伤寒沙门菌各型要求的培养条件各不相同，在同等培养条件下，甲型副伤寒沙门菌与培养基的投入产出比值偏低。 实验中试图对甲型副伤寒沙门菌培养条件进行优化，以达到提高其菌体的产量，降低试剂盒制备的生产成本，这将对甲型副伤寒沙门菌的诊断和预防具有重要的现实意义。1材料与方法 1．1材料 1．1．1菌种甲型副伤寒沙门菌菌株号为CM-CC50001，来源于中国食品药品检定研究院，由兰州生物制品研究所有限责任公司保管。 1．1．2仪器OLYMPUS CX22LED生物显微镜，购自日本OLYMPUS公司；PHSJ-5型精密pH计，上海雷磁精密仪器有限公司产品；AL104-IC电子天平，梅特勒-托利多（上海）有限公司。电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；VS-1300L-U洁净化工作台，购自苏州安泰空气技术有限公司；LKB—UltrospecⅢ型分光光度计为LKB Biochrom England 产品。 1．1．3试剂与培养基培养基由兰州生物制品研究所有限责任公司培养基室提供。盐酸、氯化钠和氢氧化钠，分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。
沙门氏菌病又称副伤寒。是沙门氏菌细菌引起人和动物共患疾病的总称。猫副伤寒主要是由鼠伤寒沙门氏菌所致。临床主要以肠炎和败血症为特征，以幼小猫为主，成年猫多为隐性感染，怀孕的动物会因此而流产。 鼠伤寒沙门氏菌在自然界分布很广，很容易在动物、人和环境之间传播。猫主要是经消化道'呼吸道感染。圈养的猫常因吃了没煮熟的或没加工的食物而感染，散养的猫在自由觅食时，吃了变质食物而发病。另外，器皿、医疗器械亦可成为传播媒介。 此病症状： 根据患猫不同年龄、营养状况、免疫状态和细菌感数量等因素而表现出以下几种类型： 1 胃肠炎型：潜伏期3－5天。患病初期表现出精神沉郁，食欲下降，体温上升至40°C至41.1°C。随后呕吐、流涎、腹痛、腹泻。腹泻物初为水样粪便，后为带血的粪便。病后几天内体重减轻，严重脱水，粘膜苍白，虚弱，休克。表现为机体应激性增强，后肢瘫痪，失明抽搐。少数病例可引起肺炎，出现咳嗽，呼吸困难及鼻出血。 2 菌血症与毒血症型：主要见于小猫，是一般的胃肠炎过程的前期症状。患病的猫表现为极度沉郁、全身虚弱、体温下降，微循环发生障碍，毛细血管充盈不良，可发生转移性感染，侵害某个器官，潜伏期往往多年。 治疗方法： 1 抗菌消炎：如果患猫呕吐不太严重，可经口给药。氯霉素（2毫克/千克体重）口服，每日4次，肌肉注射时剂量减半，连用4－6天；呋喃唑酮（0.01克/千克体重）每日2次，连用5－7天；甲氧苄氨嘧啶（0.04-0.08克/千克体重）每日2次，连用7天；磺胺甲基异恶唑或磺胺嘧碇（0.02－0.04克/千克体重）每日2次，连用7天。 2 对症治疗：有肠道出血的猫可肌肉注射止血敏2毫升，每日3次。另外，用0.1%高锰酸钾或口服补液盐和次硝酸铋液直肠深部灌肠。 3 辅助疗法：对呕吐、腹泻较为严重的猫，为防脱水可静滴糖盐水或复方氯化钠。心脏功能减退者，可肌肉注射0.5%强尔心，剂量为0.5-2毫升。 预防措施： 猫沙门氏菌病预防比较困难。为了降低此病发生，要采取预防措施： 1 严格控制副伤寒病猫和带菌猫与健康猫接触。有病猫生活过的环境及用具，用5%氨水或2%－3%烧碱溶液彻底消毒。
沙门氏菌病 沙门氏菌在各种动物以及人类当中分布广泛。其中有些菌株可导致猪病。 这种细菌主要在生长猪以及有些母猪的肠道内繁殖。感染猪只可连续数周甚至数月从粪便中排出病原，而不表现任何症状。在屠宰的时候，猪只肠道中的沙门氏菌可能污染胴体，导致人类食物中毒，对公共健康构成潜在威胁。 霍乱沙门氏菌S. choleraesuis和德比沙门氏菌S. derby对猪具有宿主适应性，感染母猪可携带病原很长时间。其中霍乱沙门氏菌有时会引发母猪的临床症状（体温升高、抑郁、败血症、肺炎、脑膜炎、关节炎和腹泻），但很少引起人类的疾病。然而猪当中最常见的血清型是鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium，这种沙门氏菌有时会导致仔猪腹泻，更是导致人类食物中毒的一种主要原因。该沙门氏菌的有些毒株具有多种抗药性。如果确诊猪群中感染了这种病原，就应采取必要卫生措施，以防工作人员被感染。猪体内还常会检到一些以其它动物为宿主的沙门氏菌，但这些细菌不会导致发病。 发病与否与病原剂量有关，病原数量达到一定水平之后才会引发临床症状。 需要注意，鼠伤寒沙门氏菌是造成人类食物中毒的常见原因。这种病菌常可在猪身上检出。任何日龄猪只均可感染沙门氏菌病，8周龄以上生长猪更常见。典型的、严重的沙门氏菌病通常发生在12～14周龄阶段。 症状 断奶猪与生长猪 ?霍乱沙门氏菌会导致急性败血病和肺炎，表现发烧、厌食、呼吸困难、抑郁、咳嗽和生长缓慢等病症。 ?肢体末端（鼻、蹄、尾等部位）皮肤变蓝。 ?下痢恶臭，有时带血。这是个常见的典型症状。 ?肝脏受损时会表现黄疸，关节受损时会表现跛行。 ?患脑膜炎后会表现神经症状。 ?若不治疗，死亡率会上升。 ?鼠伤寒沙门氏菌感染可造成腹泻。 仔猪 ?仔猪通常可从初乳当中获得母源免疫，少见发病。 母猪 霍乱沙门氏菌感染和鼠伤寒沙门氏菌感染可能导致下列症状： ?体温升高。 ?精神抑郁。 ?食欲减退。 ?耳部、鼻吻部及尾部充血（皮肤变红）。 ?肺炎。 ?咳嗽。
小儿鼠伤寒沙门菌26例临床分析 宋淑萍 （安定区第二人民医院儿科甘肃定西743011） 关键词：腹泻；沙门菌；鼠伤寒；交叉感染；儿童 感染性腹泻是儿科的常见病，而细菌所致的感染性腹泻仍占重要地位，占30%左右，值得引发重视。我院收治经粪便培养证实为鼠伤寒沙门菌感染患儿27例，其中1例于住院三天转院，现将26例患儿的临床资料整理如下。 1. 临床资料 1.1 病例选择2007年1月至2009年12月我院儿科收治鼠伤寒沙门菌感染患儿26例，男16例，女10例。均为2岁以下婴幼儿，最小1例为30天新生儿，1岁以下共14例，占总数的53、8%。29例患儿中以腹泻为主诉入院20例，以急性上呼吸道感染住院6例，以支气管炎住院2例。住院后全部病例均有发热，体温37.6~40.0摄氏度，其中37.6~37.9摄氏度4例，38~39摄氏度4例，热程最短9天。全部病例均有腹泻，常在发热的同一天开始。腹泻每日≤10次10例，＞10次16例，粪便性状多变，多为黄绿色黏液便、脓血便或便带血丝，也可为蛋花汤样便，伴里急后急；不同患儿粪便性质不同，同一患儿各次粪便的性状亦可截然不同，伴恶心、呕吐18例，里急后重12例，不同程度脱水19例。伴小细胞低色素性贫血3例，伴佝偻病(初期)4例。
1.2 病因26例患儿均来自农村，有4例在外院治疗过程中(原发病为急性上呼吸道感染)出现腹泻、发热，经粪培养确诊为鼠伤寒沙门菌肠炎，患儿无特殊食物及药物接触史，此6例所住病房于1个月内曾收住鼠伤寒沙门菌肠炎(虽已经终末消毒处理)，考虑院内感染的可能性极大，另外18例患儿均与患者有直接接触史，其中8例与出院后粪便已成形但仍带菌的患儿有接触史，另外2例病因不明确。 1．3 实验室检查 1.3.1 粪便镜检4例初次粪便检查镜检阴性或少量白细胞、红细胞、脓细胞，22例初检均可见到数量不等的白细胞、红细胞、脓细胞。 1.3.2粪便培养第1次粪便培养出鼠伤寒沙门菌者22例。4例第1次未培养出细菌；第2次再送培养才出现鼠伤寒沙门菌。 1.3.3外周血象26例鼠伤寒沙门菌感染患儿外周血象检查结果：白细胞计数(1.1～1.5)×109/L者8例，(>1.5～ 2.0)×109/L者12例，>2.0×109/L以上者6例。26例的中性粒细胞0. 50～0. 80。 1.3.4药物敏感试验药物敏感试验与年龄、性别差异无统计学意义，而与发病时间有关，随时间的推移，敏感药物发生变化，耐药菌株逐渐增多，到目前，敏感药物只有亚胺培南／西司他丁钠（泰能）。中敏：头孢哌酮钠／舒巴坦。耐药：氨苄青霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素、妥布霉素、头孢唑林、头孢噻肟、头孢三嗪、头孢哌酮（先锋必）、磺胺甲口恶唑／甲氧苄啶（复方新诺明）、氟派酸、环丙沙星、诺氟沙星、利福平、四环素、氯霉素。
第三篇主要的病原微生物 第十三章病原细菌 第四节沙门氏菌 沙门氏菌(Salmonella)种类繁多，目前已发现2000多个血清型，且不断有新的血清型发现。它们主要寄生于人类及各种温血动物肠道，有些专对人致病，有些专对动物致病，也有些对人和动物都能致病。 一、生物学特性 （一）形态与培养其形态与大肠杆菌相似，无芽孢，除鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌外，其余均有周鞭毛，多数有菌毛。革兰氏染色阴性。本菌为兼性厌氧菌。在普通培养基上均能生长，在含有乳糖、胆盐和中性红指示剂的麦康凯琼脂平板上或SS琼脂平板上形成无色半透明、中等大小、表面光滑的菌落，可与大肠杆菌等发酵乳糖的肠道菌加以区别。 沙门氏菌不发酵乳糖和蔗糖，能发酵葡萄糖、麦芽糖和甘露醇产酸产气，V-P 试验阴性，不水解尿素，不产生靛基质，有的产生硫化氢。生化反应对鉴定沙门氏菌有重要意义。 （二）抗原构造沙门氏菌抗原结构复杂，可分为O抗原、H抗原和毒力Vi 抗原三种。 O抗原为细胞壁的脂多糖，能耐热100℃达数小时，也不被酒精或0.1％石炭酸所破坏。菌体抗原有许多组成成分，以阿拉伯字1、2、3、4等数字代表。每种菌常有数种O抗原，有些抗原是几种菌共有的，将具有共同抗原的沙门氏菌归属一组，这样可以把沙门氏菌分为A、B、C、D、E等34组，对动物致病的大多数在A—E内。 H抗原为蛋白质，对热不稳定，65℃15min或纯酒精处理后即被破坏。H抗原有两种：第1相和第2相，前者用a、b、c、d等表示，称为特异相。后者用1、2、3、4等表示，是几种沙门氏菌共有的称非特异相。具有第1相和第2相抗原的细菌称为双相菌，仅有其中一相抗原者称为单相菌。 伤寒与丙型副伤寒沙门氏菌的某些菌株有Vi抗原，存在于O抗原的外层，它能阻碍O抗原与相应抗体的特异性结合。 （三）抵抗力本菌的抵抗力中等，与大肠杆菌相似，不同的是亚硒酸盐、煌绿等染料对本菌的抑制作用小于大肠杆菌，故常用其制备选择培养基，有利于分离粪便中的沙门氏菌。沙门氏菌在水中能存活2～3周，在粪便中可活1～2月。对热的抵抗力不强，60℃15min即可杀死，5%石炭酸、0.1%的升汞、3%的来苏儿10～20min内即被杀死。 二、致病性 沙门氏菌属的细菌均有致病性，致病的毒力因子有多种，其中主要的有脂多糖、肠毒素、细胞毒素及毒力基因等，具有极其广泛的动物宿主。感染动物后常导致严重的疾病，并成为人类沙门氏菌病的传染源之一。因此沙门氏菌病是一种重要的人畜共患病。本菌最常侵害幼、青年动物，使之发生败血症、胃肠炎及其
前言 本标准代替 GB/T 4789.4-2008《食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验》。 本标准与 GB/T 4789.4-2008 相比，主要变化如下 ——修改了标准的中英文名称； ——修改了标准的范围； ——修改了培养基和试剂； ——修改了设备和材料； ——修改了附录 A。 本标准的附录 A、附录 B 为规范性附录。 本标准所代替的历次版本发布情况为： ——GB 4789.4-84、GB 4789.4-1994、GB/T 4789.4-2003、GB/T 4789.4-2008。 食品安全国家标准 食品微生物学检验沙门氏菌检验 1 范围 本标准规定了食品中沙门氏菌（Salmonella）的检验方法。 本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 冰箱：2 ℃～5 ℃。 2.2 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，42 ℃±1 ℃。 2.3 均质器。 2.4 振荡器。 2.5 电子天平：感量 0.1 g。 2.6 无菌锥形瓶:容量 500 mL，250 mL。 2.7 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 2.8 无菌培养皿：直径 90 mm。 2.9 无菌试管：3 mm×50 mm、10 mm×75 mm。 2.10 无菌毛细管 2.11 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 2.12 全自动微生物生化鉴定系统。 3 培养基和试剂 3.1 缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录 A 中 A.1。 3.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录 A 中 A.2。 3.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见附录 A 中 A.3。 3.4 亚硫酸铋（BS）琼脂：见附录 A 中 A.4。 3.5 HE 琼脂：见附录 A 中 A.5。 3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：见附录 A 中 A.6 3.7 沙门氏菌属显色培养基。 3.8 三糖铁（TSI）琼脂：见附录 A 中 A.7。 3.9 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录 A 中 A.8。 3.10 尿素琼脂（pH 7.2）：见附录 A 中 A.9。 3.11 氰化钾（KCN）培养基：见附录 A 中 A.10。 3.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录 A 中 A.11。 3.13 糖发酵管：见附录 A 中 A.12。 3.14 邻硝基酚-D 半乳糖苷（ONPG）培养基：见附录 A 中 A.13。 3.15 半固体琼脂：见附录 A 中 A.14。 3.16 丙二酸钠培养基：见附录 A 中 A.15。 3.17 沙门氏菌 O 和 H 诊断血清。 3.18 生化鉴定试剂盒。
沙门氏菌基本知识及检测方法 沙门氏菌属(Salmonella)是肠杆菌科的一个大属，有2000多个血清型，我国发现的约有100个。沙门氏菌广泛存在于猪、牛、羊、家禽、鸟类、鼠类等多种动物的肠道和内脏中。1880年Eberth首先发现伤寒杆菌，1885年Salmon分离到猪霍乱杆菌，由于Salmon发现本属细菌的时间较早，在研究中的贡献较大，遂定名为沙门氏菌属Salmonella 。本属细菌绝大多数成员对人和动物有致病性，能引起人和动物的败血症与胃肠炎，甚至流产，并能引起人类食物中毒，是人类细菌性食物中毒的最主要病原菌之一。 根据沙门氏菌的致病范围，可将其分为三大类群。第一类群：专门对人致病。如伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌(甲型、乙型、丙型)。第二类群：能引起人类食物中毒——食物中毒沙门氏菌群，如鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、纽波特沙门氏菌等。第三类群：专门对动物致病，很少感染人，如马流产沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌。致病性最强的是猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerae)，其次是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)。 一、沙门氏菌属的生物学特征： 1.形态染色特性：G-无芽孢杆菌。大小通常为 0.7～1.5μm × 2.0～5.0μm，菌端钝圆，散在，偶有短丝状，无荚膜，除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外均有周身鞭毛，能运动，绝大多数菌株有菌毛。需氧或兼性厌氧菌，生长温度范围为10～42℃，最适生长温度为37℃，适宜pH为6.8～7.8，对营养要求不高，在普通培养基中生长旺盛，胆盐可促进其生长。 2.培养特性：需氧或兼性厌氧菌；生长温度范围为10～42℃，最适生长温度为37℃；适宜pH为6.8～7.8；对营养要求不高，在普通培养基中生长旺盛；胆盐可促进其生长。 §普通琼脂：圆形、光滑、无色半透明、边缘整齐或不太整齐的中等大小(2 ～ 4mm)菌落。鸡白痢、鸡伤寒、猪副伤寒、甲型副伤寒沙门氏菌等只能长成细小菌落。§麦康凯琼脂和伊红美兰琼脂(EMB)：菌落无色半透明
鼠伤寒沙门菌：通常严重污染后，也没有感官性状的改变（因为不分解蛋白质）。潜伏期一般为12－36小时，短者6小时，长者48－72小时，大多集中在48小时内，超过72小时不多。症状为头痛、恶心、呕吐、腹泻、腹痛，腹泻一日数次至十余次，主要为水样便，少数带有粘液或血。体温38－40度，一般在发病2－4天体温下降。多数病人在2－3天后胃肠炎症状消失。 鼠伤寒沙门菌即是胃肠炎型，突然发病，发烧，体温可达38－40度以上，伴有恶寒、恶心、呕吐、腹泻、腹痛。吐、泻严重者有脱水现象或出现感染性休克，是较为常见的一种类型。二型类伤寒型,病情缓和,突出的有高热,胃肠炎症状不明显。三型类霍乱型，有剧烈的呕吐、腹泻，大便呈米汤样。四型类感冒，体升高，恶寒，全身不适，四肢及腰部疼痛。五型败血症型，起病突然，有高烧、恶寒、可有脑膜炎合并症。多由猪霍乱沙门菌引起。 中毒发生的原因分析：首先是食品被鼠伤寒沙门菌污染，其次是本菌在适宜的条件下，在被污染的食品中大量繁殖（因为丁香鱼是定型包装的成熟制品，师傅直接拆封包装后在容器中加入调料盛装上盘，没有加热处理，未能杀死病菌）。 急救与治疗：1、洗胃、催吐、导泻（硫酸钠）、0.05%高锰酸钾溶液反复洗胃，越早效果越好。2、抗生素治疗。3、
补充水份和纠正电解质紊乱。4、对症治疗。 预防：1、防止食品被污染――生熟分开等。2、控制食品中沙门菌的繁殖，主要因素是温度和贮藏时间（最适宜繁殖温度是37℃，要低温贮藏）。加工后的食物，保存时间应缩短在6小时内。3、彻底杀死沙门菌。加热灭菌，沸水起煮2.5－3小时，中心温度达80℃以上持续12分钟以上。4、注意事项：禽蛋煮沸8分钟以上，隔顿食物吃前一定要回锅加热，即使感官性质没有明显改变，也必须回锅加热或改制。
鼠伤寒沙门氏菌引起的一起食物中毒探讨 俞保社庐阳区疾病预防控制中心 沙门氏菌是一大群寄生于人类和动物肠道，其生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性菌。其种类繁多，少数能使人致病，其他可使动物致病，偶尔可传染给人。主要引起人类伤寒、副伤寒以及食品中毒或败血病。在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌食品中毒常占首位或者第二位。沙门氏菌菌型繁多，已确认的沙门氏菌有2 500 个以上血型。在常规检测中，血清学作为诊断依据，但经常发生生化符合而血清不凝集的现象。2012年5月25日市一院急诊科收治4名疑似因吃卤菜引起的食物中毒患者，标本检测出现此现象，具体处置如下。 【材料】： 基本情况：发病患者晚上就餐食物为某板鸭店购买的板鸭及家中自备的部分菜。首发病例4小时后出现腹痛、腹泻、发热等不适症状，其余三人陆续出现发类似症状， 4人至合肥市某院急诊科就诊。经流行病学调查：7人于在家就餐，餐后4小时左右陆续发病。最早发病5月24日晚11:30左右（餐后4小时，最先发病的蒋志容据推断应该个体差异的问题对被污染的食物较为敏感，较早地出现了症状。），最迟发病5月25日早晨8时左右（餐后约11时）。发病统计时长约11小时。 样品采集：采集蒋某大便标本1份，胡某大便标本和肛拭子各1份，患者家中剩余板鸭1份、水果刀涂抹样1份，板鸭店砧板、刀具、容器、从业人员手的涂抹样及板鸭各1份共10份样品进行检测。 【实验室检验】： 前增菌：除便样和肛拭子外，样品称取25g放入盛有25mlBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打90S。样品为液态，直接进行培养，于36℃±1℃培养18h。 增菌：轻轻摇动培养过的样品混合物，移取5ml，转种于10mlTTB内；于42℃±1℃,18h~24h培养。同时，另取5ml,转种于10mlSC内，于36℃±1℃,18h~24h培养。 分离：便样和肛拭子直接分离培养，取经TTB增菌液1环，划线接种
如对您有帮助，可购买打赏，谢谢 生活常识分享沙门菌感染的途径和原因都有哪些 导语：沙门菌感染是一种常见的记性传染病，可以通过由本菌污染的肉类食物感染，因为沙门菌感染的表现形式有很多种，可以分为败血症型、胃肠炎型和 沙门菌感染是一种常见的记性传染病，可以通过由本菌污染的肉类食物感染，因为沙门菌感染的表现形式有很多种，可以分为败血症型、胃肠炎型和伤寒型等感染类型，除了这些表现之外还有其它类型的表现，我们在这里就不详细多说了，大家只需要做一个了解就好。大部分的人都不怎么了解沙门菌感染的途径和原因，所以往往到患病了才引起注意。下面就跟着小编来看看沙门菌感染的途径和原因都有哪些吧！ 起病当日至2周前有否进食不洁食物如凉菜、酱肉、松花蛋等及同居同食者有否类似病症的发生;有否密切接触鼠类、狗、猫、鸡、鸭及鸟类史或进食被上述动物污染食物史;新生儿要特别注意询问有无家庭及管理人员通过饮食管理或生活接触造成被传染沙门菌的可能。 沙门氏菌侵入机体后发病与否取决于细菌的型别、数量、毒力及机体的免疫状态。各型沙门氏菌的致病力差别明显，如鸭沙门氏菌常引起无症状感染，猪霍乱沙门氏菌常引起败血症和迁徙性病灶，鼠伤寒沙门氏菌多引起胃肠炎，亦可进入血循环引起败血症。此外机体的免疫状态也有重要作用。有人发现，摄入大量的沙门氏菌(105～106)才能引起健康人胃肠炎，而婴幼儿、年老体弱、慢性疾病患者则少量沙门氏菌即可致病。胃酸减少，胃排空增快，肠蠕动变慢、肠道菌群失调等，可增加沙门氏菌的感染机会。 沙门氏菌经口腔进入人体内，克服了共生细菌的抑制和小肠粘膜吞噬细胞的作用，得以在肠道大量繁殖，从而引起局部微绒毛变性、粘
2020版药典微生物限度计数—沙门菌 2020版本药典 (1) 菌种及菌液制备 1) 菌液制备 将铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌分别接种在胰酪大豆胨琼脂培养基上，35℃条件下培养24小时，将新鲜培养物用pH7.0的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。(2) 控制菌检查方法适用性试验 控制菌检査用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示特性的检查，各培养基的检查项目及所用的菌株见表1。 表1 控制菌检査用培养基的促生长能力、抑制能力和指示特性 沙门菌菌检查方法适用性试验 1、RV沙门菌增菌液体培养基促生长能力检查：分别接种不大于l00cfu的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃
条件下培养18小时。 2、RV沙门菌增菌液体培养基抑制能力检查：分别接种不大于l00cfu的金黄色葡萄球菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养24小时。 3、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基促生长能力检查：分别接种不大于l00cfu的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养18小时。 4、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基指示特性检查：分别接种不大于l00cfu的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养18小时。 5、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基抑制能力检查：分别接种不大于l00cfu的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养24小时。 6、三糖铁琼脂培养基指示特性检查：分别接种不大于l00cfu的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养18小时。 7、三糖铁琼脂培养基抑制能力检查：分别接种不大于l00cfu的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养18小时。 (3) 沙门菌检査 1) 供试液制备和增菌培养 取10g供试品直接接种至90ml的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，35℃培养24小时。选择和分离培养取上述培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中，35℃培养24小时。取少量RV沙门
沙门氏菌 沙门氏菌属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌，己发现1800种以上。除可感染人外，还可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。 沙门氏菌属（Salmonella）是一大群寄生于人类和动物肠道内，生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌，有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病，这些统称为沙门氏菌。 沙门氏菌目前已经发现1800种以上，按抗原成分可分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌型。其中与人类疾病有关的主要有甲组的副伤寒甲杆菌，乙组的副伤寒乙杆菌和鼠伤寒杆菌，丙组的副伤寒丙杆菌和猪霍乱杆菌，丁组的伤寒和肠炎杆菌。 此菌可引起禽伤寒、鸡白痢、猪霍乱、鼠伤寒沙门氏菌病、猪副伤寒、马流产沙门氏菌病等疾病。致病性最强的是猪霍乱沙门氏菌（Salmonella cholerae），其次是鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）和肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）。感染沙门氏菌或食用被带菌者粪便污染的食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。，近日美国多地暴发疑似由生鸡肉引发的沙门氏菌疫情，至少42%患者已入院治疗。数据显示，已有18个州的278人感染具有耐药性的海德堡沙门氏菌。
沙门氏菌属肠道细菌科，包括那些引起食物中毒、导致肠胃炎、伤寒和副伤寒的细菌。能引起食物传播性疾病，近年来，已经成为最常见的食物中毒原因。肠炎沙门氏菌感染通常源于奶制品、禽产品和肉产品；鸡肉和鸡蛋尤其是高风险食品。沙门氏菌感染的症状通常是肠胃出现问题，包括恶心、腹部绞痛、呕吐和腹泻，一般最多持续7天。在免疫力低下的人群中，如果不及时服用抗生素类药品，沙门氏菌感染将导致生命危险。 关注食品安全，关注三方圆
沙门菌检查法 1 简述 沙门菌属是肠杆菌科的重要致病菌，按Bergey系统细菌学手册第一卷（1984），沙门菌分5个亚属。2003年出版的第八版的临床微生物手册将沙门菌属分成两个菌种即肠炎沙门菌和乍得沙门菌，其中肠炎沙门菌分6个亚种，包括常见的伤寒、甲型副伤寒、乙型副伤寒、丙型副伤寒、，鼠伤寒，猪霍乱等沙门菌杂内，迄今已发现2501个血清型。O抗原抗血清A-E群包含了沙门菌分离株的95%，所以常用沙门菌A-F O多价血清进行沙门菌初筛试验。药品中的沙门菌，是以鉴定沙门菌属为准，即对没10g（或10ml）药品中是否检出沙门菌作出检验报告。 由于沙门菌血清型繁多，各血清型的生化及血清学特性虽密切相关，却不尽相同，采用一种增菌培养基和两种分离培养基，不可能涵盖所有沙门菌的最适增菌及分离条件。 此外，由于药品在生产过程中，常受到加热、干燥等加工步骤的影响，药品中污染的沙门菌可受到损伤或呈休眠状态，故须在增菌培养前先进行预增菌。然后再进行增菌及分离、三糖铁琼脂初步鉴别、生化试验、血清学试验等步骤。 2 仪器、设备及用具（见大肠埃希菌2）。 3 试液指示液（参见大肠埃希菌3） 3.1 无菌脲试液[附录2.5]。 3.2 酚磺酞指示液[附录 4.4]。
3.3 亮绿试液[附录2.9]。 3.4 氰化钾试液[附录2.14]。 3.5溴甲酚紫指示液[附录 4.5]。 3.6 革兰染色液[附录2.4，2.10，2.16]。 3.7 沙门菌属A-F“O”多价血清（即O多价1）生物制品研究所供应。 4 培养基 4.1 营养琼脂培养基[附录 5.2]。 4.2 营养肉汤培养基[附录 5.1]。 4.3 半固体营养琼脂培养基[附录 5.3]。 4.4 曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）[附录 5.8]。 4.5 麦康凯琼脂培养基（MacC）[附录 5.9]。 4.6 四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB）[附录 5.11]。 4.7 三糖铁琼脂培养基（TSI）[附录 5.10]。 4.8 胆盐硫乳琼脂培养基（DHL）[附录 5.13]。 4.9 沙门菌属志贺菌属琼脂培养基（SS）[附录 5.12]。 4.10 蛋白胨水培养基[附录 5.18]。 4.11 脲（尿素）琼脂培养基[附录 5.23]。 4.12 氰化钾培养基[附录 5.24]。 4.13 赖氨酸脱羧酶培养基[附录 5.25]。 5 对照用菌液 取乙型副伤寒沙门菌[CMCC（B）50094]是营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，36℃±1℃培养18～24h后，用0.9%