微生物学大实验
食品中腐败菌的分离纯化及生物学性状观察
（标题小四黑体，正文小四宋体，段前、段后0，行距20磅）
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0 前言
食品腐败变质是指食品受到各种内外因素（例如温度，气体等）的影响，造成其原有物理性质或化学性质发生变化，降低或失去其营养价值和商品价值的过程。食品腐败变质的过程实质上是食品中碳水化合物、蛋白质、脂肪在污染微生物的作用下分界变化、产生有害物质的过程。
本次实验以略微腐烂的苹果、栗子、香蕉，饮料为材料，运用三区划线、倾注、点植、涂布等方法从中分离出腐败菌，观察和分析其菌种及菌落形态。
1 试验材料和仪器设备
1．1试验材料
食材：土豆、苹果、栗子、香蕉、饮料。
试剂：营养琼脂粉、麦芽粉、琼脂粉、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钠、溴麝香草酚兰溶液、草酸结晶紫、碘液、95%酒精、沙黄、生理盐水、%吕氏碱性美蓝染液、自来水等。
1．2仪器设备
试验仪器：显微镜、蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、试管、酒精灯、接种针（环）、针、培养皿、盖玻片、载玻片、三角玻璃涂布棒等。
2 试验方法
培养基的制备
2.1.1营养琼脂培养基
称取4.5克营养琼脂粉，加入100ml水加热溶解，分装，在121℃下蒸汽灭菌。20min后取出导入无菌平皿中冷却凝固。
2.1.2土豆培养基
将去皮土豆200g切成2cm左右小块加入1000ml水煮沸10min，过滤补充水份，加入20g琼脂粉，20g葡萄糖，加热溶化，分装，121℃下蒸汽灭菌20min。
2.1.3麦芽汁培养基
称取5g麦芽粉加入100ml和2g琼脂，在115℃下蒸汽灭菌20min。
2.1.4糖发酵培养基的制备
2.1.4.1葡萄糖发酵管
取0.25g葡萄糖加入100ml的已配置好的糖溶液混合均匀即可.
2.1.4.2葡萄糖发酵管
取0.25g乳糖加入100ml已配置好的糖溶液混合均匀即可.
2.1.4.3麦芽糖发酵管
取0.25g麦芽糖加入100ml已配置好的糖溶液混合均匀即可.
2.1.4.4蔗糖发酵管
取0.25g蔗糖加入100ml已配置好的糖溶液混合均匀即可
2.1.4.5甘露醇发酵管
取0.25g甘露醇加入100ml已配置好的糖溶液混合均匀即可
注:糖溶液: 蛋白胨2g,0,04%溴甲酚紫水溶液,蒸馏水100ml,调pH为
分别吸取上述五种糖溶液5ml放在试管中,并放入一个小倒管.每种取两支试管.在培养箱中供糖发酵试验使用.
2．2 分离方法
2．2．1三区划线法
使用接种环，将其烧灼，待冷却后，取菌。然后在酒精灯附近，将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/3-1/2，此为第一区。再将接种环上多余的细菌烧灼，待冷后，在第一区划线末端，再划下一区域，面积约占1/4面积，此为第二区。用同样方法划第三区，划满整个平皿。
2．2．2点植法
使用接种针，将其烧灼，然后在培养皿上点一下以降温，取菌。然后在酒精灯附近，将已沾菌的接种针在培养皿中点上一点。用相同的方法在培养基上点第二个点，直至培养基上呈现均匀的六个点。
2．2．3涂布法
使用三角玻璃涂布棒，在蒸汽灭菌锅内灭菌，待冷却后，取菌，然后将菌均匀的涂在培养皿上。
2．3 培养
2．3．1细菌
在37±1℃恒温培养箱中培养24小时。
2．3．2酵母菌
在28℃恒温培养基中培养48小时。
2．3．3霉菌
在28℃恒温培养基中培养48小时。
2．4 鉴定
2．形态鉴定
①.细菌：做革兰氏染色试验。
a.涂片将培养的不同菌分别做涂片，干燥、固定。固定时通过火焰1～2次即
可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
b.染色初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。
脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出
酒精刚刚不出现紫色时为止，约20～30s，立即用水冲净酒精。
复染用番红液染1～2min，水洗。
镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
②.酵母菌：
a.在载玻片中央加一滴%吕氏碱性美蓝染液，按无菌操作法在营养琼脂培养基
上取培养48小时的菌种少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。
b.盖玻片，放置3min后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察菌体形
态和出芽情况，同时根据是否染上颜色来区别死、活细胞。
③.霉菌：制片观察，霉菌的组织状态及孢子形状。在载玻片中央滴加一滴乳酸
酚用针挑取菌落周边放在乳酸酚中搅拌均匀,盖上薄片至于显微镜观
察.
2.4.2生理鉴定
细菌：糖发酵试验。
用接种环在酒精灯上经灭菌后分别接种在五种糖溶液的试管中,在37±1℃恒温培养箱中培养24小时后观察其产酸产气情况
3 结果与讨论
细菌
3.1.1菌落的形态：
培养结果：如下图是香蕉培养菌落(图一)和栗子培养菌落(图二)
图一(涂布法) 图二(点植法)
结果分析: 香蕉中分离的菌落为微小较为规则的圆形，颜色为近似乳白色。在37±1℃恒温培养箱中培养24h后可嗅到一种特殊的臭味。说明该细菌在温暖，富含有机物质的培养基中能够正常的旺盛的生长。
栗子中分离的菌落为不规则椭圆形，颜色为乳白色和少许黄色两种,一部分表面干瘪无光泽且多褶皱,为菌落变老,中心隆起较高呈突脐状，直径在-1.0cm之间。该菌在土豆琼脂培养基中繁殖旺盛,有嗜糖的特性,而且该菌落特征符合细菌菌落特征,因此初步判定该菌种为细菌。
3.1.2不同菌落革兰氏染色的结果
1）栗子中菌落革兰氏染色结果在显微镜下的观察结果如下图（图三）：
图三
结果分析：在显微镜（油镜）下可清楚观察到该细菌经革兰氏染色后呈现红色，为革兰氏阴性菌，且菌体均无芽孢，成短杆状，所以为革兰氏阴性无芽孢杆菌。
2)香蕉中菌落经革兰氏染色后在显微镜下的观察结果如下图（图四）：
图四
结果分析:革兰氏染色可通过显微镜观察到该菌也呈红色，可判断该菌种为革兰氏阴性,且菌体较小无芽孢，成微小不规则杆状形,为短杆菌属。
酵母菌
3.2.1菌落的形态
培养的结果:从腐烂的苹果中经过麦芽培养基的培养分离得到的菌落形态如下图(图五)：
图五（三区划线法）
结果分析:从腐烂的苹果中分离的菌落呈乳白色,较不透明整体颜色一致，菌落质地均匀边缘整齐，该菌落成圆形，表面湿润光滑，富有光泽，直径1cm左右。该菌种在麦芽培养基中生长,主要用于鉴定酵母菌，而且菌落形态与酵母菌菌落形态相似，所以，该菌最有可能是酵母菌。
3.2.2显微镜观察结果
在载玻片上滴一滴生理盐水,用接种环灭菌后取该菌落在载玻片上,再滴一滴伊红美兰,盖片后在显微镜下可观察的形态如下图(图六).
图六
结果分析:通过显微镜低倍镜可直接观察到该菌体，说明该菌个体形态较大。且能被碱性美蓝染液染色成淡蓝色和蓝色.再通过油镜可明显观察到该菌具体形态,该菌落为均匀球型，综合上述特征可判断其为酵母菌
霉菌
3.3.1菌落的形态
从腐烂的苹果中分离得到的菌种经土豆培养基的培养形成的菌落如图(图七)：
图七
结果分析:该菌落形态较大,质地疏松,表面干燥且不透明呈棉絮状交织,菌落与培养基间连接紧密,不易挑取,菌落的正面与反面的颜色、构造，以及边缘与中心的颜色和构造较不一致,菌落直径在1.5cm左右.通过菌落形态基本可以确定该菌种为霉菌。
3.3.2显微镜观察结果
腐败苹果中菌落在显微镜下可观察的结果如下图(图八、图九)
图八
图九
结果分析: 通过显微镜可直接察到该菌体之间如丝状交织在一起，个体粗而分化，所以，判断该菌为霉菌。
4 结论
5 参考文献
葡萄球菌属 金黄色葡萄球菌 生物学特性： 1．形态：G+，球形，葡萄状，0.4～1.2 m 2．培养：色素、耐盐 3．抗原构造：SPA 4．分类：金黄色葡萄球菌；表皮葡萄球菌；腐生葡萄球菌 5．抵抗力：强；易耐药 致病性： 1、致病物质：血浆凝固酶；溶血素；杀白细胞素；肠毒素 2、所致疾病：化脓性炎症；食物中毒；假膜性肠炎 防治原则：注意个人卫生；严格无菌操作；加强食品监督；合理使用抗生素。 链球菌 乙型溶血性链球菌 生物学特性： 1、形态：G+，球形,链状,0.5～1.0 m 2、培养：血平板 3、分类： 1) 根据溶血现象分： 甲型溶血性链球菌：草绿色溶血环。条件致病菌 乙型溶血性链球菌：透明宽大溶血环。致病性强 丙型链球菌：无溶血环。无致病性 2) 依细胞壁多糖抗原不同分：A、B、C、D等20个群，致病链球菌株90%属A群 4、抵抗力：不强 致病性： 1、致病物质： （1）菌体表面物质：M蛋白；脂磷壁酸 （2）毒素： 1）链球菌溶血素： SLO：对氧敏感,免疫原性强,感染后血中可出现溶血毒素O抗体； SLS：对氧稳定; 免疫原性弱,与溶血环有关 2）致热外毒素（红疹毒素或猩红热毒素） （3）侵袭性酶：透明质酸酶；链激酶；链道酶。 使链球菌的感染容易扩散且脓汁稀薄。 2、所致疾病 （1）乙型溶血性链球菌：化脓性疾病；中毒性疾病（猩红热）；超敏反应性疾病如风湿热、急性肾小球肾炎（2）甲型溶血性链球菌： 条件致病菌，引起亚急性细菌性心内膜炎 防治原则： 1、讲究卫生，及时治疗病人和带菌者，减少传染源。 2、彻底治疗咽峡炎、扁桃体炎，以防止急性肾小球肾炎、风湿热、亚急性细菌性心内膜炎。 3、治疗链球菌感染性疾病首选青霉素G。 肺炎链球菌 生物学特性： 1、形态：G+ ，矛头状,钝端相对,成双排列,荚膜 2、培养：血平板，自溶现象 3、生化反应：胆汁溶菌试验阳性，菊糖分解试验阳性 4、抗抗力：弱 致病性： 主要致病物质：荚膜
生物大分子分离技术综述 摘要：生物大分子包括核酸DNA和RNA、多糖、酶、蛋白质以及多肽等。生物大分子分离技术是生物研究中的核心技术之一，当前医学，药学及生命科学学科之间的交叉渗透为大分子分离技术的发展提供了更多的契机。本文对以沉淀、透析、超滤和溶剂萃取为代表的传统分离技术, 以及色谱, 电泳等现代分离技术的发展概况、方法、特点及应用进行了综述。 关键字：分离技术生物大分子 1前言 生命科学的发展给生物大分子的分离技术提出了新的要求。各种生化、分子研究要求提取分离高纯度，结构完整和具有生物活性的活性的生物大分子样品，这就使得分离技术在各项研究中起着至关重要的作用。对生物大分子分离技术的研究也就随之产生。同时，随着各学科之间的交叉渗透，纳米材料、计算机自动化等技术的发展也为生物大分子技术的发展提供了更多的空间。 生物大分子的制备具有如下特点：生物样品的组成极其复杂，许多生物大分子在生物样品中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，耗时长；许多生物大分子在分离过程中就非常容易失活，因此分离过程中如何保证生物大分子的活性，也是提取制备的困难之处；生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的,温度、PH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。这些都要求生物大分子的分离技术以此为依据，突破这些难点，优化分离程序以获得符合要求的生物大分子试剂。 2传统分离技术 被广泛应用传统的生物大分子分离方法有透析、溶剂萃取、沉淀和超滤等，它们都是一些较早就建立起来比较完善的的分离方法。 2.1透析法 1861年Thomas Graham发明透析方法,已成为生物化学实验中最简易常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的分离过程中,除盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品等都需用到透析。现在，除半透膜的材料更加多样化，透析方式也更加多样。透析法主要是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。例如分离和纯化DNA、蛋白质、多肽、多糖等物质时，可用透析法以除去无机盐、单糖、双糖等杂质。反之也可将大分子的杂质留在半透膜内，而将小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中，而加以分离精制：透析是否成功与透析膜的规格关系极大。透析膜的膜孔有大有小，要根据欲分离成分的具体情况而选择。透析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜、蛋白质胶膜、玻璃纸膜等。分离时，加入欲透析的样品溶液，悬挂在纯化水容器中，经常更换水加大膜内外溶液浓度压，必要时适当加热，并加以搅拌，以利透析更快。最后，透析是否完全，须对透析膜内溶液进行检测。
木霉菌属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目，粘孢菌类，是一类普遍存在的真菌。绿色木霉是木霉菌中具有重要经济意义的一种，目前在工业、农业和环境科学等方面有着广泛的用途。绿色木霉在自然界分布广泛，常腐生于木材、种子及植物残体上。绿色木霉能产生多种具有生物活性的酶系，如：纤维素酶、几丁质酶、木聚糖酶等。绿色木霉是所产纤维素酶活性最高的菌株之一，所产生的纤维素酶的降解作用，目前日益受到重视，国内外对这方面的研究也很多。同时，绿色木霉又是一种资源丰富的拮抗微生物，在植物病理生物防治中具有重要的作用。它的作用机制有以下几种：产生抗生素；重寄生作用，这是木霉菌作为拮抗菌最重要的机制；溶菌作用；竞争作用。 纤维单胞菌属拉丁学名[Cellulomonas (Bergey et al.,1923),Clark,1952] 在幼龄培养物中细胞为细长的不规则杆菌，0.5～0.6μm×2.0～5.0μm，直到稍弯，有的呈V字状排列，偶见分支但无丝状体。老培养物的杆通常变短，有少数球状细胞出现。革兰氏阳性，但易褪色。常以一根或少数鞭毛运动。不生孢，不抗酸。兼性厌氧，有的菌株在厌氧条件下可生长但很差。在蛋白胨-酵母膏琼脂上的菌落通常凸起，淡黄色。化能异养菌，可呼吸代谢也可发酵代谢。从葡萄糖和其他碳水化合物在好氧和厌氧条件下都产酸。接触酶阳性。能分解纤维素。还原硝酸盐到亚硝酸盐。最适生长温度30℃。广泛分布于土壤和腐败的蔬菜。 康宁木霉菌丝有隔膜,蔓延生长,广铺于固体培养基上,菌外观为浅绿,黄绿或绿色,反面无色,分生孢子.梗为菌丝的短侧枝,其上对生或互生分枝,分枝上又可继续分枝,形成2级,3级分枝,分枝末端即为瓶状梗.分生孢子由小梗相继生出面,靠黏液把它们聚成球形或近球形的孢子头,分生孢子卵形成椭圆形,壁光滑.单个孢子近无色,形成堆状为绿色,与此相似的还有绿色木霉! 此菌有很强的纤维素霉及纤维,二糖淀粉酶等,它能利于农副产品,如麦杆,木材,木屑等纤维素原料,使之转变为糖质原料 佛州侧耳子实体覆瓦状丛生。菌盖直径3~12cm，低温时白色，高温时带青蓝色转黄色至白色，初半球形，边缘完整，后平展成扇形或浅漏斗形，边缘不齐或有深刻。菌肉稍薄，白色。菌褶浅黄白色，干时变淡黄色，稍密集至稍稀疏，延生，常在菌柄上形成脉络状。菌柄侧生（有孢菌株），或偏心生至中央生（无孢菌株），细长，内实，白色，长3~7cm，粗1~2cm，基部有时有白色绒毛。孢子印白色；孢子近柱形，6~9μm×2.5~3μm。 黑曲霉半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。 分生孢子梗自基质中伸出，直径15～20pm，长约1～3mm，壁厚而光滑。顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长有成串褐黑色的球状分生孢子。孢子直径2.5～4.0μm。分生孢子头球状，直径700～800μm，褐黑色。菌落蔓延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状。背面无色或中央略带黄褐色。有时在新分离的菌株中能找到白色、圆形、直径约1mm的菌核。分生孢子头褐黑色放射状，分生孢子梗长短不一。顶囊球形，双层小梗。分生孢子褐色球形。 广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。有的菌株还可将羟基孕甾酮转化为雄烯。生长适温37℃，最低相对湿度为88%，能引致水分较高的粮食霉变和其他工业器材霉变。 侧孢霉是一种嗜热丝状真菌,具有分解纤维素的特性.固体PDA培养条件下进行形态观察表明,所采用的嗜热侧孢霉菌株,菌丝丛枝状、有隔,分生孢子浅褐色,顶生或侧生.利用ITS序列
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，
金黄色葡萄球菌 形态与染色：G+，球形葡萄串状排列，无特殊结构。无鞭毛无芽胞，一般不形成荚膜。 菌落特点：呈圆形，表面光滑、凸起、湿润、边缘整齐、有光泽、不透明的白色或金黄色菌落，周围有β溶血环 培养基：营养要求不高，琼脂平板、血平板均可。 生化反应：β溶血（+），触酶试验（+），能分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气，分解甘露醇（致病菌）。 a群链球菌（化脓性链球菌） 形态染色：G+，球菌链状排列，可有荚膜，无芽胞，无鞭毛，有菌毛。 菌落特点：在血平板上可形成灰白色、圆形、凸起、有乳光的细小菌落，菌落周围出现透明溶血环。 培养基：营养要求较高，加有血液、血清等成分的培养基。 生化反应：β溶血（+），触酶（-），分解葡萄糖，产酸不产气，不分解菊糖，不被胆汁溶解肺炎链球菌 形态与染色：G+，矛头状尖向外双球菌，有荚膜 ，无鞭毛，无芽胞。 菌落特点：在固体培养基上形成小圆形、隆起、表面光滑、湿润的菌落，菌落周围有草绿色溶血环。随着培养时间延长，细菌产生的自溶酶裂解细菌，使血平板上的菌落中央凹陷，边缘隆起成“脐状” 培养基:营养要求较高，加有血液、血清等成分的培养基。 生化反应：分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖等，产酸不产气。对菊糖发酵，大多数新分离株为阳性。肺炎链球菌自溶酶可被胆汁或胆盐激活，使细菌加速溶解，故常用胆汁溶菌试验与甲型链球菌区别。 淋病奈瑟菌 形态与染色：G-，双球菌 ,肾形，似一对咖啡豆，无芽胞，无鞭毛，有菌毛，新分离菌株有荚膜。 菌落特点：菌落凸起、圆形、灰白色或透明、表面光滑的细小菌落。 培养基：专性需氧，营养要求高，多用巧克力培养基 生化反应：氧化酶、触酶试验阳性,对糖类的生化活性最低,只能氧化分解葡萄糖，产酸不产气。 脑膜炎奈瑟菌 形态染色：G-菌，呈肾形或豆形，两菌相对呈双球状，无鞭毛，无芽胞，新分离的菌株有多糖荚膜和菌毛。 菌落特点：无色、圆形、凸起、光滑、透明、似露滴状的小菌落。 培养基：专性需氧，在普通琼脂培养基上不能生长。需在巧克力色血琼脂培养基上。 生化反应：绝大多数菌株能分解葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气(因淋病奈瑟菌不分解麦芽糖，借此可与淋球菌区别)，不分解乳糖、甘露醇、半乳糖和果糖，触酶试验阳性，氧化酶试验阳性。能产生自容酶。 大肠杆菌（大肠埃希菌） 形态染色：G-菌，短杆状，有周身鞭毛和周身菌毛，无芽胞。 菌落特点：灰白色，圆形，湿润，有的可出现溶血环，中等大小S型菌落。 培养基：无特殊要求，琼脂平板、血平板均可。 生化反应：β溶血+，能发酵葡萄糖、乳糖等多种糖类，产酸并产气。吲哚试验阳性、甲基红反应阳性、VP试验阴性、枸橼酸盐（IMViC）试验阴性。
细菌就是一种具有细胞壁的单细胞微生物,在适宜条件下,能进行无性二分裂繁殖,其形态与结构相对稳定。掌握细菌形态结构特征,对鉴别细菌,研究致病性,诊断疾病与防治原则等都有 重要意义。 第一节细菌大小与形态 一细菌的大小 细菌体积微小,一般要用光学显微镜放大几百倍到一千倍左右才能观察到。通常以微米(μm)为测量其大小的单位。细菌种类不同,大小差异很大,同一种细菌在不同生长环境中,或在同一生长环境的不同生长繁殖阶段,其大小也有差别。 二细菌的形态 细菌的基本形态有球状、杆状及螺旋状,根据形态特征将细菌分为球菌、杆菌与螺形菌三大 类、 (一)球菌(coccus) 球菌单个菌细胞基本上呈球状。按细菌生长繁殖时的分裂平面及分裂后排列方式不同,可将球菌分为: 1、双球菌:细菌在一个平面分裂,分裂后两个菌细胞成双排列,如肺炎链球菌。 2、链球菌:细菌由一个平面分裂,分裂后菌细胞连在一起,呈链状,如乙型溶血性链球菌。 3葡萄球菌:细菌在多个不规则的平面上分裂,分裂后菌细胞聚集在一起似葡萄串状,如金黄色葡萄球菌。 4、四联球菌:细菌在两个相互垂直的平面上分裂,分裂后四个菌细胞联在一起。 5、八叠球菌:细菌在上下、前后与左右三个相互垂直的平面上分裂,分裂后八个菌细胞联在一起。 (二)杆菌(bacillus) 杆菌呈杆状,多数为直杆状,也有稍弯的。不同杆菌的大小、长短、粗细差异很大。大杆菌如 炭疽杆菌长3～10μm,中等的如大肠杆菌长2～3μm,小的如流感杆菌长0、7～1、5μm。菌体粗短呈卵园形的称为球杆菌;菌体末端膨大成棒状,称棒状杆菌;菌体常呈分枝生长趋势,称为分枝杆菌,大多数杆菌就是单个、分散排列的,但有少数杆菌分裂后菌细胞连在一起呈链状,称为链杆菌。 (三)螺形菌(spirillar bacterium) 螺形菌菌细胞呈弯曲或旋转状,可分为两类: 1、弧菌:菌细胞只有一个弯曲呈弧形或逗点状,如霍乱弧菌。 2、螺菌:菌细胞有多个弯曲,如鼠咬热螺菌。弯曲呈“S”或海鸥形者如空肠弯曲菌、幽门螺 杆菌等。 第二节细菌的结构与化学组成 细菌的基本结构有细胞壁、细胞膜、细胞质与核质四个部分组成。某些细菌除具有其基本结 构外,还有荚膜、鞕毛、菌毛、芽胞等特殊结构。 一、基本结构 (一)细胞壁(cell wall) 细胞壁位于细菌的最外层,就是一层质地坚韧而略有弹性的膜状结构,其化学组成比较复杂,并随不同细菌而异。用革兰染色法可将细菌分为革兰阳性菌与革兰阴性菌两大类。两类细菌细胞壁的共有组分为肽聚糖,但各自还有其特殊组成成分。 1、肽聚糖(peptidoglycan) 细菌细胞壁的基本结构就是肽聚糖,又称粘肽。它就是原核生物细 胞所特有的物质,不同种类的细菌,其组成与连接的方式亦有差别。革兰阳性菌的肽聚糖由聚 糖骨架、四肽侧链与五肽交联桥三部分组成(图11-3,a),革兰阴性菌的肽聚糖由聚糖骨架与四 肽侧链两部分组成(图11-3,b)。
在从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。 不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特分子生物学的研究及应用中，防止其他微生物的混入。定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”， 、用固体培养基分离和纯化1 有繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、便成称为菌落。一定形态结构的子细胞生长群体，当固体培养基表面众多菌落连成一片时，可以成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，以及许多真菌和单细胞藻鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、为对该微生物进行分类、所谓平板，类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。固体培养基用琼脂或其它凝这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。建立的采用Kock最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100 稀释倒平板法1.1 ），然后分别取不、1:100001:1000首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培同稀释液少许，与已熔化并冷却至如果养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。这个菌落可能就是由一个在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，稀释得当，细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。涂布平板法1.2 且采用稀释因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，因此在微生物倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，再用无菌玻璃涂棒将将一定量的微生物悬液滴加在平板表面，制成无菌平板，冷却凝固后，）。菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落（图1供参 考． 涂布平板法1 图平板划线法1.3 最简单的分离微生物的方法是平板划线法，即用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，），微
细菌就是一种具有细胞壁得单细胞微生物，在适宜条件下，能进行无性二分裂繁殖，其形态与结构相对稳定。掌握细菌形态结构特征，对鉴别细菌，研究致病性，诊断疾病与防治原则等都有重要意义。 第一节细菌大小与形态 一细菌得大小 细菌体积微小，一般要用光学显微镜放大几百倍到一千倍左右才能观察到。通常以微米(μm)为测量其大小得单位。细菌种类不同，大小差异很大，同一种细菌在不同生长环境中，或在同一生长环境得不同生长繁殖阶段，其大小也有差别。 二细菌得形态 细菌得基本形态有球状、杆状及螺旋状，根据形态特征将细菌分为球菌、杆菌与螺形菌三大类、 (一)球菌(coccus) 球菌单个菌细胞基本上呈球状。按细菌生长繁殖时得分裂平面及分裂后排列方式不同，可将球菌分为： 1、双球菌：细菌在一个平面分裂，分裂后两个菌细胞成双排列，如肺炎链球菌。 2、链球菌：细菌由一个平面分裂，分裂后菌细胞连在一起，呈链状，如乙型溶血性链球菌。3葡萄球菌：细菌在多个不规则得平面上分裂，分裂后菌细胞聚集在一起似葡萄串状，如金黄色葡萄球菌。 4、四联球菌：细菌在两个相互垂直得平面上分裂，分裂后四个菌细胞联在一起。 5、八叠球菌：细菌在上下、前后与左右三个相互垂直得平面上分裂，分裂后八个菌细胞联在一起。 (二)杆菌(bacillus) 杆菌呈杆状，多数为直杆状，也有稍弯得。不同杆菌得大小、长短、粗细差异很大。大杆菌如炭疽杆菌长3～10μm，中等得如大肠杆菌长2～3μm，小得如流感杆菌长0、7～1、5μm。菌体粗短呈卵园形得称为球杆菌；菌体末端膨大成棒状，称棒状杆菌；菌体常呈分枝生长趋势，称为分枝杆菌，大多数杆菌就是单个、分散排列得，但有少数杆菌分裂后菌细胞连在一起呈链状，称为链杆菌。 (三)螺形菌(spirillar bacterium) 螺形菌菌细胞呈弯曲或旋转状，可分为两类： 1、弧菌：菌细胞只有一个弯曲呈弧形或逗点状，如霍乱弧菌。 2、螺菌：菌细胞有多个弯曲，如鼠咬热螺菌。弯曲呈“S”或海鸥形者如空肠弯曲菌、幽门螺杆菌等。 第二节细菌得结构与化学组成 细菌得基本结构有细胞壁、细胞膜、细胞质与核质四个部分组成。某些细菌除具有其基本结构外，还有荚膜、鞕毛、菌毛、芽胞等特殊结构。 一、基本结构 (一)细胞壁(cell wall) 细胞壁位于细菌得最外层，就是一层质地坚韧而略有弹性得膜状结构，其化学组成比较复杂，并随不同细菌而异。用革兰染色法可将细菌分为革兰阳性菌与革兰阴性菌两大类。两类细菌细胞壁得共有组分为肽聚糖，但各自还有其特殊组成成分。 1、肽聚糖(peptidoglycan) 细菌细胞壁得基本结构就是肽聚糖，又称粘肽。它就是原核生物细胞所特有得物质，不同种类得细菌，其组成与连接得方式亦有差别。革兰阳性菌得肽聚糖由聚糖骨架、四肽侧链与五肽交联桥三部分组成(图11-3，a)，革兰阴性菌得肽聚糖由聚糖骨架与四肽侧链两部分组成(图11-3，b)。
梭杆菌生物学特性 (一)分类 梭杆菌属(Fusobacterium)是临床较常见的革兰阴性无芽胞厌氧杆菌，因其形态细长、两端尖细如梭形而得名。本属菌共有21个种和7个亚种，临床标本中常见的有具核梭杆菌、坏死梭杆菌、死亡梭杆菌和溃疡梭杆菌。代表菌是具核梭杆菌。DNAG+C含量为26～34mol％。 (二)临床意义 梭杆菌是寄生于人类口腔、上呼吸道、肠道和泌尿生殖道的正常菌群，可引起各种软组织感染，是口腔感染(如奋森溃疡性咽峡炎)、肺脓肿及胸腔等感染的常见病原菌。也可从肠道感染、尿路感染、手术感染灶以及血液等多种临床标本中分离到。在临床感染中以具核梭杆菌最常见。坏死梭杆菌是毒力很强的厌氧菌，是扁桃体周围脓肿中最常分离到的厌氧菌，也是Lemierre综合征(又称咽峡后脓毒症)的致病菌。 (三)生物学特性 梭杆菌为革兰阴性杆菌，菌体纤细长丝状，常呈多形性。典型的形态特征为梭形，两端尖细、中间膨大，大小(5～l0)μm～1μm，有时菌体中有革兰阳性颗粒存在。无鞭毛、无芽胞。 严格厌氧，在厌氧血平板上生长良好，经48小时培养后，菌落直径l～2mm，圆形、凸起、灰白色、光滑、透明或半透明。典型菌株呈不规则圆形、面包屑样，用透视光观察菌落常显示珍珠样光斑点。一般不溶血。陈旧菌落的周围常可见一扩散环，但菌落呈R型。 (四)微生物学检验 梭杆菌的鉴定特征：革兰阴性棱杆菌，两端尖细，中间膨大，呈梭状。菌落呈面包屑样。大部分菌种对胆汁敏感，在20％胆汁中不生长。本菌生化反应较弱，多数不发酵糖类，少数菌株对葡萄糖、果糖可出现弱发酵反应。大多数菌种吲哚阳性，脂酶试验阴性，不分解七叶苷，不还原硝酸盐。对卡那霉素和多黏菌素敏感，对万古霉素耐药。梭杆菌主要代谢产物是丁酸，很少或不产生异丁酸和异戊酸，而拟杆菌不产生丁酸，可产生异丁酸和异戊酸，纤毛菌产生大量乳酸而不产生丁酸，可通过气液相色谱分析加以鉴别。
微生物菌种的分离和纯 化方法 https://www.doczj.com/doc/0918308274.html,work Information Technology Company.2020YEAR
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。 1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法
细菌是一种具有细胞壁的单细胞微生物，在适宜条件下，能进行无性二分裂繁殖，其形态和结构相对稳定。掌握细菌形态结构特征，对鉴别细菌，研究致病性，诊断疾病和防治原则等都有重要意义。 第一节细菌大小与形态 一细菌的大小 细菌体积微小，一般要用光学显微镜放大几百倍到一千倍左右才能观察到。通常以微米(μm)为测量其大小的单位。细菌种类不同，大小差异很大，同一种细菌在不同生长环境中，或在同一生长环境的不同生长繁殖阶段，其大小也有差别。 二细菌的形态 细菌的基本形态有球状、杆状及螺旋状，根据形态特征将细菌分为球菌、杆菌和螺形菌三大类. (一)球菌(coccus) 球菌单个菌细胞基本上呈球状。按细菌生长繁殖时的分裂平面及分裂后排列方式不同，可将球菌分为： 1.双球菌：细菌在一个平面分裂，分裂后两个菌细胞成双排列，如肺炎链球菌。 2.链球菌：细菌由一个平面分裂，分裂后菌细胞连在一起，呈链状，如乙型溶血性链球菌。3葡萄球菌：细菌在多个不规则的平面上分裂，分裂后菌细胞聚集在一起似葡萄串状，如金黄色葡萄球菌。 4.四联球菌：细菌在两个相互垂直的平面上分裂，分裂后四个菌细胞联在一起。 5.八叠球菌：细菌在上下、前后和左右三个相互垂直的平面上分裂，分裂后八个菌细胞联在一起。 (二)杆菌(bacillus) 杆菌呈杆状，多数为直杆状，也有稍弯的。不同杆菌的大小、长短、粗细差异很大。大杆菌如炭疽杆菌长3～10μm，中等的如大肠杆菌长2～3μm，小的如流感杆菌长0.7～1.5μm。菌体粗短呈卵园形的称为球杆菌；菌体末端膨大成棒状，称棒状杆菌；菌体常呈分枝生长趋势，称为分枝杆菌，大多数杆菌是单个、分散排列的，但有少数杆菌分裂后菌细胞连在一起呈链状，称为链杆菌。 (三)螺形菌(spirillar bacterium) 螺形菌菌细胞呈弯曲或旋转状，可分为两类： 1.弧菌：菌细胞只有一个弯曲呈弧形或逗点状，如霍乱弧菌。 2.螺菌：菌细胞有多个弯曲，如鼠咬热螺菌。弯曲呈“S”或海鸥形者如空肠弯曲菌、幽门螺杆菌等。 第二节细菌的结构与化学组成 细菌的基本结构有细胞壁、细胞膜、细胞质和核质四个部分组成。某些细菌除具有其基本结构外，还有荚膜、鞕毛、菌毛、芽胞等特殊结构。 一、基本结构 (一)细胞壁(cell wall) 细胞壁位于细菌的最外层，是一层质地坚韧而略有弹性的膜状结构，其化学组成比较复杂，并随不同细菌而异。用革兰染色法可将细菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌两大类。两类细菌细胞壁的共有组分为肽聚糖，但各自还有其特殊组成成分。 1.肽聚糖(peptidoglycan) 细菌细胞壁的基本结构是肽聚糖，又称粘肽。它是原核生物细胞所特有的物质，不同种类的细菌，其组成与连接的方式亦有差别。革兰阳性菌的肽聚糖由聚糖
微生物的实验室培养——自酿葡萄酒中酵母菌的分离与纯化 一、实验目的：掌握无菌技术的操作，尝试用平板划线法和稀释涂布平板法分离纯化酵母菌。 二、实验步骤 （1）制备培养基（马铃薯琼脂培养基）：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板（已完成） （2）分离纯化 实验 步骤 操作流程流程叙述操作目的、作用 接种方法一：点燃酒精灯 ↓ 1.灼烧接种 环并冷却 ↓ 2.沾取菌液 ↓ 3.平板划线 ↓ 4.转动培养 皿约70°角 ↓ 5.灼烧并冷 却接种环 ↓ 6.平板划线 ↓ 7．倒置培养 用火柴点燃酒精灯，保证实验操作在酒精 灯火焰进行 将接种环放在火焰上灼烧，直至烧红， 让接种环自然冷却 打开装有菌液的试管，塞子要拿在手上， 将试管口通过火焰灭菌，将冷却的接种环 伸入菌液中，沾取菌液。将试管口通过火 焰灭菌，用塞子塞住试管 左手将皿盖打开一条缝隙；右手把沾有菌 种的接种环迅速伸入平板内，划3到5条 平行线（不要划破培养基），盖上培养皿盖 逆时针旋转培养皿约70°角 将接种环放在火焰上灼烧，直至烧红让接 种环自然冷却 从第一区域划线的末端开始往第二区域划 线，重复以上操作，在三、四、五区域划 线，注意不要将最后一区的划线与 相连。（也可以用连续划“Z”字形线的方 法 倒置培养皿，放入培养箱中培养 避免周围环境中微生物的 污染 清除； 防止杀死菌种 防止塞子被污染； 清除的杂菌 接种到培养基表面 调整角度，准备第二区域 的划线 在琼脂固体培养基表面连 续划线的操作，将聚集的 菌种逐步稀释分散到培养 基的表面 减少培养基内的水分蒸 发，使培养基保持湿润； 防止水珠回流打散菌落 在右图所示 的培养皿内 用笔模拟接 种环画出两 种平板划线 法的划线轨 迹 接种 方法 二： 1.系列稀 释操作 准备六只试管 ↓ 分别加入4.5mL蒸馏水并灭菌，编号 ↓ 取 mL菌液放入第1支试管并混匀 ↓ 从第1支试管取0.5ml菌液放入第2只试管并 混匀 ↓ 重复步骤，直至最后一支试管 2.涂布平 板操作 滴加100μL菌液到培养基表面 ↓ 引燃涂布器，待酒精燃尽后，冷却8～10s ↓ 把培养皿打开一条缝 ↓ 在培养皿盖内侧进一步冷却涂布器，均匀涂布 菌液，转动培养皿，涂匀 ↓ 盖上皿盖,放置10min ↓ 倒置培养皿，放入培养箱中培养 清除涂布器上的杂菌 使菌液均匀分布在培 养基表面 使液体被充分吸收 结果 观察 观察划线平板和涂布平板上的菌落形态、颜 色、大小，可挑取少量菌落制成临时装片，显 微镜下观察。 对菌落进行初步鉴定 1
设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定以及保藏技术 一．实验目的 1.学习大肠菌群分离纯化、鉴定的原理。 2.掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。 3.学习掌握菌种保藏的原理和方法。 二.实验原理 菌种的分离纯化 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1.涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。 2.平板划线法 最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。 大肠菌群的培养鉴定 大肠菌群能在乳糖胆盐液体培养液中生长，并且产气产酸，使培养液变色。还能在伊红美兰固体培养上生长，形成黑紫色的菌落，有的还有金属光泽。其他病原菌的菌落呈粉红色。再做镜检观察是无芽孢的革兰氏阴性杆菌（呈红色）。即可鉴定是有大肠菌群的菌存在。 菌种保藏 菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。 保藏菌种一般是选用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要创造一个低温；干燥；缺氧；避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的 三.实验器材 1.菌种：污水中的大肠菌群、酵母菌和霉菌 2、培养基：乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、麦芽汁固体斜面培养基 和马铃薯固体斜面培养基。 3.器材：接种环、安培瓶、干燥器、冰箱、产气管、试管、培养皿、无菌平皿、无菌玻璃涂棒移液管、电炉、双目显微镜、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅、恒温干燥箱等。 4.试剂：革兰氏一(草酸铵结晶紫)、革兰氏二(路哥氏碘液) 、革兰氏三（95%乙醇）、 革兰氏四（蕃红）；试剂：医用液体石腊（比重0.83～0.89）。 四．试验方法及步骤 1.大肠菌群的分离纯化 第一天 a．涂布平板法：将已熔化的营养琼脂培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的含大肠菌群的污水滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，置培养箱中37℃培养24小时。经培养后挑取单个菌落。 第二天 b．平板划线法：经培养后挑取单个菌落，接种环以无菌操作沾取少许菌落，在无菌伊红美兰琼脂培养基平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果
实验二微生物的分离、纯化和接种 微生物的分离、纯化 1、目的要求 1.1了解微生物分离和纯化的原理 1.2掌握常用的纯化分离微生物的方法 2、基本原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、pH值、温度和溶解氧等要求，或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。而纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 本实验将在混合有几种微生物菌液中分离纯化出两种微生物来。 3、实验材料 3.1培养基 肉汤培养基（固体）。
3.2溶液或试剂 盛4.5ml无菌水的试管，其中有一只盛有玻璃珠。 3.3仪器或其他用具 无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，涂布器等。 4流程 倒平板制备梯度稀释液涂布（或划线法）培养挑单菌落保存。 5、步骤 5.1平板划线分离法 5.1.1倒平板 倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后置于桌面上，待凝固后即成平板(教材p367图13-14)。并用记号笔标明培养基名称、菌液编号和试验日期。 5.1.2划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取菌悬液一环在平板上划线(教材p367图13-15)。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。
工业微生物菌种的分离与筛选 来源：青岛海博 一、微生物工业对菌种的要求 (一)、微生物工业的生产水平由三个要素决定：生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。其中生产菌种的性能是最重要的因素。 （二）、微生物工业对菌种的要求是： （1）菌株高产，在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力; （2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物; （3）生长繁殖能力强，较强的生长速率，产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力; （4）能够高效地将原理转化为产品; （5）能利用广泛的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性小; （6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用; （7）在发酵过程中产生的泡沫要少; （8）具有抗噬菌体的能力；
（9）遗传稳定性， 二、工业用微生物菌种的来源及选育 （一）微生物菌种的来源 一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选： （1）是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买； （2）从大自然中采集样品分离； （3）从一些发酵制品中分离筛选目的菌株。 当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选用转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。 （二）微生物工业菌种的分离 1、野生菌株的分离、筛选过程 （1）新菌种分离与筛选的步骤 菌种分离的流程如下： 标本采集→标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏 ①采样 采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，
取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。 ②标本预处理 ④纯种分离：采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。 ⑤高产菌株的筛选：这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，获得适合于工业生产用菌种。还要对菌种进行发酵性能测定， ⑥毒性试验：据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。 2、菌种的分离方法 （1）施加选择性压力分离法 主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和 营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微
普通植物病理学 实验十七、病原菌的分离培养和纯化 一、目的要求 (1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。 (2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。 (3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。 二、基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。 三、材料、仪器与用具 1．材料(依当地情况进行选择，下列材料供参考) (1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricularia orycae)。 (2)玉米大斑病叶(exserohilum turcicum)。 (3)玉米弯孢菌叶斑病叶(curvularia lunata)。 (4)玉米小斑病叶(bipolaris maydis)。 (5)番茄灰霉病果(botrytis cinefca)。
(6)黄瓜菌核病果(sclerotinia sclerotiorum)。 (7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseudomonas syringaepv．1achrymans)。 (8)水稻白叶枯病叶(xanthomonas campestms 。 (9)大豆细菌性斑点病叶(pseudomonas syringaepv．glycinea)。 (10)白菜软腐病叶(erudnia carotovora subsp．carotovora)。 2．培养基pda培养基；肉膏蛋白胨培养基；加寄主组织煎汁的培养基等。 3．仪器与用品超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等。0．1％升汞溶液配制：升汞1e 浓盐酸2．5ml 蒸馏水1000ml。先将升汞溶于盐酸中，待充分溶解后，再加水稀释。升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心。 四、实验操作 (一)病原真菌的分离 1．组织分离法按照以下步骤进行： (1)取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。提示：为了保证无菌操作，应注意下面几点：工作前最好将所需的物品都放在超净工作台内，工作中临时去取容易带来杂菌；保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；工作中，特别在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。 (2)用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1--2滴(可减少细菌污染)，然后将融化而冷至60c 左右的pda培养基倒人培养皿中，每皿倒10--15ml，轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。提示：加入25％乳酸1～2滴，可基本保证平板上不出现污染细菌苗落。除乳酸外，在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。加青霉素(20μg／ml)可以抑制g+细菌生长；加多黏霉素b(5．0μg／ml)可以抑制g—细菌生长；加链霉素(40μg／ml)或氯霉素(50μg／ml)可以抑制大部分细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45c左右(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)’时加
如何根据不同微生物种类对生态环境的不同要求以及不同的营养要求指导微生物菌种资源的的分离纯化？请举出1个应用实例。 首先分析筛选菌种的生态分布状况，以减少采样工作的盲目性。土壤是自然界微生物生活的大本营，土壤一般都是首选的采样目标；采样地点选好后，先除去表土，取离地面5—20cm深处的土样约数十克，盛入事先灭过菌的牛皮纸袋或塑料袋等容器中，并记录样品的编号、采样时间、地点、立地条件、植被情况等。采到的样品应尽快带回实验室内使用。若暂时不能分离使用，应置冰箱中保存。 各种天然生境中的微生物群体实质上是一种混合培养物，其中的目标菌可能非常少，因此需要设计一些方法把需要的目标微生物从混合的微生物群体分离出来或者使其丰度提高。常用的方法是选择性培养和富集培养。 选择性培养：提供一个特别设计的培养环境，以有利于所要分离的微生物的生长，而不适于其它微生物的生长。 富集培养：在培养中，通过添加某些特殊营养物质或控制培养条件，使本来数量极少的待筛选微生物丰度提高，从而增加其分离几率的培养方法称为富集培养。 富集培养本质上和选择性培养无很大差异，可以认为是选择性培养的一种类型。如果经一次富集培养后该微生物数量还太少，则可根据需要进行多次富集培养，直至达到可进行稀释分离的程度为止。 分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含某一种或单一微生物克隆（菌株）的过程。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法、稀释涂布平板法、稀释混合平板法、平板划线法。 微生物的性能测定：分离得到纯种微生物，只是选种工作的第一步。所得到的纯种是否具有符合生产或科研要求的性能，还必须通过测定才能知道。性能测定的方法一般分初测和复测。主要的有培养特性测定、酶活性测定、产孢性能测定、次生代谢产物产生量测定等。具体方法包括透明圈测定、最适培养温度、需氧测定，最适pH条件测定等。 不同的微生物种类，对生态环境的要求和营养需要是不同的，在分离纯化微生物时，应该根据它的生活习性进行，选择合适的分离方法，达到纯化目的。一般常用的分离方法包括如下几种： 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。固体培养基分离方法又分为稀释倒平板法、涂布平板法、平板划线法、稀释摇管法。 2、用液体培养基分离和纯化 大多数细菌和真菌，用平板法分离通常是满意的，因为它们的大多数种类在固体培养基上长得很好。然而迄今为止并不是所有的微生物都能在固体培养基上生长，例如一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等，这些微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。 稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了，得到纯培养物的机率就会急剧下降。因此，采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。 3、单细胞（孢子）分离