火棘果中原花青素含量测定方法的建立
摘要：采用香草醛-盐酸法对火棘提取物中原花青素含量进行测定，考察了标准物、光照条件、反应时间、反应温度、盐酸浓度、香草醛浓度等因素对原花青素与香草醛显色反应的影响。结果表明，香草醛-盐酸法测定火棘提取物中原花青素含量的适宜条件为：1mL提取液，6mL 4％香草醛甲醇溶液以及3mL浓盐酸，混匀后不避光条件下30℃水浴保温10min后，以儿茶素为标准品，波长500nm处测定吸光度值。该测定方法具有良好的重复性、稳定性、重现性，回收率较高。
关键词：火棘，原花青素，香草醛盐酸法，含量测定
分类号:TS201.2[著者标引] 文献标识码：A 文章编号：栏目信息：
Determination of proanthocyanidins content in Pyracantha
fortuneana fruit
Abstract:Vanillin-HCl assay was adopted to determine the content of proanthocyanidins in Pyracantha fortuneana extract. Several parameters, such as standard, light, reaction time, reaction temperature, HCl concentration and vanillin concentration that affecting the color reaction of proanthocyanidin were investigated. The results showed the appropriate reaction conditions were as the following, 1mL of pyracantha extract, 6mL of 4g/100mL vanillin solution and 3mL of concentrated HCl in methanol respectively, after blending the reaction was carried out at 30℃for 10min and then measured the absorbance at 500nm. Assessment of the method by statistics showed the method has good repeatability, stability, reproducibility and high recovery rate.
Key words:Pyracantha fortuneana; proanthocyanidins; Vanillin-HCl; assaying
火棘（Pyracantha fortuneana）属于蔷薇科苹果亚科（Maloideane），是一种药食两用多用途常绿野生灌木，在我国有7个种属，主要分布于东南、西南和西北部，分布广泛，资源丰富，其乙醇提取物含丰富的原花青素，具有清除自由基[1]、抗氧化[2]、抗病毒[3]、抗细菌[4-5]和抑制肿瘤[6]等多种功效，广泛应用于食品、药品及化妆品等领域，市场前景广阔。原花青素是一类多酚类混合物，化学成分复杂，其含量测定目前国际上并无统一的方法。铁盐催化比色法[7]在国外最早是由Swain和Hillis[8]提出，其反应特征性显著，操作简便，但重现性较差；正丁醇—盐酸法[9]选择性高，但受多酚结构的影响较大，与儿茶素单体不反应；HPLC法[10]测得的结果相对准确，但其所需单体的获得操作复杂，不易得到；HPLC-MS法[11]只能测得原花青素的相对含量，不能作为定量分析的方法；香草醛-盐酸法[12]对缩合单宁的选择性虽然不是很好，但其对原花青素的反应灵敏度高，重现性好。鲍俊竹[13]、姚开等[14-15]采用香草醛-盐酸法、香草醛-硫酸法和正丁醇-盐酸法3种方法测定葡萄籽提取物中原花青素含量，对其结果进行比较，表明香草醛-盐酸法具有较高的准确度和精密度，优于其它方法。因此香草醛盐酸法较适用于低浓度原花青素样品测定。目前香草醛法主要用于葡萄籽、蔷薇、莲子皮等原花青素的含量测定，其操作方式较多，差别较大[16-22]。国内外关于火棘中原花青素的研究甚少，对火棘中原花青素的含量测定方法的研究更未见报道，因此有必要优化建立专属火棘中原花青素含量测定的方法，这必将为火棘资源的进一步开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
火棘提取物实验室自制；实验用水均为去离子水；无水乙醇、甲醇、盐酸、香草醛均为分析纯；
(+)-儿茶素标准品、原花青素标准品购自上海金穗生物科技有限公司。
万分之一电子天平德国赛多利斯公司；隔膜真空泵GM-1.0A 天津市沸腾实验设备有限公司；集热式磁力加热搅拌器DF-101B 金坛市医疗仪器厂；5424R小型台式高速冷冻离心机（Centrifuge 5424R）德国eppendorf；UV-5800PC扫描型紫外可见分光光度计上海元析仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 火棘提取物制备干燥去籽后的火棘果皮肉粉粉碎，过20目筛→体积分数60%的乙醇浸提两次→抽滤→离心→上清液。取5mL上清液至25mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，配制成质量浓度一定的火棘提取物溶液，备用。
1.2.2 标准品的选择及最大吸收波长的确定分别吸取质量浓度1.0mg/mL原花青素标准品，儿茶素标准品溶液各1mL，至10mL试管中，加入4g/100mL香草醛甲醇溶液（现配现用，以下操作相同）6mL，浓盐酸3mL，摇匀，水浴30℃条件下避光反应30min后，空白对照以甲醇代替，其它步骤相同。在波长400~700nm 范围内进行全波段扫描。确定最大吸收波长。
1.2.3 标准曲线的绘制分别吸取1.0mg/mL儿茶素标准溶液各0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4mL 至10mL试管中，用甲醇稀释至1mL，配制成质量浓度分别为0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4mg/mL 的浓度梯度系列，摇匀，再向其中加入6mL 4g/100mL香草醛甲醇溶液和3ml浓盐酸，混匀，在30℃水浴避光反应30min后，用甲醇代替标准品作空白对照，于A500处测定吸光度，以质量浓度对吸光度进行回归分析，得标准曲线方程。
1.2.4火棘提取物与香草醛/盐酸反应的影响因素
1.2.4.1光照及反应时间对吸光度的影响取一定浓度的火棘提取物溶液1mL，至10mL试管中，加入1g/100mL香草醛甲醇溶液6mL，浓盐酸3mL，摇匀，水浴30℃条件下反应30min后，以甲醇为空白对照，其它步骤同上。考察避光与不避光条件下，在5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min时火棘提取物与香草醛反应后溶液吸光度的变化。
1.2.4.2 温度对吸光度的影响取一定浓度的火棘提取物溶液1mL，至10mL试管中，参照1.2.2反应体系，以甲醇为空白对照，其它步骤相同。考察温度各为20、30、40、50℃时对火棘提取物与香草醛反应的吸光度的影响。
1.2.4.3盐酸体积分数对吸光度的影响取一定浓度的火棘提取物溶液1mL，至10mL试管中，参照1.2.2反应体系，以甲醇为空白对照，其它步骤相同。考察盐酸体积分数各为20%、40%、60%、80%、100%时火棘提取物与香草醛反应的吸光度的变化情况。
1.2.4.4香草醛质量浓度对吸光度的影响取一定浓度的火棘提取物溶液1mL，至10mL试管中，参照1.2.2反应体系，以甲醇为空白对照，其它步骤相同。考察香草醛质量浓度各为0.5、1、2、3、4、5、6g/100mL 时对火棘提取物与香草醛反应的吸光度的影响。
1.2.5测定方法评价
1.2.5.1火棘提取物溶液标准曲线关系的建立分别制备质量浓度为2.4、3、4、6、8、10、12、15mg/mL 火棘提取物溶液，各取1mL至10mL试管中，加入甲醇稀释至1mL，然后分别加入6mL 4g/100mL香草醛甲醇溶液和3mL浓盐酸，混匀，在30℃水浴中不避光反应10min后，用甲醇代替标准品作空白对照，在A500处测定吸光度，以质量浓度对吸光度进行回归分析，得样品曲线方程，以确定火棘果提取物溶液的浓度线性范围。
1.2.5.2 方法的重复性考察取质量浓度为2.4mg/mL和15mg/mL的火棘提取物溶液各1mL，至10mL试管中，分别加入6mL 4g/100mL香草醛甲醇溶液及3mL浓盐酸，按照最佳实验条件显色反应后测定A500，共测定5次。此测定在相同条件下由同一分析人员独立完成。
1.2.5.3方法的稳定性考察取质量浓度为2.4mg/mL和15mg/mL的火棘提取物溶液各1mL，至10mL试管中，分别加入6mL 4g/100mL香草醛甲醇溶液及3mL浓盐酸，按照最佳实验条件，每隔10min在A500下测定一次反应液的吸光度，连续测定5次。测定结果之间的精密度称为稳定性。
1.2.5.4 方法的重现性考察取质量浓度为2.4mg/mL和15mg/mL的火棘提取物溶液各1mL，至10mL试管
中，分别加入6mL 4g/100mL香草醛甲醇溶液及3mL浓盐酸，按照最佳实验条件显色后测定A500，共测定5次。此测定在不同实验室，由不同分析人员完成，测定结果之间的精密度称为重现性。
1.2.5.5测定方法的回收率试验取质量浓度为6mg/mL的火棘提取物溶液0.9mL，至10mL试管中，向其中加入0.1mL甲醇，摇匀，再加入6mL 4g/100mL香草醛甲醇溶液及3mL浓盐酸，按照最佳实验条件显色后测定A500，确定此火棘提取物溶液中原花青素的含量。再取质量浓度为6mg/mL的火棘提取物溶液0.9mL，至10mL比色管中，加入0.25mg/mL的儿茶素标准品溶液0.1mL，按照同样方法测定混合后溶液中的原花青素含量，重复测定5次，计算该法的回收率。回收率（%）=（原花青素测得量?原花青素原有量）/加入原花青素的量×100
2 结果与讨论
2.1标准品的选择及最大吸收波长的确定
按照1.2.2实验设计，结果见下图1。由图可知以儿茶素及原花青素为标准品显色反应后溶液的最大吸收波长均为500nm，但是在同样条件下以儿茶素为标准品，显色反应后溶液的吸光度值高很多，因此灵敏度相对以原花青素为标样时更高一些，故在测定低浓度原花青素样品时，选择儿茶素作为标准品较为合适，测定最大吸收波长为500nm。
图1 儿茶素及原花青素标样紫外扫描图
Fig.1 UV wavelength scanning diagram of catechin and procyanidins standard substance
2.2 标准曲线的绘制
按照1.2.3实验设计，可知儿茶素标准溶液的吸光度Y与火棘提取物溶液质量浓度X之间的回归方程为：Y=2.0936X+0.0461，R2=0.9963，吸光度在质量浓度0.05mg/mL～0.40mg/mL范围内线性关系较好，其中X为火棘提取物浓度（mg/mL），Y为吸光度。其标准曲线见图2。
图2 香草醛-盐酸法测定原花青素标准曲线图
Fig.2 Standard curve of proanthocyanidin by vanillin-HCl assay
2.3 火棘提取物与香草醛盐酸反应的影响因素
2.3.1 光照及反应时间的影响按照1.2.4.1方案设计，实验结果见图3。通过实验可知，在避光与不避光条件下火棘提取物与香草醛-盐酸反应的吸光度并没有显著的差别，两种情况下吸光度随着时间的逐步延长，吸光度值逐渐减小，考虑实验操作的实用性，故可在不避光、显色反应10min时测定火棘提取物与香草醛反应的吸光度。
图3 光照及反应时间对原花青素测定结果的影响
Fig.3 Effect of light and reaction time on the determination results of proanthocyanidins
2.3.2温度的影响在2.3.1确定的条件下，考察温度对显色反应的影响。结果见图4，分析可知，火棘提取物与香草醛显色反应后溶液的吸光度随着温度的改变发生了明显的变化，最初吸光度随温度升高先逐步增大，在30℃时达到最大值，之后随着温度进一步升高吸光度值快速减小，由此可以确定最适宜的显色温度为30℃。
图4 温度对原花青素测定结果的影响
Fig.4 Effect of temperature on the determination results of proanthocyanidins
2.3.3 盐酸体积分数在确定的条件下，考察盐酸加入量对显色反应的影响，结果见图5。分析可知，火棘提取物与香草醛显色反应后溶液的吸光度随着盐酸体积分数的增加先快速增加，后增加趋势渐缓，在体积分数100%时吸光度达到最大。因此在保证实验结果不受影响、空白对照颜色不发生变化的情况下选择盐酸体积分数为100%较合适，即直接以浓盐酸参与显色反应。
图5 盐酸体积分数对原花青素测定结果的影响
Fig.5 Effect of HCl on the determination results of proanthocyanidins.
2.3.4 香草醛质量浓度在确定的条件下，考察香草醛质量浓度对显色反应的影响，结果见图6。分析可知，随着香草醛质量浓度的增大，反应的吸光度逐渐增大。当质量浓度超过4g/100mL时，虽然吸光度依然缓慢增大，但增加幅度极缓，并且，当质量浓度高于4g/100mL时，空白溶液变为黄绿色，这可能是因为香草醛浓度过高发生自身缩合引起，所以选用香草醛质量浓度为4g/100mL比较合适。
图6 香草醛质量浓度对原花青素测定结果的影响
Fig.6 Effect of vanillin concentration on on the determination results of proanthocyanidins.
2.4 测定方法评价
2.4.1火棘提取物溶液曲线关系考察按照1.2.5.1实验设计可知，火棘提取物溶液的吸光度Y与溶液质量浓度X之间的回归方程为：Y=0.0496X+0.0892，R2=0.9965，吸光度在质量浓度2.4～15mg/mL 内线性关系良好，这为之后方法评价提取物浓度范围选择提供了理论依据，其中X为浓度（mg/mL），Y为吸光度。火棘原花青素提取物溶液标准曲线见图7。
图7 火棘原花青素提取物溶液标准曲线
Fig. 7 Calibration curves of proanthocyanidins in pyracantha fortuneana extract solution
2.4.2方法的重复性考察按照1.2.5.2实验设计，记录相关数据，求出相对标准偏差RSD（%），实验结果见表1。
表1 重复性试验
Table 1 Repeatability tests of the determination results
质量浓度（mg/mL）吸光
度A1
吸光
度A2
吸光
度A3
吸光
度A4
吸光
度A5
平均
值A
标准偏
差SD
相对标
准偏差
RSD(%)
2.4 0.192 0.190 0.191 0.186 0.191 0.190 0.0023 1.234
15 0.840 0.839 0.855 0.835 0.856 0.845 0.0098 1.156
由表1可知，此测定方法的标准偏差各为0.0023和0.0098，相对标准偏差各为1.234%和1.156%，呈现出良好的重复性和稳定性。
2.4.3方法的稳定性考察按照1.2.5.3实验设计，记录相关数据，求出相对标准偏差RSD（%），实验结果见表2。
表2 稳定性试验
Table 2 Stability tests of the determination results
质量浓度（mg/mL）吸光
度A1
吸光
度A2
吸光
度A3
吸光
度A4
吸光
度A5
平均
值A
标准偏
差SD
相对标
准偏差
RSD(%)
2.4 0.170 0.167 0.164 0.160 0.157 0.164 0.0052
3.19
15 0.837 0.817 0.803 0.779 0.755 0.798 0.0321 4.02
由表2可知，此测定方法的标准偏差各为0.0052和0.0321，相对标准偏差各为3.19%和4.02%，因此在溶液显色反应后50min以内，此测定方法有良好的稳定性。
2.4.4 方法的重现性考察按照1.2.5.4试验设计，记录相关数据，求出相对标准偏差RSD（%），实验结果见表3。
表3 重现性试验
Table 3 Reproducibility tests of the determination results
质量浓度（mg/mL）吸光
度A1
吸光
度A2
吸光
度A3
吸光
度A4
吸光
度A5
平均
值A
标准偏
差SD
相对标
准偏差
RSD(%)
2.4 0.150 0.151 0.152 0.151 0.150 0.151 0.0008 0.55
15 0.827 0.828 0.829 0.830 0.827 0.828 0.0013 0.16
由表3可知，此测定方法的标准偏差各为0.0008和0.0013，相对标准偏差各为0.55%和0.16%，因此测定方法具有极好的重现性和稳定性。
2.4.5方法的加标回收率测定按照1.2.5.5实验设计，记录相关数据，求出相对标准偏差RSD（%），实验结果见表4。
表4 原花青素回收率实验
Table 4 Recovery tests of proanthocyanidins
火棘提取物吸光度A 原花青
素原有
儿茶素
加入量
原花青素
测得量
回收
率(%)
平均值
(%)
相对标
准偏差
量(mg) (mg) (mg) RSD(%)
0.382 0.1604
0.025
0.025
0.025
0.025
0.025
0.1862
0.1867
0.1853
0.1848
0.1858
103.3
105.2
99.5
97.6
101.4
101.4 2.98
由表4可知，此实验方法测定原花青素的回收率为101.4%，相对标准偏差为2.98%。说明此实验具有较高的回收率，精密度良好。
3 结论
本实验采用香草醛-盐酸法测定了火棘提取物中原花青素的含量，分别考察了标准物、光照条件、反应时间、反应温度、盐酸浓度、香草醛浓度等因素对原花青素与香草醛显色反应的影响。结果表明，香草醛-盐酸法测定火棘提取物中原花青素含量的适宜条件为：1mL提取液，6mL 4％香草醛甲醇溶液以及3mL 浓盐酸，混匀后不避光条件下30℃水浴保温10min后，以儿茶素为标准品，波长500nm处测定吸光度值。该测定方法具有良好的重复性、稳定性、重现性，回收率较高。
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