分类号学号M201075020学校代码10487密级
硕士学位论文
丙烯酰胺对纹状体神经末梢多巴胺相关转
运蛋白的影响
学位申请人：熊飞
学科专业：公共卫生硕士
指导教师：严红副教授
答辩日期：
2012年5月
A dissertation submitted to Huazhong University of Science and Technology in conformity with the requirements for the degree of
Master of Science
The impact of acrylamide on the dopamine
transport transport--related protein proteins
s in the striatal nerve terminal
Candidate
:Fei Xiong Major
:Master of Public Health Supervisor :Vice Prof.Hong Yan
Tongji Medical College
Huazhong University of Science and Technology
Wuhan,Hubei 43004300303030,
,P.R.China May,202012
12
独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。
学位论文作者签名：
日期：年月日
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保密，在______年解密后适用本授权数。
本论文属于不保密
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学位论文作者签名：指导教师签名：
日期：年月日日期：年月日
目录
缩写词（Abbreviation） (1)
摘要 (2)
Abstract (7)
前言 (13)
第一部分丙烯酰胺对大鼠神经行为毒性的影响 (17)
材料与方法 (17)
结果 (19)
讨论 (23)
第二部分丙烯酰胺对大鼠多巴胺相关转运蛋白mRNA和蛋白表达的影响 (26)
材料与方法 (26)
结果 (32)
讨论 (37)
第三部分丙烯酰胺对PC12细胞多巴胺相关转运蛋白的蛋白表达的影响 (42)
材料与方法 (42)
结果 (44)
讨论 (46)
参考文献 (48)
小结 (55)
综述 (56)
附图 (74)
致谢 (77)
（Abbreviation）
缩写词（
缩写词
ACR Acrylamide丙烯酰胺
DA Dopamine多巴胺
TH Tyrosine hydroxylase酪氨酸羟化酶
PD Parkinson’s disease帕金森氏病
GA Glycidmidae环氧丙酰胺
MAO-B Monoamine oxidase-B单胺氧化酶B
DAT Dopamine transporter多巴胺转运体
VTA Ventral tegmental腹侧被盖区
VMAT2Vesicular monoamine transporter2Ⅱ型单胺囊泡转运体
PC12Rat pheochromocytoma大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤CNS Center nervous system中枢神经系统
PNS Peripheral nervous system外周神经系统
CAS Chemical Abstracts Service美国化学文摘服务社登记号NFA National Food Administration瑞典国家食品管理局
GSH Glutathione还原型谷胱甘肽
Ct Threshold Cycle循环阈值
AD Alzheimer's Disease阿尔茨海默氏病
CYP2E1Cytochrome P450细胞色素P450
MAPK Mitogen-aetirated potein kinase丝裂原活化蛋白激酶DEPC Diethyl Pyrocarbonate焦碳酸二乙酯
HRP Horseradish Peroxidase辣根过氧化物酶
RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain
逆转录-聚合酶链式反应Reaction
SDS Sodium Dodecyl Sulphate十二烷基硫酸钠
PKA Protein kinase A蛋白激酶A
PKC Protein kinase C蛋白激酶C
D2Rs Dopamine D2receptor多巴胺D2受体
Nurr1Nuclear receptor related1protein核受体相关因子1
丙烯酰胺对纹状体神经末梢多巴胺相关转运蛋白的影响
硕士研究生：熊飞
指导老师：严红副教授
摘要
丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)是一种从水合丙烯腈中提取出来的具有乙烯基的水溶性有机化合物，是国内外广泛应用于化工冶炼、污水处理、纺织加工及化妆品生产的一种化学原料。早在20世纪70年代就有职业性中毒的报道，主要表现为神经系统症状，除职业接触外，在饮用水、高温油炸食品和食品的包装材料中都可以检测到单体丙烯酰胺的存在，由于其可以直接经口进入人体，从而引起了社会的高度关注。有关流行病学调查和实验研究发现，丙烯酰胺对人和实验动物除了有生殖毒性、遗传毒性及致癌性等作用以外，还有明显的神经毒性。丙烯酰胺急性、亚急性中毒主要以损伤中枢神经系统为主，表现为神经精神症状和小脑共济失调，而慢性中毒则以损害周围神经系统为主，关于其机制目前尚不清楚。
纹状体作为基底节最大的综合处理元件，包含着大量的多巴胺能神经元，在整个脑部中的多巴胺神经递质含量最高。在多巴胺能系统神经通路中多巴胺神经递质首先在突触前膜中进行合成、转运、释放、降解，以达到突出间隙中多巴胺神经递质的平衡，突触间隙中的多巴胺神经递质进入突触后膜发挥突触后效应，而多巴胺相关转运蛋白在整个过程中发挥着重要作用，维持突触间隙中多巴胺神经递质的平衡，当该平衡被打破后神经系统就会出现不同程度的病症，主要表现在感觉运动整合、躯体平衡运动及学习记忆等方面。以往对ACR的人群流行病学和实验研究时所出现的神经症状和体征，似乎很大程度上预示着与纹状体多巴胺神经通路中多巴胺神经递质平衡被打破有关。
但直至目前，有关丙烯酰胺影响纹状体维持多巴胺神经递质平衡的相关转运
蛋白的研究报道较少，其具体机制仍未完全明确。因此，本研究拟通过体内和体外实验的结合，检测丙烯酰胺对多巴胺转运体、单胺囊泡转运体及多巴胺合成酶—酪氨酸酸羟化酶的影响，探讨其引起神经毒性的可能机制，为防治丙烯酰胺中毒提供理论依据。
第一部分丙烯酰胺对大鼠神经行为毒性的影响
目的：探讨丙烯酰胺对大鼠神经行为毒性的影响。
方法：健康成年雄性SD大鼠40只，体重230±20g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（鄂）2010-0007号。大鼠在10h：14h 明暗光循环的动物房内，自由饮水、摄食，检疫观察7天后用于实验。将大鼠按体重随机分为4组，分别为对照组、低剂量(20mg/kg)组、中剂量(30mg/kg)组、高剂量（40mg/kg）组，每组10只，均单笼饲养。按照对应的染毒剂量对各ACR 剂量组进行灌胃染毒，对照组则灌胃给予等容量的生理盐水，每周连续染毒5天间隔2天，总共19天，并于第0，6，13，19天称量体重并进行步态评分，于第0，19天测定大鼠的后肢支撑力和甩尾时间。末次给药24小时后，断头处死大鼠，迅速取出脑组织，用预冷PBS缓冲液洗净，称量大小脑重量，并于冰盘上迅速分离纹状体、大脑皮层及小脑，并用干净滤纸吸干置于﹣80℃冰箱中保存备用。取出大鼠心、肝、脾、肺、肾、睾丸等脏器，称量重量并记录。
结果：（1）在整个染毒期内低剂量组大鼠虽然体重增长始终低于对照组，但差异无显著性；与对照组比较，中剂量组大鼠平均体重于第19d明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；高剂量组大鼠平均体重于第6d、13d、19d也明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。另外，与低、中剂量组相比，高剂量组大鼠平均体重于第19d明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。（2）脏器系数显示，高剂量组大小脑、心脏、肺脏、肾脏及睾丸脏器系数均有增加，且差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。（3）染毒第6d、13d、19d，与对照组比较，低、中、高剂量组步态评分均明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，且染毒结束后，其分值分别集中于1-2、2-3、3-4分之间，并呈现出时间—剂量—效应关系。另外，与低、中剂量组相比，高剂量组步态评分于第6d、13d、19d也
明显增加，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。（4）染毒第19d，与对照组相比，低、中、高剂量组后肢支撑力指数均明显增加，差异有统计学意义(P< 0.01)，且呈现出剂量—效应关系。另外，与低、中剂量组相比，高剂量组后肢支撑力指数也明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)（5）染毒第19d高剂量组的甩尾时间比对照组明显缩短，差异有统计学意义(P<0.01)。
结论：ACR亚急性染毒能导致大鼠体重下降；大小脑、心脏、肺脏、肾脏及睾丸脏器系数增加；步态评分增高；后肢支撑力指数增加；甩尾时间缩短。具有明显的神经毒性，主要引起感觉运动功能异常。
第二部分丙烯酰胺对大鼠多巴胺相关转运蛋白mRNA和蛋白
表达的影响
目的：探讨丙烯酰胺对大鼠纹状体多巴胺转运体(DAT)、单胺囊泡转运体(VMAT2)和酪氨酸羟化酶（TH）mRNA表达和蛋白水平的影响。
方法：动物分组及处理同第一部分。实时荧光定量PCR技术检测大脑皮层、小脑和纹状体内DAT、VMAT2、TH mRNA表达水平，并检测纹状体中MAO-B mRNA表达水平；Western Blot蛋白印迹技术检测纹状体内DAT、VMAT2、TH的蛋白表达水平。
结果：（1）大脑皮层结果显示：与对照组比较，各剂量组VMAT2mRNA表达水平均明显降低，其中低、中剂量组分别降低了30%、29%，差异具有统计学意义(P<0.05)，而高剂量组则降低了56%，差异具有统计学意义(P<0.01)。DAT、TH各组间差异均无统计学意义。（2）小脑结果显示：与对照组比较，低、中、高剂量组DAT、VMAT2、TH mRNA表达均明显降低，差异具有统计学意义(P <0.01)。（3）纹状体结果显示：DAT mRNA表达与对照组相比，低、中、高剂量组均明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；Western blot结果显示，高剂量组的糖基化DAT蛋白表达明显降低，仅为对照组的78%，差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，高剂量组VMAT2mRNA表达显著降低(P<0.01)，VMAT2蛋白表达也显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，
高剂量组TH mRNA和蛋白表达均明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，高剂量组MAO-B mRNA表达明显降低，差异具有统计学意义(P< 0.01)。
结论：ACR亚急性染毒不仅会使大鼠小脑中DAT、VMAT2、TH mRNA表达降低，还会使纹状体中DAT、VMAT2、MAO-B mRNA和蛋白表达降低，TH mRNA和蛋白表达增加，提示ACR亚急性染毒会导致多巴胺神经递质的合成和转运功能失常，引起胞质和突触间隙中多巴胺含量改变，从而导致多巴胺神经系统功能紊乱。
第三部分丙烯酰胺对PC12细胞多巴胺相关转运蛋白的蛋白
表达的影响
目的：探讨丙烯酰胺对PC12细胞中多巴胺转运体(DAT)、单胺囊泡转运体(VMAT2)和酪氨酸羟化酶（TH）蛋白表达的影响。
方法：取对数生长期的PC12细胞，分为1个对照组和6个染毒组，各染毒组ACR终浓度分别为0.1mmol/L，0.3mmol/L，0.6mmol/L，1.25mmol/L，2.5 mmol/L，5mmol/L，染毒24h。用Western Blot蛋白印迹技术检测PC12细胞中DAT、VMAT2、TH的蛋白表达水平。
结果：（1）DAT蛋白定量结果显示：与对照组比较，0.6mmol/L和1.25mmol/L 组PC12细胞中糖基化DAT明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，0.1mmol/L、0.6mmol/L、1.25mmol/L组非糖基化DAT也明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。（2）VMAT2蛋白定量结果显示：与对照组比较，0.6 mmol/L-5mmol/L组PC12细胞中VMAT2明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；与0.1mmol/L和0.3mmol/L组比较，0.6mmol/L-5mmol/L组VMAT2也降低，差异具有统计学意义(P<0.5或P<0.01)。（3）TH蛋白定量结果显示：与对照组比较，2.5mmol/L、5mmol/L组PC12细胞中TH含量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。
结论：ACR可以引起PC12细胞中DAT、VMAT2蛋白含量降低，同时还可以引起TH蛋白含量升高，提示ACR可以引起PC12细胞中多巴胺神经递质的合成
和转运功能异常。
综上所述，ACR亚急性染毒能导致大鼠体重下降，后肢支撑力指数增加，步态评分增高，甩尾时间缩短，说明其神经毒性作用比较明显；其作用于小脑和纹状体后，不仅会使大鼠小脑中DAT、VMAT2、TH mRNA表达降低，还会使纹状体中DAT、VMAT2、MAO-B mRNA和蛋白表达降低及TH mRNA和蛋白表达增加。另外，ACR还能引起PC12细胞中DAT、VMAT2蛋白含量降低，同时还可以造成TH蛋白含量升高。因此，推测纹状体DA系统功能紊乱可能与多巴胺相关转运蛋白受到影响有关。
关键词：丙烯酰胺；多巴胺转运体；Ⅱ型单胺囊泡转运体；酪氨酸羟化酶；PC12
The impact of acrylamide on the dopamine transport-related proteins in the striatal nerve terminal
Candidate for M.D.:Fei Xiong
Tutor::Hong Yan
Tutor
Abstract
Acrylamide(ACR)is vinyl water-soluble organic compound prepared on an industrial scale by the hydrolysis of acrylonitrile by nitrile hydratase.ACR is used in chemical refining,waste water treatment,textile processing and the production of cosmetics.It can be detected in the drinking water,fried food and food packaging matetials.As early as the1970s,the neurotoxicity of ACR was reported in occupational poisoning population.Because of mostly entering the body by mouth,it has raised widespread concern in societies.Epidemiological investigations and experimental studies have shown ACR to be neurotoxic in both animals and human, and also to have reproductive toxicity,genetic toxicity and carcinogenicity.Acute and sub-acute poisoning of ACR cause damage to the central nervous system,manifested as neuropsychiatric symptoms and cerebellar ataxia,while chronic poisoning cause damage to the periphetal nervous system,but its mechanism is not clear.
The striatum is the largest integrated processing elements in the basal ganglia, and contains a large number of dopaminergic neurons.Dopamine neurotransmitter is mainly distributed in it.Dopamine in the neural pathways of dopaminergic system is firstly biosynthesized,transported,released,and degraded on the presynaptic membrane,in order to maintain the balance of prominent gap in the dopamine neurotransmitter.The dopamine neurotransmitter from the saynaptic cleft to the
postsynaptic membrane play a postsynaptic effect,while dopamine transporter protein in the whole process play an important role in maintaining the balance of the neurotransmitter dopamine in the synaptic cleft.When this balance is broken,the nervous system can experience different symptoms,which are mainly in the sensory-motor integration,body balance movement and learning and memory.In past studies with ACR,population epidemiological and experimental studies have largely seemed to indicate that neurological signs and symptoms are related with break in the balance of dopamine neurotransmitter.
Up to now,there are only a few reported about the affects of ACR on the dopamine transport-related proteins which maintain the balance of dopamine neurotransmitter in the striatum,and the exact mechanism is not yet clear.Hence,the need to investigate the potential mechanisms of neurotoxicity of ACR,and explore the impact of acrylamide on dopamine transporter,vesicular monoamine transporter and tyrosine hydroxylase,in vivo and vitro.The aim of this study is to provide a theoretical basis for the treatment of acrylamide poisoning.
PartI I Neurobehavioral Toxicity of Acrylamide in Rats
Part
Objective:The aim of this part is to investigate the neurobehaviaral toxicity of ACR in rats.
Methods:Forty healthy adult SD male rats which were provided by experimental animal center of Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,all of them were randomly divided into four groups,10per group: control group,low dose group(20mg/kg),middle dose group(30mg/kg),high dose group(40mg/kg),which were single-caged.Rats were exposed to ACR solution though oral gavage in corresponding dose and control group were given equal volume of saline.Rats were continuous exposed for5days and rest two days,total nineteen days.The body weight and gait score were measured on day0,6,13and19,the force index of hindlimb legs and tail-drift time were measured on day0and19.24hours
after the last administration,all rats were decapitated and the whole brain tissue was immediately removed and washed by pre-cooling PBS.After weighed the brain and cerebellum,striatum,cerebral cortex and cerebellum were stripped immediately and stored at-80℃for determination.Heart,liver,spleen,lung,kidney and testicle were weighed and recorded.
Results:(1)Weight of the low dose group was lower than that of the control group, but the difference was not https://www.doczj.com/doc/0216423341.html,pared with the control group,the weight of the middle dose group reduced on day19(P<0.01)and the weight of high dose group also reduced on day6,13d,19(P<0.01).Compared with the low dose group and middle dose group,the weight of high dose group was lower on day19 significantly(P<0.01).(2)Organ coefficient:brain,cerebella,heart,lung,kidney and testicle of high dose group increased significantly(P<0.05or P<0.01).(3) Compared with the control group,gait score increased(P<0.01)on day6,13and19 At the end of this experiment,their scores were concentrated between1-2,2-3,3-4 and showed a time-dose-effect relationship.In addition,compared with the control group,gait score of high dose group on day6,13and19significantly increased(P< 0.05or P<0.01).(4)Compared with the control group,the force index of hindlimb legs was significantly increased in all groups(P<0.01).Compared with the low and middle dose group,the force index of hindlimb legs was increased significantly in the high dose group(P<0.01).(5)On day19,the tail-drift time of high dose group was lower than that of the control group(P<0.01).
Conclusions:The body weight of rats were decreased,the organ coefficient of brain; cerebella,heart,lung,kidney and testicle increased;gait score increased;the force index of hindlimb legs and tail-drift time increased in the sub-acute exposure of ACR. ACR showed obvious neurotoxicity,and mainly caused sensory-motor dysfunction.
PartII II The impact of ACR on dopamine transport-related Part
proteins mRNA and protein expression
expressions s in rat
rats s
Objective:To investigate the impact of ACR on dopamine transporter(DAT), monoamine vesicle transporter(VMAT2)and tyrosine hydroxylase(TH)mRNA expression and protein levels in the rat striatum.
Methods：The animal grouping and treatment were the same as the part one.The mRNA expression of DAT、VMAT2、TH mRNA were measured by real-time PCR in the striatum,cerebral cortex and cerebellum,and the mRNA expression of MAO-B were measured in the striatum.Moreover,western blot were used to estimate the protein expression of DAT、VMAT2、TH in the striatum.
Results：(1)the result of the cerebral cortex:Compared with the control group,the expression of VMAT2mRNA reduced by30%(P<0.05),29%(P<0.05),56%(P< 0.01)in low,middle and high dose group.(2)the result of the cerebellum：Compared with the control group,the mRNA expression of DAT、VMAT2、TH mRNA reduced significantly(P<0.01).(3)the result of the striatum：Compared with the control group,in the low,middle and high dose group DAT mRNA reduced significantly(P< 0.01),and protein quantification results showed that the expression of the glycosylated DAT protein in the high dose group was decreased significantly (P<0.05).Compared with the control group,VMAT2mRNA and protein expression in high dose group was decreased significantly(P<0.01),Compared with the control group,in the high dose group TH mRNA and protein significantly increased(P<0.05). Compared with the control group,the expression of MAO-B mRNA in the high dose group significantly reduced(P<0.01).
Conclusion：Sub-acute poisoning of ACR led to VMAT2-mRNA expression in rat cerebral cortex and cerebellum decreased;DAT,VMAT2,MAO-B mRNA and protein expression decreased in the striatum;TH mRNA and protein expression was increased
in the striatum.These finding suggest that sub-acute poisoning of ACR led to the synthesis and transport function of the dopamine neurotransmitter disorders,caused by the change of dopamine content in the cytoplasm and synaptic cleft,resulting in dysfunction of the dopaminergic systerm.
Part III The impact of ACR on dopamine transport-related
proteins expression
cells s
expressions s in PC12cell
Objective：To investigate the impact of ACR on dopamine transport-related proteins expressions in PC12cells.
Methods：Taking the logarithmic growth phase PC12cells,divided into one control group and six ACR groups for24h,final concentration was0.1mmol/L,0.3mmol/L, 0.6mmol/L,1.25mmol/L,2.5mmol/L,5mmol/L respectively.Western blot were used to estimate the protein expression of DAT,VMAT2,TH in PC12cells
Results：(1)DAT protein quantification results showed that:compared with the control group,0.6mmol/L and1.25mmol/L group of the glycosylated DAT was decreased significantly(P<0.05);Compared with the control group,0.1mmol/L, 0.6mmol/L and 1.25mmol/L group of the non-glycosylated DAT was also decreased significantly(P<0.05).(2)VMAT2protein quantitative results show that: compared with the control group,0.6mmol/L,1.25mmol/L,2.5mmol/L and5mmol/L group of VMAT2protein was decreased significantly(P<0.01).(3)TH protein quantification results showed that:the2.5mmol/L and5mmol/L groups of TH protein were more than the control group significantly(P<0.05,P<0.01).
Conclusions：ACR could decrease DAT,VMAT2-protein expression,elevate TH protein expression in PC12cells.This study suggested that ACR could cause abnormal synthesis and transport function of the neurotransmitter dopamine in PC12 cells.
In summary,the ACR sub-acute exposure could decrease body weight,increase gait score and the force index of hindlimb legs,decrease tail-drift time,which suggested that ACR showed neurotoxic effects.ACR could decrease DAT,VMAT2 gene and protein expression,increase TH gene and protein expression in vivo and in vitro.These results suggested that the striatum-DA system dysfunction may be related to the dopamine transporter protein
Key words:Acrylamide;Dopamine transporter;Vesicular Monoamine transporter II;
Tyrosine Hydroxylase;PC12cells
前言
一、目的与意义
丙烯酰胺(Acrylamide，ACR)是一种有毒的无色无味的结晶状物质，CAS 登记号为76-06-1，分子式为CH2＝CHCONH2，分子量为71.08，熔点为84℃～85℃，沸点为125℃，室温下性质很稳定，易溶于水、乙醇、乙醚、丙酮等，微溶于甲苯，不溶于庚烷和苯等非极性物质，当暴露于紫外光、氧化条件下或者温度达到熔点及以上时易发生聚合反应形成聚丙烯酰胺，是现代工业化学中常用于合成聚丙烯酰胺的一种水溶性化工原料。聚丙烯酰胺被广泛应用于采矿冶炼、土壤改良、污水或废水处理、造纸、合成塑料和染料、生产化妆品和凝胶电泳分离蛋白实验等[1-3]。甚至在饮用水、高温油炸食品和食品的包装材料中均可检测到丙烯酰胺单体的存在。2002年4月，瑞典国家食品管理局(National Food Administration,NFA)和斯德哥尔摩大学学者首次在高温油炸的淀粉类食品中发现ACR含量高，从而立刻引起国际社会的高度关注[4-6]。随后世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)召开紧急专家咨询会议，专门探讨了关于食源性ACR的安全性问题。经过大量研究后发现，ACR进入人体后主要被细胞色素P450系统（CYP2E1等）氧化为环氧丙烯酰胺（GA），然后在环氧化酶或者在谷胱甘肽（GSH）的作用下形成谷胱甘肽共轭体，最后形成硫醇尿酸等代谢产物（图1）[7-12]。ACR可以经过皮肤粘膜、消化道、呼吸道等多种途径进入人体发挥效应，主要表现为神经毒性、生殖毒性、遗传毒性及致癌性等，其中以神经毒性尤为明显，如嗜睡、手指麻木，位置性震颤，步态紊乱，肌肉萎缩，肌肉无力，手出汗脱屑以及接触性皮炎等[13]。因此，国际癌症研究中心(IARC)将ACR划为2A类致癌物(即“人类可能的致癌物”)[14]。世界卫生组织WHO提出的经处理后的饮用水中ACR含量标准应低于1ug/L，但研究发现油炸高温淀粉类食品中ACR含量高出该标准的500倍以上，大量存在于我们日常生活环境中[15]。除了饮水和食物等食源性途径接触ACR外，职业性接触也是ACR中毒的主要途径。
早在20世纪70年代，我国就有关于丙烯酰胺的职业中毒报道，也进行了相关
的防治研究，于1996年提出了丙烯酰胺中毒诊断标准（GB16370-1996）[16]。现场劳动卫生学研究和体格检查发现长期接触丙烯酰胺的工人，中毒多发生在接触6～8个月其主要表现为神经系统症状，如全身乏力、四肢麻木、食欲不振、体重减轻、严重时还会出现步履蹒跚、四肢震颤等[17-21]。大量动物实验显示，ACR的大鼠经皮LD50为400mg/kg，大鼠、小鼠、豚鼠和兔经口LD50为150～180mg/kg,人体的口服致死量为(50～500)mg/kg，属中等毒性物质，对各类动物均有不同程度的神经毒作用，主要表现为神经损伤的三联征，即下肢外展，共济失调和肌无力，也会使其自主神经功能发生障碍，例如尿储留，压力神经感受异常和血管收缩神经功能障碍等[22-25]。上述的动物实验和人群调查研究均显示ACR中毒会导致有关躯体运动和平衡功能障碍，而在整个脑中，锥体外系是控制运动和平衡的关键部位，从狭义的角度看，锥体外系就是指黑质纹状体多巴胺能系统[26-27]。黑质纹状体多巴胺能系统受损被认为是帕金森综合征(Parkinson's disease,PD)、亨廷顿舞蹈病(Huntingtons chorea)、阿兹海默病（Alzheimer's disease）、注意力缺陷多动综合征、精神分裂症等多种疾病形成的主要原因，其主要临床表现为运动障碍、震颤麻痹、步态异常等，因此，学者们推测黑质纹状体多巴胺能系统受损也是ACR中毒的可能原因[28-31]。
本课题组成员前期研究发现，ACR可以引起多巴胺能神经系统通路中多巴胺(Dopamine,DA)的改变。DA是参与运动、认知、情感、摄食以及内分泌调节的重要神经递质，如果该神经递质含量改变，就会影响整个多巴胺能神经系统的功能，从而引起相应的临床症状。而酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）、多巴胺神转运体（dopamine transporter,DAT）及单胺囊泡转运体（vesicular monoamine transporter,VMAT）是多巴胺能神经系统通路中合成和转运DA的蛋白质，它们在维持突触间隙中DA含量平衡发挥着至关重要的作用。因此，如果这些蛋白质功能失调会导致脑内DA平衡失调，从而引起帕金森病、药物依赖及精神分裂症等多种疾病。早期的电生理研究显示，丙烯酰胺抑制了中枢和周围神经系统突触的神经传递。Lopachin等研究观察到丙烯酰胺中毒的大鼠纹状体突触囊泡神经递质摄取和释放都存在障碍，提出对突触囊泡转运功能的抑制可能导致突触神经递质储存功能障碍，并影响神经递质的释放。以上这些结果均提示DA
转运过程的异常可能是ACR作用的一个重要途径。但截至目前，仍缺乏ACR对纹状体多巴胺转运功能的全面系统的研究。因此本实验拟从纹状体多巴胺相关转运蛋白的角度进一步探讨ACR的毒作用机制，为将来防治ACR中毒提供新的理论依据。
图1丙烯酰胺生物转化过程
二、研究内容和技术路线
(一)研究内容
1模拟职业人群接触方式，建立ACR大鼠亚急性间歇中毒模型，以步态评分、后肢支撑力、甩尾时间为神经行为学指标，观察不同剂量ACR染毒对大鼠神经行为毒性的影响。
2从DA合成和转运的角度，选取DAT、VMAT2、TH，利用RT-PCR检测方法，检测不同剂量ACR染毒对不同脑区DAT、VMAT2、TH mRNA表达的影响，并用Western blot检测方法，检测纹状体中DAT、VMAT2、TH的蛋白表达水平，初步探讨ACR致多巴胺系统的神经毒性机制。
3在体外建立ACR染毒模型，利用Western blot检测方法，检测不同剂量ACR染毒对DAT、VMAT2、TH蛋白表达水平的影响，以验证并解释体内模型的结果，为进一步研究干预措施提供参考。
(二)技术路线
综述细胞内的蛋白质合成、加工、修饰、分选与运输方式及其生物学意义。 蛋白质是生命活动的主要承担者，是构成细胞和生物体结构的重要物质，在生物体及细胞的生命活动中发挥重大作用。 1.许多蛋白质是构成细胞和生物体结构的重要物质，称为结构蛋白。 2.细胞内的化学反应离不开酶得催化，绝大多数酶都是蛋白质。 3.有些蛋白质具有运输载体的功能。（血红蛋白运输氧） 4.有些蛋白质起信息传递的作用，能够调节机体的生命活动。（如，胰岛素） 5.有些蛋白质有免疫功能，人体的抗体是蛋白质，可以帮助人体抵御病菌和病毒等抗原的侵害。 1 蛋白质的合成 蛋白质的生物合成过程实质上是基因表达的一个过程，它包括转录和翻译。即把mRNA 分子中的碱基排列顺序转变为蛋白质或多肽链中的氨基酸排列顺序的过程，可分为起始、延长和终止3个阶段，分别由不同的起始因子、延伸因子和终止因子（释放因子）参与。细胞中的蛋白质都是在核糖体上合成的，并都是起始于细胞质基质之中。 2 蛋白质的加工与修饰 许多新生肽要经过一种或几种共价键修饰，这种修饰可以在正延伸着的肽链中进行。一般情况下，翻译后修饰一是为了功能上的需要，另一种情况是折叠成天然构象的需要。在粗面内质网合成并进入内质网腔的蛋白质发生的主要化学修饰作用有糖基化、羟基化、酰基化和二硫键的形成。而在细胞质基质中发生蛋白质修饰的类型主要有辅酶或辅基与酶的共价结合、磷酸化和去磷酸化、糖基化、甲基化、酰基化等。蛋白质的修饰加工主要包括： 切除加工：包括切除N-端甲硫氨酸、信号肽序列和切除部分肽段，将无活性的前体转变成活性形式。（包含信号肽的胰岛素前体称为前胰岛素原，去掉信号肽的胰岛素的前体称为胰岛素原),进一步切除称为C链的肽段后才能形成活性形式的胰岛素） 糖基化：糖基化主要发生在内质网和高尔基体中。粗面内质网上合成的大多数蛋白在都发生了糖基化。主要作用是促进蛋白质在成熟过程中折叠成正确构象，增加蛋白质的稳定性，有N-连接的糖基化和O-连接的糖基化之分。 羟基化：最常见的是内质网上合成的跨膜蛋白在通过内质网和高尔基体的转运过程中发生的，它由不同的酶来催化，把软脂酸链共价地连接在某些跨膜蛋白的暴露在细胞质基质中的结构域。 磷酸化与去磷酸化：蛋白磷酸化与去磷酸化参与代谢调控和信号转导以及蛋白与蛋白之间的相互作用。（PDGF受体的酪氨酸残基经过自身磷酸化后才与细胞质定位蛋白质结合。） 亲脂修饰：最常见的亲脂修饰是酰化和异戊二烯化。蛋白质亲脂修饰后可以改变膜结合能力和特定的蛋白与蛋白之间的相互作用。N-豆蔻酰化（豆蔻酸以酰酰氨键形式共价连在肽链N 端的残基上）能增加特定G蛋白的α亚基对膜结合的β、γ亚基的亲和力。 甲基化：通过甲基转移酶进行。天冬氨酸的甲基化能促进已破坏蛋白的修复或降解，在2，3-二磷酸核酮糖羧化酶（rihilose-2,3-biosphosphate carboxylase）、钙调蛋白（calmodulin）、组氨酸（histone）、某些核糖体蛋白和细胞色素C中都有甲基化的赖氨酸残基。 二硫键形成：二硫键通常只发现于分泌蛋白（如胰岛素）和某些膜蛋白中，在细胞质中由于有各种还原性物质，所以细胞质蛋白没有二硫键。因为内质网腔是一个非还原性环境，所以粗糙内质网上的新生肽只暂时形成二硫键。当新生肽进入内质网腔时，一些肽链可能会按氨基酸次序依次暂时形成二硫键，但最终会通过交换二硫键位置的形式形成正确的结构，内质网中可能还有一种二硫键异构酶催化该过程。 3 蛋白质的分选和转运
一、蛋白质的合成 1、核糖体是合成蛋白质的机器，其功能是按照mRNA的指令由氨基酸合成蛋白质。 2、游离核糖体游离于胞质中，合成细胞内的基础蛋白质；附着核糖体，附着在内质网表面，构 成粗面内质网的核糖体，合成分泌蛋白和膜蛋白。 3、蛋白质合成的一般过程： 1）氨基酸的活化。氨基酸和tRNA在氨酰一tRNA合成酶作用下合成活化的氨酰一 tRNA。2）起始、延伸和终止。3）蛋白质合成后的加工。肽链N端Met的去除； 氨基酸残基的化学修饰，乙酰化、甲基化、磷酸化等；肽链的折叠；二硫键的形成。 二、蛋白质的分泌合成、加工修饰和转运 1、信号肽介导分泌性蛋白在粗面内质网的合成。 1）信号肽是蛋白质合成中最先被翻译出来的一段氨基酸序列，通常由18-30个疏水氨基酸组成，能指引核糖体与内质网结合，并引导合成的多肽链进入内质网 腔。 2）新生分泌性蛋白质多肽链在胞质中的游离核糖体上起始合成。当新生肽链N端的信号肽被翻译后，可立即被细胞质基质中的信号识别颗粒（SRP）识别、结 合。 3）与信号肽识别结合的SRP,识别结合内质网膜上的SRP-R,并介导核糖体锚泊附着于内质网膜的通道蛋白移位子上。而SRP则从信号肽一核糖体复合体上解离， 返回细胞质基质中重复上述过程。 4）在信号肽的引导下，合成中的肽链，通过由核糖体大亚基的中央管和移位子蛋白共同形成的通道，穿膜进入内质网网腔。随之，信号肽序列被内质网膜俄面的信号肽酶且除， 新生肽链继续延伸，直至完成而终止。最后完成肽链合成的核糖体大、小亚基解聚，并 从内质网上解离。 2、跨膜驻留蛋白的插入和转移决定了蛋白质的两种去处：1）穿过膜进腔，为可溶性蛋 白质，包括分泌蛋白和内质网驻留蛋白。2）嵌入内质网膜中，形成膜蛋白。 3、粗面内质网与外输性蛋白质的分泌合成、加工修饰和转运过程密切相关。 1）新生多肽链的折叠与装配，与合成同时发生。内质网为新生多肽链正确的折叠和装配提供了有利的环境。分子伴侣通过对多肽链的识别结合来协助它们的折叠组装和转运。 2）蛋白质的糖基化。在粗面内质网网膜腔面的糖基转移酶作用下发生N一连接糖基化。 三、蛋白质的加工、分选和定向运输 1、蛋白质在高尔基体内加工等。 1）糖蛋白的加工合成。糖基化修饰加工合成的糖蛋白，主要包括N一连接糖蛋白和O一连接糖蛋白两种类型。前者，糖链合成与糖基化修饰始于内质网，完成 于高尔基复合体；后者，则主要或完全是在高尔基复合体中进行和完成的。 2）蛋白质糖链的加工有严格的区域性和顺序性：甘露糖去除发生在中间扁囊高尔基复合体靠近顺面的部位；N一乙酰葡萄糖胺加入在中间部；半乳糖加入在中 间扁囊区靠近反面的部位。 3）蛋白质的水解加工。 2、分选蛋白质：高尔基体通过对蛋白质的修饰、加工，使其带上能被高尔基复合体网膜上专一 受体识别的分选信号，进而选择、浓缩，形成不同靶向的分泌泡。 四、蛋白质合成的质量监控 1、内质网至高尔基体的蛋白质必须是正确折叠和组装的。分子伴侣可特异性的识别错
如有侵权请联系网站删除 牛血清白蛋白的提取与鉴定 一、实验目的 1. 掌握牛血清白蛋白的提取与鉴定方法 2.掌握盐析法、透析法及电泳法 二、实验原理 牛血清白蛋白是牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。应用相同浓度硫酸铵盐析法将血清中白蛋白与其它球蛋白分离，最后用透析法除盐，即可提取白蛋白。再利用电泳过程中带电粒子的移动速度与粒子荷电量、电场强度、粒子重量与半径及介质的黏稠度等有关，对牛血清白蛋白进行分离与鉴定。 三、操作步骤 （一）盐析取离心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）稀释血清，摇匀后，逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2mL，边加边摇，充分混匀，然后静止放臵10分钟，再离心（2000r/min）10min，将上清液倾入试管中。 （二）透析（1 ）取干净的比色板，在各孔内滴加一滴纳氏试剂 （2）透析袋未放入水中时，立即取水中液体检查有无NH4+ (3)取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯内，使透析袋下半部侵入水中，对蛋白液进行透析，常用玻璃棒搅拌袋外（烧杯中）液体，以缩短透析时间。 (4)每隔2分钟检查一次，更换蒸馏水多次，用纳氏试剂检查袋外液体的NH4+，观察颜色变化并记录，直至袋内盐分透析完毕。 (5)将袋内液体倾入试管，即得牛血清白蛋白溶液。 （三）电泳（1）点样取一张膜条，将薄膜无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透，取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以薄膜的无光泽面距一端1.5㎝处作点样线，将牛血清样品与待测的牛血清白蛋白溶液分别用点样器在同一张薄膜的点样线处不同位置点样。标准液点一次，待测液点三次。 （2）电泳将点样后的膜条臵于电泳槽架上，放臵时膜条无光泽面向下，点样端臵于阴极，待平衡5min后，打开电源，调节电泳仪的电压为160伏，通电60min，关闭电源后用镊子将膜条取出。 （3）染色将膜条直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染2分钟取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗5min，直至背景漂洗干净为止，用滤纸吸干薄膜。（4）鉴定比较样品与待测液中白蛋白在薄膜上的电泳结果，看位置是否一致。 四、仪器和试剂 仪器：离心管、离心机、试管、玻璃纸、烧杯、比色板、滴管、玻璃棒、电泳仪、醋酸纤维素薄膜、天平 试剂：牛血清待测液、牛血清样品、PBS（磷酸盐缓冲生理盐水，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）配制的0.9%NaCl溶液）、pH7.2饱和硫酸铵溶液、纳氏试剂、巴比妥缓冲液、氨基黑10B染色液、漂洗液 五、预测结果位置一致，实验成功。若在待测液的电泳结果中出现其他球蛋白的黑带区域，则说明提取不够纯。 六、参考文献[1]陆红玲.生物化学与分子生物学实验教程.西安:第四军医大学出版社,2010 精品资料
蛋白质的入核转运机制 哺乳动物细胞中的蛋白质，绝大部分是在细胞质的核糖体上合成的（线粒体合成极少），由于各个部位所需蛋白质分子在结构和功能方面各不相同，在进化过程中每种蛋白质都形成一个独特的地址签，蛋白质合成后，细胞通过对蛋白质地址签的识别将其运输到相应的部位，完成蛋白质的分选。 具有分选信号的蛋白质虽然可以被准确地分选出来，但如何到达细胞内的特定部位呢，这就是蛋白质的运输。运输方式目前认为有三种：1.门孔运输：定位在细胞核内的蛋白质通过核膜上的核孔复合体进入细胞核2.跨膜运输：定位在线粒体、过氧化物酶体、内质网的蛋白质通过这些细胞器膜上的蛋白质传导通道进入细胞器3.囊泡运输：定位在高尔基复合体、溶酶体、膜蛋白和分泌蛋白是通过这种方式进行转运的。 进入细胞核的蛋白质还必须带有核定位信号（NLS），NLS 是富含碱性氨基酸的短肽可定位在蛋白质的任何部位。NLS的氨基酸残基片段可以是一段连续的序列（T抗原），也可以分成两段，两段之间间隔约10个氨基酸残基（核质蛋白）NLS序列可存在于亲核蛋白的不同部位，在指导完成核输入后并不被切除。 哪些蛋白质需要进入细胞核呢？需要转运入核的蛋白质主要是参与基因的复制、转录的蛋白因子和各种酶，如RNA、DNA 聚合酶、组蛋白、拓朴异构酶及大量转录、复制调控因子都必须
从细胞质进入细胞核才能正常发挥功能。还有一些需要转运入核才能发挥作用的外源性大分子像基因治疗外源重组DNA、病毒基因等。 有NLS的蛋白质通过核膜上的核孔复合体进入细胞核。核通过一个有双层膜的外被与胞质分隔。内膜与核纤层接触，为核提供了一个表面的膜。外膜与胞质中的内质网连接。这双层膜在被称为核孔复合物的开口处接触。核孔复合物有四部分组成，朝向胞质面与外核膜相连的胞质环，其上对称分布8条纤维；朝向核基质与内核膜相连的核质环，其上亦对称分布8条纤维，末端交汇成篮网样结构；把胞质环、核质环、中央栓连接到一起的辐条；核孔中央跨膜糖蛋白组成的中央栓。 核孔复合体具有双功能性运输通道，被动运输和主动运输，需要进入细胞核的带有NLS的蛋白质主动运输进入细胞核，过程如下 ①具有NLS的转运蛋白与输入蛋白α/β异二聚体结合，形成NLS-输入蛋白α/β三聚体; ②形成的NLS-输入蛋白α/β三聚体与核孔复合体的胞质丝结合; ③通过胞质丝的弯曲把三聚体依次呈递至核孔复合体中央栓蛋白，再与核质丝结合、解离、平衡，三聚体转运至细胞核; ④该复合体通过核孔复合体中央栓时，与Ran-GTP相互作用，同时激活输入蛋白β，至使输入蛋白β与NLS分别从复合体上
第十二章蛋白质的生物合成及转运 蛋白质的生物合成在细胞代谢中占有十分重要的地位。目前已经完全清楚，贮存遗传信息的DNA并不是蛋白质合成的直接模板，DNA上的遗传信息需要通过转录传递给mRNA。mRNA才是蛋白质合成的直接模板。mRNA是由4种核苷酸构成的多核苷酸，而蛋白质是由20种左右的氨基酸构成的多肽，它们之间遗传信息的传递与从一种语言翻译成另一种语言时的情形相似。所以人们称以mRNA为模板合成蛋白质的过程为翻译或转译(translation)。 翻译的过程十分复杂，几乎涉及到细胞内所有种类的RNA和几十种蛋白质因子。蛋白质合成的场所是核糖体，合成的原料是氨基酸，反应所需能量由A TP和GTP提供。蛋白质合成的早期研究工作都是用大肠杆菌的无细胞体系进行的，所以对大肠杆菌的蛋白质合成机理了解最多。真核细胞蛋白质合成的机理与大肠杆菌的有许多相似之处。 第一节遗传密码 任何一种天然多肽都有其特定的严格的氨基酸序列。有机界拥有1010～1011种不同的蛋白质，构成数目这么庞大的不同的多肽的单体却只有20种氨基酸。氨基酸在多肽中的不同排列次序是蛋白质多样性的基础。目前已经清楚，多肽上氨基酸的排列次序最终是由DNA上核苷酸的排列次序决定的，而直接决定多肽上氨基酸次序的却是mRNA。不论是DNA还是mRNA，基本上都由4种核苷酸构成。这4种核苷酸如何编制成遗传密码，遗传密码又如何被翻译成20种氨基酸组成的多肽，这就是蛋白质生物合成中的遗传密码的翻译问题。 一、密码单位 用数学方法推算，如果mRNA分子中的一种碱基编码一种氨基酸，那么4种碱基只能决定4种氨基酸，而蛋白质分子中的氨基酸有20种，所以显然是不行的。如果由mRNA 分子中每2个相邻的碱基编码一种氨基酸，也只能编码42=16种氨基酸，仍然不够。如果采用每3个相邻的碱基为一个氨基酸编码，则43=64，可以满足20种氨基酸编码的需要。所以这种编码方式的可能性最大。应用生物化学和遗传学的研究技术，已经充分证明了是 293
第八次实验： 牛血清白蛋白的 提取与鉴定 一、实验名称牛血清白蛋白的提取与鉴定 二、实验目的1、掌握盐析法提取牛血清白蛋白 2、掌握血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳法 鉴定牛血清白蛋白 3、了解用溴甲酚绿鉴定血清蛋白 三、实验原理1，蛋白质是水化作用较强的高分子物质， 向其加入碱土金属的中性盐类可是蛋白质胶粒脱水并失去 电荷，从溶液中沉淀出来。球蛋白在半饱和的硫酸铵溶液 中可析出，而清蛋白则需在饱和的硫酸铵溶液中可析出。 可将血清中白蛋白与其它球蛋白分离，最后用透析法除盐， 即可提取白蛋白。2，利用电泳过程中带电粒子的移动速度
与粒子荷电量、电场强度、粒子重量与半径及介质的黏稠 度等有关，可对牛血清白蛋白进行分离与鉴定。3，血清中 的白蛋白与溴甲酚绿在ph=4.2的条件下结合生成绿色化合 物，溶液由黄色变为绿色，而球蛋白基本不与之反应，缩 短反应时间可去除干扰，其颜色的深浅与白蛋白浓度成正 比，可用于鉴定牛血清白蛋白。 四、实验步骤 （一）盐析取离心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS磷酸盐缓冲生理盐水稀释血清，摇匀后，逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2mL，边加边摇，充分混匀，然后静止放臵10分钟，再离心（4000r/min）10min，将上清液倾入试管中。 （二）透析取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯内，使透析袋下半部侵入水中，对蛋白液进行透析，常用玻璃棒搅拌袋外（烧杯中）液体，以缩短透析时间。更换蒸馏水多次，用纳氏试剂检查袋外液体的NH4+，观察颜色变化，直至袋内盐分透析完毕。将袋内液体倾入试管，即得牛血清白蛋白溶液。（三）BCG法鉴定 白蛋白+溴甲酚绿ph=4.2 绿色复合物 或（三）电泳鉴定
通道蛋白是一类横跨质膜,能使适宜大小的分子及带电荷的分子通过简单的自由扩散运动, 从质膜的一侧转运到另一侧。通道蛋白可以是单体蛋白,也可以是多亚基组成的蛋白,它们都是通过疏水的氨基酸链进行重排,形成水性通道。通道蛋白的运输作用具有选择性,所以在细胞膜中有各种不同的通道蛋白。通道蛋白参与的只是被动运输,在运输过程中并不与被运输的分子结合,也不会移动,并且是从高浓度向低浓度运输,所以运输时不消耗能量。 血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质(缩写为HB或HGB)。是使血液呈红色的蛋白。血红蛋白由四条链组成，两条α链和两条β链，每一条链有一个包含一个铁原子的环状血红素。氧气结合在铁原子上，被血液运输。血红蛋白的特性是:在氧含量高的地方，容易与氧结合;在氧含量低的地方，又容易与氧分离。血红蛋白的这一特性，使红细胞具有运输氧的功能。 转运蛋白是膜蛋白的一大类，介导生物膜内外的化学物质以及信号交换。脂质双分子层在细胞或细胞器周围形成了一道疏水屏障，将其与周围环境隔绝起来。尽管有一些小分子可以直接渗透通过膜，但是大部分的亲水性化合物，如糖，氨基酸，离子，药物等等，都需要特异的转运蛋白的帮助来通过疏水屏障。 锚蛋白属于联结蛋白家族,广泛存在于各种组织细胞中。锚蛋白连接整合膜蛋白到细胞骨架蛋白网络,在多种细胞功能活动中起关键作用,参与细胞内蛋白转运。对锚蛋白功能的研究将有助于阐明与其异常相关疾病的发病机制,为基因诊断和治疗提供理论基础。 水孔蛋白的其中一种AQP1，是由四个相同的亚基构成,每个亚基的相对分子质量为28kDa,每个亚基有六个跨膜结构域,在跨膜结构域2与3、5与6之间有一个环状结构,是水通过的通道。每个单体蛋白的中空部分都形成具有高度选择性的通道，只允许水分子跨膜运输而不允许带电质子或其他离子通过，在功能上都可以作为一个独立的运输水通道。
BSA牛血清白蛋白 牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent。 CAS号：9048-46-8 英文名称：Bovine albumin 英文同义词：nhsa;BSA-C;AC-BSA;ALBUMIN, PIG;albumenpowder;SERUM ALBUMIN;ACETYLA TED BSA;BSA ACETYLATED;Bovine albumin;BSA, METHYLA TED 中文名称：牛血清白蛋白 中文同义词：蛋白粉；牛白蛋白；卵蛋白粉；血清蛋白；血清白蛋白；牛血蛋白质；复合氨基酸；牛血清蛋白；牛血清白蛋白；血清白蛋白（牛） CBNumber: CB5107573 分子式：N/A 英文别名：Bovine serum albumin 化学性质 储存条件: 2-8°C 溶解度: PBS: >40 毫克/毫升 form : lyophilized powder Merck : 13,8542 稳定性：Stable. Incompatible with strong oxidizing agents and strong acids. Refrigerate. EPA化学物质信息：Albumins, blood serum(9048-46-8) 用途 1、用于生化研究、遗传工程和医药研究 2、用作医药保健食品、调味品 3、维持渗透压、pH缓冲、载体作用 4、在PCR体系中有助于Taq酶的稳定性及活性，可以提高PCR的效率
蛋白质的合成 蛋白质的种类是由基因决定的,也就是说人类基因组有多少个基因,人体就有多少种蛋白质,只是蛋白质表达的时期和部位不同.根据人类基因组计划分析得知：全部人类基因组约有2.91Gbp,约有39000多个基因；也就是说人体蛋白质的种类有39000多种 蛋白质生物合成可分为五个阶段，氨基酸的活化、多肽链合成的起始、肽链的延长、肽链的终止和释放、蛋白质合成后的加工修饰 一．氨基酸的活化 分散在胞液中的各种氨基酸需经特异的氨基酰-tRNA合成酶催化，ATP供能，并需Mg2＋或Mn2＋参与在氨基酸的羧基上进行活化，生成中间复合物 （）后者再与相应的tRNA作用，将氨基酰转移到tRNA分子 的氨基酸臂上，即3′末端腺苷酸中核糖的3′（或2′）羟基以酯键相结合形成氨基酰-tRNA 【氨基酰tRNA的生成】
tRNA 各种tRNA的一级结构互不相同，但它们的二级结构都呈三叶草形 三叶草形结构的主要特征是:含有四个螺旋区、三个环和一个附加叉 四个螺旋区构成四个臂，其中含有3′末端的螺旋区称为氨基酸臂，因为此臂的3′-末端都是C-C-A-OH序列，可与氨基酸连接三个环分别用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示 环Ⅰ含有5，6二氢尿嘧啶，称为二氢尿嘧啶环（DHU环） 环Ⅱ顶端含有由三个碱基组成的反密码子，称为反密码子环；反密码子可识别mRNA分子上的密码子，在蛋白质生物合成中起重要的翻译作用 环Ⅲ含有胸苷（T）、假尿苷（ψ）、胞苷（C），称为假尿嘧啶环（TψC环）；此环可能与结合核糖体有关tRNA在二级结构的基础上进一步折叠成为倒“L”字母形的三级结构
起始因子 原核起始因子只有三种（IF1、IF2、IF3） 真核起始因子(简称为eIF)种类多且复杂，已鉴定的真核起始因子共有12种 延长因子 原核生物（简称EF）由三部分组成：EF-Tu，EF-Ts，和EF-G EF-Tu它介导氨酰-tRNA进入核糖体的空位 EF-Ts充当EF-Tu亚基的鸟嘌呤核苷酸交换因子,催化EF-Tu释放GDP EF-G催化tRNA的移位和多肽延伸的每个循环后期mRNA从核糖体上掉下来 真核生物（简称eEF） 真核生物中分为：eEF-1和eEF-2 eEF-1有两个亚基，α和βγα相当于原核生物中的EF-Tu亚基，它介导氨酰-tRNA进入核糖体的空位Βγ相当于原核生物中EF-Ts，核苷酸交换因子α,催化GDP从α上释放eEF-2相当于原核生物的EF-G，催化tRNA的移位和多肽延伸的每个循环后期mRNA从核糖体上掉下来
课程设计说明书 课程名称：生物分离工程 设计题目：牛血清白蛋白的分离提纯工艺 院系：环境与化学工程学院 学生姓名：孙盼盼 学号：41004020111 专业班级：10级生物工程01班 指导教师：王晓军 2013年6月20日
目录 1.设计任务书 (1) 2.设计背景 (1) 2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 (1) 2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 (1) 3.设计原理 (2) 4.设计工艺流程及设计方案说明 (2) 4.1对原材料的粗分级分离 (3) 4.2对粗分离成分进行细分级分离 (3) 4.3 蛋白的结晶与重结晶 (3) 4.4 对分离出的蛋白质进行纯度鉴定 (3) 4.5 牛血清白蛋白质分离提纯的整个工艺流程 (3) 5.操作过程 (4) 5.1蛋白质分离的准备阶段 (4) 5.2细分级分离设备的设计 (4) 5.3蛋白质的纯度鉴定 (8) 6.参考文献 (8) 7.课程设计心得 (9)
1.设计任务书 现有一混合物料液中含有酪蛋白（分子量：57000Da，pI 4.5）、β-乳球蛋白（分子量：35000Da，pI 5.1）、α-乳白蛋白（分子量：14000Da，pI 4.2）和牛血清白蛋白（分子量：66200Da，pI 4.7），设计一个分离纯化工艺纯化其中的牛血清白蛋白。 2.设计背景 2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 蛋白质是（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。 蛋白质具有很多生物化学共性，运用相关性质进行蛋白质的分离制备多种不同的单一蛋白质，更好的为人们所有。蛋白质的分离提纯技术已经很成熟，相关的工艺流程包含各种不同的分离提纯设备，这些设备运用蛋白质的不同原理对其进行分离纯化，单一蛋白质的分离提纯在现实生活中具有重要意义！ 2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫
第十八节：蛋白质的合成及转运 ?翻译以mRNA为直接模板，tRNA为氨基酸运载体，核蛋白体为装配场所，共同协调完成蛋白质生物合成的过程。也就是把mRNA的碱基排列顺序转译成多肽链中氨基酸的排列顺序。 ?三大进展使蛋白质合成的主要过程得到认识 ①蛋白质合成的部位－核糖体；②氨基酸被氨酰tRNA激活；③遗传密码子。 1．遗传密码 ?密码子是指编码一个特定氨基酸的三联体核苷酸。 ?编码连续氨基酸的密码子中没有标点。 起始密码子：AUG（Met）, (少数情况下GUG(Val)) ? ?终止密码子：UAA，UAG，UGA（无义密码子并非总是无义的，是稀有氨基酸如磷酸丝氨酸、硒半胱氨酸（UGA）掺入肽链的正常途径） ? ?遗传密码的特性 ①连续性；②读码不重叠性；③通用性；④简并性；⑤摆动性（变偶性）。 ?简并性：每一个氨基酸可能有一个以上的密码子；（甲硫氨酸AUG和色氨酸只有一个密码子）?摆动性：大多数密码子的第三个碱基与其反密码子的相应配对比较松，使一些tRNA能识别多个密码子 ?意义：密码子和反密码子相互作用平衡了准确性和速度的需要。 ?密码子的特性 ①无标点符号；②读码不重复；③一定的防突变功能。 ?碱基丢失――后续氨基酸全改变 ?一个碱基突变――一个氨基酸改变 ?密码子第三个碱基改变――氨基酸可能不变（简并性，摆动性） ?阅读框移动和RNA编辑――――― 一些mRNA在翻译前就被编辑。 ?在一些病毒DNA中发现不同阅读框中的重复基因 (密码子结构与氨基酸侧链极性之间有一定关系. 1)氨基酸侧链极性性质在多数情况下由密码子的第二个碱基决定。第二个碱基为嘧啶(Y)时，氨基酸侧链为非极性，第二个碱基为嘌呤(P)时，氨基酸侧链侧有极性. 2)当第一个碱基为U或A，第二个碱基为C，第三个碱基无特异性时，所决定的氨基酸侧链为极性不带电; 3)当第一个碱基不是U，第二个碱基是G时，氨基酸侧链则带电。在此前提下，若第一个是C或A时，表示带正电
牛血清白蛋白的提取与鉴定 一、实验目的掌握牛血清白蛋白的提取与鉴定方法 二、实验原理 牛血清白蛋白是牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38 g/100 ml），分子量68 kD。等电点4.8。应用相同浓度硫酸胺盐析法将血清中白蛋白与其它球蛋白分离，最后用透析法除盐，即可提取白蛋白。再利用电泳过程中带电粒子的移动速度与粒子荷电量、电场强度、粒子重量与半径及介质的粘稠度等有关，对牛血清白蛋白进行分离与鉴定。 二、实验步骤 （一）盐析取离心管一支加入牛血清2 ml、加入等量PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）稀释血清，摇匀后，逐滴加入pH 7.2饱和硫酸铵溶液2ml，边加边摇，充分混匀，然后静止放置10分钟，再离心（4000 r/min）10 min，将上清液侵入试管中。 （二）透析取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100 ml烧杯内，使透析袋下半部侵入水中，对蛋白液进行透析，常用玻璃棒搅拌袋外（烧杯中）液体，以缩短透析时间。更换蒸馏水多次，用纳氏试剂检查袋外液体的NH4+，观察颜色变化，直至袋内盐分透析完毕。将袋内液体倾入试管，即得牛血清白蛋白
溶液。 （三）电泳 （1）点样取一张膜条，将薄膜无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透，取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以薄膜的无光泽面距一端1.5 cm处作点样线，将牛血清样品与待测的牛血清白蛋白溶液分别用点样器在同一张薄膜的点样线处不同位置点样。 （2）电泳将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时膜条无光泽面向下，点样端置于阴极，待平衡5 min后，打开电源，调节电泳仪的电压为160V，通电60 min，关闭电源后用镊子将膜条取出。 （3）染色将膜条直接浸入盛有氨基黑10B的染色液中，染2分钟取出，立即浸入漂洗液中，分别在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗5 min，直至背景漂洗干净为止，用滤纸吸干薄膜。 （4）鉴定比较样品与待测液中白蛋白在薄膜上的电泳结果，看位置是否一致。 四、实验仪器和试剂 仪器：离心管、离心机、试管、玻璃纸、烧杯、比色磁盘、滴管、玻璃棒、电泳仪、醋酸纤维素薄膜、分光光度计。 试剂：牛血清待测液、牛血清样品、PBS（磷酸盐缓冲溶液，用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）配制的0.9% NaCl溶液）、pH7.2饱和磷酸铵溶液、纳氏试剂、巴比妥缓冲液、氨基黑10B染色液、漂洗液、0.4N氢氧化钠溶液。 五、预测结果 位置一致，实验成功。若在待测液的电泳结果中出现其他球蛋白的黑带区域，则说明提取不够纯。 六、参考文献 【1】陆红玲. 生物化学与分子生物学实验教程。西安：第四军医大学出版社，2010. 巴比妥缓冲液（pH8.6）取巴比妥5.52g与巴比妥钠30.9g，加水使溶解成2000ml，即得。
牛血清白蛋白 简介 牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent。 CAS号：9048-46-8 英文名称：Bovine albumin 英文同义词：nhsa;BSA-C;AC-BSA;ALBUMIN, PIG;albumenpowder;SERUM ALBUMIN;ACETYLATED BSA;BSA ACETYLATED;Bovine albumin;BSA, METHYLATED 中文名称：牛血清白蛋白 中文同义词：蛋白粉；牛白蛋白；卵蛋白粉；血清蛋白；血清白蛋白；牛血蛋白质；复合氨基酸；牛血清蛋白；牛血清白蛋白；血清白蛋白（牛） CBNumber: CB5107573 分子式：N/A 英文别名：Bovine serum albumin 化学性质 储存条件: 2-8°C 溶解度: PBS: >40 毫克/毫升 form : lyophilized powder Merck : 13,8542 稳定性：Stable. Incompatible with strong oxidizing agents and strong acids. Refrigerate. EPA化学物质信息：Albumins, blood serum(9048-46-8)
用途 1、用于生化研究、遗传工程和医药研究 2、用作医药保健食品、调味品 3、维持渗透压、pH缓冲、载体作用 4、在PCR体系中有助于Taq酶的稳定性及活性，可以提高PCR的效率，在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的。 生产方法 以牛血为原料分离出血清，用硫酸铵分级沉淀后，经辛酸处理精制而得。 贮存方法 每10克加100毫升水进行溶解，或用PBS溶解也可，视用途而决定。然后分装成小支。若不使用防腐剂可贮存在零下20或30摄氏度的恒温柜中，若使用防腐剂（如0.1%叠氮化钠）则可贮存在零上4摄氏度的环境下。一般可存放数月不变质。防腐剂可能对牛血清白蛋白的效果造成影响，应慎用。 编辑本段结构与作用 成分结构 牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent。它是牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。
牛血清白蛋白-9048-46-8（MSDS） 牛血清白蛋白 化学品安全技术说明书 第一部分化学品及企业标识 化学品中文名称: 牛血清白蛋白化学品英文名称: Bovine albumin 企业名称: Shenzhen Biochemilogic Co. Ltd. 地址: 广东省深圳市宝安区龙华镇大浪明君工业园A2栋4楼邮编: 518109 电子邮件地址: 传真号码: 企业应急电话: 技术说 明书编码: 生效日期: 2010年02月26 日国家应急电话: 第二部分成分/组成信息 纯品 , 混合物 ? 化学品名称:牛血清白蛋白有害物成分:牛血清白蛋白浓度: ?95% CAS No.:9048-46-8 第三部分危险性概述 危险性类别: 无资料侵入途径: 吸入，食入，经皮吸收。健康危害: 刺激眼睛，呼吸系统和消化系统，引起皮肤过敏。环境危害: 对环境有危害，曝光或遇 热分解对大气可造成污染。燃爆危险:无资料 第四部分急救措施 第 1 页共 6 页 牛血清白蛋白皮肤接触: 立即脱去被污染的衣服，用清水或肥皂水彻底冲洗 皮肤至少15分钟， 如果暴露皮肤的外观发生了变化或疼痛，就医。眼睛接触: 立即提起眼睑， 用大量流动清水冲洗至少15分钟。即使没用急性疼
痛或外观变化，一定要就医。吸入: 迅速脱离现场至空气新鲜处。保持呼吸道通畅。如呼吸困难，不能进 行人工呼吸，给输氧，就医。食入:不能催吐，喝2-4杯牛奶或水，立即就医。 第五部分消防措施 危险特性:在足够的浓度下与空气可形成爆炸性混合物。有害燃烧产物: 一氧化碳、二氧化碳、刺激性和有毒烟雾和气体。灭火方法及灭火剂: 消防人员必须穿全身防护服，戴防护眼镜，佩戴自给式呼吸 器。使用适合周围环境的灭火设施。灭火剂:雾状水、泡沫、 干粉、二氧化碳。灭火注意事项: 没有配备全身防火防毒服和供氧设备请不要待在危险区。 第六部分泄露应急处理 应急处理: 应急处理人员须穿戴化学防护衣进入现场。化学品未经处理严禁向环 境排放。消除方法: 隔离泄漏污染区，限制出入。切断火源。确保有足够的通风，建议应 急处理人员戴防尘面具(全面罩)，穿防毒服。避免扬尘，小心扫起， 置于袋中转移至安全场所，防止流入水渠。收集回收或运至废物处理 场所处置。 第七部分操作处置与储存 操作注意事项: 密闭操作，全面通风。防止粉尘释放到车间空气中。操作人员必 第 2 页共 6 页 牛血清白蛋白
基本信息 【词条中文名称】牛血清白蛋白【词条拼音名称】Níuxuèqīng báidànbái 牛血清白蛋白 【词条英文名称】Bovine albumin 【词条英文别名】Bovine serum albumin 【词条分类性质】名词词组，偏正词组【词条适用范围】医学领域，药学领域【CAS 数字登录号】9048-46-8 BSA简介 BSA结构 CAS号：9048-46-8 英文名称：Bovine albumin 英文同义词：nhsa;BSA-C;AC-BSA;ALBUMIN, PIG;albumenpowder;SERUM ALBUMIN;ACETYLATED BSA;BSA ACETYLATED;Bovine albumin;BSA, METHYLATED 中文名称：牛血清白蛋白 中文同义词：蛋白粉；牛白蛋白；卵蛋白粉；血清蛋白；血清白蛋白；牛血蛋白质；复合氨基酸；牛血清蛋白；牛血清白蛋白；血清白蛋白（牛） CBNumber: CB5107573 分子式：N/A 英文别名：Bovine serun albumin 化学性质 储存条件: 2-8°C 溶解度: PBS: >40 mg/mL form : lyophilized powder Merck : 13,8542 稳定性：Stable. Incompatible with strong oxidizing agents and strong acids. Refrigerate. EPA化学物质信息：Albumins, blood serum(9048-46-8) 用途 1、用于生化研究、遗传工程和医药研究 2、用作医药保健食品、调味品
牛血清白蛋白的提取与鉴定 一、实验目的 1.掌握牛血清白蛋白的提取与鉴定方法 2.掌握盐析法、透析法及电泳法 二、实验原理 牛血清白蛋白是牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。应用相同浓度硫酸铵盐析法将血清中白蛋白与其它球蛋白分离，最后用透析法除盐，即可提取白蛋白。再利用电泳过程中带电粒子的移动速度与粒子荷电量、电场强度、粒子重量与半径及介质的黏稠度等有关，对牛血清白蛋白进行分离与鉴定。 三、操作步骤 （一）盐析取离心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）稀释血清，摇匀后，逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2mL，边加边摇，充分混匀，然后静止放臵10分钟，再离心（2000r/min）10min，将上清液倾入试管中。 （二）透析（1）取干净的比色板，在各孔内滴加一滴纳氏试剂 （2）透析袋未放入水中时，立即取水中液体检查有无NH4+ (3)取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯内，使透析袋下半部侵入水中，对蛋白液进行透析，常用玻璃棒搅拌袋外（烧杯中）液体，以缩短透析时间。 (4)每隔2分钟检查一次，更换蒸馏水多次，用纳氏试剂检查袋外液体的NH4+，观察颜色变化并记录，直至袋内盐分透析完毕。 (5)将袋内液体倾入试管，即得牛血清白蛋白溶液。 （三）电泳（1）点样取一张膜条，将薄膜无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透，取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以薄膜的无光泽面距一端1.5㎝处作点样线，将牛血清样品与待测的牛血清白蛋白溶液分别用点样器在同一张薄膜的点样线处不同位置点样。标准液点一次，待测液点三次。 （2）电泳将点样后的膜条臵于电泳槽架上，放臵时膜条无光泽面向下，点样端臵于阴极，待平衡5min后，打开电源，调节电泳仪的电压为160伏，通电60min，关闭电源后用镊子将膜条取出。 （3）染色将膜条直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染2分钟取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗5min，直至背景漂洗干净为止，用滤纸吸干薄膜。（4）鉴定比较样品与待测液中白蛋白在薄膜上的电泳结果，看位置是否一致。 四、仪器和试剂 仪器：离心管、离心机、试管、玻璃纸、烧杯、比色板、滴管、玻璃棒、电泳仪、醋酸纤维素薄膜、天平 试剂：牛血清待测液、牛血清样品、PBS（磷酸盐缓冲生理盐水，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）配制的0.9%NaCl溶液）、pH7.2饱和硫酸铵溶液、纳氏试剂、巴比妥缓冲液、氨基黑10B染色液、漂洗液 五、预测结果位置一致，实验成功。若在待测液的电泳结果中出现其他球蛋白的黑带区域，则说明提取不够纯。 六、参考文献[1]陆红玲.生物化学与分子生物学实验教程.西安:第四军医大学出版社,2010