稳转慢病毒
一、所需试剂
1、慢病毒载体(详细信息见附录及《质粒得扩增提取》）（大肠杆菌-８0℃保存2-3年,质粒-２0℃保存2—3年,病毒液—80℃保存１年)
(１)载体质粒:两端得LＴR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp 得序列及位于env序列中得RRＥ,含宿主RNＡ聚合酶识别部分
（2）包装质粒（psPAX2）:包含了pｏl、gａｇ包装成分
（３）包膜质粒（pＭD2、G):用其她病毒得包膜蛋白代替了ｅnv基因、
三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力得病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞
3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒
4、转染试剂：XTＲEME—ＧENＥ(－20℃保存，不可分装），一种脂质与其她组份构成得混合物
5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存)：5ＸPＥG800０／NaＣｌ溶液(聚乙二醇)：NaCl ８、766 g; PEG８00050ｇ溶解在2０0mｌMilｌi-Q纯水中,高压蒸汽灭菌
＊＊也可直接从公司买来病毒液（—80℃封口膜封口冻存管保存,4℃保存３天）:滴度一般为10８TU/ml
6、10ｍｇ/ml polyｂreｎｅ（-20℃分装保存）:溴化己二甲铵。就是带正电得小分子，与细胞表面得阴离子结合,提高慢病毒对细胞得感染效率,通常加入pｏｌybrｅnｅ能提高感染效率２～1０倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度(1～１0μｇ/ｍl）
7、无血清培养基:ｏｐtｉmｅn
8、贴壁细胞(复苏后3代以上得细胞)
９、puromｙcin:嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞
二、具体步骤
＜一〉病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转)
第一天
１、种板,10×1０５个293Ｔ细胞，加入全培养基双抗ＤMＥM４—5ml，过夜
2、配制5ＸPＥG８0０0/NaCl溶液
称取NaCｌ8、766 g； PEG800０ 50g溶解在200ml Miｌli-Ｑ纯水中;1２1摄氏度３０miｎ湿热灭绝 30min；保存在4℃
第二天
１、配管
2、加入２ml全培养基DMEM
3、将1加入2,孵育10ｈ，换成5ml全培养基
第四天第五天：
1、9：00与1７：0０各收取一次5ｍｌ培养液,共20mｌ（－80℃保存)
2、过滤:用孔径为０、４5mm得过滤器除去上清中得29３T细胞
3、加入5ml 5ＸPEＧ８０0０/NaＣｌ溶液,每30miｎ－1ｈ上下摇匀一次
4、４℃过夜
第六天
１、4℃,3500rｐｍ，20ｍiｎ
２、弃上清,倒扣纸上静置1－2min，吸干残余液体
３、加入120—１50μlＰBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶
４、５0μｌ分装，—80℃保存。
〈二〉慢病毒转染靶细胞
前期预实验MOI(步骤同正式试验）(见三2，直接订购病毒液时才需要)
１、第一天：准备96孔板，每孔加入100００个2９3T，为每个病毒准备２0个孔（稀释１0个浓度,各2个副孔)。放入37℃，5％ＣO２培养箱中培养。
2、第二天:在EP管中做10倍梯度稀释,连续1０个稀释度。稀释方法如下:每种病毒准备１0个1、5ml EP管,每管加入２07μl培养液,往第一个管中加入２3μｌ病毒原液，混匀后，吸取23μｌ加入第二个管混匀.依此类推，做十个稀释度(１０~1０－8）。
吸取9６孔板中原有得培养基，加入含稀释好得病毒液。并做好标记.
3、第三天：换液
4、第四天：观察结果并计算滴度
在荧光显微镜下观察结果,并数出最后两个有荧光得荧光细胞克隆数。假设为Ｘ与Y,则滴度（TＵ/ml）=（Ｘ+Ｙ×10)/2/Ｘ孔得病毒液得含量(μl )×10０0。（前面算出得就是没μl病毒量,所以乘于1000)
第一天：
1、准备病毒液(可在第一天做）：在冰上融解
2、准备完全培养基与Polybrｅnｅ混合物（1:1000-1:20００稀释，终浓度在５—１0μg/ｍl之间）,加入相应培养板中(６孔板2mｌ，1２孔板1ml，２4孔板50０μl）
3、加入浓缩病毒液（１２孔板30μｌ-50μｌ）（如果就是直接购买病毒液需根据MＯI确定病毒液量加入病毒液，自己包得病毒可以）
4、培养过夜,对polybrenｅ毒性敏感得细胞在４-6小时候换液
第三天
1、对细胞进行换液
第五天
1、用药物进行稳定株得筛选(具体筛选药物根据载体内得基因定，用氨苄青霉素0、5μg/ml －10μg／ml)
2、需设置空白对照(未处理细胞加入相同浓度氨苄青霉素，党对照全部死光为筛选周期）第六天之后（根据筛选周期)
1、换液传代
2、观察GFP报告基因确定转染效率，或用qRT—PＣR确定转染效率
三、注意事项及知识点
1、名词解释
(1）病毒感染复数(multiｐｌｉcity ｏf inｆｅｃｔiｏnＭOＩ）：含义就是感染时病毒与细胞数量得比值，即为每个细胞被多少个有活力病毒所感染
2、慢病毒摸索时加入梯度(具体见自己得说明书）
3、慢病毒得储存与稀释：
可以将病毒暂时放置于4 ℃保存;如需长期保存请放置于－８0℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）
Ａ。病毒可以存放于—80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过６个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度
B。反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度1０%；因此在病毒使用过程中按照每次得使用量进行分装.
４、慢病毒载体示意图
《1》载体质粒(PLKＯ、１抑制载体,PCＤH-GＦＰ+ｐuro过表达载体)：(1)5’LTR:lｏng terｍinalｒｅpeat即长末端重复序列,不编码蛋白质，但含有启动子,增强子等调控元件
（２)包组信号ψ:LTR－ψ通过包装细胞得RNＡ聚合酶转录为RNA，通过ψ信号起始包装
（3）启动子、酶切位点与抗性基因（amp氨苄青霉素ｐuｒo嘌呤霉素）
（4)ｓtuffｅr:目得基因插入位点（慢病毒载体可插入５kｂｐ左右）
(5）GFP：green ｆlｕorｅsceｎｔproｔein绿色荧光蛋白
(6）WPRE:Woodchuck Hｅpatｉｔis Ｖirus （ＷＨP）PｏsｔtrａnscriptioｎalＲegulatoｒｙElｅmenｔ肝炎病毒转录后调控元件。转录后可形成三级结构，促进基因得表达
（7)c/CTＳ：逆转录病毒顺式作用区域，其中该ｃ与CTS区域诱导三链DＮA结构
（更新于20１8、1１) 《2》包装质粒
(1）gag基因编码病毒得核心蛋白基质蛋白、衣壳蛋白、核衣壳蛋白等
(2)pol基因编码病毒复制所需得酶类,如反转录酶、整合酶、蛋白酶(3）prｏ基因则编码切割蛋白前体所需得蛋白酶
（４）多种酶切位点与巨细胞病毒启动子
《３》包膜载体
(1）VＳV-G:水疱性口炎病毒糖蛋白Ｇ基因，用于代替enｖ基因