本科毕业论文（设计）
( 2013届)
题目：福建竹叶青蛇（Trimeresurus stejnegeri）透明骨骼标本制作
学院：生命与环境科学学院
专业：生物技术
学生姓名：宋孟祥学号：20909051045
指导教师：黄田职称（学位）：讲师（学士）
合作导师：职称（学位）：
完成时间：2013 年5 月25 日
成绩：综合成绩：等级：
黄山学院教务处制
学位论文原创性声明
兹呈交的学位论文，是本人在指导老师指导下独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权利和责任。
声明人（签名）：
年月日
目录
摘要 (Ⅳ)
英文摘要 (Ⅳ)
1 引言 (1)
1.1 福建竹叶青的基本特征 (1)
1.2 福建竹叶青的分类地位 (1)
1.3福建竹叶青的地理分布 (2)
1.4 文献回顾 (2)
2 材料和方法 (3)
2.1 材料 (3)
2.1.1 材料的选择 (3)
2.1.2 药品与器材 (3)
2.2 方法 (3)
2.2.1 制作的步骤 (3)
2.2.2 观察与摄像 (4)
3 结果 (4)
4 讨论 (7)
4.1 实验心得 (7)
4.2 透明骨骼的优点 (8)
参考文献 (8)
致谢 (8)
福建竹叶青蛇（Trimeresurus stejnegeri）透明骨骼
标本制作
宋孟祥（20909051045）
导师：黄田（讲师）
（黄山学院生命与环境科学学院，黄山学院，中国，黄山，245041）
摘要：本实验不需要一般的动物解剖上的肌肉剔除，就可以将骨骼纤细的福建竹叶青，制作成透明骨骼标本，即利用阿利辛蓝(Alcian Blue 8GS)和茜素红(Alizarin Red S)对已经处理好福建竹叶青的软骨和硬骨分别进行染色,再经过酒精脱色，甘油透明后，使之全部骨骼在不受任何损伤的情况下较为清楚的展现出来，为研究其生物形态和骨骼构造的研究提供了科学的资料。
关键词：福建竹叶青；透明标本；骨骼；骨骼学
The production of transparent skeletal specimen of
Trimeresurus stejnegeri
Meng-Xiang SONG (20909051042)
Supervisor: Tian HUANG (Lecturer)
(College of Life and Environment sciences, Huangshan University, Huangshan, 245041 China)
Abstract: This experiment does not require general animal anatomy which needs muscle removing. By the transparency bone staining,we can made Trimeresurus stejnegeri, which bone are weak and thin, into a transparent skeleton specimen .We use Alcian Blue (Alcian Blue 8GS) and Alizarin Red (Alizarin Red S) respectively staining of the processed Trimeresurus stejnegeri cartilage and bone. Then we decolorize the bones by alcohol and make them transparent with glycerin. So that all the bones of the snake are displayed without any injury, then we can understand the snakes biomorphic and the skeletal structure, which provided scientific information for the study.
Key Words: Trimeresurus stejnegeri; transparent specimens; bone; Osteology
1 引言
1.1 福建竹叶青的基本特征
据赵尔宓《中国蛇类》（2006）介绍，福建竹叶青蛇Trimeresurus stejnegeri是头侧有颊窝的管牙类毒蛇。头呈三角形，与颈区分明显，头背都是小鳞，只有鼻间鳞与眶上鳞略大；躯体粗细正常，尾具缠绕性。通身以绿色为主，尾背及尾尖焦红色。俗名：小青蛇、小青虫、刁竹青、白线连、金线连、红线连、红眼睛、青竹蛇、青竹丝、蓝牙蛇等。
头背都是小鳞片，眼与鼻孔之间有夹窝，第一上唇被鳞沟与鼻鳞完全分开，尾具缠绕性，且较短。上鄂骨具管牙，有颊窝，体型中等，尾部占全长的1/5左右。体侧常有一条由红白各半的或白色的背鳞缀成的纵线。眼与鼻孔之间有颊窝，尾较短，具缠绕性，头背都是小鳞片，鼻鳞与第一上唇鳞被鳞沟完全分开；躯干中段背鳞19～21行；腹鳞150～178；尾下鳞54～80对。据《四川爬行类原色图鉴》介绍：发现于山区溪边、草丛中、灌木中、岩壁上或石上、竹林中、路边枯草上、田埂草丛中。多见于阴天活动，晴天傍晚也可见到，以傍晚和夜间最为活跃。食性广泛，有记载的如：蛙、蝌蚪、蜥蜴、鸟、鱼、食虫目动物等，卵胎生，怀卵4-5枚。
图1-1 福建竹叶青图（来自（引自《中国蛇类》赵尔宓摄）
1.2 福建竹叶青的分类地位
竹叶青蛇是管牙类毒蛇，有夹窝，东南亚国家分布广泛. 福建竹叶青蛇的分类
动物界：Fauna
脊椎动物门：Chordat
爬行纲：Reptilia
有鳞目：Squamata
蛇亚目：Serpentes
蝰科：Viperidae
竹叶青属：Trimeresurus
福建竹叶青：Trimeresurus stejnegeri
1.3 福建竹叶青的地理分布
福建竹叶青蛇的地理分布：福建、安徽、四川、广东、广西、湖南、湖北、贵州、海南、河南、甘肃、吉林、台湾、江苏、江西、浙江等省。分布图如
北京
中国
台湾
海南
图1-2 福建竹叶青蛇的分布图
1.4 文献回顾
据陈斌、王跃（2002）介绍，脊椎动物骨骼研究是动物运动生理的重要内容，在动物系统学中则用于解决动物各分类单元间的系统关系，其中标本的制作非常关键，标本的优劣直接影响研究的可靠性。通常有三种方法：X光片法、解剖学方法和透明骨骼染色法。而透明骨骼染色法因制法简单，易于识别软硬骨，成本低，所以国外广泛使用，但在国内则应用较少。
透明骨骼标本在教学和科研上都有很大的价值，它更具有直观性。小型的脊
感。它不经一般的解剖，就可了解动物的骨骼构造，提供准确的数据。在国外普遍使用，Webb GN，ById RA（1994）就用此法对动物的软骨和骨进行了研究。目前国内在透明骨骼标本方面也有研究，如刘万胜等（2008）研究了青蛙骨骼染色透明标本的制作及应用，唐国华等（1995）介绍了快速制作胚胎骨骼透明标本的方法，赵荧和张栩胤（2006）在整体显示大鼠骨骼和软骨的复合染色法等方面做了研究等。但国内的研究还比较少，而且这些研究没有广泛应用到相应的教学当中。
作者通过对福建竹叶青蛇进行透明，之后采用阿利辛蓝（A lcian Blue 8GS）和茜素红（A lizarin Red S）对软骨和硬骨染色，经过脱色，使蛇的全部骨骼在不受任何损伤的情况下清楚的展现出来。
2材料和方法
2.1 材料
2.1.1 材料的选择
选小型完整的活体或死去不久的脊椎动物。材料的形体不宜过大，如蛇40cm，鱼10cm，其它哺乳类小动物为10cm左右为宜。制作透明骨骼标本要求材料体型小，这样做出的标本效果好，透明度高。
本实验所用的福建竹叶青蛇产自屯溪区，长67cm，重44g。
2.1.2 药品与器材
药品：阿利辛蓝、酒精、茜素红、氢氧化钾、蒸馏水等
固定液：75%酒精；
软骨染色液：20mg阿利辛蓝，60ml无水乙醇和40ml冰乙酸；
硬骨染色液：5mg茜素红加100ml蒸馏水；
脱色液：梯度酒精（25%、50%、75%、100%）；
透明液：0.3 mol/L氢氧化钾溶液；
保存液：100%丙三醇溶液。
器材：小烧杯、玻璃棒、镊子、塑料瓶等。
2.2 方法
2.2.1 制作的步骤
除内脏、眼睛和有色素沉着的结缔组织。解剖后用清水将蛇清洗干净。
2）固定：把处理好的福建竹叶青蛇整理好姿势后浸在95%的酒精中进行固定。固定的时间根据材料的大小而定，一般为1天左右，直至透明骨骼标本硬化固定充分为宜。
3）透明：将固定好的透明骨骼标本剥去蛇皮，放入蒸馏水中清洗、浸泡半天，取出后浸入0.3 mol/L的氢氧化钾溶液中透明。浸泡时间根据材料的大小而定，待肌肉半透明能隐约看到里面的骨骼就要停止透明。
4）软骨染色：将经过透明的骨骼标本用蒸馏水清洗2~3次，放到软骨染色液中染色。软骨染色液按20mg阿利辛蓝，60ml无水乙醇和40ml冰乙酸的比例配制。这一过程需要2天左右，期间要注意观察。
5）脱色：将骨骼标本置于升序梯度脱色液中进行脱色处理，每24小时左右换一次梯度脱色液，期间注意颜色变化，至肌肉变成白色为止。这一过程需要4天左右的时间。
6）硬骨染色：将脱色后的透明骨骼标本取出，先用清水清洗2~3次,然后放入硬骨染色液中进行染色。硬骨染色液按100ml水加入5mg茜素红的比例配制。这一过程需要2天，期间要注意观察。
7）脱色：将染好的竹叶青骨骼标本依次浸泡于升序梯度脱色液中，每24小时更换一次梯度透明液，直至硬骨以外的颜色全部脱掉为止。
8）保存：将透明骨骼标本缚于玻璃板上，用相机拍照。选择大小合适的标本瓶，用100%甘油浸泡，瓶口用防水不干胶密封。
2.2.2 观察与摄像
利用放大镜进行福建竹叶青蛇的体型及骨骼观察；利用数码相机，定期对标本进行拍照.
3结果
制好的建竹叶青蛇透明骨骼标本肌肉无色透明，硬骨为红色，软骨为蓝色，易于识别，界限清晰，弥补了传统解剖方法的不足，能提供传统解剖不易得到的信息。
图3-1 福建竹叶青蛇的头部透明骨骼
图3-2 福建竹叶青蛇头部模式图
图3-4 福建竹叶青蛇脊柱图
图3-5 福建竹叶青蛇脊柱模式图
肋骨
脊柱肋软骨
由上图3-1至图3-6观察可知:福建竹叶青蛇的骨骼系统主要由头骨、脊柱和肋骨组成。
福建竹叶青蛇的头骨由颅骨和咽骨组成。
颅骨组成:顶骨一块，基蝶骨一块，上枕骨一对,外枕骨一对,基枕骨一块，前耳骨一对,鼻骨一对，前额骨一对，额骨一对，后额骨一对。
咽骨组成：上领前上领骨一块，上领隔骨一块，犁骨一对，胯骨一对，翼骨一对，方骨一对，鳞骨一对，齿骨一对,上隅骨一对,隅骨一对,夹板骨一对,耳柱骨一对。所有硬骨均被染成紫红色。颅内软骨、鼻间软骨等被染成蓝色。
脊柱位于身体的背部正中,它是由一连串的椎骨所组成,从前至后可分为衰椎、枢椎、躯椎及尾椎四部分。脊柱被染成紫红色。
肋骨为细长而弯曲的弓状骨，左右成对，躯推肋骨的长短，大小不一。前部最短小，渐次增大，至中部最粗长，后部又渐次短小。肋骨被染成紫红色，边缘的软骨被染成蓝色。
4讨论
4.1 实验心得
本文所用骨骼染色方法与以往国内所用的有所不同，所用药品更少，也更简单，有利于缺乏设备药品的学校进行生物教学与研究。此方法也可以用于蝾螈、鲫鱼、蟾蜍及小白鼠的骨骼标本制作，也可用于动物血液系统及内脏器官的研究，对脊椎动物的胚胎发育、解剖的研究有很大帮助。
在染色前，标本应除去皮肤、内脏和皮下脂肪组织，此操作在进行时要尤其仔细，清除的不够彻底，会造成染色的不均匀，很难达到最佳染色结果。在试验中，溶液浓度的控制还有浸泡时间的控制要把握好，以免损毁组织和破坏骨骼。染色全程中随时注意颜色变化，适可而止，不然会影响组织的脱色操作，达不到预期的透明效果。
4.2 透明骨骼的优点
随着生物学, 特别是生物动物学的发展, 对动物学的实验教学提出了越来越高的要求。透明骨骼实验操作简单，药品成本低，操作时间短，得到的骨架没损伤，传统解剖方法得到的骨架容易出现磨损，而且一个人可以同时进行多个动物的透明骨骼制作，弥补了传统解剖方法的不足；形象生动的显示了较小动物的骨骼和肌肉的准确分布，能得到完整的生物构架，解决了较小动物解决的难题，而
参考文献
陈斌，王跃招．介绍一种透明骨骼标本染色法．生物学通报，2002，37（4）：57．
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刘万胜，黄明辉，刘力华，郑登秀．青蛙骨骼染色透明标本的制作及应用，现代预防医学，2008，35（9）：1700-1771．
唐国华，申家兴，唐运莲．快速制作胚胎骨骼透明标本法．衡阳医学院学报，1995，23（1）：
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唐子英，唐子明，唐庆瑜．脊椎动物标本制作．复旦大学出版社，1985．
杨安峰．硬骨-软骨双染色法．动物学杂志，1987，22（2）：40-4．
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Webb, G.N., ById, R.A., Simultaneous differential staining of cartilage and bone in rodent letues: alI Alcian blue an d Alizarin red S procedure without glacial acetic acid. Bioteehnol Histoehem, 1994, 69 (2): 181-185.
致谢
本文的研究工作是在黄田老师指导下完成的。黄老师以其严谨、务实、负责的治学态度，平易近人的工作作风和高度的责任心与敬业精神深刻地感染并影响着我。
感谢黄老师在我的学习中给予的指导和教诲，我从他的身上学到了很多宝贵经验，这对我来说是一身受用的宝贵财富。和蔼亲切的性格使他成了我的良师益友，在以后的学习和生活中我一定会秉承黄老师的优良作风，努力把我在老师身上和黄山学院的所学到的知识和经验用到以后的工作生活中。
在课题研究过程中，黄松教授和黄山蛇园研究所提供了本实验的材料和良好的科研环境，在此表示由衷的感谢。