大肠杆菌在发酵型酸牛奶生长繁殖浅谈
摘要：本文以发酵乳作为基础，其中添加一定浓度的以大肠杆菌为典型菌的大肠菌群，用以研究大肠杆菌在发酵乳中的生长情况。
关键词：大肠杆菌发酵型酸牛奶生长情况
一引言：
发酵型酸牛奶大致可以分为三个品类：第一类是满足营养需求的基础酸奶；第二类是满足美味休闲的大果粒、谷物酸奶；第三类是健康功能酸奶，如通畅、免疫、儿童成长等。其中基础酸奶的市场规模占60%以上，果粒（谷物）酸奶和功能性酸奶的市场规模相对较低。
因大肠杆菌对产品存在着污染隐患，现阶段没有相关文献说明大肠杆菌在发酵型酸牛奶中生长繁殖情况，为此，本文就大肠杆菌在发酵型酸牛奶生长情况进行了评述。
二术语和定义：
1.大肠菌群：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.发酵乳fermented milk：以生牛（羊）乳或乳粉为原料，经杀菌、发酵后制成的pH 值降低的产品。
3.大肠杆菌：广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在4
4.5℃发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP实验、柠檬酸盐）生化实验为++--或-+--的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。
三设备及试剂：
1.温箱:36±1度
2.冰箱:2-5度
3.恒温水浴:46±1℃
4.天平：感量0.01g
5.均质器
6.振荡器
7.无菌培养皿:直径为90mm
8.无菌吸管：1ml(具0.01ml刻度)
9.无菌锥形瓶:容量为500ml
10.移液器：20-200ul
培养基和试剂:
1.结晶紫中性红胆盐琼脂
2.煌绿乳糖胆盐肉汤
3.无菌生理盐水
4.无菌1mol/lNaOH和1mol/lHCL
四实验方法
1 收集发酵型酸牛奶，以大肠杆菌作为大肠菌群的典型菌落，其中添加10ml的复溶大肠杆菌(菌种编号为CCTCC AB91112)于样品中；
2 进行震荡混匀，36℃培养24小时后待检；
3 每隔24小时进行检测1次大肠菌群，同时检测样品的酸度和PH值；
4 具体操作步骤:
（1）称取25g混匀样品于25ml装有玻璃珠的无菌生理盐水中，用无菌1mol/lNaOH和1mol/lHCL调节PH在6.5-7.5之间，制成1:1稀释液。
（2）取2份2ml稀释样品接种2个无菌平皿（1:1稀释时，每皿2ml等同于吸取原液1ml）,同时，分别取2ml生理盐水加入两个无菌平皿作空白对照。
（3）及时将18-20ml冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)倾注于每个平皿中。小心选择平皿，待培养基于样品溶液充分混匀，凝固后，按照GB 4789.3—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》第二法大肠菌群平板计数法再加
3ml-4mlVRBA 覆盖平板表层，翻转平板，置于36℃±1℃培养18-24h。
（4）同时取待检样品若干检测样品的酸度和PH值。
5 证实实验
从VRBA平板上提取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于10个BGLB肉汤管内，36±1℃培养14-48h,观察产气情况，凡BGLB肉汤管产气，即报告为大肠菌群阳性。四.检测结果及分析：
注：1-5#样品为友芝友桶装酸牛奶
表1：大肠菌群的检测结果
图1：酸度的变化情况
图2：大肠菌群的检测结果
依据以上实验数据可知：
1、当发酵乳中含有大肠菌群时，大肠菌群产酸，导致样品中酸度升高，PH值降低。
2、当发酵乳中含有大肠菌群时，随着时间的推移，待测样品的大肠菌群的数量急剧递
减，直至减少为无菌落生长。
参考文献
[1] 依据国标GB4789.3-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》中第二法大肠菌群平板计数法
蒙牛乳制品武汉有限责任公司徐俊兰
大肠杆菌发酵经验总结 首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。 其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。 第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。 第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。 大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下几点，并作出相应解决措施。 一、代谢副产物-乙酸 乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。 预防乙酸产生的措施： 1、通过控制比生长速率来减少乙酸的产生： 比生长速率越高，乙酸产生越多，当比生长速率超过某个值时，乙酸开始产生。可以通过降低温度，调节酸碱度，控制补料等方法来降低比生长速率。 2、透析培养： 在大肠杆菌的培养过程中可以用透析技术除去发酵液中的有害物质，降低乙酸含量从而实现重组菌的高密度发酵和产物的表达。 3、控制葡萄糖的浓度： 葡萄糖是大肠杆菌发酵过程中重要的碳源之一，用其作碳源是要将其控制在一个较低的水平上，以减少乙酸的产生。 常用的控制方法主要有： 恒pH法：大肠杆菌会代谢葡萄等产生乙酸，使pH 值下降。因此可通过pH值的高低作为控制葡萄糖的指标，该法的缺点是pH 的变化不完全是由葡萄糖代谢的结果，容易造成补料体系出错。恒溶氧法：菌体代谢时会消耗氧，使溶氧下降，当葡萄糖浓度低到一定程度时菌体代谢下降，消耗氧能力下降，溶氧上升。因此，根据溶氧曲线补加葡萄糖，保持溶氧恒定，可以控制葡萄糖在一定的水平。 二、温度 大肠杆菌发酵最适温度是37 C，当温度最适菌体生长时，比增长速率将会增大。随温度上升细
大肠杆菌培养 一、菌种冻存液的制备 含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。 二、培养基制备 LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4） 液体培养基 胰化蛋白胨 10.0g 酵母粉 5.0g 氯化钠 10.0g 水 1000ml pH 7.4 固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂 三、平板的制备 1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。 2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。所有锥形瓶如上述操作。用记号笔注明培养基名称、配制日期。 4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。 5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。 四、接种大肠杆菌 1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。 3）因实验一般都要求挑取单菌落，故涂平板适应考虑冻存液内细菌数量，若菌量过大应适当稀释。一般方法一获得单菌落的可能性比较大。涂平板应在酒
大肠杆菌在发酵型酸牛奶生长繁殖浅谈 摘要：本文以发酵乳作为基础，其中添加一定浓度的以大肠杆菌为典型菌的大肠菌群，用以研究大肠杆菌在发酵乳中的生长情况。 关键词：大肠杆菌发酵型酸牛奶生长情况 一引言： 发酵型酸牛奶大致可以分为三个品类：第一类是满足营养需求的基础酸奶；第二类是满足美味休闲的大果粒、谷物酸奶；第三类是健康功能酸奶，如通畅、免疫、儿童成长等。其中基础酸奶的市场规模占60%以上，果粒（谷物）酸奶和功能性酸奶的市场规模相对较低。 因大肠杆菌对产品存在着污染隐患，现阶段没有相关文献说明大肠杆菌在发酵型酸牛奶中生长繁殖情况，为此，本文就大肠杆菌在发酵型酸牛奶生长情况进行了评述。 二术语和定义： 1.大肠菌群：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 2.发酵乳fermented milk：以生牛（羊）乳或乳粉为原料，经杀菌、发酵后制成的pH 值降低的产品。 3.大肠杆菌：广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在4 4.5℃发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP实验、柠檬酸盐）生化实验为++--或-+--的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。 三设备及试剂： 1.温箱:36±1度 2.冰箱:2-5度 3.恒温水浴:46±1℃ 4.天平：感量0.01g 5.均质器 6.振荡器 7.无菌培养皿:直径为90mm 8.无菌吸管：1ml(具0.01ml刻度) 9.无菌锥形瓶:容量为500ml 10.移液器：20-200ul 培养基和试剂: 1.结晶紫中性红胆盐琼脂 2.煌绿乳糖胆盐肉汤 3.无菌生理盐水 4.无菌1mol/lNaOH和1mol/lHCL 四实验方法 1 收集发酵型酸牛奶，以大肠杆菌作为大肠菌群的典型菌落，其中添加10ml的复溶大肠杆菌(菌种编号为CCTCC AB91112)于样品中；
★根据能否进行有性繁殖，可将酵母菌分为： ●假酵母：只有无性繁殖过程。 ●真酵母：既有无性繁殖，又有有性繁殖过程。 1、芽殖 是yeast无性繁殖的主要方式。 一个酵母能形成的芽数是有限的，（平均24个） 出芽方式： 多边出芽、两端出芽、三边出芽、单边出芽。 环境适宜时，可出现假菌丝 芽殖过程： 母细胞形成小突起（A—D） 核裂（E—G） 原生质分配（H—I） 新膜形成（J—K） 形成新细胞壁（L） 出芽痕和诞生痕： 酵母出芽繁殖时，子细胞与母细胞分离，在子、母细胞壁上都会留下痕迹。在母细胞的细胞壁上出芽并与子细胞分开的位点称出芽痕，子细胞细胞壁上的位点称诞生痕。由于多重出芽，致使酵母细胞表面有多个小突起。 ◆芽痕 ◆假菌丝: Saccharomyces cerevisiae的芽殖过程 有的酵母菌进行芽殖后，长大的子细胞不与母细胞立即分离，并继续除芽，细胞成串排列，这种菌丝状的细胞串就称为假菌丝。假菌丝的各细胞间仅以狭小的面积相连，呈藕节状。而霉菌的菌丝为真菌丝，即相连细胞间的横隔面积与细胞直径一致，呈竹节状的细胞串，称为真菌丝。 借细胞横分裂法繁殖,与细菌类似.如Schizosaccharomyces octosporus（八孢裂殖酵母）。进行裂殖的酵母菌种类较少. 2、裂殖； 掷孢子（ballistospore）是掷孢酵母属等少数酵母菌产生的无性孢子，外形呈肾状。这种孢子是在卵圆形的营养细胞上生出的小梗上形成的。孢子成熟后通过一种特有的喷射机制将孢子射出。因此，如果用倒置培养皿培养掷孢酵母并使其形成菌落，则常因其射出掷孢子而可在皿盖上见到由掷孢子组成的菌落模糊镜像。 此外，有的酵母如Candida albicans等还能在假菌丝的顶端产生厚垣孢子。产生掷孢子等无性孢子 适宜的条件下，二倍体细胞减数分裂形成子囊孢子殖。 1、有性繁殖的过程：一般通过邻近的两个性亲和性不同的细胞各自伸出一根管状的原生质突起，随即相互接触、局部融合并形成一个通道，再经过质配、核配形成双倍体细胞——接合子。接合子进行减数分裂，形成4个或8个子核，每一个子核和周围的细胞质一起，在其表面形成孢子壁后就形成子囊孢子，形成子囊孢子的细胞称为子囊。一般一个子囊可产生4-8个子囊孢子。孢子数目、大小、形状因种而异。 酵母的二倍体营养体细胞
大肠杆菌发酵经验总结-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1
大肠杆菌发酵经验总结 大肠杆菌发酵经验总结 首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。 其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。 第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。 第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，p H偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。 大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，现总结以下几点，并作出相应解决措施。 一、代谢副产物-乙酸 乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当
酵母菌 在我们的日常生活中，几乎天天都离不开酵母菌。为了让学生对酵母菌有一个全面的了解，本文将有关酵母菌的知识做一个简单的汇总。 1酵母菌的分布 酵母菌在自然界中分布很广，尤其喜欢在偏酸性、温暖潮湿且含糖较多的环境中生长。例如，在水果、蔬菜、花蜜的表面和果园土壤中最为常见，因而有人称其为糖菌。在牛奶和动物排泄物中也可找到。但它们既怕过冷又怕过热，所以市场上出售的鲜酵母一般要保存在10℃~25℃之间。 2酵母菌的形态、大小、结构 酵母菌是一种显微镜下可见的单细胞微生物，是微生物王国中的“大个子”，细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠型、椭圆形、柠檬形或藕节形等。酵母菌细胞核与细胞质有明显的分化，个体直径比细菌大几倍到十几倍。一般为1~5μm×5~30μm，最长的可达100μm。酵母菌无鞭毛，不能游动。 酵母菌属于真核生物，具有典型的真核细胞结构，有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体、核糖体等，有的还具有微体，如白假丝酵母。酵母菌细胞壁的厚度为25~70nm。重量约
占细胞干重的25%，主要成分为葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和几丁质(总共超过90%)。 3酵母菌的分类、生态学地位 酵母菌不是分类学上的名称，而是一个形态学类群，酵母菌只是一个俗称，是指以芽殖为主，并大多数为单细胞的一类真菌，在分类上大部分属于真菌门的子囊菌纲，也有一些属于半知菌纲，如假丝酵母。已知的酵母菌有370多种。 从生态系统的成分上看，除个别酵母菌营寄生生活外，绝大多数酵母菌能利用无生命的有机物或从死亡的机体及残余部分获取能
量，因此在生态系统中属于分解者，在生态系统的物质循环中起到非常重要的作用。 4酵母菌的代谢 由于酵母菌只能利用现成的有机物，因此在同化作用方面属于异养型。在异化作用方面，酵母菌属于兼性厌氧型生物。有氧气存在时，酵母菌可通过有氧呼吸，把糖类分解成二氧化碳和水，并获得较多能量；在无氧环境下，酵母菌又可以通过无氧呼吸，把糖类分解成酒精和二氧化碳，无氧呼吸产生的能量较少。 5酵母菌的应用 工业酿酒就是利用酵母菌的无氧呼吸原理，在无氧条件下通过酵母菌的无氧发酵把果汁或麦芽汁酿制成美味可口的酒类。另外，它还能使面粉中游离的糖类发酵，产生二氧化碳气体。在蒸煮过程中，二氧化碳受热膨胀，于是馒头就变得松软，所以被称为发酵之母。 利用酵母菌发酵还可以生产维生素、有机酸、脂肪等。也可以从酵母菌细胞中提取多种贵重药物，如核苷酸、辅酶A、细胞色素c、凝血质、核黄素等等。自1980年以来，酵母菌一直被用来大规模生产人、动物以及植物来源的蛋白质。 在基因工程中，可以将酵母菌的染色体改造后作为运载体，携带目的基因进入受体细胞。但是与其他环状质粒载体不同的是，酵
大肠杆菌发酵经验总结 大肠杆菌发酵经验总结 首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。 其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。 第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。 第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。 大家讨论得较多的是关于代副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，现总结以下几点，并作出相应解决措施。 一、代副产物-乙酸 乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。 预防乙酸产生的措施：
课程设计说明书 课程名称：发酵工程 设计题目：大肠杆菌的高密度发酵 院系：生物与食品工程学院 学生姓名：****** 学号：201006030051 专业班级：10生物工程（2）班 指导教师：*****
课程设计任务书设计题目大肠杆菌的高密度发酵 学生姓名所在院系生物与食品工 程学院 专业、年级、班10生物工程 设计要求： 1、树立正确的设计指导思想，严谨负责、实事求是、刻苦钻研、勇于探索的作风和学风。 2、根据所给资料，按照任务书中提出的范围和要求按时独立完成，不得延误，不得抄袭他人成果。 3、说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。 4、设计标准要求规范、实用、切合实际。 5、设计应严格按有关设计规范进行。 6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。 学生应完成的工作： 1、明确设计标准适用的范围，给出产品以清晰明确的定义。 2、确定引用标准和技术要求，确定特定的理化指标及标准。 3、确定理化指标所采用的测定方法，一般首选国标或公认经典方法。新方法需经多试验或单一实 验法验证。 4、给出检验规则。 5、对产品的外观、流通保藏过程中操作给出规范。 参考文献阅读：[1] Fuchs C, Koste D, Wiebusch S, et al. Scale-up of dialysis fermentation for high cell densityCultivation of Escherichian coji[J]。Biotechnol, 2002, 93: B. 2002, 93: 243~251 [2] 刘子宇，李平兰，郑海涛等.微生物高密度培养的研究进展[J].中国乳业，2005，12:47~51 [3] Riesenberg D. High cell-density cultivation of Escherichian coli. Curr. Opin. Biotechnol.1991，2: 380~384 工作计划： 2013.5.27----2013.5.30 接受设计任务，查阅相关文献。 2013.5.30----2013.6.3 整理文献资料，进行产品标准的应用设计。 2013.6.3— 2013.6.9 整理设计内容，完成课程设计报告。 任务下达日期：2013年5月27日 任务完成日期：2013年6月9日 指导教师（签名）：学生（签名）：
大肠杆菌发酵经验总结 首先， 补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响）所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果 。 其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制p H值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。 第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导， 1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达； 2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。 第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，p H偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易形成较低的p H，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比. 温度对大肠杆菌的影响:大肠杆菌发酵最适温度是37 C，当温度最适菌体生长时，比增长速率将会增大。随温度上升细菌代谢加快，其产生代谢副产物也会增加。这些副产物会对菌体的生长产生一定的抑制作用。菌体生长过快也会影响质粒的稳定性。降低培养温度，菌体对营养物质的摄取和生长速率都会下降。同时也减少了有毒代谢
酵母菌 酵母菌的特点： 是一类单细胞真菌的统称，多数出芽繁殖少数裂殖或产子囊孢子，能发酵糖类产能，细胞壁含葡聚糖和甘露聚糖，喜含糖量高，酸性的水生环境下生长 酵母菌包括：线粒体，芽体液泡，芽体，核，液泡膜，细胞壁，细胞膜 酵母菌细胞壁：外层为甘露聚糖，内层为葡萄糖，其间夹有蛋白质分子 酵母菌细胞膜功能： 用以调节细胞外溶质运送到细胞内的渗透屏障；细胞壁等大分子成分的生物合成装配基地；部分酶的合成和作用场所 酵母菌其他细胞构造： 液泡：储藏含有营养物和一些水解酶，金属离子，也可以调节细胞的渗透压 线粒体：富含参与电子传递和氧化磷酸化的酶，是进行氧化磷酸化的细胞器 微体：存在于有些酵母菌中 酵母菌的繁殖方式: 无性生殖： 芽殖：主要的无性繁殖方式，成熟细胞长出一个小芽，到一定程度后脱离母体继续长成新个体。 裂殖：少数酵母菌可以象细菌一样借细胞横割分裂而繁殖，例如裂殖酵母。 有性生殖：酵母菌以形成子囊和子囊孢子的形式进行有性繁殖 1.两个性别不同的单倍体细胞靠近，相互接触 2.接触处细胞壁消失，质配 3.核配，形成二倍体核的接合子 酵母菌生活史的三种类型： 营养体以单倍体/双倍体两种情况存在 营养体只以单倍体存在 营养体只以双倍体存在 营养体以单倍体/双倍体存在的特点： a.一般情况下都以营养体状态进行出芽繁殖； b.营养体既可以单倍体形式存在，也能以双倍体形式存在； c.在特定条件下进行有性繁殖； 营养体以单倍体存在的特点：a. 营养细胞为单倍体；b.无性繁殖以裂殖方式进行； c.二倍体细胞不能独立生活，故此阶段很短； 营养体以双倍体存在的特点：a.营养体为二倍体，不断进行芽殖，此阶段较长；b.单倍体的子囊孢子在子囊内发生结合；c.单倍体阶段仅以子囊孢子形式存在，故 不能进行独立生活 霉菌 霉菌概念：菌丝体发达，绒毛状、网状或絮状，不产生大型子实体的真菌通称为霉菌。 真菌营养体的基本单位是菌丝。霉菌菌丝直径约为2~10 m，比一般细菌和放线菌菌丝大几到几十倍。 菌丝可分为营养型菌丝和气生菌丝。 密布在营养基内部主要执行吸取营养物功能的菌丝称为气生菌丝。 伸展到空气中的菌丝体称为气生菌丝。 霉菌的繁殖方式：无性孢子，有性孢子，菌丝断片 无性孢子生殖：不经两性细胞配合，只是营养细胞的分裂或营养菌丝的分化（切割）而形成新个体的过程。 无性孢子有：厚垣孢子、节孢子、分生孢子、孢囊孢子等。 有性孢子生殖： 霉菌有性孢子繁殖的特点： a）霉菌的有性繁殖不如无性繁殖那么经常与普遍，多发生在特定条件下，往往在自然条件下较多，在一般培养基上不常见。 b）有性繁殖方式因菌种不同而异，有的两条营养菌丝就可以直接结合，有的则由特殊的性细胞（性器官）--------配子囊或由配子囊产生的配子来相互交配，形成有性孢子。c）核配后一般立即进行减数分裂，因此菌体染色体数目为单倍，双倍体只限于接合子。 d）霉菌的有性繁殖存在同宗配合和异宗配合两种情况。 e）霉菌的有性孢子包括接合孢子、卵孢子、子囊孢子等 霉菌生活史： 无性繁殖阶段：菌丝体（营养体）在适宜的条件下产生无性孢子，无性孢子萌发形成新的菌丝体，多次重复 有性繁殖阶段：在发育后期，在一定条件下，在菌丝体上分化出特殊性器官（细胞），质配、核配、减数分裂后形成单倍体孢子，再萌发形成新的菌丝体。 霉菌的代表：毛霉，根霉，曲霉，青霉 毛霉属： 特征：低等真菌，菌丝发达、繁密，为白色、无隔多核菌丝，为单细胞真菌。菌落蔓延性强，多呈棉絮状。 代表种：高大毛霉、总状毛霉和梨形毛霉。 繁殖： 无性繁殖：产孢囊孢子。 有性繁殖：产生接合孢子。 应用： 能产生蛋白酶，具有很强的蛋白质分解能力，多用于制作腐乳、豆豉。 有的可产生淀粉酶，把淀粉转化为糖。在工业上常用作糖化菌或生产淀粉酶。 有些毛霉还能产生柠檬酸、草酸等有机酸，有的也可用于甾体转化。根霉应用：①根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产这些酶类的菌种。在酿酒工业上常用做糖化菌。②有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸。③有的也可用于甾体转化。曲霉属: 繁殖：无性繁殖产分生孢子；大多数有性阶段不明，归为半知菌类。少数种可形成子囊孢子，归为子囊菌亚门。曲霉的菌丝、孢子常呈现各种颜色，黑、棕、绿、黄、橙、褐等，菌种不同，颜色各异。 应用： ①是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。 ②是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。 ③生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等） ④农业上用作生产糖化饲料的菌种。 青霉的应用： 是生产抗生素的重要菌种， 如产黄青霉和点青霉都能生产青霉素。 生产有机酸，如葡萄糖酸、柠檬酸。 霉菌孢子与细菌芽孢的比较： 黄曲霉素的去除：强碱去除，淘洗去除，活性炭吸附，排除破碎的花生粒 青霉素发明者、英国科学家弗莱明爵士 真核微生物的特征：细胞核具有核膜；能进行有丝分裂；细胞质中存在线粒体或同时存在叶绿体等细胞器； 真核生物与原核生物的比较： 真核微生物包括：真菌，显微藻类，原生动物 真菌包括：覃菌，霉菌，酵母菌 真菌的特点： 1、细胞质中含有线粒体但没有叶绿体，不进行光合作用，无根、茎、叶的分化； 2、以产生有性孢子和无性孢子二种形式进行繁殖； 3、营养方式为化能有机营养（异养）、好氧； 4、一般具有发达的菌丝体；
资料14-1酵母菌的生殖方式 (1) 资料14-2几种促进插枝生根的生长调节物质及其使用方法 (2) 资料14-3果树为什么要用嫁接方法生殖而不用种子生殖 (3) 资料14-4植物组织培养在生产实践上的应用 (3) 资料14-5仙人掌类的嫁接 (5) 资料14-6无性生殖的种类 (6) 资料14-7削取不带木质部的芽接接穗的方法 (6) 资料14-8水螅的生殖 (7) 资料14-1酵母菌的生殖方式 酵母菌多数为单细胞，呈卵圆形或圆柱形，比细菌大得多，直径大约为5～6μm。酵母菌具有细胞壁、细胞膜、细胞核、液泡、线粒体及各种贮藏物质。酵母菌的生殖方式有多种类型，下面介绍几种有代表性的生殖方式： 1.无性生殖 芽殖酵母菌主要是通过出芽的方式进行无性生殖。在良好的营养和生长条件下，酵母菌生长迅速。这时可以看到所有细胞都长有芽体，而且在芽体上还可形成新的芽体，所以经常可以见到呈簇状的细胞团。芽体的形成过程是这样的：在母细胞形成芽体的部位，由于水解酶对细胞壁多糖的分解，使细胞壁变薄。大量新细胞物质--核质（染色体）和细胞质等在芽体起始部位上堆积，使芽体逐步长大。当芽体达到最大体积时，它与母细胞相连部位形成了一块隔壁。隔壁的成分是由葡聚糖、甘露聚糖和几丁质构成的复合物。最后，母细胞与子细胞在隔壁处分离。于是，在母细胞上就留下一个芽痕，而在子细胞上就相应地留下了一个蒂痕。根据酿酒酵母细胞表面留下芽痕的数目，就可确定细胞曾产生过的芽体数，因而也可用于测定该细胞的年龄。裂殖酵母菌的裂殖与细菌的裂殖相似。其过程是细胞伸长，核分裂为二，然后细胞中央出现隔膜，将细胞横分为两个大小相等的、各具有一个核的子细胞。进行裂殖的酵母菌种类很少。 2.有性生殖 有性生殖的方式是指一般通过邻近的两个性别不同的细胞各自伸出一根管状的原生质突起，随即相互接触、局部融合并形成一个通道，再通过质配、核配和减数分裂，形成4个或8个子核，每一个子核与其附近的原生质一起，在其表
附件 水中大肠杆菌群检测方法－多管发酵法 NIEA E201.54B 一、方法概要 本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ± 1 ℃、 48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水样所 产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。二、适用范围 本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样中大肠杆菌群之检验。 三、干扰 (一) 水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。 (二) 检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。 四、设备 (一) 量筒：100至1000 mL之量筒。 (二) 吸管：有0.1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。 (三) 试管：大小约150 × 15 mm之试管或有盖螺旋试管。 (四) 发酵管（fermentation tube）：大小约22 × 9 mm之玻璃管。 (五) 稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。 (六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。 (七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。 (八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。 (九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0.01 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至0.001 g。
(十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。 (十一) 高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2或 1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。 (十二) 高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在160℃达2小时或170℃达1小时以上者。(十三) 接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。 (十四) pH计：精确度达0.1 pH单位。 五、试剂 (一) 试剂水：蒸馏水或去离子水，导电度在25 ℃时小于2 μ mho / cm（μS / cm）。 (二) 培养基，应使用市售商品化培养基。 １、硫酸月桂酸胰化蛋白胨培养基（Lauryl sulfate tryptose broth，简称LST） 1倍浓度LST培养基含有下列成份： 胰化蛋白胨（Tryptose）20.0g 乳糖（Lactose） 5.0g 氯化钠（NaCl） 5.0g 磷酸氢二钾（K2HPO4） 2.75g 磷酸二氢钾（KH2PO4） 2.75g 硫酸月桂酸钠（Sodium lauryl sulfate）0.1g 试剂水1L 配成2倍浓度（取71.2 g LST培养基粉末溶于1 L试剂水），完全溶解后，分取10 mL注入装有倒置发酵管之试管内，经121℃灭菌15分钟，冷却后备用，灭菌后培养基之pH值应在 6.8 ± 0.2。灭 菌后培养基若未当日使用，应保存在4 ± 2℃，保存期限为14天。可根据检验需求量，依配方配制培 养基。
大肠菌群测定的操作细则 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料 1.1 温箱：36±1℃。 1.2 冰箱:0～4℃。 1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。 1.4 天平。 1.5 显微镜。 1.6 均质器或乳钵。 1.7 平皿:直径为90mm。 1.8 试管。 1.9 吸管。 1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。 1.12 载玻片。 1.13 酒精灯。 1.14 试管架。 2 培养基和试剂 2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。
2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。 2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中 3.22规定。 2.6 生理盐水。 2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。 3 操作步骤 3.1 检样稀释 3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。 3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。 3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。 3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。3.2 乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。 3.3 分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。
大肠杆菌的检测方法 大肠菌群测定的操作细则 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料 1.1 温箱：36±1℃。 1.2 冰箱:0～4℃。 1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。 1.4 天平。 1.5 显微镜。 1.6 均质器或乳钵。 1.7 平皿:直径为90mm。 1.8 试管。 1.9 吸管。 1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。 1.12 载玻片。 1.13 酒精灯。 1.14 试管架。 2 培养基和试剂 2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。 2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。 2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中 3.22规定。 2.6 生理盐水。 2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。 3 操作步骤 3.1 检样稀释 3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。 3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。 3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。
大肠杆菌生长曲线的制备 一、实验目的 1 了解细菌生长曲线特点及测定原理； 2 学习用比浊法测定细菌的生长曲线。 二、基本原理 将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。 测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简便。 三、器材 1菌种：大肠杆菌
2培养基：LB培养基（蛋白胨10g 酵母膏5g Nacl 10g pH7.0~7.2） 3仪器和器具：721分光光度计，比色杯，恒温摇床，无菌吸管，试管，三角瓶。 四、方法与步骤 1种子液制备 取大肠杆菌斜面菌种1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入LB培养基中，静止培养18h作种子培养液。 2标记编号 取11支无菌试管，分别编号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。 3接种培养 吸取2.5ml种子液加入装有60mlLB培养基的锥形瓶中，混匀。分别取5ml加入到11根试管，于37℃下振荡培养。然后分别按对应时间将试管取出，立即放冰箱中贮存，待培养结束时一同测定OD值。 4生长量测定 将未接种的LB培养基倾倒入比色杯中，选用600nm 波长分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0h起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.10.～0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，
3.3 酵母菌的形态与结构 了解：酵母菌与我们的生活关系 理解：酵母菌的结构及与食品发酵的关系 掌握：酵母菌细胞的结构、繁殖方式及在实际中的应用； 1、酵母菌的形态、大小和菌落特征 2、酵母菌的细胞结构 3、繁殖及生活史 4、酵母菌的代表属 1、酵母菌的形态、大小和菌落特征 2、酵母菌的细胞结构 3、繁殖及生活史 1、酵母菌的细胞结构 2、繁殖及生活史 结合生活实践启发式讲授 思考题、课后习题1-10 借助多媒体播放生产视频
复习：1、霉菌的基本结构 2、霉菌的菌落和类型 引入：多媒体啤酒的生产过程视频 第三节酵母菌 酵母菌不是分类学上的名称，是非丝状真菌。酵母菌广泛应用与食品、医药、化工、饲料等各方面，在国民经济中有重要作用。 ①、酿酒，作馒头 ②、医药和化工方面的重要菌种。目前，可利用酵母菌制造酵母片、核糖核酸、核苷酸、核黄素、辅酶A、细胞色素以及脂肪酶、乳糖酶和多种氨基酸等产品。 ③、在以石油为发酵原料制取柠檬酸，反丁烯二酸，脂肪酸的工业中，也应用酵母菌。 ④、在农业生产中可用作发酵饲料。 但是，也由少数酵母菌是发酵工业的污染菌，它们消耗酒精；降低酒精产量或产生不良气味，影响产品质量。少数是高渗透压的酵母菌可使果酱、蜂蜜及蜜饯等食品腐败变质。可见，酵母菌与人类的关系密切。 酵母菌在自然界的分布非常广泛，在很多水果、蔬菜及多种植物的花和果实上都有酵母菌的存在。在果园土壤中酵母菌的含量很多，由于一些水果掉在地上，酵母菌可利用水果的糖分，致使果园中有酒味。 一、酵母菌的形态、大小和菌落特征
酵母的菌体为单细胞。通常为卵圆形，也有的酵母为球形、柠檬形、香肠状和菌丝状等。菌体无鞭毛、不能游动。 酵母菌比细菌的单细胞个体要大的多，约1-5×5-30微米或更长，不同酵母菌的个体差异很大。在工业上常用的酵母菌其平均直径约为4-5微米。 大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起。有的酵母菌培养时间过长时，菌落表面呈皱缩状，菌落多为乳白色，仅有少数呈红色。酵母菌菌落特征是分类鉴定的重要依据。 不同酵母菌在液体培养基中的生长情况也不相同。有的在液体中均匀生长；有的在底部生长，产生沉淀；有的在表面生长，产生菌膜，菌膜的表面状况及厚度也不相同。以上特征对分类也具有意义。 二、酵母菌的细胞结构 酵母菌的细胞结构与其他真菌的细胞结构基本相同。但也有本身特点。 酵母菌结构特点： 1．细胞壁：由外到内依次为甘露聚糖、蛋白质、葡聚糖（与细胞壁强度有关），也有少量类脂和几丁质。 2．细胞膜 细胞膜的功能是：①调节胞外溶质运送到细胞内的渗透屏障；②细胞壁等大分子成分的生物合成和装配基地；③部分酶的合成和作用场所。
大肠杆菌生长曲线的测定 一、基本原理 生长曲线是微生物在液体培养基中所表现出来的生长、繁殖的规律，不同的微生物表现为不同的生长曲线，而即使是同一种微生物在不同培养条件下，其生长曲线也不同。因此测定微生物的生长曲线对于了解，掌握微生物的生长规律是有帮助的。 由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此可利用光电比色计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度。本实验是以活菌计数法与光电比浊法相对应来测定大肠杆菌在不同培养条件下的生长曲线，从而观察分析大肠杆菌在这些培养条件下的生长情况。 二、器材 培养了20小时的大肠杆菌悬液；肉汤蛋白胨培养基（液体、固体）；浓缩的肉汤蛋白胨液体培养基（浓缩5倍）；无菌酸溶液（甲酸：乙酸：乳酸＝3：1：1）。 1毫升及5毫升无菌吸管；无菌试管；无菌生理盐水； 无菌平皿；血球计数器；显微镜；光电比色计；无菌离心管；离心机等。 三、操作步骤 1．将经20小时培养的大肠杆菌培养物，倒入无菌离心管内离心（3000r.p.m×10），以无菌生理盐水洗涤三次后，制成约9亿毫升的菌悬液（用显微镜直接计数法），作为种子。上述过程都必须注意严格无菌操作。 2．取盛有200毫升培养基经灭菌的三角瓶三瓶，分别标明A、B、C，按5%接种量，将上述种子接入，置37℃振荡培养。在B瓶培养了4小时后取出，加入10毫升无菌酸溶液，然后继续振荡培养。在C瓶培养了6小时后取出，加入10毫升无菌浓缩肉汤蛋白胨液，再继续振荡培养。 3．间隔一定时间，即0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20小时后，从A、B、C三角瓶中各取5毫升菌液放于无菌试管中，置冰浴。并作适当稀释，使菌悬液的光密度控制在0.0－0.4范围内，再置光电比色计中进行比浊测定（400－440毫微米波长），用未接种的肉汤蛋白胨液为空白对照。记下光密度值。 另外，A管在比浊测定以前，以无菌操作吸取0.1毫升菌液于肉汤蛋白胨琼脂平板上，用玻璃刮棒涂抹均匀后，置37℃培养30小时后计数。 4．按间隔时间全部测完了以后，以菌悬液光密度值（O.D.）为纵坐标，培养时间为横坐标再绘制一条A培养条件下的生长曲线。 四、思考题 1．比较A、B、C三组生长曲线有什么不同？说明原因，标出A组生长曲线的四个时期的位置及名称。 2．两条A生长曲线有什么不同？为什么？