华南师范大学实验报告
学生姓名：黎嘉俊学号：008
专业：生物工程年级、班级：10工程一班课程名称：生物工程下游技术实验实验项目：黑曲霉β-D甘露聚糖
酶的纯化
实验类型：□验证□设计□综合实验时间：2013年9月17日
实验指导老师：江学文实验评分：
一．实验目的
<
1、粗酶的制备
2、硫酸铵分级沉淀
3、透析袋的处理方法和使用
二．原理
1、盐析原理：中性盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化层逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。
2、透析袋脱盐：酸性β-甘露聚糖相对分子质量为39000和40000，选择MWCO（切割分子量或截留分子量）14000的透析袋，透过掉分子量小于1000的蛋白质；并借助分子扩散脱盐。
三．实验试剂和器材
纱布1卷、脱脂棉1包、琼脂条1包、透析袋MWCO（分子量）7000 [
四．实验步骤
1、将黑曲霉菌株斜面接种三角瓶固体发酵培养基,℃恒温培养
72 h。
2、称取10克发酵麸曲，加100毫升的醋酸缓冲液，温度℃，转速135rpm，摇
床摇60 min后，用￠15㎝滤纸过滤。
3、取滤液40毫升，在不断搅拌下分步加入（NH4）2SO4 克（待加入部分溶解
后再加入剩余部分）。
4、置冰箱中5℃下静止沉淀过夜。
5、标准曲线的绘制：分别吸取%标准甘露糖溶液、、、、，分别定容至50ml。
再分别吸取上述溶液各于试管中各加,5-二硝基水杨酸显色液（DNS试剂），
煮沸5min（另作1管对照，取蒸馏水，加试剂，同样煮沸5min）。冷却后，
用721型分光光度计在530nm波长下比色，记录各管的光密度值，以光密
度作纵坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为横坐标，绘制标准曲线。五．实验结果
（
0.1%标准甘露糖溶液体积/ml0246810 OD100.0970.4150.873 1.254 1.674 OD200.0970.4160.873 1.256 1.674 OD300.0970.4150.874 1.256 1.674 OD平均值00.0970.4153330.873333 1.255333 1.674 OD标准差000.0005770.0005770.0011550
六．分析与讨论
（1）本次实验的第一步是标准曲线的制作，在使用分光光度计测定OD值时发现，加入的%标准甘露糖溶液体积为10ml的比色管的试样测出的OD值略大，正常来说OD值若大于时虽进行稀释否则误差较大。据分析多组的数据显示装有10ml的试样测出的OD值多数超过，可能是试样浓度太大引起，但超出范围较小，在可以接受的范围内，而且曲线的上升趋势仍然正常，没有出现较大程度的偏离，相关系数为，而且图中个点的位置都在标准曲线的附近并没有偏离太多，均匀分布在曲线的两端，结果比较理想，因而该曲线符合实验的要求。
（2）本实验的第二步为转速135rpm，摇床摇60 min后，用￠15㎝滤纸过滤，耗时较长而且效果不太好，可以采用高速离心，转速8000rpm，10min，溶液分层明显，然后直接用滤纸过滤仍然有较好效果，且耗时短，过滤时如遇到过滤较难的情况，可以更换滤纸继续操作。
（3）实验的第三步是取滤液40毫升，在不断搅拌下分步加入（NH4）2SO4 克，待加入部分溶解后再加入剩余部分，否则不能沉淀出绝大多数的蛋白质，影响实验的结果，造成误差。
七．思考题
1、（NH4）2SO4沉淀蛋白质的原理是盐析，与其它盐相比其优点有那些
答：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：①成本低，不需要特别昂贵的设备。②操作简单、安全。③对许多生物活性物质具有稳定作用。
`
中性盐沉淀蛋白质的基本原理：
蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。
常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：
1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。由下表可以看到，硫铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类。2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯
度提高了四倍。
3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L 浓度的（NH4）2SO4保存可达数年之久。
4) 价格便宜，废液不污染环境。
2、影响盐析的因素有那些
~
答：盐析的影响因素①蛋白质的浓度：中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果有较大的影响。通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。对低浓度的蛋白质，要使用更
大的硫酸铵饱和度，但共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低。通常认为比较适中的蛋白质浓度是％～％，相当25mg/mL～30mg/mL。
②pH?值对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变pH?值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH?值常选在该蛋白质的等电点附近。
③温度的影响：温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大，但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进行，但对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失。
{
华南师范大学实验报告
学生姓名：黎嘉俊学号：008
专业：生物工程年级、班级：10工程一班课程名称：生物工程下游技术实验实验项目：盐析β-D甘露聚糖酶
>
活力测定
实验类型：□验证□设计□综合实验时间：2013年9月24日
实验指导老师：江学文实验评分：
一．实验目的
1、掌握β-D甘露聚糖水解各种甘露聚糖之间β糖苷键的机制和理论。。
2、掌握以魔芋精粉为底物测定发酵制品中β-D甘露聚糖活力的操作方法。二．基本原理
水解含B一1，4甘露糖苷键的甘露多糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等)的内切水解酶，属于半纤维素酶类。B一甘露聚糖酶能将广泛存在于豆类籽实中的甘露聚糖降解为甘露低聚糖，不仅消除了甘露聚糖对单胃动物的抗营养作用，同时生成的甘露低聚糖在动物肠道中起着重要的调节作用。
[
三、实验试剂和器材
721型分光光度计、恒温水浴锅、秒表。的醋酸缓冲液
四、实验步骤
1、倾去部分上清液，立即将沉淀部分在4000rpm，离心10min。收集沉淀，加约20毫升蒸馏水溶解，倒入事先准备好的透析袋中。
（透析袋处理：剪成15㎝长度，沸水浴中煮10min，捞起、扯开，在一端1㎝处用细绳扎紧口，用水试一下是否有漏，若有漏需重新绑扎，直至不漏为止。处理过程中需戴手套！）
2、酶液倒入透析袋后，另一端1㎝处也用细绳（应用长一点的！）扎紧口，浸于4～5℃的蒸馏水中（250ml烧杯），持续时间，并不时搅拌，期间每隔20min 更换1次4～5℃的新鲜蒸馏水，以利迅速达到平衡，每次用水量约150毫升。注：1、上端口切不可浸于水中，以免水进入袋中胀破透析袋！
2、透析同时可准备2支50ml的比色管，各加魔芋精粉，加的醋酸缓冲液溶解。操作顺序：先量取的醋酸缓冲液加入比色管，在55℃水浴预热，再分次、少量将魔芋精粉加入，待先加的溶解后再加剩下的！溶解完毕，将2支溶有魔芋精粉的50ml比色管始终置于55℃水浴中预热，等待酶解。
-
3、将透析好的酶液透析袋置于玻璃漏斗上，解开上端口细绳或剪去上端口一部分，但不要使酶液流出！）。
4、2支溶有魔芋精粉的50ml比色管，1支加透析好的酶液2ml；另1支加灭活的透析酶液2ml（用做对照），55℃水浴下反应10 min，取出，立即进行下面操作：事先准备2支50 ml的比色管，1支加DNS试剂，立即加酶解反应液；另1支加DNS试剂，立即加对照管的酶解反应液，2管同时沸水浴5 min后，定容至10ml ,于530 nm处测定光吸收值。
在本实验条件下,定义每10 min产生1 mg还原糖的酶量为一个单位。
（酶液灭活：取5毫升透析酶液置于10 ml的比色管，沸水浴15 min。）五、实验结果
计算β-D 甘露聚糖酶活力 252011.54227
/2520B n B g ml n μ?????----酶活力(u/g 湿基）)=所测吸光度值在标准曲线上的葡萄糖；
测吸光度时比色管定容体积，ml ；
溶解沉淀的体积,ml ；
2-水解消耗的酶液体积；反应液稀释倍数；
4-与盐析沉淀的滤液量相当的曲料量，g （湿基）
… 样本OD值-样本空白OD值OD1
2.523OD2
2.519OD3
2.524OD平均值
2.522OD标准差0.002645751
∵Y=（样本OD 值-样本空白OD 值）=
∴Y=→x=Y/=≈
又∵%标准甘露糖溶液浓度为1mg/ml
∴酶活力（u/g湿基）=×
又∵反应液的稀释倍数n=20/(2/6×=40
B=×1mg/ml×103=16330
∴酶活力（u/g湿基）=×
，
=16330×10×20×40/（2×27）×1/4
≈×108u/g
六、分析与讨论
(1)本次实验是基于第一次实验的标准曲线的基础上进行的，在测量OD值的时候不需要用第一次实验的空白对照，因为测量出来的样本OD和样本空白OD相减能消去空白OD的值，因而可以把样本空白OD作为对照，调零操作，直接能显示样本OD减去样本空白OD的结果作为实验的结果。本次实验测量的结果偏大，有第一台仪器测量能达到，另一台仪器的结果比较合适，为左右，但仍比正常的数值偏大很多，数值不在实验第一步得出的标准曲线上，不在标准曲线的适用范围内的数值的话，带入得出的公式误差会很大。通常测量的OD值取用范围在以内，超过该数值误差比较大，若要再进行实验最好进行稀释，测量得出的OD值再乘以稀释倍数。若直接取用本次的较大的测量数据也能带进公式求出，不过误差较大。
(2)本次实验测量的OD值偏大，经过观察发现比色杯里面有絮状悬浮杂质，而且液体的颜色明显偏深，进行实验之前其实最好进行过滤再进行OD值的测量。而且实验的各组出现的情况也相同，都是OD值偏大，都能上到，可能实验用的酶液的原料也不纯，有杂质等原因。
(3)实验的第二步，酶液倒入透析袋后，浸于4～5℃的蒸馏水中（250ml烧杯），持续时间，并不时搅拌，期间每隔20min更换1次4～5℃的新鲜蒸馏水，以利
迅速达到平衡，因为酶液的处理条件比较温和，尽量在低温条件下处理，以免酶
失活。而且透析的过程中要不断搅拌，这样可以加快铵根离子的排除，减少后面
实验结果的误差，也能缩短实验时间。但是操作的时候要注意，要封好透析袋的
两个口，不能让外面的水进去，否则会引起较大的误差。
七、思考题
1、透析原理及其作用
>
答：透析（dialysis）是通过经过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，作用是将
小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。
2、一般所选用透析液的性质如何在搅拌下，样品液与透析液之比多少较好在静止状态下过夜进行，样品液与透析液之比多少较好
答：
（1）
①理想的透析液流量应该是血流量的两倍，既200-400ml/min的血流量对应400-800ml/min的透析液流量，根据临床实践和对清除率的研究,透析液流量通常设定为500ml/min。
②电导度= (mS/cm)，对应钠浓度=135-145(mEq/l)，经常校正透析机的电导度控制和显示
③pH = ，碳酸氢根= 28-42(mEq/l ) ，定期测定透析液的pH值和碳酸氢根
④为了使病人在透析当中感觉舒适和保持热量平衡，透析器入口处的温度通常保持在℃之间。透析机的保护系统与透析液回路的温度监测计连接，使进入透析器的透析液温度保持在℃之间。
,
（2）在搅拌下进行，样品液与透析液（蒸馏水）体积比为1：10，在静置下进行，样品液与透析液（蒸馏水）体积比为1：20。
{
华南师范大学实验报告
学生姓名：黎嘉俊学号：008
专业：生物工程年级、班级：10工程一班课程名称：生物工程下游技术实验实验项目：酵母RNA的提取及
含量测定（紫外吸收法）
《
实验类型：□验证□设计□综合实验时间：2013年10月8日
实验指导老师：江学文实验评分：
一、实验目的与要求
1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。
2、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法，
3、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。
二、实验原理
由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，
用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调利用等电点沉淀。酵母含RNA达，而DNA含量仅为，为此，提取RNA多以酵母为原料。
}
核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C一C=C-），能够强烈吸收250-280nm 波长的紫外光。核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm 处。遵照Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。
在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。
核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm 波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH 和离子强度发生变化。RNA 溶液（pH = ）的ε（ρ）= 7 700-7 800，RNA 的含磷量为%，含1μg /mL RNA 溶液的光密度为。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可计算测出其中核酸的含量。该法简单、快速、灵敏度高，如核酸3μg/mL 的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小。
蛋白质由于含有芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 波长处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中的蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。
三、主要仪器和试剂
啤酒酵母粉
NaOH溶液
95%乙醇、乙醚、酸性乙醇溶液：30mL乙醇加HCl。
】
紫外分光光度计 离心机
真空干燥箱
三角瓶、烧杯
水浴锅
四、实验步骤
1、称5g 干酵母粉悬浮于30mL NaOH 溶液中，并在研钵中研磨均匀。
2、悬浮液转入三角烧瓶，沸水浴加热30min ，冷却，转入离心管，5000转/分，离心15分钟后，将上清慢慢倾入10mL 酸性乙醇，边加边搅动。
|
3、加毕，静置，待RNA 沉淀完全后，5000r/min 离心3min 。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次。
4、再用乙醚洗涤沉淀一次后，用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA 粗品的重量，
5、纯度测定：将样品配制成含5～50μg 核酸/mL 的溶液，于紫外分光光度计上测定260nm 吸收值，计算核酸浓度和两者吸收比值。
五、计算：
稀释倍数毫升）
浓度（微克??=L D O RNA 024.0./260 为260nm 波长处的光密度读数；L 为比色杯的厚度，一般为1或；为1μgRNA/mL 的光密度；为1μgDNA/mL 的光密度
实验数据如下：
、
滤纸
滤纸+沉淀 沉淀 重量（g ）
（
其中RNA 粗品占沉淀的70%，杂质占沉淀的30%，故RNA 粗品的重量为：
×=
干酵母粉RNA 含量（%）=RNA 重（g ）/干酵母粉重（g ）×100%=5g=%
稀释倍数1=100/= OD 260（1）=
稀释倍数2=100/×200/25= OD 260（2）=
RNA 浓度（微克/毫升）1=OD 260/（×L ）×稀释倍数
=（×1）×=μgRNA/mL
RNA 浓度（微克/毫升）2= OD 260（1）/（×1）×稀释倍数
<
=（×1）×=μgRNA/mL
RNA 纯品的质量（ug ）1=RNA 浓度×RNA 粗品的重量=μgRNA/g ×
=μg
RNA 纯品的质量（ug ）2=RNA 浓度×RNA 粗品的重量=μgRNA/mg ×
=μg
故甘酵母粉中RNA 含量（%）1=%100?）干酵母粉重（）重（g g RNA =%10056^1083.194?-?g
g =×10-3%
~ 故甘酵母粉中RNA 含量（%）2=
%100?）干酵母粉重（）重（g g RNA =%10056^1064.193?-?g g =×10-3%
六、分析与讨论：
（1）本次实验的结果RNA 含量较低，可能是由于实验过程中操作不规范引起的，如研磨过程中在研钵上面有残留或者研磨不够充分，留有颗粒状的酵母粉等也会引起较大的误差。整个实验过程中要严格实验操作，例如乙醇、氢氧化钠、乙醚等试剂的量要控制好，否则也会引起较大的误差，实验过程中有利用离心机的步骤，需要两两平衡，平衡时不能加入蒸馏水或其他乙醇之类的试剂，否则会引起pH 值的改变，导致RNA 的损失，也会引起较大的误差，只能在两个管中的溶液互相加减以达到平衡。实验过程中尽量把酵母粉转移完全。
（2）实验过程中的离心步骤可以采取提高转速以达到更好的效果，能更好的分离和收集到RNA ，在用95%乙醇和乙醚洗涤的时候需要分部进行，不能一次把全
部的乙醇或者乙醚都倒进去，否则会导致RNA有可能残留，影响实验结果，宜分步进行，而且抽滤的时候应先用95%乙醇把滤纸湿润，以免抽滤过程中液体中旁边缝隙漏过。
（3）实验过程中稀释倍数不宜太大，第一次实验稀释倍数选用2500左右，测量出来的OD值只有，OD值太小所以不宜选用，否则误差较大，第一次测量选用的稀释倍数为，测量的OD值也比较小，为，相比第一次实验，第二次的数据较好，比第一次的数据误差小。造成RNA含量低的原因也可能是材料的问题，可能材料啤酒酵母的RNA含量本身较低所致。
七、思考题：
1.破酵母细胞时为什么要在沸水浴中进行
~
答：由于酵母细胞外有一层厚厚的细胞壁，而RNA存在于细胞质中，所以必需将酵母细胞的细胞壁研磨破碎后才能提取出RNA。加入NaOH之后水浴煮沸30min的作用是促进细胞壁变性，使类脂、甘露聚糖、葡聚糖等成分部分分解，使蛋白质变性，从而使细胞破裂，RNA则从细胞中分离出来。
另外细胞中含有多种分解RNA的酶类（如RNase等），为了避免RNA在提取过程中被降解，得到较为完整的RNA分子，破碎酵母细胞时应在沸水中进行，这样可以使细胞中降解RNA的蛋白酶类活性受到抑制甚至变性失活，从而起到保护RNA分子的作用。
2.为什么用酵母作为实验原料如何使RNA从酵母中释放出来RNA的等电点是多少
答：酵母繁殖快，生长周期短；其细胞质中的核酸大部分是RNA，而DNA很少；RNA提取液与菌体分离比较容易，因此酵母是提取RNA的好材料。
工业上将RNA从细胞中释放出来主要有三种方法，包括稀碱法、浓盐法和自溶法。（1）稀碱法是在一定的碱浓度下，使构成细胞壁的蛋白质、脂肪及糖的化合物得到水解，从而破坏细胞壁，使RNA从细胞中释放出来，该方法属于化学破壁法。（2）浓盐法是基于改变酵母细胞的渗透压，是细胞自身破裂而释放出RNA，即利用高浓度的盐（10% NaCl）在90～100°C条件下改变了细胞膜通透性，并将核蛋白体解离成RNA和蛋白质而使RNA释放到盐溶液中。同时，90～100°C的高温可破坏磷酸单酯酶和磷酸二酯酶的活力，避免RNA的降解。该方法属于物理化学破壁法。（3）自溶法是利用某些酵母菌种在发酵结束后，细胞中的溶酶体膜破裂，使得溶酶体中的水解酶释放到细胞之中，利用菌体自身的酶系将细胞溶解，从而释放出RNA。通常自溶法的菌浓度为2%，PH值～10，自溶温度以60～65°C为宜。
RNA的等电点为。根据核酸在等电点溶解度最小的性质，将溶液在低温下调pH 至～，RNA则以白色絮状沉淀形式从盐溶液中析出。再次离心，固液分离，便可获得RNA粗产品。
3 为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解
|
答：酵母菌的细胞壁呈“三明治”结构——外层为甘露聚糖，内层为葡聚糖，中间层为一层蛋白质分子（包括多种酶类），此外细胞壁壁上还含有少量的类脂和几丁质。稀碱溶液能够对酵母菌细胞壁和细胞膜上的脂类起到抽提作用，脂类发生皂化反应从而被分解，使细胞穿孔。同时细胞壁的聚糖成分在碱液中会部分水解，蛋白质（包括多种酶类）也会发生变性，从而增加酵母细胞的通透性，酵母细胞原生质膜失去选择透过性，细胞就破裂使RNA流出。
4.核酸的溶解性质是什么常用什么试剂分离沉淀核酸
答：核酸是具有极性的高分子物质，根据相似相溶原理，DNA和RNA都是微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。它们可溶于2-甲氧乙醇，也可溶于10%左右的氯化钠溶液，但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂，尤其是在50%左右的乙醇溶液中溶解度很小。因此，常用乙醇从溶液中沉淀核酸，当乙醇浓度达50%时，DNA就沉淀出来，当乙醇浓度达75%时RNA也沉淀出来。
(
华南师范大学实验报告
学生姓名：黎嘉俊学号：008
专业：生物工程年级、班级：10工程一班课程名称：生物工程下游技术实验实验项目：柠檬酸结晶提取
实验类型：□验证□设计□综合实验时间：2013年10月15日
实验指导老师：江学文实验评分：
*
一、实验目的与要求
学习钙盐沉淀硫酸转溶提取柠檬酸的方法；
学习结晶精制柠檬酸的方法。
二、原理
钙盐沉淀法的原理；
碳酸钙（或氢氧化钙）可与发酵液中的柠檬酸发生中和反应，生成难溶
性的柠檬酸钙沉淀，柠檬酸钙在80～90度之间溶解度极低，通过过滤（或离心）的方法将其与糖、蛋白质、其他有机酸、无机离子等可溶性杂质
分离开。
在柠檬酸钙沉淀物中加入稀硫酸在80～85度之间进行酸解反应，生成柠
檬酸和硫酸钙沉淀，硫酸钙在80度左右溶解度极低，趁热过滤（或离心）可将其与柠檬酸分离，获得较纯净的柠檬酸酸解液。
后续工艺：柠檬酸酸解液再进行脱色、阳离子交换层析除去杂质，最后
可以通过结晶法获得纯净的柠檬酸晶体。
^
结晶法的原理和操作。
原理：通过冷却、挥发溶剂等方法使溶液达到过饱和状态时，具有一定形状和大小的固态粒子可从均匀的溶液中析出，称为结晶。
结晶过程：1、产生晶核；2、晶核成长。过饱和度是这两个过程的推动力。
影响晶体质量的因素：
1、溶液中杂质少，产品纯度较高；
2、冷却结晶时，温度要缓慢降低，防止晶核大量形成，形成粒度不一
的晶体；
3、控制搅拌速度，结晶初期可搅拌促使晶核产生，晶核成长时降低搅
拌速度，防止将长成的晶体打碎。
三、主要试剂和仪器
!
中温α﹁淀粉酶；
发酵液：黑曲霉玉米粉发酵培养基；
仪器：旋转薄膜蒸发仪、水浴锅；
其它材料：L NaOH、H2SO4溶液、固体碳酸钙粉末。
磷酸氢二钾500克（1瓶）
硫酸镁·7H2O 500克（1瓶）
硫酸锰·H2O 500克（1瓶）
四、实验步骤
】
实验流程
碳酸钙硫酸柠檬酸
柠檬酸柠檬酸钙↓
硫酸钙↓
1、黑曲霉玉米粉发酵液八层纱布过滤除去菌体和残渣
量筒测量清液体积V0；
2、量取5mL清液、5mL蒸馏水于锥形瓶中，再滴入2～3滴酚酞指示剂，
用NaOH 溶液滴定，滴定终点为淡红色，30s内不褪色，记下消耗的NaOH 溶液体积V1；
&
M酸（g）＝V1(mL)×(mol/L)××1/3×210×V0/5
M碳酸钙（g）＝M酸×（V0－5）/V0×1/210×3/2×100
3、钙盐沉淀：
称取一定质量的碳酸钙粉末，边搅拌边缓慢地加入到剩余的清液中（防止产生大量的泡沫使溶液溢出），85℃反应10min（使柠檬酸钙沉淀下来），趁热抽滤，并用与沉淀体积相当的沸水洗涤沉淀物2次（除去残糖、蛋白质可溶性杂质）；
4、酸解：
VH2SO4（mL）＝M碳酸钙/100/(mol/L)×1000
在沉淀物中加入约等体积的蒸馏水，调匀成浆状，量取一定体积H2SO4溶液，边搅拌边加入到浆液中，85度反应10min，趁热抽滤，获得清亮的酸解液；
5、低压浓缩：
[
将酸解液转入圆底烧瓶中，水浴60～70℃，真空度~，浓缩至原体积约1/10；
6、冷却结晶：
将浓缩液转入烧杯中，于室温下搅拌，待出现晶核，停止搅拌，再移入4度冰箱冷却结晶约15min，抽滤获得柠檬酸晶体，烘干后称重m克柠檬酸。
五、实验结果
（1）量筒测量清液体积V0=125ml
（2）记下消耗的NaOH 溶液体积V1=
(3) M酸（g）＝V1(mL)×(mol/L)××1/3×210×V0/5
=×××1/3×210×125/5=
M碳酸钙（g）＝M酸×（V0－5）/V0×1/210×3/2×100
=×（125-5）/125×1/210×3/2×100
=
（4）VH2SO4（mL）=110ml
（5）烘干后称重m克柠檬酸为
（6）计算黑曲霉发酵柠檬酸的产率：
m柠檬酸（g）/ V发酵液（mL）=125=%
六、分析与讨论：
（1）实验的第二步是通过计算酸度计算需要加入碳酸钙的量为，要是溶液pH 达到，以便让柠檬酸钙沉淀，但是发现加入碳酸钙，pH仍然为3左右，因此实验中加入大量的碳酸钙，约。实验过程中加入碳酸钙的量最好要把总量记下，以便控制好下一步加入硫酸的体积。由于没有记下准确的加入碳酸钙的量，所以加入浓硫酸的体积需要进行摸索，加入的量至少要是溶液pH变为2，（原来的柠檬酸发酵液pH大概为2）因而最终记下硫酸体积为110ml。加入碳酸钙的量不宜太多，否则会出现加入硫酸的体积至几百毫升，溶液pH仍然降不到2。（2）实验的第五步为低压浓缩，可以发现刚开始时浓缩速度较高，后来效率降低了，因而为加快速度改用加热蒸发浓缩，加热到水分较少的时候室温冷却一段时间在转入冰箱，溶液会自动析出柠檬酸晶体，烘干后可以称量柠檬酸晶体质量。
（3）实验得出的柠檬酸为，计算出来的结果发酵产率较低，可能是使用的菌种发酵效率低所致，有些小组得到的柠檬酸晶体比较多，可能因为加入的硫酸体积较多，以致析出来的晶体有可能不纯，有部分硫酸钙残留。
七、思考题：
1、为何要在高温下分离提纯柠檬酸并用沸水洗涤柠檬酸钙沉淀
答：在较高温，85℃反应10min是为了使柠檬酸钙沉淀下来，趁热抽滤，并用与沉淀体积相当的沸水洗涤沉淀物2次是为了除去残糖、蛋白质可溶性杂质。
2、影响柠檬酸发酵的因素有那些
答:柠檬酸发酵的条件：
1、合适的碳源（淀粉、麦芽糖、甘露糖等），高浓度的糖；
2、限制有机氮源、选择适量的无机氮源（铵盐）；
3、合适的pH值；
4、发酵液中溶氧量要高（摇床的转速250r/min）；
5、限制重金属离子如Mn2+、Fe2+、Zn2+的含量。
影响黑曲霉发酵生产柠檬酸的因素：
1、菌种；
2、发酵培养基（碳源、氮源）；
3、纯种发酵与灭菌；
4、无机添
加剂；5、pH对微生物生长的影响；6、溶氧的影响；7、温度对微生物生长的影响。
3、影响柠檬酸提纯得率的因素有那些
答：钙盐沉淀中是否充分沉淀；可溶性杂质是否完全除去；多次抽滤操作中抽滤是否充分；冷却洁晶是否充分。
微生物实验报告
实习报告 实习名称食品微生物检验实习 系别生物与化学工程系 年级专业12级食品科学与工程专业学生姓名某某某 指导老师王老师、黄老师、李老师 X X 学校
2015 年1 月13日
1、实习时间、地点和实习单位 2、实习目的 通过食品微生物检验实习，掌握培养基的配制、包扎及灭菌；正确采集样品并对样 品进行稀释、滴加、培养；菌落观察、鉴定与计数；数据处理、分析等方面内容，并结 合生产和科研技术的发展，开设较高的综合性实验为主，运用综合的实验方、实验手段 对我们的知识、能力、素质形成综合的培养。为我们今后从事各种与食品相关的工作打 下基础。 3、实习过程概述 3.1参加认识实习动员大会 2014年11月8日上午由黄大川、王瑶琼2位老师召开了微生物实习动员大会。会 上，老师们说明了实习目的、内容、时间、地点，着重强调了此次实习的自主性和和注 意事项，另外还应遵守实验室的规章制度，保持高度的安全意识。 3.2实习内容 一、腐乳中细菌含量的检测 1、实验材料和设备 1ml移液管 5支,1000ml、500ml、100ml的烧杯各1、1、2个,250ml锥形瓶 3个， 100ml量筒1个，研钵1个,滴定管1支,试管5支,试管架1个，玻璃棒1根,培养皿 12 个,涂布器1个,洗耳球1个,酒精灯1盏,电磁炉1个，天平1台,药匙1个，pH试纸， 标签纸1张，纱布、棉花、线、报纸若干，高压蒸汽灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台。 2、牛肉膏蛋白胨培养基的配制 配方：牛肉膏3g 蛋白胨10g NaCl 5g 琼脂15—20g 水1000ml pH 7．4—7．6 步骤：称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→倒平皿→接种→培
生物工程下游技术生物工程下游技术的定义 指从动植物与微生物的有机体或器官、生物工程产物（发酵液、培养液）及其生物化学产品中提取、分离、纯化有用物质的技术过程。 实质：是研究如何从混合物中把一种或几种物质分离出来的科学技术。 1.生化工程分离技术 预处理 结晶干燥 离心法：离心过滤、离心沉降、超离心 萃取法：有机溶剂、双水相、液膜、反胶团、超临界 层析法：凝胶过滤层析、反相层析、亲和、疏水相互作用、聚焦、离子交换 膜分离：微滤、超滤、 反渗透、透析、电渗透 2.生物物质常用的分离技术 氨基酸：结晶和离子交换法 蛋白质和多肽：离子交换层析、电泳 糖类：吸附层析 脂质：有机溶剂萃取、超临界流体萃取和层析 抗生素：有机溶剂萃取、离子交换、结晶和吸附层析 3. 生物分离方法的选择与评价 原则： 步聚少，次序合理，产品规格（注射，非注射），生产规模，物料组成，产品形式，产品稳定性，危害性，物性：溶解度、电荷、分子大小、功能团、稳定性、挥发性，废水处理 4.浓缩率：浓缩程度一般用浓缩率(concentration factor)表达，是一个以浓缩为目的的分离过程的最重要指标。浓缩率为m，mt=mx则目标产物未得到任何程度的分离纯化。 5.分离因子：分离因子又称分离系数。产品中目标产物浓度越高，杂质浓度越低，则分离因子越大，分离效率越高。 6. 回收率：无论是以浓缩还是以分离为目的操作过程，目标产物均应以较大的比例回收, 回收率R：
生物分离操作多为间歇过程（分批操作），若原料液和产品溶液的体积分别为VC和VP。 1 生物产品与普通化工产品分离过程有何不同？ 2 设计生物产品的分离工艺应考虑哪些因素？ 3 分离纯化的回收率与浓缩率如何计算？ 4 现代生物分离工程研究方向有哪些特点？ 5 分离纯化指标有哪些? 简述pH对发酵液过滤特性的影响，并举例说明。 答：（1） pH直接影响发酵液中某些物质的电离程度和电荷性质，因此适当调节pH值可以改善发酵液的过滤特性。（2）氨基酸和蛋白质在酸性条件下带正电，碱性条件下带负电，等电点时净电荷为零，两性物质在等电点下的溶解度最小，等电点沉淀法在生物工业分离中广泛使用。（3）如味精生产，利用等电点沉淀法提取谷氨酸，一般蛋白质也在酸性范围达到等电点；膜分离中可通过调整pH 值改变易吸附分子的电荷性质，减少膜堵塞和膜污染；此外，细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在特定pH下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤进行。 第二章 1.预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率： ⑴改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度。 ⑵相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。 ⑶尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）； 2.预处理的方法 凝聚和絮凝 加热法 调节悬浮液的pH值 杂蛋白的去处 高价无机离子的去处 助滤剂 反应剂 3凝聚与絮凝：.凝聚与絮凝处理过程就是将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使其聚集起来,增大体积以便固液分离。 凝聚和絮凝技术常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中。 凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。
生物技术制药试卷A 一、名词解释：（本题共10小题，每小题5分，共计50分） 1、生物药物：是指利用各种生物材料，综合采用各种生物技术的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。 2、抗生素：由微生物产生，在低浓度下能杀灭和抑制病原体，但对宿主不会产生严重的副作用的物质，或使用化学方法半合成的衍生物和全合成的仿制品。广义的抗生素还包括一些抗肿瘤药、杀虫剂和除草剂。 3、补料分批发酵：是指将种子接入发酵反应器进行培养，经过一段时间之后，间歇式地、或者连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。 4、限制性内切酶：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA 分子内部进行的，故名限制性内切酶。 5、载体：将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。 6、转化细胞系：正常细胞经过某个转化过程，失去正常细胞的特点而获得无限增殖能力的细胞系。 7、微载体培养：将细胞吸附于微载体表面，再在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面生长成单层的方法称为微载体培养法。 8、毛状根：受到发根农杆菌感染后形成的根组织，易于培养，改变了植物的次生代谢。毛状根生长快速和次级代谢产物含量高，特别适用于从木本植物和难于培养的植物中得到较高含量的次级代谢产物。
9、气升式反应器：没有搅拌，气体通过喷管进入剪切力更小，主要用于悬浮细胞的分批式培养，近年开发用于贴壁细胞的微载体培养，并进行半连续、连续和灌流式培养。 10. 酶固定化：指经物理或化学方法处理，使酶（细胞）限制或固定于特定空间位置，使之不但能连续发挥催化作用，而且反应后酶又可以反复利用的技术。 二、简答题（本题共5小题，每小题8分，共40分） 1. 简述生物药物新药的研发流程。 答：新药研究和开发的主要过程： (1)确定研究计划； (2) 准备候选菌株； (3) 选择合适药理模型初筛（摇瓶）、复筛（小型发酵）体外试验、细胞试验； (4) 提纯有效成分进行化学分析； (5) 精制样品（中型发酵）； (6) 临床前Ⅱ期(Preclinical Ⅱ) ； (7) Ⅰ期临床(Preclinical I)； (8) Ⅱ期临床(Preclinical Ⅱ)； (9) Ⅲ期临床(Preclinical Ⅲ)； (10) 注册申请上市、试生产； (11) 售后监测(Post－marketing surveillance)。 2.简述生物药物的优点和缺点。 答：生物药物是指利用各种生物材料，综合采用各种生物技术的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。 优点：
省高等教育自学考试大纲 课程名称：生物工程下游技术课程代码：6705 第一部分课程性质与目标 一、课程性质与特点 生物工程下游技术这门课程适合于理工科专业生物工程专业进行学习。本课程的容更多的涉及到工业应用。下游技术是对于由生物界自然产生的生物体或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应、微生物转化等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术，也称为下游工程或下游加工过程，是生物技术产品产业化的必经之路。目前所指的下游技术大多数属于“物质分离”畴。主要研究的是物质分离的方法原理及相关的仪器设备。生物工程下游技术这门课程涉及到物理，化学，生物化学，发酵工程，生物工程与设备等多门学科。 二、课程目标与基本要求 通过学习生物工程下游技术这门课程应掌握以下基本知识点： 1.生物工程下游技术的研究对象和发展历程 2.下游技术的理论基础 3.发酵液预处理，微生物细胞破碎方法和设备 4.溶剂萃取和浸取，超临界流体萃取，双水相萃取，反胶团萃取，膜分离过程，液膜分离，离子交换法，色谱法等主要分离单元操作技术及分离过程的特点，工艺设计与设备选型通过学习了解各种分离方法的原理，适用围，熟悉常用分离设备的操作，在实际应用中可以选择合适的分离方法对仪器进行操作达到分离的目的。通过学习，具备对生物产品的分离、纯化技术的应用能力，及对生物物质提纯最佳方案的设计能力。 三、与本专业其他课程的关系 本课程的容更多的涉及到工业应用。下游技术对各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。在生物工程专业课程的学习中，是一门将生物工程上游技术应用到实际生产中所需要借助的手段。 《物理学》，《无机化学》，《有机化学》，《物理化学》等基础课是这门课程的基础，《微
2012级制药专业 工业微生物学实验报告 姓名: 刘甜甜学号: 2012304090 班级: 制药12-2班指导老师：王健 日期：2014.6.11
一、实验目的 1、抑制或杀死微生物的一些物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的原理。 2、掌握物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的试验方法。 3、了解细菌的形态特征、染色特点。 4、了解细菌在普通培养基、选择培养基、血平板上的菌落特征。 5、掌握细菌分离划线培养的方法。 6、掌握细菌的初步生化反应。 7、掌握细菌密集划线法，掌握细菌K-B药敏纸片法。 二、实验内容 1 细菌Gram’s stain染色，镜检，观察记录细菌形态和特色特征 1.1 实验原理：染色原理：G+菌与Gˉ菌细胞壁不同，G+菌比Gˉ菌细胞内核糖核酸镁盐含量高，G+菌比Gˉ等电点低。 1.2 实验步骤： 1.2.1.制片：○1涂片：取半滴生理盐水置一洁净玻片上，以无菌操作技术自平板上去菌落少许，与生理盐水混匀，均匀涂布约1cm2大小，自然干燥； ②固定：取含菌膜的玻片与酒精灯火焰上来回三次，使菌膜牢固附于玻片表面； 1.2.2染色：①初染：取结晶紫一到两滴覆盖于菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,细流水冲洗，切勿直接冲洗涂片区域； ②媒染：取卢氏碘液1~2滴覆盖菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,用上法细流水冲洗； ③脱色：取95%酒精2~3滴于菌膜表面，轻微摇动，局部接近无色即可, 用上法细流水冲洗； ④复染：取1：10稀释石炭酸复红覆盖涂片区域，轻微摇动，用上法细流水冲洗； ⑤吸水纸初步吸干玻片水分，然后自然干燥； 1.2.3 镜检：于涂片区域加半滴香波油，油镜（100倍目镜）下。 图1：Gram’s stain（1000×）图2：染色试验 三、分离培养 1实验原理：四区划线法是把混杂着在一起的微生物或同一微生物群体的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养繁殖后生成个菌落。有时这些单菌落并非由单个细胞繁殖而来，故必须反复分离多次才能得到纯种。其原理是微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。
生物工程下游技术复习题 第一章绪论 生物下游加工过程的几个阶段 预处理和固液分离, 提取（初步分离）, 精制（高度纯化）, 成品制作. 评价分离效果的重要参数:纯度，回收率，浓缩率。
第二章发酵液预处理和固液分离 主要名词：凝聚、絮凝 凝聚：指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象； 絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。1.改变发酵液过滤特性的方法 调酸（等电点），热处理，电解质处理，添加凝聚剂，添加表面活性物质，添加反应剂冷冻-解冻，添加助滤剂 2.发酵液的相对纯化 （1）高价无机离子的去除方法 （2）杂蛋白的去除方法 沉淀法，变性法，吸附法。 3常用的固液分离方法： 重力沉降，浮选，旋液分离，介质过滤，离心。 （1）离心 离心机种类：碟片式。管式。倾析式。 （2）过滤（澄清过滤，滤饼过滤） 过滤机种类：按推动力分为4种重力过滤，加压过滤，真空过滤，离心过滤。 板框压滤机，真空转鼓过滤机 第三章细胞破碎和包涵体复性 细胞破碎的主要方法和适用对象，了解基本机理
方法：珠磨法原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。 高压匀浆法原理：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。不适用范围：易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀） 珠磨法固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难 高压匀浆法液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌 超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作X-press法固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合 酶溶法酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差化学渗透法改变细胞膜的渗透性具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差渗透压法渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用 冻结融化法反复冻结-融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物 干燥法改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活 第四章沉淀法 1.蛋白质的表面特征 蛋白质组成 20种氨基酸构成的两性高分子电解质，包括疏水性氨基酸和亲水性氨基酸 蛋白质折叠趋势 疏水性氨基酸：向内部折叠的趋势 亲水性氨基酸：分布于蛋白质外表面的趋势 结果 在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残基暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区
生物技术大实验 实验报告集 班级生物技术1212学号 1220212206 姓名宋扬 使用时间2015.12.14至2015.12.19 组别一 苏州科技学院化学与生物工程学院
实验室学生守则 一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员 的指导。 二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、 准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。 三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。凡不按教师的指导擅自操 作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。 四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。未经允许不得随便挪 动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室 外。 五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和 吃东西。 六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管 理人员报告。 七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、 水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。 苏州科技学院化学与生物工程学院
实验报告
菌体量随着时间增加而增长，而辅酶Q10 含量也随着菌体量的增长而变大。后期因为菌体量的减少，也开始降低。下罐。 还原糖浓度（柱状图） 还原糖浓度不断下降，在24小时开始每隔一段时间补充葡萄糖，使葡萄糖含量维持在 一开始溶氧在100%，随着菌体生长发酵，开始下降，控制在30%左右，随着菌体增加，降为 粘，影响氧气传递。 前期消耗氮源，产氨，pH上升，随着菌体生长繁殖，消耗碳源，产酸， 源，使pH维持在6.8左右。当pH过低时，通过补加氨水，使pH维持稳定。
华南师范大学实验报告 学生姓名：黎嘉俊学号：008 专业：生物工程年级、班级：10工程一班课程名称：生物工程下游技术实验实验项目：黑曲霉β-D甘露聚糖 酶的纯化 实验类型：□验证□设计□综合实验时间：2013年9月17日 实验指导老师：江学文实验评分： 一．实验目的 < 1、粗酶的制备 2、硫酸铵分级沉淀 3、透析袋的处理方法和使用 二．原理 1、盐析原理：中性盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化层逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。 2、透析袋脱盐：酸性β-甘露聚糖相对分子质量为39000和40000，选择MWCO（切割分子量或截留分子量）14000的透析袋，透过掉分子量小于1000的蛋白质；并借助分子扩散脱盐。 三．实验试剂和器材 纱布1卷、脱脂棉1包、琼脂条1包、透析袋MWCO（分子量）7000 [ 四．实验步骤
1、将黑曲霉菌株斜面接种三角瓶固体发酵培养基,℃恒温培养 72 h。 2、称取10克发酵麸曲，加100毫升的醋酸缓冲液，温度℃，转速135rpm，摇 床摇60 min后，用￠15㎝滤纸过滤。 3、取滤液40毫升，在不断搅拌下分步加入（NH4）2SO4 克（待加入部分溶解 后再加入剩余部分）。 4、置冰箱中5℃下静止沉淀过夜。 5、标准曲线的绘制：分别吸取%标准甘露糖溶液、、、、，分别定容至50ml。 再分别吸取上述溶液各于试管中各加,5-二硝基水杨酸显色液（DNS试剂）， 煮沸5min（另作1管对照，取蒸馏水，加试剂，同样煮沸5min）。冷却后， 用721型分光光度计在530nm波长下比色，记录各管的光密度值，以光密 度作纵坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为横坐标，绘制标准曲线。五．实验结果 （ 0.1%标准甘露糖溶液体积/ml0246810 OD100.0970.4150.873 1.254 1.674 OD200.0970.4160.873 1.256 1.674 OD300.0970.4150.874 1.256 1.674 OD平均值00.0970.4153330.873333 1.255333 1.674 OD标准差000.0005770.0005770.0011550
第一章 1.生物产品的哪些特性制约了下游技术的可选范围？ 1生物物料2产品稳定性、产品性质、产品共存物性质的要求。 2.生物工程下游技术分哪几个阶段？ 四个阶段：预处理；提取（初步分离）；精制（纯化）；成品制作。 3.生物工程下游技术的特点有哪些？ 快速分离、保证纯度、高选择性、分离步骤多、需要高度浓缩。 4.生物工程纯化过程选择依据有哪些？ 生产成本要低、工艺步骤要少、操作程序合理、适应产品的技术规格、生产要有规模、产品具有稳定性、环保和安全要求、生产方式。 第二章下游技术的理论基础 1下游技术中都存在哪些过程？ 物理学过程；化学过程；生物学过程。 2下游技术中物理过程按物理化学原理有哪些分类？ @根据相性质分为：机械分离（非均相）：过滤、重大沉降、离心；传质分离（均相）：均相。 @物理化学原理：平衡分离：1.气体传质：吸收2.气液传质：精馏3.液液传质：萃取4.液固传质：浸取、结晶、吸附、离子交换、色谱分析 5.气固传质：干燥、吸附、升华；速率分离（差速分离）：1.膜分离：超滤、反渗透、电渗析2.均分离：电泳、磁泳、离心沉降。 3什么是对流传递扩散传递及扩散传递的重要性？ 对流传递是由流体的宏观运动引起；扩散传递分为分子传递（由分子的随机热运动引起）和涡流传递（由微团的脉动引起）尽管对流传质速度要扩散传质速度大很多，但在很多情况下，扩散传递都是非常重要的，特别是存在异相界面物质传递的情况下，物质在异相界面间境界膜中的扩散速率往往成为物质传递速率的限制性因素。 4生物反应器的放大原则？ 几何相似、恒定等体积功率放大、恒定传氧系数放大、恒定剪切力恒定叶端速度放大、恒定的混合时间放大。 第三章发酵液的预处理1发酵液预处理的目的？ 固液分离（分离菌体及其它悬浮颗粒）、除去一些可溶性杂质、改变滤液的性质以利于后续的提取与精制。 2发酵液预处理的方法有哪些？并简述各种方法的原理特点和应用36 降低液体黏度（加水稀释法、加热法）、凝聚和絮凝法、调节PH法、加入助滤剂法、加吸附剂法或加盐法（加入反应剂）。 3发酵液进行过滤的目的是什么？影响发酵液过滤速度的因素有哪些？ 目的：以压力差为推动力，依靠过滤介质将固体和液体分离 影响因素：1.从进料侧至过滤介质另一侧的压力降2.过滤面积3.滤饼阻力（厚度、颗粒大小）4.滤液黏度5.过滤介质和初始滤饼层的阻力。4发酵液过滤的方法有哪些？ 并简述各种方法的类型特点和应用39 方法：常压过滤、加压过滤、真空过滤、离心过滤。 5如何进行过滤介质的选择和条件的优化？ 过滤介质除具有过滤作用外，还是滤饼的支撑物，它应具有足够的机械强度和尽可能小的流动阻力。合理选择过滤介质取决于许多因素，其中过滤介质所能截留的固体粒子大小以及对滤液的透过性是过滤介质最主要的技术特性过滤介质种类1.织物介质：绵、丝、毛、麻等2.粒状介质：硅藻胶、活性炭、白土 3.多孔固体介质：多孔陶瓷、玻璃、塑料4.微孔纤维素和金属薄膜介质：醋酸纤维素 过滤条件的优化：1.改善发酵液物理性质：降低滤饼比阻、降低发酵液黏度、降低固体浓度、热处理 2.改善设备结构：扩大设备尺寸、增加过滤面积。 6发酵液的构成？ 微生物（菌体）、残存的固体培养基、未被微生物完全利用的糖无机盐蛋白质以及微生物的各种代谢产物。 7发酵液特性有哪些？ 1目标产物浓度普遍较低，悬浮液中大部分是水2菌体细胞等固体粒子的性质差异较大，且具有一定的可压缩性3菌体细胞等悬浮颗粒小，其相对密度和液相相近4液相黏度大，多为非牛顿型流体5性质不稳定易随时间变化，如易受空气氧化微生物污染蛋白质酶水解等作用的影响。
1.请描述生物工程下游技术的一般工艺流程，并分析各步可采用方 法及其原理 按生产过程分，下游技术工艺过程大致可分为4个阶段，即预处理、提取（初步分离）、精制（纯化）、成品制作。 发酵液→预处理→细胞分离→细胞破壁→碎片分离→提取→精制→成品制作加热过滤匀浆法离心沉淀(重)结晶浓缩 调PH 离心研磨法双水相吸附离子交换干燥 絮凝膜分离酶解法膜分离萃取色谱分离无菌加工 超滤膜分离成型 结晶 （1）预处理和固液分离 加热法：加热可降低液体黏度，只适用于产物对热较稳定的发酵液。在适当的温度和受热时间下可使菌体或蛋白质凝聚形成较大颗粒的凝聚物，改善发酵液固液分离特性。加热是蛋白质变性凝固的有效方法。 调节PH法：PH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，调节PH可以改变菌体和蛋白质的带电性质，从而改变其过滤特性。蛋白质属于两性电解质，两性电解质在溶液中的PH处于等电点时分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加溶解度最小。因此，调节溶液的PH，可使蛋白质溶解度下降而析出，这是除去蛋白质的有效方法。改变PH，还能使蛋白质变性凝固。 絮凝：在某些高分子絮凝剂的存在下。基于桥架的作用，使胶粒形成絮凝团的过程。 （2）提取（初步分离）
沉淀：在溶液中加入沉淀剂使溶质溶解度降低，生成无定形固体从溶液中析出的过程。原理：沉淀分离就是通过沉淀，在固-液分相后，除去留在液相或沉积在固相中的非必要成分。 吸附：吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸附剂表面的过程。吸附的原理：固体内部分子所受分子间的作用力是对称的，而固体表面分子所受力是不对称的。向内的一面受内部分子的作用力较大，而表面向外一面所受的作用力较小，因而当气体分子或溶液中溶质分子在运动过程中碰到固体表面时就会被吸引而停留在固体表面上。 萃取：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的技术。原理：利用各物质在不同溶剂中具有不同的溶解度的原理来达到将目标产物分离纯化的目的。 超滤：超滤是利用膜的透过性能，在静压差的推动力作用下，达到分离离子、分子及其某种微粒目的的膜分离技术。原理：超滤是一种筛分过程，在一定的压力作用下，含有大小分子溶质的溶液流过超滤膜表面时，溶剂和小分子物质（如无机盐类）透过膜，作为透过液被收集起来；而大分子溶质（如有机胶体）则被膜截留而作为浓缩液被回收。 结晶：将形成晶型物质的过程称为“结晶”。原理：通过结晶溶液中的大部分杂质会留在母液中，再通过过滤、洗涤即可得到纯度高的晶体。 （3）精制（纯化）
第三章 发酵液预处理与固液分离 1.加水稀释法 （稀释后要过滤速率提高的百分比要大于加水量） 1.降低液体黏度 2.加热法 2.调整PH （如利用蛋白质的等电点） 3.凝聚：在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电 位下降，而使胶体体系不稳定的现象。 过滤特性改变 凝聚值越小，凝聚能力就越强 絮凝：在有些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大 絮凝团的过程。 混凝：包括上述两种方法。 4.加入助滤剂 （最常见的是硅藻土） 5.加入反应剂 1. Ca 2+ : 加草酸钠 除杂 Mg 2+ :加三聚磷酸钠 C a 2+ ：加黄血盐 1.沉淀法 2.杂蛋白的除去： 2.变性法 （有加热法，调PH ，加酒精， 丙酮等有机溶剂或表面活性剂 等。） 3.吸附法 (加入某些吸附剂或沉淀剂吸附 杂蛋白而除去) 1.离心 公式：Q=v ω2Z g d v L S ?-=μ ρρ18)(2 固液分离手段 θπctg r r g n Z )(323132-= 2.过滤 （1）板框过滤机 （适合固体含量在１％—１０％的悬浮液 的分离） （２）真空转鼓过滤机 （适合固体含量大于１０％） （３）硅藻土过滤机 （适合固体含量小于０．１％）
第五章细胞破壁 细胞破壁１．破壁方法：（１）珠磨法原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小 珠，石英砂，氧化铝等研磨剂一起快速搅拌或 研磨，研磨剂，珠子与细胞之间的互相剪切， 碰撞，使细胞破碎。 （2 ）高压匀浆法原理：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由 于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破 碎。 是大规模细胞破碎的常用方法。 （3）超声破碎法（适合实验室用） （4 ）酶溶法 1 .外加酶法 2. 自溶法（1）加热法 （2）干燥法 （5）化学渗透法 2.破碎率的测定（1）直接测定法破碎前利用显微镜计数器直接计数 破碎后用染色的方法把破碎的细胞与未受损 的细胞分开。即可直接计算破碎率。 （2）目的产物测定法通过测定破碎液中目的产物的释放量 来估算破碎率。 （3）导电率测定法根据导电率随着破碎率的增加而呈线性 增加 第五章．溶剂萃取与浸取 一、溶剂萃取过程的理论基础： ——是把目标物质从第一个液相中依靠更强大的溶解力抽提到第二个液相中。如把水相中的醋酸抽提到醋乙酯中。 1．萃取溶剂的选择 根据萃取目标产物的介电常数，寻找极性相接近的溶剂为萃取溶剂。好的溶剂应满足以下要求： ①萃取容量大，单位体积萃取溶剂能萃取大量产物； ②选择性好，只萃取产物而不萃取杂物； ③有利于相的分散和两相分离，与被萃取相互溶度小，且粘度小，界面传力小 ④易回收和再生； ⑤化学致定性好，不易分解，对设备腐蚀性小； ⑥经济性好，价廉易得； ⑦安全性好，闪点高，对人体无毒或低毒。
动物生物反应器 专业：生物技术班级：093姓名：贺霞霞 一、概述 1、生物反应器：生物反应器是利用生物体所具有的生物功能，在体外或体内通过生化反应或生物自身的代谢获得目标产物的装置系统、细胞、组织器官等等。 2、内容：生物反应器听起来有些陌生，基本原理却相当简单。胃就是人体内部加工食物的一个复杂生物反应器。食物在胃里经过各种酶的消化，变成我们能吸收的营养成分。生物工程上的生物反应器是在体外模拟生物体的功能，设计出来用于生产或检测各种化学品的反应装置。或者说，生物反应器是利用酶或生物体（如微生物）所具有的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统，是一种生物功能模拟机，如发酵罐、固定化酶或固定化细胞反应器等。 生物反应器（bioreactor）经历了三个发展阶段：细菌、细胞基因工程、转基因动物生物反应器。转基因动物生物反应器的出现之所以受到人们极大的关注，是因为它克服了前两者的缺陷，即细胞基因工程产物往往不具备生物活性，必须经过糖基化、羟基化等一系列修饰加工后才能成为有效的药物，而细胞基因工程又因为的培养条件要求相当苛刻、成本太高而限制了规模生产。另外，转基因动物生物反应器还具有产品质量高、容易提纯的特点。一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫做动物生物反应器。几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可以经过人为驯化为生物反应器。从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织或器官要方便产物的获得，例如乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器、动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引人注目。 二、动物生物反应器的介绍 1、转基因动物与生物反应器
《生物工程下游技术实验》讲义 实验项目一：“超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术” 实验一：植物超氧化物歧化酶（SOD）活性测量(6学时) 过程 1.每组30g绿豆,洗涤，蒸馏水浸泡过夜，倒去浸泡的水，加入300 ml蒸馏水液，匀浆 机匀浆，二层纱布过滤，离心（3000 rpm）得清液，取少量清液进行SOD活性及蛋白质含量测量，计算材料中SOD总活性单位及比活性单位（units/mg Pr）。 2.所得清液测量其总体积，缓慢加入硫酸铵至35%饱和度（查一般实验手册,约 19.4g/100ml清液），5℃冰箱中静置备用下一实验。 SOD活性的测定：（二种方法取一种，本次实验用前者，要求理解后者的原理） ●邻苯三酚自氧化法：这是最简单的一种检测方法，但干扰因素较多。 ●NBT光化还原法：比较稳定，但受酚类物质干扰。 一、利用连苯三酚自氧化测SOD活性的方法 溶液配制： 1，连苯三酚：630 mg------→100 ml 10 mmol/L HCl (0.085 ml 36%的浓HCl ，用蒸馏水配成100 ml)。共配500ml. 2，pH 8.30 50 mmol/L Tric-HCl： A) 0.1 mol/L Tris: 12.114g-----1000 ml (储备液) B) 0.1 mol/L HCL: 浓盐酸稀释得到（8.5 ml 36%的浓HCl ，用蒸馏水配成1000 ml）(储 备液) ●0.05mol/L pH 8.3: 500ml A+199ml B-------定容到1000ml.. 操作： 25?C，3 ml 50 mmol/L pH8.30 的Tric-HCL 缓冲液，加入10 μl 50 mmol/L 连苯三酚（具体加入量应每次测量前校正，加入的原则是使下面的A325变化控制在0.07 ／min左右），迅速摇匀，倒入光径1 cm的比色杯(应该用石英杯)中，每３０秒测一次Ａ３２５值，自氧化速率的变化（?Ａ）控制在0.07 ／min左右，加入酶液后再测连苯三酚自氧化速率的变化（?Ａ’），酶量的加入控制在使加样后的?Ａ’在0.035/min左右。（以上?Ａ?Ａ’的变化值不需特别严格，?Ａ只要控制在0.1以下0.04以上，?Ａ’变化在?Ａ的约一半左右即可） 一个SOD活性单位（连苯三酚单位）：在以上条件下，加入酶如果在一分钟时间能抑制连苯三酚自氧化速率的一半，此时所加的酶量就为一个SOD的酶活性单位（unit，U）。
实验四环境中微生物的检测和分离纯化 一、实验目的 1.熟悉常用微生物培养基的配置方法。 2.学习并掌握各种无菌操作技术，并用此技术进行微生物稀释分离、划线分离接种。 3.用平板划线法和稀释法分离微生物。 4.认识微生物存在的普遍性，体会无菌操作的重要性。 二、实验原理 土壤中有数量巨大、种类丰富的微生物，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的是平板分离法。 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品含菌数。 三、实验器材 土样10g，牛肉膏蛋白胨培养平板20个，未知菌种平板，当天降雪； 平皿，涂棒，接种环，无菌200ul, 1000ul吸头，记号笔，酒精灯，取液器:1000ul 、200ul 各一支，培养箱； 0.9% 无菌生理盐水，250ml三角瓶中装99ml生理盐水,每瓶加约20粒玻璃珠，250ml 三角瓶中99ml生理盐水,作100倍稀释用。 四、实验步骤 1.配置培养基：取牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水1000ml配置培养基，调 pH至7.2，灭菌。于讲课前倒板20块。 2.采集野外样品：选择肥沃土壤,去表层土,挖5~20cm深度的土壤数10g,装入烧杯,带 回实验室;取校河水装入烧杯，带回实验室；取新积雪中间层转入烧瓶，带回实验 室。 3.制备土壤稀释液：称取土样1.0g，放入盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中， 用手振荡5min使土壤均匀分散成为土壤悬液（10-2）。用200ul的无菌吸头从中吸 取0.1ml土壤悬液，注入事先分装有0.9ml无菌水的试管中，吹吸3次，摇匀（10-3）。 类推制得10-4、10-5的土壤悬液。 4.涂板： 1）土壤稀释液（9块）：用无菌吸头，分别吸取10-3、10-4、10-5浓度土壤稀释液100ul，较均匀地放入已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上，用无菌玻璃 涂棒涂匀。每个浓度做3个平板。 2）单菌落划线（4块）：用接种环挑取未知平班上的菌落，做单菌落划线分离，每人2板。 3）手指（1块）：分别用未洗过的手指头, 用自来水打湿的手指头，用自来水洗过的手指头，用肥皂洗过的手指头和用酒精棉球擦过的手指头(不用毛巾擦)在同 一平板的不同分区涂抹（用力一致）。
生物工程下游技术实验课程教学大纲 课程名称：生物工程下游技术（Downstream Processing of Bioengineering） 课程编码：1313083216 实验类别：专业课 总学时数：46 实验时数：16 学分：2.5 开课单位：生命科学学院生物技术教研室 适用专业：生物技术 适用对象：本科（四年） 一、课程的性质、类型、目的和任务 本课程为生物技术专业本科生必修的专业课程。是非单独设课课程，在实验中要求： 1、在本实验课程中培养和提高学生运用生物分离技术的原理的能力。 2、掌握生物分离技术的基本方法和技能，培养学生正确记录实验数据和现象、正确处理实验数据和分析实验结果的能力。 3、培养学生严谨认真、实事求是的科学态度和良好的实验作风。 4、在教学中，教师要向学生讲明该实验课的性质、任务，并使学生明确实验课的地位和作用，提高学生学习的主动性。 5、学生实验前，必须预习实验内容，了解每个实验的目的、原理和方法。 6、实验过程中，要求学生操作要规范、做好实验原始记录、爱惜仪器、节约药品、遵守安全制度、使学生养成良好的实验习惯，树立良好的学风。 7、要求学生实验后按时完成实验报告。。 二、本课程与其它课程的联系与分工 本课程宜从三年级第二学期开始，以确保学生学习本课程具有所需要的数学、物理、化学、微生物学、酶工程、微生物工程、细胞工程等基础。 三、课程内容及教学基本要求 [1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”； 实验一、大肠杆菌的超声波破碎 细菌培养和收集[3]；细胞破碎[3]；细胞液分离[2] 实验二、氨基酸的吸附层析 薄板制备[3]；点样[3]；展层[3]；显色[3]；测定Rf值[2] 实验三、蛋白质溶液的凝胶层析脱盐 凝胶柱制备[3]；加样与洗脱[3]；检测[3] 实验四、有机溶剂萃取抗生素 试剂配制[3]；化学效价测定[3]；标准曲线制备[3]
微生物学实验报告格式 专业学号 姓名 实验一、···培养基的配制和高压蒸汽灭菌 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（实际用到哪些试剂、材料、玻璃器皿等都要写出，包括数量） 四、实验步骤（按照实际步骤填写,切忌抄袭） 五、注意事项（自己总结实验过程中的注意点） 六、思考题 1、简述培养基的配制原则？ 2.为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？ 3.高压蒸汽灭菌时，为什么要先将灭菌锅锅内的冷空气完全排尽？ 实验二自生固氮菌的分离纯化 （这是个综合实验，请大家回顾三周来的所有操作步骤，将其整理成连贯完整的一份报告，注意每次实验的衔接，不要把其他的实验项目写进来，但也不要漏写该实验的相关步骤。） 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（整个综合实验有涉及到的材料都要列出）
四、实验步骤（详叙每周所做的相关步骤） 五、注意事项（自己总结实验过程中的注意点） 六、思考题 1、划线分离时，为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉？划线为何不能重叠？ 2、如何从自然界中分离自己所需要的纯培养？ 实验三平板培养测数法 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（实际操作有涉及到的材料都要列出） 四、实验步骤（详叙相关步骤） 五、实验结果 六、注意事项（自己总结实验过程中的注意点） 七、思考题 1、平板菌落计数法中，为什么溶化后的培养基再冷却至45℃左右才能倒平板？ 2、本次实验是否成功？如果失败，试分析原因。 实验四简单染色 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（包括菌种、染料、玻璃器皿） 四、实验步骤 五、实验结果（黏贴染色结果图片并描述所观察到的细菌的显微形态）
六、思考题 1、简单染色要获得成功，有哪些问题需要注意，为什么？ 实验五革兰氏染色 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（包括菌种、染料、玻璃器皿） 四、实验步骤 五、实验结果（黏贴染色结果图片并判断自己分离到的菌种是G还是G+-？） 六、思考题 1、革兰氏染色要获得成功，有哪些问题需要注意，为什么？ 2、什么情况下会导致结果出现假阳性或假阴性？ 实验六放线菌的印片染色法 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（包括菌种、染料、玻璃器皿） 四、实验步骤 五、实验结果（黏贴染色结果图片并描述放线菌的显微形态特征） 六、注意事项 微生物学实验报告格式
一、概念 1、生物制药：是指运用微生物学、生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，利 用生物技术的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。 2、基因工程：是指在体外按既定的目的和方案，将一目的基因片段，与载体结合，构成DNA重组体，随即引入受体细 胞中，随细胞繁殖而扩增，同时也可进行基因表达，产生特定的基因产物或新性状的遗传物质的技术。 3、载体：是携带外源DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具，载体本质是DNA 。 4、质粒：是染色体外能自主复制的双链闭环DNA分子。 5、沉淀：是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。 6、盐析：是一种根据蛋白质在高浓度盐溶液中的溶解度低的特点来分离蛋白质的方法。 7、等电点沉淀法：是利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。 8、凝胶过滤层析：是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。 9、离子交换层析：带有不同电荷的物质，对层析柱中的离子交换剂亲和力不同，通达改变冲洗液的离子强度和pH值， 将物质依次从层析柱中洗脱分离出来的方法。 10、亲和层析：就是根据生物大分特异性的分子识别建立的一种纯化方法 11、膜分离：在压力、电场或温差作用下，某些物质可以透过膜，而另些物质则被选择性的拦截，从而使溶液中不同 组分，或混和气体的不同组分被分离,这种分子级的分离称为膜分离。 12、电泳：在直流电场中，带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳。 13、分光光度技术：利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定 量分析和物质结构分析的方法 二、简答题 1、现代生物制药下游技术包括哪些内容 1.生物反应器及大规模细胞培养 2.生物细胞破碎技术 3.生物分子的分离纯化技术 4.生物分子含量检测技术 5.生物分子鉴定技术 6.生物分子活性检测技术 2、基因工程基本操作过程 包括目的基因的制备、基因载体的选择、DNA重组、DNA重组体的转化、重组体的筛选和鉴定、外源基因的表达 3、生物化学样品制备特点 ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。 ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。 ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活就是生物大分子提取 制备最困难之处。 ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响， 很难准确估计和判断。 ⑸为保护所提取物质的生理活性及结构上的完整性，生化分离方法多采取温和的“多阶式”进行（常说逐层剥皮式）。 常常少至几个多至几十个步骤，并不断变换各种分离方法，才能达到纯化目的 4、生化分离制备实验设计基本思路 ⑴确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。 ⑵建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。 ⑶通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。 ⑷生物材料的破碎和预处理。 ⑸分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。 ⑹生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电 泳都是一个峰。 ⑺产物的浓缩，干燥和保存。 5、蛋白质盐析的原理及优缺点 原理：蛋白质是由疏水性氨基酸和亲水性氨基酸组成的，在水中蛋白质折叠后，由亲水性氨基酸与周围的水分子形成水化膜，因此，蛋白质在水溶液中的溶解度是由它周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质
生物工程下游技术期末闭卷考试题库 一、选择题（每题1分，共20分） 1、在发酵液中常加入 B ，以除去发酵液中的钙离子。 A. 硫酸 B. 草酸 C. 盐酸 D. 硝酸 2、在发酵液中加入草酸，其作用是ABCD 。 A. 去除钙离子 B. 去除部分镁离子 C. 改善发酵液的过滤性能 D. 有助于目标产物转入液相。 3、在发酵液中加入三聚磷酸钠，它和 B 形成可溶性络合物，可消除对离子交换的影响。 A. Ca2+ B. Mg2+ C.Zn2+ D. Fe3+ 4、环丝氨酸的发酵液中，加入磷酸盐的主要目的是去除AD 。 A. Ca2+ B. Fe3+ C. Zn2+ D. Mg2+ 5、在发酵液中加入黄血盐，可去除 C ，使其形成普鲁士蓝沉淀。 A. Ca2+ B. Zn2+ C. Fe3+ D. Mg2+ 6、发酵液中，细胞絮凝机理是 A 。 A. 胶体理论 B. 高聚物架桥理论 C. 双电层理论 D. 盐析理论 7、在生物产品分离中， C 技术可代替或改善离心和过滤方法，富集或除去发酵液中的细胞或细胞碎片。 A. 凝聚 B. 双水相萃取 C. 絮凝 D. 色谱 8、高压匀浆法提高细胞破碎率的方法有 ABC 。 A. 适当地增加压力 B. 增加通过匀浆器的次数 C. 适当地增加温度 D. 提高搅拌器的转速 9、下列 AB 可采用高压匀浆法进行细胞破碎。 A. 大多数细菌 B. 酵母 C. 放线菌和霉菌 D.包涵体 10、珠磨法提高细胞破碎率的方法有 BCD 。 A. 适当的增加压力 B. 增加装珠量 C. 延长破碎时间 D. 提高转速 11、下列 ABCD 可采用珠磨法进行细胞破碎。 A. 大多数细菌 B. 酵母菌 C. 放线菌和霉菌 D. 含有亚细胞器（如包涵体）的微生物细胞 12、下列 AC 可采用渗透压冲击法进行破碎。 A. 动物细胞 B. 酵母菌 C. 革兰氏阴性细菌 D. 革兰阳性细菌 13、下列 AC 可采用冷冻－融化法进行破碎。 A. 动物细胞 B. 酵母菌 C. 革兰氏阴性细菌 D. 革兰阳性细菌 14、下列 C 可采用EDTA法进行破壁。 A. 动物细胞 B. 酵母菌 C. 革兰氏阴性细菌 D. 革兰阳性细菌 15、关于用化学渗透法破壁的优点，下列说法正确的是 ABC 。