生物化学实验报告
姓名：孟旭阳
学号： 3120100004
专业年级： 2012级临床医学二
组别：第三实验室
生物化学与分子生物学实验教学中心
【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：】
一、实验原理
（一）质粒DNA的提取（碱裂解法）
1、基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
2、在pH值高达12.6的碱性条件下，细菌的线性染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。
3、当以pH4.8的NaAc溶液调节pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而线状染色体DNA片段不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。（二）质粒DNA的定量（紫外分光光度计法）
1、DNA和RNA分子中由于碱基上存在共轭体系，对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰且吸收强度与溶液中DNA和RNA的浓度成正比。
A=1时，双链DNA溶液的浓度为50μg/ml，单链RNA的浓度为40μg/ml。
2、当
260
而蛋白质分子中由于色氨酸和酪氨酸的存在，其最大吸收波长为280nm ，可通过测定在260nm 和280nm 的吸光度比值（260A /280A ），估计核酸的纯度。
3、紫外分光光度法只能用于测定浓度＞0.25μg /ml 的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。 （三）质粒DNA 的酶切鉴定
1、①限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA 分子特异性核酸序列的DNA 水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具酶。
②不同的质粒DNA 有不同的核苷酸序列，因而其上的限制性内切酶酶切位点的位置和数量就不同，即有不同的酶切图谱。根据质粒的酶切图谱，选择合适的限制性内切酶，可以将质粒切割成线性DNA 或不同大小的片段，通过鉴定酶切后的产物在电泳凝胶中的区带数以及片段的迁移率，以已知分子量的线状DNA 为对照，可以判断酶切片段的大小，从而对提取的质粒进行鉴定。
2、琼脂糖凝胶电泳
①在一定电场强度下，DNA 分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA 分子本身的大小和构型（相对分子质量不同的DNA 片段泳动速度不一样），且DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。
②凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA ，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA 分子：一般来说，其中闭环结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是单链开环。
③染色
溴化乙锭（EB ）：3，8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐，可与DNA 结合，在紫外光照射下呈现红橙荧光，有致癌性。
Gelview ：荧光染料，在紫外光照射下呈现绿色荧光。 （四）聚合酶链式反应（PCR ）
指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过程。
二、实验材料
（一）碱裂解法提取质粒DNA
1、样品：细菌培养物
2、试剂：①溶液P1（细菌悬浮液），已加入RNaseA；②溶液S2（细菌裂解液）；③溶液S3（中和液）；④去蛋白液W1；⑤漂洗液W2，已加入无水乙醇；⑥洗脱缓冲液Eluent；
⑦灭菌水
3、仪器及器材：①1.5ml EP管；②吸附柱，收集管；③涡旋振荡器；④微量移液器（10μl、200μl、1000μl）
（二）质粒DNA的定量（紫外分光光度计法）
1、样品：提取的质粒DNA溶液
2、试剂：灭菌的去离子水
3、仪器及器材：①紫外分光光度计；②微量移液器（10μl、200μl）；③UVette比色皿；④1.5ml EP管
（三）质粒DNA的酶切鉴定
1、样品：质粒DNA溶液
2、试剂：①EcoRⅠ核酸内切酶；②Hind Ⅲ核酸内切酶；③10×M酶切缓冲液；④灭菌去离子水
3、仪器及器材：恒温水浴箱；微量移液器（10μl）；1.5ml EP管
（四）PCR链式反应
1、试剂：①菌液：DNA模板（含靶基因片段）；②引物：正向引物、反向引物；③2×Premix；④灭菌去离子水
2、仪器及器材：①PCR仪；②微量移液器（10μl、200μl）；③0.2 mlPCR反应管（五）琼脂糖凝胶电泳
1、样品：PCR产物、提取的质粒DNA、酶切产物
2、试剂：电泳指示剂；Gelview；TBE；琼脂糖；DNA Marker5000
3、仪器及器材：胶床，电泳槽
三、实验步骤
（一）实验流程
（二）操作步骤
1、PCR链式反应
①取0.2 mlPCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂：
试剂体积（μl）
灭菌去离子水 19
2×Premix 25
正向引物-SO100(10×M) 2
反向引物-SO101(10×M) 2
菌液 2
总体积为50μl；
②将反应管放入PCR仪中，PCR仪反应过程如下：
1）94℃预变性2 分钟后开始以下循环；
2）变性温度和时间：94℃，30 秒；退火温度和时间：55℃，30 秒；延伸温度和时间：72℃，60 秒。此过程循环25～30次；
3）72℃ 8 分钟；
4）4 ℃保温。
实验过程约1小时30分钟
2、质粒DNA提取
①取1.5ml培养物加入EP管中；
②9000rpm×30s，弃上清液；
③加入250μl溶液P1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮；
④加入250μl溶液S2，颠倒6～10次混匀（不要剧烈振荡），直到溶液变得清亮；
⑤加入400μl溶液S3，立即温和混匀，室温放置3～5min。13000rpm离心10min，小心取上清液（700～800μl）；
⑥将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液；
⑦加入500μl去蛋白液W1，13000rpm离心1min，弃滤液；
⑧向吸附柱中加入500μl漂洗液W2，13000rpm离心1min，弃滤液；
⑨重复步骤⑧一次；
⑩空柱13000rpm离心2min，然后室温放置3～5min，使残留乙醇挥发；
○11取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加60μl～100μl洗脱缓冲液Eluent，室温放置1min，13000rpm离心1min洗脱质粒DNA，-20℃保存备用。3、质粒DNA的酶切
在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反应物：
反应物体积（μl）
无菌去离子水 10.0
10× M酶切缓冲液 2.0
质粒DNA 6.0
Hind III 1.0
EcoR I 1.0
总计20.0μl，混合后37℃水浴1～2h。
4、质粒DNA的定量
①取一洁净的1.5ml EP管，加入2μl质粒DNA样品和98μl灭菌水并混匀；
②打开紫外分光光度计电源开关，无需预热。
③根据样品的不同，在仪器控制面版上选择对应的方法组。如测量质粒DNA浓度选
，测量RNA浓度选等，以此类推。
④选择进入方法组后，选择你所需要的方法，然后按enter键确认。
⑤按parameter/dilution键设置样品稀释倍数，输入样品的体积和稀释样品所用稀释液的体积，按enter键确认。
⑥后推打开仪器上放置石英比色皿的槽盖。
⑦按照设置的稀释方法，先向石英比色皿中加入对应体积的空白稀释液，然后把石
英比色皿放入检测槽，按blank键进行调零。
⑧再按照设置的稀释方法，向石英比色皿中加入对应体积的样品，并用微量加样器轻轻混匀。
⑨按sample键，仪器会根据样品的稀释倍数自动计算出样品的最终浓度。
5、琼脂糖凝胶电泳
①制备电泳支持物：凝胶准备→胶床准备→铺胶→静置→胶床置于电泳槽中→加电泳缓冲液→拔梳子；
②样品准备：将5μl提取的质粒DNA、酶切产物，分别与约为样品体积1/5的loading buffer用加样器轻轻混匀（PCR产物本身有颜色，不需要再加loading buffer）；
③上样：用加样器吸取样品各5μl，轻轻的加入到凝胶的样品孔中；
④盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。电压120v，时间25～30分钟；
⑤电泳结束后，用紫外检测仪直接观察电泳条带。
（三）注意事项
1、PCR链式反应
①注意每换一种试剂换一个新吸头，且PCR反应管标记在侧面；
②如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心或者将反应管盖上盖子使劲甩，使反应液集中于管底，然后将反应管放到PCR仪上。
2、质粒DNA提取
①加入250 溶液P1后需剧烈振荡，使沉淀彻底悬浮；
②加入250 溶液S2、S3后，千万不要剧烈振荡，为了避免染色体DNA因机械外力作用下断裂成小片段，从而能与质粒DNA相分离，所以要温和混匀，直到溶液变得清亮；
③菌液离心后除去上清液时，上清液要尽可能去得干净，吸取时注意不要碰到沉淀；
④在用70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀时，应尽量将乙醇挥发干净。因为如果残留较多乙醇，以后在做酶切鉴定时，乙醇会使限制性内切酶失活。
3、质粒DNA的酶切
①加液过程中尽量不要有气泡产生，并尽量使液体在离心管底部；
②影响酶切反应的因素有：底物DNA的纯度，反应系统，反应体积，时间和温度；
③大多数酶以浓缩液存放，吸取时需严格取量；
④质粒DNA最好最后再加入，以防止操作不当引起试剂的污染；
⑤反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。
4、质粒DNA的定量
①紫外光不能透过普通玻璃，因此UVette比色皿为石英制。因此测定时应轻拿轻放，小心使用；
②执UVette比色皿时，应注意拿着比色皿的粗糙面，勿碰比色面。空白对照和样品应该在同一比色皿中检测，避免不同比色皿间的检测误差；
③转样时必须防止比色皿中有气泡或其他悬浮物；
④测定过程中注意不要对着比色皿讲话，否则会污染样品，影响测定数据的准确性；
⑤有多个样品要测定时，需在弃去比色皿的样品后，加入去离子水冲洗多次，然后再测定下一个样品；如果各个样品的浓度有差异，测定的顺序应从低浓度到高浓度。
5、琼脂糖凝胶电泳
①凝胶浓度选择应根据样品DNA分子大小而定，所以电泳前应对DNA片段大小有粗略的估计。本实验胶浓度为1%；
②倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃，温度太高会使制板变形；
③胶一定要凝固好才能拔梳子，方向要竖直向上，不要弄坏点样孔；
④电泳前，确认样品孔位于电场负极；
⑤点样时枪头下伸，一定不要弄破胶，并且点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多；
⑥Gelview有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔；
⑦紫外线照射不要太久。
⑧影响DNA分子迁移速率的因素：DNA的分子大小、琼脂糖浓度、DNA分子的构象、电源电压、嵌入染料的存在、离子强度影响。
⑨电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。
【实验报告第二部分（实验记录）：①主要实验条件（如材料的来源、质量；试剂的规格、用量、浓度；实验时间、操作要点中的技巧、失误等，以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依据）；②实验中观察到的现象（如加入试剂后溶液颜色的变化）；③原始实验数据。评分（满分20分）：】
四、主要实验条件
（一）材料
提取质粒DNA时所用材料是细菌培养物，质粒DNA的定量与酶切鉴定时所用材料均为此前提取的质粒DNA溶液，PCR反应当场用试剂配制材料，琼脂糖凝胶电泳则以PCR 产物、提取的质粒DNA、酶切产物为材料。
（二）试剂
溶液Ⅰ（即溶液P2）：50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris·Cl（pH8.0），10mmol/L EDTA （pH8.0），2mg/mL 溶菌酶。
溶液Ⅱ（即溶液S2）：0.2mol/ L NaOH（从5mol/L贮存液中现用稀释），1% SDS。
溶液Ⅲ（即溶液S3）：5mol/L乙酸钠 60ml，冰乙酸 11.5ml，水 28.5ml。所配成的溶液中钠的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。
2×Premix：Taq酶 5U/μl；4×dNTP 10mM each；10×buffer 500mM KCl；100mM Tris-HCl（pH 8.3）；MgCl2 25mM
Mgcl，10mmol/L DTT，10×M酶切缓冲液：500mmol/L Tris-HCL（pH7.5），100mmol/L
2
1000mmol/L Nacl
电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。
TBE：5×TBE贮液2L：54g Tris-base、27.5g硼酸、20ml 0.5M的EDTA（pH8.0）加水至1L，用水稀释10倍。
（三）实验时间
1、PCR链式反应：反应的整个时间约1.5h，反应结束后不要立即取出，在电泳使用时再取出。
2、质粒DNA的提取：严格按照实验步骤中的时间进行，尤其是每次离心的时间都要设定准确。
3、质粒DNA的酶切：试剂混合在37℃下水浴1～2h。
4、质粒DNA的定量：实验过程不要拖延太长时间，否则样品浓度会因为存放时间太长而变化；
5、琼脂糖凝胶电泳：凝胶已经提前制备好，因此直接点样即可。接通电源后电泳约25～30分钟。
（四）操作要点
1、加样枪的使用。用加样枪加样时，因为操作有误使加入液体过多，但经过纠正没有对实验造成严重影响。吸取液体时不需要将按钮按到底，否则吸取的液体会偏多，加液时要尽量把枪头内的液体全部挤出；
2、质粒DNA提取的操作要点在于混匀，必须按照步骤中的提示操作，是颠倒混匀、剧烈振荡或是温和混匀都不要弄错；
3、制备PCR反应物时要注意加入试剂的顺序，要按照操作要求依次加入；
4、琼脂糖凝胶电泳点样时，用移液抢将样品加至点样孔。每孔点样的体积为5μl，因此吸取每一个样品时，操作要稳当且细心。加样时，按钮按到第一档位即可，若按到第二档位可能会出现气泡。
五、实验现象
琼脂糖凝胶电泳结束后用紫外线检测仪直接观察结果，并拍下照片保存。
以下红色框内为本组的电泳结果，从左到右依次为质粒DNA、PCR目的条带和酶切片段。
六、原始实验数据
紫外分光光度法定量提取的质粒DNA 溶液得到的数据如下： DNA 浓度＝93.2μg /ml
260A /280A ＝1.52
【实验报告第三部分（结果与讨论）：①结果（定量实验包括计算）：应把所得的实验结果（如观察现象）和数据进行整理、归纳、分析、对比，尽量用图表的形式概括实验的结果；②讨论：不应是实验结果的重述，而是以结果为基础的逻辑推论。③结论：简单扼要，说明本次实验所获得的结果。（包括思考题）。评分（满分45分）： 】
七、结果与讨论： （一）结果
1、琼脂糖凝胶电泳得到结果如下：
M ：DL5000 DNA Marker
①：质粒DNA ；②：PCR 目的条带；③：酶切片段 2、紫外分光光度法定量提取的质粒DNA 溶液： DNA 浓度＝93.2μg /ml ；260A /280A ＝1.52 （二）结果分析：
1、①中可以观察到两条带，自下而上分别为：线性和开环质粒DNA 。在溶液S
2、
5000bp
3000bp 2000bp 1500bp 1000bp 750bp
← 酶切 长片段
↑
含目的DNA 片段的酶切短片段
S3作用下，原本应该出现在最下方的表示超螺旋质粒DNA 的条带不会出现。由于②中的全部质粒DNA 仍然为超螺旋型，所以只出现一条带，而且位置比①中两条带都靠下。③中上方的是酶切长片段，下方的是含目的DNA 片段的酶切短片段。
2、琼脂糖凝胶电泳拖尾的原因有以下两点：a 、样品浓度过高。这种情况稀释一下就行了。提取质粒的时候常出现这种情况。b 、蛋白杂质阻碍DNA 的泳动。提取基因组DNA 时常出现这种情况。
因此，①中条带拖尾现象严重，原因为样品浓度过高，可能也混杂了较多蛋白质。 3、纯净DNA 的260A /280A 比值为1.8；若比值＜1.8，说明样品中含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化DNA ；若比值＞1.8，说明仍有RNA ，可以考虑用RNA 酶处理样品。实验结果为1.52，说明样品中混杂了蛋白质。
八、思考题：
1、碱法提质粒中溶液I 、II 、III 的作用？
答：溶液Ⅰ：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活； 溶液Ⅱ：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性；
溶液Ⅲ：酸性条件下质粒DNA 复性，变性蛋白-SDS ＋线性DNA 沉淀，＋Na 可中和DNA 。
2、简述PCR 产物电泳出现非特异扩增条带的原因。
答：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是＋2Mg 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR 循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
3、根据实电泳结果，结合理论知识，写出质粒DNA 、酶切产物、PCR 扩增产物的片段大小应该为多少。
答：质粒DNA 片段大小应根据酶切后变成线性的DNA 片段进行判断，则其大小为3000
＋1000＝4000bp；酶切产物中酶切长片段为3000bp，含目的DNA片段的酶切短片段为1000bp；PCR扩增产物的片段大小为1000bp。