NIRF is frequently upregulated in colorectal cancer and its oncogenicity can be suppressed by let-7a microRNA
Feng Wang a ,Peng Zhang a ,Yanlei Ma a ,Jianjun Yang a ,Mary Pat Moyer b ,Chenzhang Shi a ,Jiayuan Peng a ,Huanlong Qin a ,?
a Department of Surgery,Sixth People’s Hospital Af?liated with Shanghai Jiao Tong University,Shanghai,China b
INCELL Corporation,San Antonio,TX 78249,United States
a r t i c l e i n f o Article history:
Received 26May 2011
Received in revised form 16September 2011Accepted 26September 2011
Keywords:NIRF Let-7a CRC
Overall survival Oncogenicity
a b s t r a c t
Np95ICBP90RING ?nger (NIRF)is essential for the regulation of cell proliferation and has been implicated in tumorigenesis.However,the role of NIRF in colorectal cancer (CRC)remains unclear.In this study,we demonstrated that NIRF expression was aberrantly increased in CRC tissues and associated with poor overall survival.Bioinformatics analysis indicated that NIRF was a putative target of the microRNA let-7a,which was con?rmed by luciferase reporter assay.We then demonstrated in vitro that enforced expression of let-7a,or knockdown of NIRF,led to reduced CRC cell proliferation due to cell cycle arrest at the G0/G1phase and reduced cell migration.Finally,an in vivo tumorigenicity assay in nude mice showed that synthetic let-7a suppressed NIRF expression and reduced tumor growth.Taken together,our results provide new evidence that NIRF has an oncogenic role in CRC.This opens up the possibility of targeting NIRF and let-7a for CRC therapy.
ó2011Elsevier Ireland Ltd.All rights reserved.
1.Introduction
Colorectal cancer (CRC)is one of the most common can-cers and is a signi?cant contributor to cancer death [1].
Despite recent advances in the diagnosis and treatment of CRC,the overall prognosis for CRC patients remains poor.Therefore,there is an urgent need to develop novel therapeutic approaches for CRC.To achieve this,a deeper understanding of the molecular and genetic networks that control the initiation and progression of CRC is imperative.Np95ICBP90RING ?nger (NIRF)protein belongs to the ubiquitin plant homeo domain (PHD)really interesting new gene (RING)?nger (UHRF)family and is encoded by a gene located on chromosome 9p23-24[2].NIRF protein possesses several diverse structural domains,including an NIRF_N domain,a PHD ?nger,a set-and ring-associated (SRA)domain,and a RING ?nger domain,some of which have been shown to be essential for the regulation of cell proliferation [3].Several studies have investigated the potential role of NIRF in cancers with contradictory results,suggesting the dual potential of NIRF as tumor suppressor or oncogene in malignant cells [2,4–6].
MicroRNAs (miRNAs)are a class of short,highly con-served non-coding RNAs that regulate the expression of
0304-3835/$-see front matter ó2011Elsevier Ireland Ltd.All rights reserved.doi:10.1016/j.canlet.2011.09.033
Abbreviations :CRC,colorectal cancer;CT,cycle threshold;dsRNA,double-stranded RNA;ICBP90,inverted CCAAT box binding protein of 90kDa;IHC,immunohistochemistry;mRNA,messenger RNA;miRNA,microRNA;NIRF,Np95ICBP90RING ?nger;PHD,plant homeodomain;qRT-PCR,quantitative real-time reverse-transcription PCR;RING,really interesting new gene;ROC,receiver operating characteristic;RT-qPCR,reverse transcription followed by quantitative real-time PCR;siRNA,small interfering RNA;SRA,set-and ring-associated;MTT,methyl-thiazolyl-tetrazolium;NC,negative control;PCNA,proliferating cell nuclear antigen;PCNP,PEST-proteolytic signal containing nuclear pro-tein;UHRF,ubiquitin PHD RING ?nger;UHRF2,ubiquitin-like with plant homeo domain (PHD)and ring ?nger domains 2;UTR,untranslated region.
?Corresponding author.Address:Department of Surgery,Sixth People’s Hospital Af?liated with Shanghai Jiao Tong University,600Yishan Road,Shanghai 200233,China.Tel.:+862164361349;fax:+862164368920.
E-mail address:hlong_qin@https://www.doczj.com/doc/1f9174239.html, (H.Qin).
target genes through messenger RNA(mRNA)decay or translation repression[7].Abnormalities of miRNA expres-sion have been observed in various types of human cancers and are correlated with the prognosis and survival of can-cer patients[8,9].Emerging data suggest that miRNAs may function as oncogenes or tumor suppressor genes and play a critical role in cancer development[10].
Using bioinformatic algorithms and luciferase reporter assay,in this study we found that NIRF is a target of let-7a,a common tumor suppressor miRNA.We wondered which role NIRF played in CRC(tumor suppressor or onco-gene)and whether it was regulated by let-7a miRNA.We ?rst compared NIRF expression between CRC tissues and paired normal colorectal tissues to determine if NIRF had potential as a novel prognostic biomarker for CRC.Then we explored the association between let-7a and NIRF in CRC and the implications of this association in the tumor-igenesis of CRC.
2.Materials and methods
2.1.Patient samples
The Ethics Committee of the Sixth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University,approved this study.A total of164CRC patients were enrolled;all gave written informed consent.The patients underwent surgical resection of tumors at the Sixth People’s Hospital,Shanghai Jiao Tong University between2003and2007,during which samples of cancer and adjacent non-tumor tissues were collected.No patients received chemotherapy or radiother-apy before the surgery.
The matched non-tumor adjacent tissue was obtained from a segment of the resected specimens that was the far-thest from the tumor(>10cm).Tissue samples were col-lected,snap-frozen in liquid nitrogen,and stored atà80°C until used.All tissues were histologically con?rmed to be adenocarcinoma of the colon or rectum.
2.2.Tissue microarray construction and immunohistochemistry(IHC)
Formalin-?xed and paraf?n-embedded tissue cylinders (diameter2mm)were punched from morphologically rep-resentative tissue areas and gathered into one recipient paraf?n block(3?2.5cm)using a homemade semi-automated tissue arrayer.Five composite tissue microarray blocks with328tissue cores were designed and cut into 5l m sections.To block endogenous peroxidase,dewaxed paraf?n sections were treated for30min with methanol containing1%hydrogen peroxide.After washing in Tris buffer,slides were incubated with anti-human NIRF pri-mary antibody(rabbit polyclonal,1:250dilution,Abcam, Cambridge,UK).For immunostaining,a peroxidase-conju-gated goat anti-rabbit antibody(Zhongshan Goldenbridge Biotechnology,Beijing,China)was used,following the manufacturer’s guidelines.
NIRF staining was assessed under a light microscope by two independent investigators.The reading of tissue slides was masked and both assessors were unaware of clinical outcomes.Staining was considered positive for NIRF when a strong coloration was evident in the epithelial cells, mostly in the nucleus.Tissues were scored semi-quantita-tively by counting the positive nuclei of10separate?elds at?400magni?cation in the areas with the highest density of positive nuclei.The appropriate cutoff score was obtained using receiver operating characteristic(ROC) curve analysis[11].Brie?y,taking the percentage score as the independent variable,the sensitivity and speci?city values for tumor or adjacent non-tumor tissue were plot-ted,generating an ROC curve.The score closest to both maximum sensitivity and speci?city,[i.e.,the point(0.0, 1.0)on the curve]was selected as the cut-off score.Positive staining above or below the cutoff scores was classi?ed as positive or negative,respectively.
2.3.Cell culture and transfection
The CRC cell lines LoVo,SW480,DLD1,and Caco2were obtained from the American Type Culture Collection and cultured at a density of1?105cells/mL in a humidi?ed 5%CO2atmosphere at37°C.LoVo,SW480,DLD1,and Caco2were maintained in F-12Ham’s nutrient mixture with Kaighn’s modi?cation,Leibovitz’s L-15,RPMI-1640, and Dulbecco’s modi?ed Eagle’s medium,respectively. The normal human colon epithelial cell line NCM460was provided by Incell Corporation(San Antonio,TX)and cul-tured in M3base culture media as previously described [12,13].All media were supplemented with10%fetal bovine serum and appropriate antibiotics.
The following sequences were designed and synthesized by GenePharma(Shanghai,China):synthetic let-7a(let-7a-mimics)50-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-30;synthetic let-7a inhibitor(let-7a-inhibitor)50-AACUAUACAACCUACU ACCUCA-30;let-7a mimics control(short dsRNAs similar to Dicer-processed miRNAs[14],let-7a-mimics-control)50-U UCUCCGAACGUGUCACGUTT-30;let-7a inhibitor control (let-7a-inhibitor-control)50-CAGUACUUUUGUGUAGUACA A-30;the siRNA targeting NIRF(NIRF-siRNA)50-GAUCCU GGCUUUGGAAUAUTT-30;and the negative control siRNA (NC-siRNA)50-GGATCATAAGGCGCATAGC-30.
Transfection was performed with Lipofectamine2000 reagent(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)following the man-ufacturer’s protocol.A?nal concentration of50nM RNA (for mimics)or100nM(siRNA)and their respective nega-tive controls were used for each transfection in the follow-ing experiments.
2.4.Prediction of candidate miRNAs and luciferase reporter assay
The three most widespread and web-based bioinfor-matic algorithms(TargetScan,PicTar,and miRanda)were used to predict candidate miRNAs for binding to NIRF, based on complementarities of the nucleotide sequence of the30-untranslated region(UTR)of NIRF mRNA.To ver-ify the targeting of endogenous NIRF by miRNA,NIRF 30-UTR was ampli?ed by PCR,using the primers:forward, 50-CAAAGGACGATGATCTGCC-30and reverse,50-CTGATCA-TAAAATATTTATTAAGGT-30,with HepG2cell cDNA as a template.The product was puri?ed and cloned into the
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pTA2vector using a TA cloning kit(Toyobo Biotechnology, Shanghai,China),and then subcloned into the psiCHECK vector(Promega,WI,USA)at the XbaI site.DLD1cells were transfected with NIRF30-UTR or a control reporter vector by Lipofectamine2000and then cotransfected with miRNA let-7a-mimics or negative control.After36h,luciferase assay was performed using the Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)in triplicate.Fire?y luciferase activity was normalized to that of Renilla luciferase for each sample.
2.5.Real-time RT-PCR and Western blot
Total RNA was extracted from the tissues or cultured cells using Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA)for both miRNA and mRNA analyses.For the analysis of mature let-7a, quantitative PCR(RT-qPCR)was performed using the miS-cript PCR System(Qiagen,Hilden,Germany)according to the manufacturer’s instructions,and the following prim-ers:let-7a forward50-TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-30, U6forward50-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-30,and the universal reverse primer50-GCGAGCACAGAATTAATAC-GAC-30.Relative expression was calculated via the compar-ative cycle threshold(CT)method using the expression of U6small nuclear RNA as the reference.
NIRF mRNA level was quanti?ed by qRT-PCR using Quan-titect SYBR Green PCR Kit(Qiagen)and normalized to b-ac-tin with the following primers:NIRF forward50-TTCTACCGG GGCAAGCAGTT-30,and reverse50-CCAAAGCCAGGATCAATA AGACG-30;b-actin forward50-CCTGTACGCCAACACAGTGC-30,and reverse50-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-30.Changes in the expression were calculated using the2àDD Ct method [15].
Total protein was extracted from the specimens or cul-tured cells using a total protein extraction kit(Millipore, Billerica,MA,USA)according to the manufacturer’s instruc-tions.The protein content was determined using a bicinch-oninic acid(BCA)protein assay kit(Bio-Rad,Hercules,CA, USA)with bovine serum albumin as the standard.Proteins (20l g)were separated by SDS–PAGE and transferred onto polyvinylidene di?uoride membranes(Millipore).The membranes were blocked in5%non-fat milk in Tris-buf-fered saline with0.05%Tween-20at room temperature for 2h,then probed with antibodies against NIRF(1:3000dilu-tion,Abcam)or b-actin(1:5000dilution,Sigma,St.Louis, MO),and?nally developed with an enhanced chemilumi-nescence kit(Amersham Life Science,Little Chalfont,UK).
2.6.Cell proliferation assay and?ow cytometry analysis
Cell proliferation was measured with a methyl-thiazolyl-tetrazolium(MTT)assay.Twenty-four hours after transfec-tion,cells were seeded at a density of5?103/well into96-well plates and cultured for24,48,72,or96h.The cells were then incubated with20l L MTT(5mg/mL)for4h at37°C and150l L dimethyl sulfoxide was added to solubilize the crystals for10min at room temperature.The optical density was measured at490nm using an enzyme-linked immuno-sorbent assay reader.
For cell cycle analysis,48h after transfection the adhered cells were collected by trypsinization and centri-fuging at1000rpm for5min.The cells were incubated with propidium iodide(0.05mg/mL,Sigma)and RNase A (0.1mg/mL,Sigma)for30min at room temperature in the dark and analyzed using a BD FACSCalibur?ow cytometer and Cell-Quest software.
2.7.Cell migration and invasion assays
Cell migration and invasion assays were performed using Transwell chambers(8l m,Corning Costar,Cambridge, MA).Twenty-four hours after transfection,5?104cells in 200l L serum-free RPMI-1640medium were placed in the uncoated(migration assay)or1:10diluted Matrigel-coated (BD Biosciences,San Jose,CA,USA)upper chamber(invasion assay).The lower chamber was?lled with500l L complete RPMI-1640medium.After cells were incubated for24h at 37°C,cells on the top surface of the membrane were re-moved by wiping with a cotton swab.The cells that migrated to the bottom surface of the?lter membrane were stained with0.5%crystal violet solution and photographed in?ve preset?elds per insert.After that,the cells were eluted with 33%acetic acid,and the absorbance optical density values for the positively stained cells were measured by microplate reader(Bio Tek)at570nM.
2.8.Tumorigenicity assay in nude mice
Six-week-old female BALB/c athymic nude mice (Chinese Academy of Sciences,Shanghai,China)were sub-cutaneously injected in the right?ank with1.5?106cells in0.1mL phosphate buffered saline(PBS).Once cancer cells developed palpable tumors,caliper measurements were performed daily and tumor volume(V)was calcu-lated using the formula V=(L?W2)/2,where L was the length and W was the width of the tumor.When tumors reached an average volume of100–150mm3,the mice were randomly divided into four groups(n=5)for daily intratumoral injection of let-7a-mimics,let-7a-mimics-control,or transfection agent or PBS as controls for28days. For each injection,5l g miRNA let-7a-mimics or let-7a-mimics-control was mixed with8l L in vivo transfection reagent(Entranster?-in vivo,Engreen,China)and hydrated with PBS at a concentration of50l g/mL to achieve the desired dose.
Growth curves were plotted using average tumor vol-ume within each experimental group at the set time points.The tumor volumes of the mice were recorded for 28days,after which the mice were euthanized.The dis-sected tumors were collected and prepared for RNA and protein isolation,and IHC staining.All animal experiments were approved by the animal center of the Sixth People’s Hospital af?liated with Shanghai Jiao-Tong University.
2.9.Statistical analyses
Data were presented as mean±standard deviation(SD) from at least three independent experiments.Statistical analyses were performed by SPSS software13.0(SPSS, Chicago,IL).A paired Student’s t-test was performed to eval-uate the difference in NIRF expression between CRC and cor-responding adjacent non-cancer tissues.ROC curve analysis
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was used to determine the cut-off points upon which to di-vide groups to compare different parameters and perform the survival analysis.The v2and Fisher’s exact tests were performed to determine the associations between NIRF expression and clinicopathological parameters.Correlations between the expressions of let-7a and NIRF mRNA or protein were calculated using Spearman’s rank correlation.The effects of protein expression on overall survival were evalu-
Correlation analysis revealed that NIRF expression was positively cor-related with tumor size,depth of invasion,positive lymph node and metastasis to other organs,and negatively correlated with Dukes staging (P<0.05),but was not correlated with patient age,gender,tumor loca-tion,differentiation or venous invasion(P>0.05;Table1).Furthermore, according to the Kaplan–Meier test the patients with positive NIRF stain-ing had shorter survival than those with negative NIRF staining (P=0.024;Fig.1C).
226 F.Wang et al./Cancer Letters314(2012)223–231
F.Wang et al./Cancer Letters314(2012)223–231227
Table1
Association between patients’characteristics and NIRF expression in164CRC cases.
Clinicopathologic variable NIRF expression Total(n=164)v2P
Positive(n=115)Negative(n=49)
Age(years)
P6084391230.7860.375 <60311041
Gender
Male6328910.0770.781 Female522173
Tumor size(cm)
P5*******.1880.007 <5422971
Tumor location
Right colon411455 2.3020.316 Left colon431659
Rectum311950
Histology differentiation
Well and moderate7839117 2.3260.127 Poor371047
Depth of invasion
Tis-T27142115.558<0.001 T3-T410835143
Venous invasion
Yes8331114 1.2870.271 No321850
Positive lymph nodes
Yes66137913.107<0.001
3.3.NIRF upregulation is correlated with reduced let-7a levels in CRC tissues and human colon cancer cells
To reveal the relationship between NIRF and let-7a expression levels in CRC,we performed RT-qPCR to detect let-7a miRNA,and qRT-PCR for NIRF mRNA levels,and Western blot analysis for NIRF protein levels,in human CRC tumor tissues,adjacent non-tumor tissues,and cell lines.
further examine whether the decreased proliferation of DLD1cells was due to cell cycle arrest,cell cycle progression was analyzed by propidium iodide staining and?ow cytometry.The results showed that DLD1cells that had been transfected with let-7a-mimics or NIRF-siRNA were obvi-ously arrested at the G0/G1phase(Fig.4B and C).Collectively,these data suggest that let-7a suppresses NIRF expression,which induces cell cycle arrest and leads to reduced cell proliferation and migration.
228 F.Wang et al./Cancer Letters314(2012)223–231
the?nal administration.The results showed that NIRF mRNA and protein levels were inversely correlated with increased accumulation of let-7a in let-7a-treated groups,compared to tumors that received mimics-NC, Entranster transfection reagent,or PBS(Fig.5D and E).
Furthermore,we performed IHC on the xenografts using antibodies speci?c to NIRF or proliferating cell nuclear antigen(PCNA),a standard marker for cellular proliferation.As shown in Fig.5F,DLD1cells displayed reduced levels of NIRF and PCNA in response to let-7a treatment.This observation is in accordance with our previous observations that let-7a suppressed the expression of NIRF.Based on these data we conclude that synthetic let-7a miRNA successfully entered DLD1tumor cells to suppress NIRF expression,leading to reduced tumor growth.
4.Discussion
UHRF is a nuclear protein family identi?ed recently,and its members mainly function as transcription factors involved in the regulation of cell proliferation.ICBP90 (inverted CCAAT box binding protein of90kDa)is the most studied member of this family,and has been suggested as a potential oncoprotein in many malignant tumors[3].NIRF possesses several diverse structural domains which in-clude an NIRF_N domain,a PHD?nger,an SRA domain, and a RING?nger domain,some of which are shared by ICBP90and con?rmed to play a critical role in cell prolifer-ation[16–18].
In the present study,we found that NIRF expression at both the mRNA and protein levels was signi?cantly higher in CRC tumor tissues than in matched non-tumor tissues. Furthermore,its overexpression was associated with malignant clinicopathological features and short survival of CRC patients.In CRC cells in vitro,knockdown of NIRF by siRNA led to reduced cell proliferation and migration. These results reveal the oncogenic features of NIRF in CRC.Indeed,it has been reported that the tumor cells HT-1080(human?brosarcoma)and HepG2(human hepa-tocellular carcinoma)express constitutively high levels of NIRF mRNA.A study by Mori et al.[2]found that prolifer-ating normal human fetal lung?broblasts expressed high levels of NIRF mRNA,which was largely repressed
upon
growth arrest.However,Mori et al.[19]reported that NIRF has the capability of being a ubiquitin ligase for PEST-proteolytic signal containing nuclear protein(PCNP)ubiq-uitination,therefore modulating cellular homeostasis.In another study they found that NIRF was involved in cell cycle control as a negative regulator[4].These discrepant ?ndings suggest that NIRF may play dual roles as a tumor suppressor or an oncogene depending on the cellular con-text,similar to transforming growth factor b(TGFB)[20].
There is accumulating evidence that the aberrant expres-sion of miRNAs is linked to the development of CRC[21,22]. Sophisticated computer-based approaches for miRNA identi?cation and target prediction,combined with validation techniques to con?rm these predictions,have contributed greatly to the discovery of new miRNAs and their functional characterization.Consequently,small mol-ecule mediated dysregulation of miRNA emerges as a poten-tial new therapeutic approach for human diseases including cancer[23].Among human cancer-related miRNAs,the let-7family has attracted signi?cant attention because its fam-ily members are expressed aberrantly in a variety of cancers. As a member of the let-7miRNA family,let-7a has been re-ported to be expressed at lower than normal levels in many cancers including CRC[24–26],and also to play a role in
the
inhibition of tumor growth by targeting oncogenes such as Ras[27],HMGA2[24],c-Myc,and several genes related to the cell cycle[25,26].
The current study provides several lines of evidence that NIRF is a novel target of let-7a and their antagonistic interaction plays an important role in the development of CRC.First,the luciferase reporter assay demonstrated that luciferase activity,under the control of the NIRF30-UTR, could be regulated by let-7a.Moreover,this downregula-tion was mediated by the direct binding of let-7a miRNA to the NIRF30-UTR,because the deletion of this region abrogated this effect.Secondly,an inverse correlation between NIRF and let-7a levels was observed in CRC tissues and cell lines.Thirdly,overexpression of let-7a sup-pressed NIRF levels and led to reduced cell proliferation and migration in CRC cells.Finally,the results of the in vivo tumorigenicity assay in nude mice showed that synthetic let-7a suppressed NIRF expression and reduced tumor growth.
Interestingly,a recent study in lung cancer showed that let-7a negatively regulated the expression of NIRF,and NIRF was required for let-7a-mediated elevation of p21WAF1[6]. Our results are consistent with this report,and support the contention that the antagonistic association between NIRF and let-7a may be a phenomenon commonly occurring dur-ing the development of different cancers.
In summary,in this study we demonstrated that NIRF is frequently upregulated in CRC and is a potential oncogene for CRC development.A further large-scale survey is needed to evaluate the potential of NIRF as a novel biomarker for CRC.In addition,our results show that let-7a negatively reg-ulates NIRF expression and inhibits CRC tumorigenesis in nude mice.These?ndings open up the possibility of apply-ing let-7a miRNA toward clinical CRC treatments.
Acknowledgments
This study was supported by Grants from the Ph.D. Grant of Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (No.BXJ201137),the Major Basic Research Program of Shanghai(No.07DZ19505),and the National973Basic Research Program of China(No.2008CB517403). Appendix A.Supplementary data
Supplementary data associated with this article can be found,in the online version,at doi:10.1016/j.canlet.2011.
09.033.
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let-7microRNA family,Cell120(2005)635–647.
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.. 一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout） 常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。 二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout） 条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。 条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。 三、基因敲入小鼠（Knockin） 基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。 此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。 获得嵌合体及之后品系纯化详细流程： 基因敲除其他方法： 一、ZFN技术制作基因敲除鼠 ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。 这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。 二、TALEN技术制作基因敲除鼠 TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。 ;.
NAD/NADH 和NADP/NADPH对细胞功能和细胞 死亡的调节和生物学影响 Ⅰ.前言 Ⅱ.NAD和NADP代谢 A.NAD和NADP的主要介绍 B.NAD的合成 C.NADP的合成 D.NAD和NADP的分解代谢 E.NAD和NADP之间的关系 F.NAD通过线粒体膜的运输 G.NAD通过细胞质膜的运输 Ⅲ. NAD和NADP的生物学功能 A.NAD和NADP的生物学功能的一般介绍 B.NAD和NADP的抗氧化作用和氧化应激 C.NAD和NADP在钙平衡中的作用 D.NAD和NADP在能量代谢和线粒体功能中的作用 E.NAD和NADP对基因表达的影响 F.NAD和NADP的免疫功能 G.NAD和NADP在血管活动中的作用 H.NAD和NADP在致癌和癌症治疗中的作用 I.NAD和NADP在衰老中的作用 Ⅳ. NAD和NADP参与细胞死亡
A.PARP-1 和NAD在细胞死亡中的作用 B.PARG在细胞死亡中的作用 C.NAD在细胞凋亡中的作用 D.NAD在轴突变性中的作用 E.AIF 和GADPH在细胞死亡中的作用 F.NADP在细胞死亡中的作用 Ⅴ. NAD和NADP的治疗作用 A.NAD+前体的治疗作用 B.NAD+的治疗作用 C.NADH的治疗作用 D.NADPH氧化酶的治疗修饰作用 Ⅵ. 结论 摘要 大量的证据表明NAD（NAD+和NADH）和NADP（NADP+和NADPH）是许多生物学过程如能量代谢、线粒体功能、钙平衡、抗氧化作用∕氧化应激的形成、基因表达、免疫功能、衰老和细胞死亡的主要调节物质。首先，NAD参与了能量代谢和线粒体功能的调节；其次，NADPH是细胞抗氧化系统的一个关键组份，并且在线粒体上依赖于NADH的活性氧簇的形成和依赖于NADPH氧化酶活性氧的形成是活性氧生成的两个关键代谢机制；第三，ADP-核糖和一些其它的由NAD和NADP衍化而来的分子能够参与钙平衡；第四，NAD 和NADP能够调节细胞死亡的多个关键因子，如线粒体通透性的改
传统ES 打靶基因敲除/敲入小鼠技术 技术原理 传统的基因打靶技术制备基因敲除（KO ）/敲入（KI ）基因打靶技术是建立在DNA 同源重组与胚胎干细胞等技术基础上的分子生物学技术。 同源重组是指当外源DNA 片段与宿主基因组片段同源性高时，同源DNA 区部分可 与宿主DNA 的相应片段发生交换（即同源重组）。 基因打靶就是通过同源重组技术将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的。基因打靶技术目前已被广泛认为是一种理想的特定修饰与改造生物体遗传物质的最佳方法。尤其是条件性和诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因在时间和空间上的靶位修饰更加明确、效果更加精确可靠， 该技术 的发展已经为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究和治疗手段，并已显示出巨大的应用前景及商业价值。 服务流程和周期 、管路敷设技术通过管线不仅可以解决吊顶层配置不规范高中资料试卷问题，而且可保障各类管路习题到位。在管路敷设过程中，要加强看护关于管路高中资料试卷连接管口处理高中资料试卷弯扁度固定盒位置保护层防腐跨接地线弯曲半径标高等，要求技术交底。管线敷设技术中包含线槽、管架等多项方式，为解决高中语文电气课件中管壁薄、接口不严等问题，合理利用管线敷设技术。线缆敷设原则：在分线盒处，当不同电压回路交叉时，应采用金属隔板进行隔开处理；同一线槽内，强电回路须同时切断习题电源，线缆敷设完毕，要进行检查和检测处理。、电气课件中调试对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行 高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料试卷相互作用与相互关系，根据生产工艺高中资料试卷要求，对电气设备进行空载与带负荷下高中资料试卷调控试验；对设备进行调整使其在正常工况下与过度工作下都可以正常工作；对于继电保护进行整核对定值，审核与校对图纸，编写复杂设备与装置高中资料试卷调试方案，编写重要设备高中资料试卷试验方案以及系统启动方案；对整套启动过程中高中资料试卷电气设备进行调试工作并且进行过关运行高中资料试卷技术指导。对于调试过程中高中资料试卷技术问题，作为调试人员，需要在事前掌握图纸资料、设备制造厂家出具高中资料试卷试验报告与相关技术资料，并且了解现场设备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况，然后根据规范与规程规定，制定设备调试高中资料试卷方案。 、电气设备调试高中资料试卷技术电力保护装置调试技术，电力保护高中资料试卷配置技术是指机组在进行继电保护高中资料试卷总体配置时，需要在最大限度内来确保机组高中资料试卷安全，并且尽可能地缩小故障高中资料试卷破坏范围，或者对某些异常高中资料试卷工况进行自动处理，尤其要避免错误高中资料试卷保护装置动作，并且拒绝动作，来避免不必要高中资料试卷突然停机。因此，电力高中资料试卷保护装置调试技术，要求电力保护装置做到准确灵活。对于差动保护装置高中资料试卷调试技术是指发电机一变压器组在发生内部故障时，需要进行外部电源高中资料试卷切除从而采用高中资料试卷主要保护装置。
敲除小鼠常见问题与回答 一、什么是ES细胞显微注射？ 答：胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。所得嵌合体小鼠的组织，将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递，这样可能获得转基因或打靶基因（来源于胚胎干细胞）稳定的生殖系传递的小鼠。一般情况下，大约能获得50%继承了目的基因的后代。 二、嵌合体 遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此能够耐受,不产生排斥反应,相互间处在嵌合 状态。在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞，使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞，产生的个体也叫嵌合体，即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞（一种是基因型被改变了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞）。 三、条件性敲除的原理？ 答：Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。 四、如何鉴定和挑选嵌合体？ 答：动物只有部分组织细胞整合有外源基因，则称为嵌合体动物。它的鉴定主要根据毛色去鉴定。注射的ES和囊胚来源不同的小鼠品系。它们的毛色不同。因此可以根据毛色的嵌合率来鉴定和挑选嵌合体。
基因敲除技术 点击次数: 2605 发布日期: -5-25 来源: 本站仅供参考, 谢 绝转载, 否则责任自负 1．概述: 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术, 是经过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。一般意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理, 用设计的同源片段替代靶基因片段, 从而达到基因敲除的 目的。随着基因敲除技术的发展, 除了同源重组外, 新的原理和技术也逐渐被应用, 比较成功的有基因的插入突变和iRNA, 它们同样能够达到基因敲除的目的。2．实现基因敲除的多种原理和方法: 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初, 胚胎干细胞( ES细胞) 分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年, 首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到 1987年, Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在, 运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的 使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1):
图1.基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤 a．基因载体的构建: 把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子 都重组到带有标记基因(如neo 基因, TK 基因等)的载体上, 成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能, 因此一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得: 现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞, 最常见的是鼠, 而兔, 猪, 鸡等的胚胎干细胞也有使用。常见的鼠的种系是１２９及其杂合体, 因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向, 是基因敲除的理想实验动物。而其它遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2, 3] ｃ．同源重组: 将重组载体经过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中, 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组, 将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中, 从而得以表示。一般地, 显微注射命中率较高, 但技术难度较大, 电穿孔命中率比显微注射低, 但便于使用。[4,5] ｄ．选择筛选已击中的细胞: 由于基因转移的同源重组自然发生率极低, 动物的重组概率为10－2～10-5, 植物的概率为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。当前常见的方法是正负筛选法( PNS法) , 标记基因的特异位点表示法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。[6]
siRNA转染常见问题解答 SiRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。其中，化学转染技术是目前最为常用的方法，由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。 针对最常见的化学转染技术，有几种常见的问题以及解决方法。 一、哪种转染试剂效果好？ 在选择转染试剂时，一般要考虑的是结合特定的细胞株，而不是被导入细胞中的物质。选择细胞毒性小，转染效率高的转染试剂。脂质体试剂的毒性较大，建议选择非脂质体的转染试剂，如BIODAI的RFect系列纳米材料转染试剂。 二、转染后出现细胞死亡是什么原因？如何优化转染条件？ 转染后细胞死亡，原因也是多样的，如脂质体毒性，转染浓度过高，转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生，这种情况下就需要适当优化转染条件；在优化转染条件时需要考虑以下因素：转染试剂和细胞特有的自身条件。例如：siRNA 与转染试剂的比例、转染时间、细胞传代数和细胞密度等。一般说，转染试剂毒性小，转染时所需的细胞密度就小，如RFect系列siRNA转染试剂一般要求30-50%细胞密度，而lipo2000转染时所需的细胞密度一般在70%左右。如果经优化后细胞死亡仍很多，应及时考虑更换转染试剂。 三、如何优化siRNA与转染试剂的比例？ SiRNA的量与转染试剂的比例需要进行优化，一般选择24孔板进行优化，比 较节省各种试剂。可以在10-100nM之间设定几个siRNA的浓度水平，如30nM， 50nM，80nM，100nM。转染试剂根据说明书推荐的剂量上下浮动各3个浓度。之后siRNA的量与转染试剂的量进行两两组合，从中选择转染效率最高的组合用于接下 来的实验。如果通过荧光显微镜观察荧光判断转染效率的话，siRNA的最低终浓度 不要低于10nM，一般推荐的siRNA终浓度多在50-100nM。这里需要说明的是，以
https://www.doczj.com/doc/1f9174239.html, 基因打靶技术在构建基因敲除或敲入细胞系中的应用 时文涛，邵荣光 （中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所，北京100050） 摘要：同源重组介导的基因打靶技术是一项判定哺乳动物基因功能的强有力工具。在过去的十几年中，应用于转基因小鼠的基因敲除∕敲入技术经过必要的完善后进一步被应用于人源细胞。本文介绍了在人源细胞系中基因打靶技术应用的优势与局限性、可应用细胞系的选择、基因打靶的基本方法，并比较系统地讲解了重组腺相关病毒介导的基因打靶的实验设计，以使读者对这项技术的应用有一个基本的了解。 关键词：基因打靶；基因敲除∕敲入；重组腺相关病毒 The Application of G ene T argeting T echnology in C onstructi onstructing ng G ene K nockout and K nockin C ell L ines Wen-tao Shi，Rong-guang Shao （Institute of Medicinal Biotechnology,Chinese Academy of Medical Sciences& Peking Union Medical College,Beijing100050,China） Abstract：Homologous recombination-mediated gene targeting technology is the most powerful technique available for analysis of mammalian gene function.Over the past decade years,the methods used to generate knockout and knockin mice have been modified for use in cultured human cells.In this paper,the advantages and limitations of gene targeting technology,suitable cell lines for gene targeting and the basic method for generating knockout/knockin cell lines are introduced.Moreover,we also systematically describe the experimental design of rAAV-mediated gene targeting to enable readers to basically understand the application of this technology. Key words：Gene targeting；Knockout；Knockin；rAAV 基金项目：教育部博士点基金（No:20070023017）
转基因生物安全性 1998年8 月，英国阿伯丁罗威特研究所教授普兹泰发现老鼠食用转基因土豆之后免疫系统受到破坏，普兹泰进一步推论，很多消费者也象被用于试验的老鼠一样食用没有经过严格鉴定的转基因食品。该消息的发布，使世界各国如日中天的转基因热潮蒙上了一层阴影。人们开始疑惑：转基因技术-改造自然还是破坏自然？造福人类还是给人类带来灾难性的毁灭？ 北京生物技术和新医药产业促进中心举办第七次生命科学前沿讨论会--基因工程和生物安全性问题，邀请了部分在京的转基因专家，畅谈讨论，旨在为我国转基因生物安全管理出谋划策。 从本世纪80年代世界上第一例转基因植物的诞生，到目前全世界大约2780万公顷的转基因作物，到利用转基因动物生物反应器大量生产医用蛋白，人类将最新的生物技术应用于医药、食品、农业领域以摆脱自然对传统作业的限制。1998年8 月，英国阿伯丁的罗威特研究所教授普兹泰发现老鼠食用转基因土豆之后免疫系统受到破坏，普兹泰进一步推论，很多消费者也象被用于试验的老鼠一样食用没有经过严格鉴定的转基因食品。该消息的发布，使世界各国如日中天的转基因热潮蒙上了一层阴影。人们开始疑惑：转基因技术--改造自然还是破坏自然？造福人类还是给人类带来灾难性的毁灭？ 转基因植物是把来源于任何生物甚至人工合成的基因转入植物。这可能是自然界无法发生的，人们也无法预测基因进入一个新的遗传背景中会产生什么样的作用。转基因动物，一是将正常人的基因片断导入动物体内，让这种基因在哺乳动物体内表达，并通过该动物分泌的奶或其他组织，提取获得具有活性的分泌物质，获得大量廉价的珍稀药物；另一方向是利用转基因动物培养人体器官，解决人体器官移植供体短缺问题。 利用转基因技术人为地打破自然界世代沿袭的性状平衡，究竟会带来什么样的后果？基于以上疑虑，基因工程生物安全性的评价成为人们日益关注的焦点。 目前对转基因植物的安全性评价一方面是环境安全性，另一方面是食品安全性。 环境安全性评价的核心问题是转基因植物释放到田间后，是否会将所转基因移到野生植物中，是否会破坏自然生态环境，打破原有生物种群的动态平衡。包括：1)转基因植物演变成农田杂草的可能性。2)基因漂流到近缘野生种的可能性。 3)对生物类群的影响。 关于食品的安全性 经和组织（OECD）1993年提出了食品安全性评价的实质等同性原则。如果转基因植物生产的产品与传统产品具有实质等同性，则可以认为是安全的。反之，
转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项 高度标准化的新兴产业 一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies 于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程 图2.基因敲除鼠制作过程示意图 1. Knockout载体设计与构建
如何设计条件性基因敲除小鼠模型 摘要： 小鼠和大鼠可谓是生命科学实验室里的明星，成功的小鼠和大鼠模型可谓是“生命科学的好帮手”。很多人可能想自己设计或是了解条件性基因敲除小鼠，在此做个小结，供大家参考。 小鼠和大鼠可谓是生命科学实验室里的明星，成功的小鼠和大鼠模型可谓是“生命科学的好帮手”。很多人可能想自己设计或是了解条件性基因敲除小鼠，在此做个小结，供大家参考。 条件性基因敲除小鼠的设计利用了Cre/LoxP或Flipe/Frt原理。它们都是位点特异性重组酶系统。这里以Cre/LoxP系统为例。比如在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个loxP序列，得到flox(flanked by loxP)小鼠。将flox小鼠与带有细胞特异性表达Cre 的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。此外，若与控制Cre表达的其他诱导系统(比如CreERT2)相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。 Cre/loxP系统来源于噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。该系统含有两个组成成分：一个是一段长34bp的DNA序列(LoxP序列)，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。LoxP的方向由中间这8个碱基决定。这段LoxP序列是Cre重组酶识别的位点。令一个组成部分是Cre重组酶。它是由噬菌体编码的一种由343个氨基酸组成的蛋白。Cre可以介导两个LoxP位点的重组，从而引起两个LoxP之间DNA序列的缺失。如果将Cre重组酶cDNA通过基因工程的手段置于组织或细胞特异性启动子之下，可以得到Cre组织/细胞特异性表达的Cre小鼠，也叫Cre工具小鼠。跟Flox小鼠交配之后，可以得到条件性基因敲除小鼠。 所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个LoxP序列。这段序列就是Flanked by LoxP，也就叫做Flox小鼠。这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得。这种小鼠跟Cre工具小鼠交配，由于Cre的表达，介导两个LoxP位点序列的重组，从而敲除两个LoxP之间的序列。由于不同Cre工具小鼠的Cre表达有组织/细胞特异性，就可以达到在不同组织、细胞里特异性敲除目的基因的目标。比如上皮细胞、胸腺细胞、T细胞、B细胞、心肌细胞、肠道、肺脏等。 那如何设计条件性基因敲除小鼠呢?这里所说的设计主要是Flox小鼠的设计。所谓条件性敲除，是说除了特定细胞外，其它细胞里面没有任何的基因表达异常。一般情况下，不要在第一个外显子前面放置LoxP序列。因为第一个外显子前面一般是启动子。放置LoxP 序列有可能会破坏或改变启动子活性。条件性敲除一般是敲掉最早引起移码突变的外显子。这样的话，最好不要敲除有起始密码子ATG的外显子。否则的话，基因可能会利用ORF 内的ATG编码一个缺少部分N端序列的蛋白，这个蛋白很可能有全部或部分野生蛋白的功能。在选择要敲除的外显子的时候(各放一个LoxP在一个外显子的两侧)，该外显子的碱基数目不能是3N，否则新基因pre-RNA拼接得到的mRNA不能产生移码突变。会产生一个
条件性基因敲除的基本原理Cre／loxP重组系统条件性基因敲除主要是通过Cre／10xP或者Ftp／FRT重组系统来实现的。这 两个系统都是位点特异性重组酶系统，已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具。这两个系统的应用，可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。此外，若与控制Cre或Flp表达的其他诱导系统相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。 1．Cre／loxP系统的原理 Cre／loxP系统来源于F1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。这段34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus of X—over in P1)。②Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP 位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反)，如图所示。 Cre／loxP系统的作用机制 2．Cre／loxP系统优点 Cre／10xP系统之所以在基因敲除中获得了非常广泛的应用，是由该系统的诸多优点决定的：①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后，可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程，因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子；②loxP位点是一段较短的DNA序列，因此非常容易合成； ③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，因此可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用；④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下，从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点。 3．Cre／loxP系统的工作流程 利用Cre／loxP系统实现体内某特定基因在特定条件下的敲除，需要两只转基因小鼠。第一只小鼠一般采用胚胎干细胞技术获得，首先在体外构建一个在目的
条件性敲除的原理（图2，3）： 利用Cre／LoxP 和来自酵母的FLP—frt 系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型[7]。通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP 的(“loxP floxed”)ES 细胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后，通过将“lo xP floxed”小鼠与Cre 转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre 重组酶)，产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。在“loxP floxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一样。但当它与Cre 转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“loxP floxed”靶基因和Cre 基因。Cre 基因表达产生的Cre 重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP 间发生切除反应，结果将一个loxP 和靶基因切除。这样，靶基因的修饰(切除)是以Cre 的表达为前提的。Cre 的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性：即Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞；而Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。所以只要控制Cre 的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度[9,10]。
在生理学研究中，为了明确某一组织或器官的功能，常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切除部分的功能。生命科学发展到今天，人们对于生命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想仍然有效。具体地说，就是在分子水平破坏想要研究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整体形态、组织结构、发育过程的变化等，进而推测相应基因的功能。这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。此外，为了研究某种疾病与某个基因之间的关系，常向生物体内人为引入某个基因，然后观察实验动物出现的各种变化，从而推测疾病与基因的关系，这种研究方法称为基因敲人(gene knock in)。
转基因生物的安全性学案 学习目标 1．举例说明对转基因生物安全性问题的不同观点及论据。 2．形成对待转基因生物安全性问题的理性、求实的态度。 学习重点： （1）对转基因生物的安全性问题多层面、多角度的关注。 （2）运用生物学知识对不同观点的理由进行辨析和讨论。 学习难点： （1）从关注整个生物圈的和谐、稳定与发展的高度去审视转基因生物的安全性。 （2）了解有关转基因生物安全性问题争论背后复杂的政治、经济、宗教和伦理道德背景。（3）保证课堂讨论、辩论会，以及社会调查的组织工作有序而有效地实施。 一、转基因成果 1．微生物方面 (1)制造出具有重要经济价值的各种重组微生物，如清除石油污染的_______________。 (2)使用___________ ____，生产稀缺的生化药物，即_______________。 2．转基因动物方面 (1)在培育_____________、________ _______的转基因家畜、家禽方面不断取得辉煌成就。 (2)科学家把转基因动物(如奶牛)变成_______________，让它们的奶中富含某种营养物质、____________或人类所需要的____________。 3．转基因植物方面 (1)成果：目前科学家已经培育出了大批具有________、_______、抗除草剂、______等全新性状的农作物。 (2)推广国家及品种：全球种植转基因农作物的国家已经有十几个，种植面积最大的前四个国家分别是________、________、________和________，其中以种植________ _______最多，其次是______ _________和_________。
高中生物转基因生物的安全性2019年3月20日 （考试总分：130 分考试时长： 120 分钟） 一、单选题（本题共计 20 小题，共计 100 分） 1、（5分）下图是通过植物细胞工程技术获得紫杉醇的途径，下列叙述不正确的是 A．该途径依据的原理是植物细胞具有全能性 B．过程①需控制好培养基中植物激素的比例 C．经过程①细胞的形态和结构发生了变化 D．过程③需使用液体培养基，有利于细胞增殖 2、（5分）下列不属于基因工程成果的是 A．乳腺生物反应器生产药用蛋白 B．从大肠杆菌体内获得白细胞介素 C．从大肠杆菌内获得生长激素 D．用高产青霉菌生产青霉素 3、（5分）下图为真核细胞内某基因（15N标记）结构示意图，该基因的全部碱基中C占30%。下列说法正确的是 A．若该基因中含有180个碱基，则该基因中含有的氢键数目为180个 B．将该基因置于14N培养液中复制3次后，含15N的DNA分子占1/8 C．DNA解旋酶只作用于①部位，限制性核酸内切酶只作用于②部位 D．该基因的一条核苷酸链中（C+G）/（A+T）为3：2 4、（5分）下列有关基因工程的相关叙述中，正确的是 A．基因治疗就是去除生物体细胞中有缺陷的突变基因 B．运载体上抗性基因的存在有利于对目的基因是否表达进行检测 C．在基因工程操作中，剪切目的基因和质粒的限制性核酸内切酶可以不同 D．转基因技术造成的变异，实质上相当于人为的基因重组，但却产生了定向变异 5、（5分）下列有关基因身份证的说法,正确的是 A．基因身份证上可以检测到个人的所有基因 B．基因身份证只对少数、个别基因进行检测 C．用基因身份证去看病或预见将来已经实践应用 D．有基因身份证就可以治疗任何疾病 6、（5分）基因治疗给无数的遗传病患者带来了希望，下列关于基因治疗的叙述正确的是 A．基因治疗可以治愈所有的遗传病B．基因治疗就是对有遗传缺陷的细胞进行基因修复 C．基因治疗分为体内基因治疗和体外基因治疗，体外基因治疗操作简便，效果可靠 D．基因治疗时可用经过修饰的病毒或农杆菌的质粒作运载体 7、（5分）在畜牧养殖业上，科学家利用基因工程的方法培育出了转基因奶牛、超级绵羊等多种转基因动物。“转基因动物”培育利用的原理是 A．基因突变 B．基因重组 C．染色体结构变异 D．染色体数目变异 8、（5分）科学家现在已经能够实现了分子水平遗传物质的人工重组。下列实例中属于分子水平人工重组的是 A．克隆动物 B．能产生抗体的小鼠脾细胞与骨髓细胞的融合细胞 C．人类基因组计划 D．将人的α-抗胰蛋白酶基因导入到羊的DNA分子中 9、（5分）关于现代生物工程技术应用的安全性，下列说法不正确的是 A．中国对于克隆人的态度是不反对治疗性克隆，可以有限制的进行克隆人的实验 B．对待生物武器的态度明确而坚定，即坚决禁止生物武器 C．对转基因植物外源DNA要进行认真选择，避免产生对人体有害或过敏的蛋白质 D．反对设计试管婴儿的原因之一是有人滥用此技术选择性设计婴儿性别 10、（5分）目前科学家把兔子血红蛋白基因导入到大肠杆菌细胞中，在大肠杆菌细胞中合成了兔子的血红蛋白。下列所叙述的哪一项不是这一先进技术的理论依据 A．所有生物共用一套遗传密码子 B．基因能控制蛋白质的合成 C．兔子血红蛋白基因与大肠杆菌的DNA都是由四种脱氧核苷酸构成，都遵循碱基互补配对原则，都具有相同的空间结构 D．兔子与大肠杆菌有共同的原始祖先 11、（5分）下图是某DNA片段，下列有关该图的叙述中，错误的是 A．②③④组成DNA的基本组成单位 B．⑥在DNA中特定排列顺序可代表遗传信息 C．某限制性内切酶可选择①作为切点 D．DNA连接酶可连接⑤处断裂的化学键
条件性敲除小鼠 定义： 条件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠，与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。 ●CKO如何实现？ 重组酶系统（如：Cre-loxP）介导的位点特异性重组技术。 Cre是重组酶（38kDa），可识别34bp 长的DNA 序列loxP。loxP 两侧各13bp 构成回文结构，中间8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性。 （当DNA 分子上存在两个同向loxP 序列时，Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化，同时将loxP 两侧的序列进行连接；当DNA 分子上存在两个方向相反的loxP 序列时，Cre 可导致loxP 之间的序列发生反转。） ●CKO敲除的是什么？ 条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre 重组酶识别的loxP 序列，这种基因称为floxed gene。 带有floxed 靶基因的小鼠称为flox 小鼠。在这种小鼠中，通常采用DNA 同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP 位点。 loxP 位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为flox/flox小鼠 ●CKO敲除何时何地发生？ 除了flox 小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。 Cre 工具鼠中，将Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。 Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞；Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或疾病发生阶段，定时地进行基因敲除。 （范衡宇老师课件） 实验时，将flox 小鼠和Cre 工具鼠进行交配，最后获得flox 纯合且Cre 杂合的小鼠。在这类小鼠中，凡是表达Cre 的细胞，两个loxP 之间的序列被切
基因打靶 基因打靶包括：胚胎干细胞的获得和培养、打靶载体的构建、重组ES细胞的筛选、嵌合体小鼠的制备、基因敲除小鼠的建立、Cre-loxP系统、FLP/FRT系统和条件性基因敲除、基因敲入和大规模ES细胞突变库的建立。 基本概念： 1.基因打靶：是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内来研究基因及基因组的功能。 2.基因敲除：是使用基因组中某个/某几个基因或基因的顺式元件产生缺陷，从而在突变体内。 3.丧生正常的功能，来推测这些基因或元件原来在体内的功能。基因敲入：在个体基因组中定点加入某个/某几个基因或顺式元件，使之表达或发挥作用，从而研究该基因或顺式元件在体内的功能。 4.基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。它的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。 自1987年早期胚胎干细胞技术建立及第一例基因剔除小鼠诞生以来，基因打靶的研究进展迅速，给现代生物学和医学研究带来了革命性的变化，并直接引发了现代生物学和医学研究各个领域中许多突破性的进展，成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。 一、胚胎干细胞的获得和培养基因打靶中用的小鼠ES细胞系有：D3、E14、R1、J1、CCE，均来源于129小鼠品系和其杂交品系（因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物）。ES 623和B6-III
ES细胞系，来源于C57BL/6小鼠品系。BALB/c-I，来源于BALB/c小鼠品系。常用的饲养层细胞为PMEF（小鼠原代胚成纤维细胞。PMEF需6 Gy的X 射线照射或丝裂霉素C处理细胞抑制生长后才能用作饲养细胞）。建立ES细胞的过程中，最好采用只传了2-3代的原代小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞，所取得的ICM（内细胞团）只有10％-30％的几率建立ES细胞系。一旦ES 克隆被确定，接下来应该考虑检查ES细胞的核型。 2、ES 细胞的核型分析建立的ES细胞有相当的比例（30-50％）不具备正常核型，故需进行核型分析。C带技术进行核型分析：小鼠细胞有40条染色体（19对加两条性染色体）。常染色体和X染色体的中心着色很深，而Y染色体的着色很浅。 3、ES 细胞的扩增一旦ES细胞系中高比例的细胞被确定有正常二倍体染色体数目，这一ES细胞需要较大量扩增和冻存。每5－6天ES细胞需经胰蛋白酶消化，以有效的低密度接种到新鲜培养基中，以保持细胞的不分化状态。60mm平皿最大细胞密度1-2×107。 二、打靶载体的构建打靶载体通常包括2个同源重组臂，用于指导打靶载体和染色体上的靶基因序列发生同源重组。同源重组臂上含有一个正筛选基因（neo），通过G418筛选，一个负选择标记的胸苷激酶（tk）基因。 三、重组ES细胞的筛选 1. 饲养细胞的准备；2. ES细胞的准备；3. 转染ES细胞；4. 挑取ES克隆；5. 96孔板ES细胞备份与细胞冻存；6. Southern 杂交。 四、嵌合体小鼠的制备 1. ES细胞的复苏；2. ES细胞的囊胚注射。注意：每天留一些ES细胞备第二天注射，注射通常持续1-2周；ES细胞注射到3.5天的小鼠囊胚，每只囊胚可注射10-20个ES细胞，注射的胚胎移入2.5天
传统ES打靶基因敲除/敲入小鼠技术 技术原理 传统的基因打靶技术制备基因敲除（KO）/敲入（KI）基因打靶技术是建立在DNA同源重组与胚胎干细胞等技术基础上的分子生物学技术。 同源重组是指当外源DNA片段与宿主基因组片段同源性高时，同源DNA区部分可与宿主DNA的相应片段发生交换（即同源重组）。 基因打靶就是通过同源重组技术将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的。基因打靶技术目前已被广泛认为是一种理想的特定修饰与改造生物体遗传物质的最佳方法。尤其是条件性和诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因在时间和空间上的靶位修饰更加明确、效果更加精确可靠，该技术的发展已经为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究和治疗手段，并已显示出巨大的应用前景及商业价值。 服务流程和周期
小鼠品系 ES细胞品系：129 （agouti）、C57BL/6N（black)、C57BL/6（agouti）。 基因打靶常用小鼠模型 （1）完全性基因敲除小鼠（Conventional Knockout，KO） 完全性基因敲除是通过基因敲除技术，把需要敲除目的基因的所有外显子或几个重要的外显子或者功能区域敲除掉，获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。 应用：用于研究某个基因（要求该基因非胚胎致死性基因）对全身生理病理的功能。
（2）条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout，CKO） 条件性基因敲除是通过基因敲除把两个loxp位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两端制备出floxed小鼠，该floxed小鼠在与表达Cre酶小鼠杂交之前，该目的基因表达完全正常，而当该floxed小鼠与组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其它组织或细胞表达正常。 应用：用于具有胚胎致死性目的基因的研究；用于研究基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能；与控制Cre或Flp表达的其它诱导系统相结合，还可以对某一基因的表达同时实现在时间和空间两方面的调控。 （3）基因敲入小鼠（Knockin，KI）