山东农业大学
硕士学位论文
泰山羊肚菌液体培养条件优化及富铁、锌、硒研究初探
姓名：李娟
申请学位级别：硕士
专业：生物化学与分子生物学
指导教师：贾乐
20050601
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论文作者签名：拗
导师签名：砺身、
曰期：口ｆ．。６
英文缩略表
山东农业大学硕士学位论文
中文摘要
泰山羊肚菌采自泰山海拔２００～６００米的山坡处，经分离纯化而得。本文以泰山羊胜菌为出发菌株，通过正交实验、单因素实验等方法确定了泰山羊肚菌液体培养及产胞外多糖最佳培养基和培养条件，为工业化生产羊肚菌菌丝体及其胞外多糖提供了理论依据。利用泰山羊肚菌对微量元素具有较强富集功能的特性，采用液体培养对铁、锌、硒进行了富集与生物转化的研艽，获得了富铁、锌、硒羊肚菌菌丝体，为补充微量元素产品的开发奠定了理论基础。在此基础上，对富硒羊肚菌菌丝体进行了一系列生化指标的测定，如氨基酸组成及含量的测定、全蛋白含量的测定及分析、以及有机硒在富硒菌丝体内的分布情况，为以后富硒羊肚菌的应用及进一步工作的开展打下基础。
以生物量与胞外多糖为指标，对泰山羊肚菌的培养基组成和发酵条件进行优化，确定泰山羊肚菌最佳摇瓶培养基组成为麸皮２００９／Ｌ，葡萄糖３０９／ｌ，，ＮＨＮＯａ２９／Ｌ，ＫＨ。Ｐｑ２９／Ｌ，ＭｇＳＯ。?７Ｈ。０１．５９／Ｌ。最佳发酵条件为２０℃，起始ｐＨ值６．５，装液量ｌＯＯｍＬ／２５０ｍＬ三角瓶，接种量ｌＯ％，摇床转速２００ｒ／ｍｉｎ，发酵时问４ｄ。在此条件下，其生物量（８．３９／Ｉ，）比对照（６．５９／Ｌ）提高了２７．７％，其胞外多糖含量（２１３５．４４１ｎｇ／ｍＬ）比对照（１４５４．６３９幢／ｍＬ）提高了４６．８％。
通过单元素富集实验确定了铁、锌、硒在培养基中的最适添加浓度，结果表明，适宜浓度的微量元素能够明显促进菌丝体的生长，提高菌丝体的生物转化能力和有机微量元素含量。
在培养基中添加最适硒离子浓度２００ｐｐｍ，得到富硒羊肚菌菌丝体。通过与未富硒羊肚菌菌丝体相比较，分析所得富硒羊肚菌菌丝体的营养成份、有机硒的分布情况。氨基酸组成分析表明，富硒羊肚菌菌丝体中氨基酸含量除半胱氨酸和蛋氨酸含量略低外，其余氨基酸含量明显升高，总氨基酸含量比对照增加５５．２％，半胱氨酸和蛋氨酸含量降低的原因可能是硒与这两种氨基酸结合生成硒代物；富硒菌丝体中８种人体必需氨基酸比对照相对提高了５３．４％。而且蛋白质含量也相应提高，比对照提高了４４．】４％。有机硒的分布情况表明，硒主要存在于羊肚菌菌丝体内的蛋白
泰山羊肚茁液体培养条件优化及富铁、锌、硒研究初探
质中，占总有机硒的７４．１３％；其次是多糖；在核糖核酸中存在最少。关键词泰山羊肚菌；液体培养；胞外多糖；生物富集；铁；锌；硒
山东农业大学硕士学位论文
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
ＭｏＪｖｈｅｌｌａ
ｅｓｃｕｌｅｎｔａｗａｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｈｉｌｌｓｉｄｅａｂｏｕｔ
２００～６００
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泰山羊肚菌液体培养条件优化及富铁、锌、硒研究初探
Ｓｅ—ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｆｅｗｉｎＳｅ—ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄａｎｄＳｅ－ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ
ＫｅｙＷｏｒｄｓ：Ｍｏｒｃｈｅｌｌａｅｓｃｕｌｅｎｔａ；ＳｕｂｍｅｒｇｅｄＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；Ｂｉｏａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ；Ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；Ｆｅｒｒｔｔｍ；Ｚｉｎｃ；Ｓｅｌｅｎｉｕｍ
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山东农业大学硕士学位论文
１．引言
１．１羊肚菌概况
羊肚菌又名羊肚蘑、羊肚菜、阳雀菌，隶属真菌中子囊菌亚门（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔｉｎ动、盘菌纲（Ｂｉｓｃｏｍｙｃｅｔｅ审、盘菌目（Ｐｅｚｉｚａｌｅ曲、羊肚菌科（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａｃｅａ曲、羊肚菌属（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ），因其菌盖表面生有许多小凹坑，外观极似羊肚而得名（兰进等，１９９３）。据有关资料记载（刑湘臣，１９９７），全世晃共有２８种，戴芳澜在《中国真菌总汇》记载已知羊肚菌在中国有８个种，其中有５０％产于我国东北。羊肚菌多生长在潮湿阔叶林中或河边沼泽地带，特别是在杨树林中多有出现。据最近报道，山东菏泽地区亦发现有羊肚菌。目前最常见的品种有：羊肚菌（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａｅｓｃｕ］ｅｎｔａ）、黑脉羊肚菌（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａａｎｇｕｓｔｉｃｅｐｓ）、小羊肚菌（ｋｌｏｒｃｈｅｌ］ａｄｅ］ｉｃｉｏｓａ）、高羊肚菌（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａｅｌａｔａ）、硬羊肚菌（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａｅｓｅｕ／ｅｎｔａｙａ，．，ｊｇｉｄａ）、尖项羊肚菌（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａｃｏｎｉｃａ）和粗柄羊肚菌（Ｍｏｒｃ＇ｈｅｌｌａｃｒａｓｓｉｐｅｓ）等等。
羊肚菌是一种野生名贵食（药）用真菌，最早收录于李时珍的《本草纲目》。中医认为其性平，味甘寒，无毒，具有益肠胃、消化助食、化痰理气、补肾、壮阳、补脑、提神之功能。近代研究发现，羊肚菌有降血脂，调节免疫功能，抗疲劳、抗辐射、抗肿瘤作用，并能减轻癌症患者放化疗引起的毒副作用。
据英国罗尔夫《菌类掌故》记述，古罗马人最喜食羊肚菌，现代欧洲人视羊肚菌为珍稀之菌。德国每年需从国外进口数吨，以供宾馆、家庭之需。目前，由于羊肚菌人工驯化、栽培尚有待研究、开发，因此野生羊肚菌在欧美市场上一直处于供不应求的局面，价格高达１５０德国马克／ｋｇｏ我国国内收购价也已达３００～４００元／ｋｇ，且呈持续上升的趋势。其经济价值远非其它食品和人工栽培的食用菌所能比拟（邢湘臣，１９９７）。１．１．１羊肚菌组成分析
粗柄羊肚菌子实体的营养成分分析结果表明，其粗脂肪含量为３．８２％，由４种脂肪酸组成．其中亚油酸占５６．０％，油酸占２８．４１％，硬脂酸占２．０２％，软脂酸占１３．５４％。不饱和脂肪酸含量占优势，是羊肚菌具有药用价值的重要原因之一。羊肚菌的蛋白质含量为２２．０６％，含１９种氨
泰山羊肚菌液体培养条件优化及富铁、锌、硒研究初探
基酸，其中包括８种人体必需氨基酸，占氨基酸总量的４７．４７％，比…般食用菌２５％～４０％的水平要高。此外，羊肚菌还含有几种稀有氨基酸，如ｃ３一氨基Ｌ一脯氨酸、ａ氨基异丁酸和２，４一二氨基异丁酸，这是羊肚菌风味独特、奇鲜的主要原因。测定分析粗柄羊肚菌的菌盖、菌柄及液体培养菌丝中的可溶性蛋白质含量、组分和氨基酸含量后发现，菌丝的可溶性蛋白质含量最高，菌盖次之，菌柄最少；而可溶性蛋白质组分则是菌柄最多，菌盖次之，菌丝最少；菌丝中必需氨基酸含量最高，菌盖中鲜味氨基酸含量最高，尤其是谷氨酸含量，明显高出菌柄和菌丝，而甜味氨基酸含量则三者相差不大（张广伦、肖正春等，１９９３；林彬、刘风梅等，１９９６）。
羊肚菌除含有丰富的多糖、蛋白质和脂肪酸外，还含有钙、锌等多种矿物质和微量元素以及ＶＢ，、ＶＢ。等多种维生素（邹方伦、潘高潮等，１９９６；刘敏莉，１９９４）。Ｂｏｕｉｌｌａｎｔ从羊肚菌中分离到几种抗菌、抗病毒的活性成分，Ｔｏｍｉｔａ则提纯分离到了血小板集落抑制因子（其效价比阿斯匹林高２～３倍）（龙正海，１９９７）。
１．１．２羊肚菌多糖
１．１．２．１羊肚菌多糖国内外研究现状
自发现羊肚菌以来，其研究日益受到重视，但研究领域仅局限于形态学和生态学。国外至今没有对羊肚菌多糖进行过较系统研究。近几年，国内学者对羊肚菌多糖的研究取得了一定进展。
贾建会等（贾建会、吕晓莲等，２００２）以深层发酵的羊肚菌菌丝体和发酵液为主要原料提取羊肚菌多糖，对影响多糖提取率的几个因素分别进行了对比实验，并对多糖进行了纯化及组分鉴定。魏芸等（魏芸、张天佑等，２０００）从液体深层发酵所得的羊肚菌发酵液中提取了三种羊肚菌纯多糖，分析了其组分和结构。李群（李群，２０００）用蒽酮比色法进行了羊肚菌多糖含量的测定，为羊肚菌多糖的深入研究奠定了基础。
１．１．２．２羊胜菌多糖的提取及分离纯化
各种多糖的提取过程基本相同，将材料粉热水抽提３次，温度９０～１００Ｙ２不等。离心收集上清液，减压浓缩至适当体积，加３至５倍乙醇，收集沉淀物，干燥得粗多糖（许周善、周晓燕等，２０００）。贾建会等（贾建会、吕晓莲等，２００２）报道，羊肚菌菌种接种液体发酵培养基，振荡培养
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至菌丝充满培养基（约需７２ｈ），过滤得发酵液和菌丝体。发酵液浓缩至糖度折光为５左右，至透析袋中，流水透析４０～４８ｈ，透析后折光约为３．５。用３倍９５％乙醇沉淀，离心分出沉淀物，沉淀物用无水乙醇沉淀２次，真空冷冻干燥即得发酵液胞外粗多糖。过滤的菌丝体蒸馏水洗涤２次，６０℃干燥，得干菌丝体。将干菌丝体粉碎，用热水浸提法提取菌丝体多糖。结合实验结果及考虑到提取成本，可确定羊肚菌菌丝体水溶性多糖的提取工艺：浸提温度９０℃，浸提时间１５０ｍｉｎ，浸提比１：４０，透析４０～４８ｈ，加入３倍９５％乙醇沉淀，沉淀物加入少许去离子水溶解，然后真空冷冻干燥即得粗多糖。按每升发酵液的干菌丝体２２９计算，可得菌丝体粗多糖约１．１４９，粗多糖得率约为５．１８９／ｌＯＯｇ干菌丝体。李群（李群，２０００）报道，同一样品浓缩液加入３倍量以上的乙醇时即可使多糖完全析出。
以乙醇等作为沉淀剂，沉淀得到的粗多糖中蛋白质等非多糖成分含量高，颜色也较深，为进一步研究多糖性质、结构和生理功能等，首先应进行脱色和去除蛋白质。粗品溶于水，用Ｓｅｖａｇ法、三氯乙酸法除去蛋白质，用２０％Ｈ：０。水溶液脱色，经透析除去小分子杂质。除去这些杂质之后，可采用ＤＥＡＥ一纤维素层析、Ｓｅｐｈａｄｅｘ凝胶过滤、季铵盐沉淀、盐析、亲和层析、超滤和电泳等方法进行纯化，然后浓缩、真空干燥或冷冻干燥，得到多糖纯品。
羊肚菌多糖的检测可用比旋度、示差折射及紫外检测等方法，也可用苯酚一硫酸法测定。纯度鉴定可用凝胶过滤法、高压电泳法、超离心法、旋光测定法、毛细管电泳法、高效液相色谱法等（刘祖同、罗信昌，２００２）。贾建会等（贾建会、吕晓莲等，２００２）将粗多糖经Ｓｅｖａｇ法和三氯醋酸法脱蛋白，再经ＤＥＡＥ～ＳｅｐｈａｄｅｘＡ一２５柱层析纯化，用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一２００凝胶层析和醋酸纤维膜电泳进行纯度鉴定，多糖的纯度达到９８％。
用苯酚一硫酸法测定羊肚菌多糖含量，经液相色谱分析，胞外多糖含量为９６．６２％，其中蛋白质２．５３％，菌丝体多糖含量为９５．５４％，其中蛋白质３．３２％。李群（李群，２０００）实验表明，蒽酮比色法应用于羊肚菌多糖测定线性好、精密度高、操作简单、所用试剂少、实验所需条件一般实验室均可达到，并且在净化过程中可将一些溶于乙醇的单、双糖去除，是一种切实可行的多糖测定方法。
泰山羊肚菌液体培养条件优化及富铁、锌、硒研究初探
１．１．２．３羊肚菌多糖组成结构分析
食用菌中分离获得的具有显著抗肿瘤活性的多糖体均是吡喃一葡萄糖聚合体，并且活性集中在Ｂ—Ｄ－葡萄糖内，活性表达分子量范围为Ｊ～２００万，溶解性越高活性越强（贾建会、徐宝梁，１９９６）。魏芸等（魏芸、张天佑等，１９９９）将液体深层发酵液用超过滤法去掉小分子量组分，经脱脂、脱色、脱蛋白质、减压低温浓缩、超速离心法分离，再用乙醇沉淀法反复多次将多糖沉淀提纯，得到羊肚菌多糖（ＭＥＰ）。对其中分子量为１０，０００～１００，０００的多糖（ＭＥＰ—ＳＰ），采用ＤＥＡＥ纤维素离子交换柱，以水为洗脱液，进行纯化分离，再经ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ一６Ｂ纯化得水溶性多糖ＭＥＰ—ＳＰＩ。研究表明，ｆｆＥＰ—ＳＰｌ是一种由木糖、葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖（摩尔比为２９：２４：６１：３９）残基为重复单元组成的杂多糖，分子量约为１１，５００。从红外光谱（ＩＲ）及核磁共振氢谱（ＨＮＭＲ）看出主链包括０吡喃糖苷键。
魏芸等（魏芸、张天佑等，２０００）改用不同浓度ＮａＣＩ为洗脱液，进行分离提纯，得到两种多糖ＭＥＰ—ＳＰ２和ＭＥＰ—ＳＰ３，用高效液相色谱法测得的这两种多糖分子量分别为２３，０００和４４，０００。气相色谱法对ＭＥＰ—ＳＰ２和ＭＥＰ—ＳＰ３组成的分析结果表明，ＭＥＰ—ＳＰ２由甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖残基为重复单元组成，摩尔比为１．７５：４．１３：０．７１：０．６８：ＭＥＰ—ＳＰ３由木糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、阿拉伯糖和半乳糖残基为重复单元组成，摩尔比为３．５８：１４．９：３．８５：ｌ‘７７：５１．３：０．５３。用核磁共振及红外光谱法等鉴定出ＭＥＰ—ＳＰ２是具有Ｂ一吡喃糖苷键的杂多糖。宋淑敏等（宋淑敏、邹作华等，１９９６）对羊肚菌经生物发酵获得ＥＦ一１１营养液中的ＥＦ一１ｌ多糖分子结构进行了研究，ＥＦ一１１多糖为高分子多糖体，分子量为１，８００，０００，其主键为由（１—３）连接的半乳糖残基构成的多分支结构的杂多糖。
１．１．３羊肚菌培养技术
羊肚菌子实体的获得受多种条件的限制，迄今未见羊肚菌规模化人工栽培，市场上主要依赖野生资源，导致其价格高昂（陈向东等，２００２）。而液体发酵可以进行工业化连续生产，具有规模大、菌丝体产量高、发酵周期短、生产效益高等优点。１９５８年，Ｊ．Ｓｚｕｅｃｓ首次在发酵罐内培养出羊肚菌菌丝球，并进行了２５００加仑的生产试验。从而导致美、法等国开始
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山东农业大学硕士学位论文
进行大规模羊肚菌菌丝工业化生产，使羊肚菌菌丝块能在市场上销售成为现实。Ｇｉｂｂｅｒｔ以１００ｒ／ｍｉｎ的转速摇瓶培养，羊肚菌菌丝形成大量小结节，４８ｈ左右培养液变清澈，９６ｈ形成圆滑或光滑的菌丝球，直径０．６３～２．５４ｃｍ，菌丝球白色或暗灰色，气味因不同种而异（沙业雄，１９９６）。多年来，科研工作者致力于探索有利于建立菌丝体生物量的最佳发酵工艺条件，不断改进羊肚菌菌丝的风味、营养成分和有效成分，己取得了丰硕成果。
１．２食用菌液体培养研究
１．２．１食用菌液体培养的由来及发展
液体培养是指把食（药）用菌所需要的糖类、有机和无机氮源、无机盐等必要营养物质混合在水溶液中，通气供氧进行菌丝大量培养繁殖。液体培养根据其所用的培养容器及供氧方式，可分为摇瓶振荡培养、浅盘静止培养、发酵罐深层培养和发酵罐密闭气培养等（黄年来，２０００）。液体培养属于生物工程内容之一，这一概念是从２０世纪４０年代中期抗生素工业的兴起而开始的，并由当时的美国弗吉尼亚大学生化工程专家设计出培养各种抗菌素的微生物系统的机械搅拌和通气的生物反应器。】９世纪末和２０世纪初，巴斯德学派的后继人跨出了医学领域，试图将微生物用于工业生产，这一尝试取得了更为直接有效的结果，并建立了食品酵母深层通风发酵工业。
时至今日，在医药食品发酵工业方面已有比较先进的生物反应器及配套设施，在理论与实践上都已经大大向前推进了。这一技术应用在食用菌方面的研究，据资料报道，最早的是１９４８年美国的Ｈ．Ｈｕｍｆｅｌｄ等对蘑菇进行的深层发酵研究。１９５８年Ｊ．Ｓｚｕｅｃｓ第一个用发酵缸来培养羊肚菌。８０年代食用菌的培植开始从农业生产跨进了工业生产的领域（梁淑娃，２０００）。日本的杉森横武等于１９７５、１９７７年用ｌ％的有机酸和Ｏ．５％的酵母膏组成液体培养基，获得了大量香菇菌丝体。国内较早报道的是上海植物生理研究所的陈美聿等人，于１９６０年进行的香菇深层发酵研究。此后有食（药）用菌深层发酵技术的扩大试验的报道（杨新美，１９９９）。１９７９年杨庆尧开始研究香菇等的液体培养，并研究了液体培养基的粘度与菌球的关系。８０年代后国内外又有许多有关食用菌液体发酵研究的报道（袁彤
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泰山羊肚菌液体培养条件优化及富铁、锌、硒研究初探
光，１９９５）。
食用菌的液体深层发酵技术之所以越来越受到人们重视，是由于该技术比传统的食用菌生产方法有明显的优越性，在液体深层培养过程中，菌丝细胞能在反应器内处于最适温度、酸碱度、氧气和碳氮比等条件下生长，呼吸作用所产生的代谢废气又能及时排放，因此新陈代谢旺盛，菌丝分裂迅速，在短期内就能获得大量的菌丝体或菌种。
分析表明，这样得到的菌丝体与农业栽培得到的菌丝体，在化学组成和生理功能上均很相似。而且液体菌种接入固体培养料时，又具有流动快、易分散、萌发快、发菌点多等特点，使袋栽食用菌接种污染得到较有效的控制。这样就可以从菌丝体中提取诸如多糖、有机酸、氨基酸、酶等代谢产物，使其生产实现工业化，因此，食（药）用菌深层发酵技术具有广泛的应用前景（杜德清等，２００３）。
１．２．２食用菌培养基的筛选
在食用菌液体培养中，培养基的筛选很重要。与其他发酵研究一样，食用菌的发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等。发酵研究的原料选择既要考虑到菌体生长繁殖的营养要求，又要注意到原料来源丰富，价格便宜，发酵周期短，有利于产物的积累和提取。１．２．２．１碳源
在２５０ｍＬ或２０００ｍＬ的三角瓶中进行试验研究，可用试剂级的葡萄糖或蔗糖作为碳源，然而进行生产试验研究时人们必须寻找廉价的糖作为代用品，如各种可溶性淀粉、废糖蜜、葡萄糖废液、工业用葡萄糖等。
各种粗糖源必须在实验室摇瓶试验中进行评定，确定是否适合生产需要。糖的浓度是决定发酵产品质量的一个重要因素，在一定的浓度范围之内，菌体生长量随糖浓度增加而增加，但是糖浓度过高，渗透压增大会影响菌体生长，同时培养基浓度增大，氧溶解的阻力大，影响供氧效率。确定糖的最适浓度的可靠方法是做系列摇瓶试验，各三角瓶的培养基中添加不同数量的糖．分析发酵过程中菌体生长量和残糖量，计算产物的百分率，确定得到最大百分率时的糖浓度。
１．２．２．２氮源
牛肉膏、蛋白胨、ＫＮＯ，、ＮＨ。ＮＯ，、（ＮＰ．）。ＳＯ。是实验室常用的氮源，大
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豆、棉籽饼、花生饼等各种蛋白质粉的水解物，通常是廉价的、可供应的氮素来源。各类氮源的最适浓度也必须通过试验确定，一般采用不同浓度进行摇瓶试验，找出最适浓度。
碳氮间最适比例对最大限度的提高菌丝的得率很重要。氮源过多，易引起菌丝生长过于旺盛，不利于代谢产物的积累。碳源不足，又容易引起菌体衰老和自溶。碳氮比不当，会影响菌丝按比例的吸收营养物质。确定碳氮比时，使用基准培养基，把一系列范围在２～４５：ｌ内的不同碳氮比分装在２５０ｍＬ锥形瓶中，每瓶１００ｍＬ，设三次重复。接种后，在一定温度，一定转速的摇床上培养，确定获得最高茵丝生长量的碳氮比。１．２．２．３无机盐和维生素
无机盐是微生物活动不可缺少的物质，其主要功能是构成菌体的成分；作为酶的组成成分；酶的激活剂或抑制剂；调节培养基的渗透压、ｐＨ和氧化还原电位。…般微生物所需要的无机盐包括硫酸盐、磷酸盐、氯化物和含钾、钠、镁、铁的化合物等，有的还需要铜、锰、锌、钴、铝、碘、溴等微量元素。
维生素是中间代谢系统中的主要成分。食用菌为了维持正常生长，～一般需要一种或多种维生素。这些维生素主要是Ｂ族维生素，如生物素、叶酸复合物、核黄素、毗哆醇复合物、硫胺素、肌醇等，其次是维生素Ｃ。任何一种维生素所需数量很少，某种生物不能合成的维生素则必须由食物和环境供应。每一种维生素在不含该维生素的完全培养基中进行测定，以确定该维生素是否为某种微生物所必需的。
食用菌对无机盐和维生素的需要量很少，但它们的有无对菌体生长和代谢产物的形成影响很大。深层发酵培养基的筛选过程中，必须对使用的无机盐和维生素种类和浓度进行测定。使用标准基本培养基，改变无机盐或维生素的种类及浓度，利用摇瓶培养技术，测定获得的最大生物量时所需浓度和最佳浓度。
１．２．３深层培养的发酵过程与控制
在液体深层培养中除了考虑培养基的组成和发酵设备外，还必须有效地控制发酵过程中的有关参数，即物理参数（温度、压力、搅拌速度、空气流量、溶解氧、排气中的０。与ｃ仉含量等）。一般来说，食用菌的液体
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深层培养要求温度２２～２８＂Ｃ，罐压０．３～０．５ｋｇ／ｃｌｎ。，空气流量０．５～１．０：１（Ｖ／Ｖ），接种量５％～３０％。根据发酵情况综合控制搅拌速度和泡沫的产生，以菌丝形态、数量以及养分消耗和代谢的变化等参数作为终止发酵的指标。
１．３食用菌富集微量元素的概况
食用菌富集微量元素最早是从蘑菇属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）中某些种类能高水平积累镉（ｃｄ）发现的（ＳｔｉｊｖｅＴ．等，１９７４）。后来研究发现诸多大型真菌都具有较强富集微量元素的能力。食用菌富集微量元素能力很强，远远超过绿色植物。从总体水平上看，食用菌体内主要微量元素如铁（Ｆｅ）、锌（Ｚｎ）、硒（ｓｏ）等都高于绿色植物，但是不同种类、同种内不同菌株间、同一菌株不同部位之间微量元素的富集程度和含量都有差异（黄晨阳等，２００４；６ａｒｃｉａ．ＭＡ等，１９９８；Ｓｅｓｌｉ．Ｅ等，１９９９；ＰｅｔｒＢａｌｄｒｉａｎ等，２００２；李开本等，１９９９：Ｋｉｒｃｈｎｅｒ．Ｇ等，１９９８；Ｄｅｍｉｒｂａｓ．Ａ等，１９９９：雷敬敷等，１９９０：Ｂｒｅｓｓａ．ＧＬ等，１９８８）。
１．３．１食用菌富集微量元素的机理
生物富集（Ｂｉｏａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）是生物有机体及处于同一营养级上的生物种群从周围环境中蓄积某种元素或难分解的化合物，从而使生物体内该物质浓度超过环境中该物质浓度的现象。食用菌对许多微量元素具有较强的富集能力，是一类高效、简便、选择性好的生物吸附剂。
食用菌对微量元素的富集是由其独特的细胞结构决定的，其细胞壁主要由多糖构成，此外也含有少量蛋白质和脂类，可以提供氨基、酰氨基、羰基、硫醇、硫醚、咪唑、磷酸根等官能团与金属离子络合。其细胞膜是具有选择性的半透性膜，又具有较大的表面积，其细胞结构与富集离子种类的不同决定了富集效率与选择性。碱性和碱土金属倾向于与氧结合，生成不太稳定的络合物，离子间的交换速度较快；过渡金属离子倾向与氧、硫、氮结合，具有中等的离子交换速度；贵重金属离子与硫、氮具有强烈的亲和性，但离子交换速度慢，并可能出现氧化还原反应。生物富集的途径主要有物理吸附、表面沉积、被动扩散、生物吸附和主动运输等，其中生物吸附和主动运输是最主要的富集途径，约占总富集量的８０％，而生物吸附又比主动运输占有更大的比重。
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微量元素的富集途径主要经历了一快一慢两个步骤：第一步，生物吸附过程，快速且与代谢无关，受ｐｌｌ值、微生物种类及其培养时问、离子种类与浓度、其它竞争离子、富集时间等影响。第二步，主动运输过程，缓慢且消耗能量，与代谢过程有关，主要受微生物的活性、培养温度、营养条件、代谢抑制物等因素的影响。
１．３．１．１生物吸附（Ｂｉｏｓｏｒｐｔｉｏｎ）
生物吸附是指生物体从溶液中吸附金属离子、非金属、化合物和固体颗粒的过程，是一个吸附一解吸的过程，被吸附的离子可以被其它离子、螯合剂或酸解吸下来，主要有络合（ＣｏｍｐｌｅｘａｔｉＯｎ）、离子交换（１０ｎｅｘｃｈａｎｇｅ）两种方式。络合是由金属离子与生物配位体中带负电的官能团结合而形成的。Ｇａｒｄｅａ发现当藻类细胞中的羧基脂化后，对ｃｕ与Ａｌ的吸附能力明显下降（Ｇａｅｄｅａ，１９９０）。在离子交换中，金属离子被吸附的同时伴随有其它离子的释放。Ｋｕｙｕｃａｋ．Ｎ曾证明多糖中的硫酸盐多糖具有显著的离子交换能力（Ｋｕｙｕｃａｋ．Ｎ，１９８９）。
１．３．Ｊ．２主动运输（ＡｃｔｉｖｅＴｒａｎｓｐｏｒｔａｔｉｏｎ）
主动运输是一种与代谢过程有关的胞内主动吸收过程，需要能量及某些特定的酶参加，是有生命的生物体特有的生物富集途径，可以形成许多金属有机物（如金属蛋白），能有效富集浓度极低的微量元素，转化途径主要有甲基化（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）和氧化一还原反应（Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ—ＲｅｄｕｃｔｉＯｎ）等。
微量元素的生物富集不同于一般简单的吸附、沉积或离子交换，而是一个复杂的物理化学反应过程，是多种机理共同作用的结果，其实质是一个络合基础上的离子交换动态平衡过程，要真实地反映该过程的机理，需要建立更为完善的理论模型体系，该领域有待于进一步地研究和完善。１．３．２食用菌作为微量元素载体的优点
食用菌不仅含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素等营养成分及活性多糖等药理活性成分，微量元素的含量和种类也比较丰富。近年来，随着食品研究从营养型的传统食品向生理调节型的功能性食品的转变，食用菌以其丰富的营养和安全、天然的保健功能赢得了越来越多人的青睐。研究表明，部分食用菌对微量元素具有较强的富集和转化作用，并且能够将微量元素从无机态转化为有机态。这不仅可以消除由于添加这类强化剂而对食
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品造成的不良影响，而且可以提高人体对微量元素的生物利用率，开发这一新型的微量元素资源有着，“阔的应用前景和显著的社会、经济效益。（Ｉ）食用菌本身富含蛋白质、多糖、维生素、膳食纤维及其它一些活性物质，且脂肪和热量很低，味道鲜美，营养丰富，其产品除可以作为微量元素的来源外，还能提供其它有益的营养元素及活性物质。
（２）食用菌富集的有机态微量元素易于被人体吸收利用。无机态的微量元素在人体内易受到磷酸盐、植酸盐、草酸盐、纤维素等物质的影响，从而使生物利用率大大降低，而有机态的微量元素则和蛋白质、多糖结合在一起，基本上不受上述物质的影响。
（３）食用菌富集的微量元素具有良好的稳定性，便于贮存、运输，能够更好地与食品中的其它成分配伍，避免其中某些营养成分的损失。
（４）食用菌本身安全无毒，富集微量元素后，只要所摄取的微量元素在限制范围内，亦对人体无毒副作用。
（５）部分食用菌已经大规模栽培，有成熟的生产管理经验和技术，生产成本低。如果采取液体深层发酵或固体高效栽培技术，能够实现大规模工厂化生产富含微量元素的产品，满足人们的需要。
１．３．３食用菌对铁、锌、硒的富集
１．３．３．１人体补充铁、锌、硒的重要性
铁、锌、硒对维持人体正常生理功能，预防和治疗某些疾病具有非常重要的作用。
１．３．３．１．１铁
健康成人体内含铁３～４９，刚好够做一颗小铁钉，仅占人体体重的万分之四左右，属于人体必需的微量元素。人体内的铁是构成血红蛋白、肌红蛋白的原料，而且还是维持人体正常生命活动最重要的一些酶的组分，与能量代谢关系十分密切。它的功用并不仅限于造血，还能促使胡萝ｂ素转化为维生素Ａ，清除血脂，产生抗体，合成体内一些重要物质（嘌呤、胶原），参与肝脏的解毒作用等。正常人体每天铁的需要量：１８岁少女为１８ｍｇ，青年男子１５ｍｇ，成年男子为１２ｍｇ，孕妇、乳母为１８ｍｇ。铁含量的过高或过低会影响含酶，如过氧化氢酶、脂类过氧化酶等酶的活性，从而影响人体的一些代谢功能。三羧酸循环（柠檬酸循环）是体内糖有氧氧化、
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供给能量的一种重要途径。三羧酸循环中有一半以上的酶和辅助因子含铁，或者在铁存在时才能发挥生物效应。当人体铁含量下降，三羧酸循环受影响，降低糖的分解，导致血糖升高。同时会引发某些疾病，如肝癌、胃腺癌等，最常见的是铁性贫血。多年来，缺铁性贫血已成为全球性的营养病。据报道，全球约有１５％～２０％的人患缺铁性贫血，其中成年男子约占１０％，妇女约占２０％，孕妇和儿童约占４０％～６０％。我国各地调查结果也大致如此，这是全世界普遍存在的一种公共卫生问题，应引起足够重视（何邦平等，２００３；张朝华等，２００２）。
１．３．３．１．２锌
锌是人体必需的微量元素，它是人体中许多重要酶的组成部分，与锌有关的酶大约有７０～１００种。许多研究表明，锌是ＲＮＡ聚合酶和ＤＮＡ聚合酶呈现活性所必需的，锌能协助葡萄糖在细胞膜上转运，锌能够促进人体的生长发育和增强人体的免疫机能（陈必链等，１９９９）。缺锌会导致儿童生长发育受阻、性成熟延迟、味觉障碍和伤口愈合缓慢等疾病，孕妇缺锌甚至会导致胎儿畸形（陈炳卿，１９９４）。在我国的饮食结构中，膳食纤维摄入过多是导致锌缺乏的一个重要原因。据调查在我国儿童中锌摄入量不足１／２ＲＡＤ的男女比例分别是３１．３％和３２．６％，儿童缺锌应当是一个引起重视的问题（葛可佑等，１９９９）。中国预防医学科学院对北京等１９个省市学龄儿童头发中含锌量的分析表明，大约有６０％的儿童低于正常值，缺锌状况相当严重（陈必链等，１９９９）。１９８８年中国营养学会推荐成年人每日锌摄入量为１５ｍｇ，健康人维持正常的锌代谢平衡每日锌需求量的估计值，婴幼儿（Ｏ～５岁）为０．１ｍｇ／ｋｇ体重，之后每天至少应补充２．５～４．Ｏｍｇ。１．３．３．１．３硒
硒是人体必需的微量元素，它通过谷胱甘肽过氧化物酶、辅酶Ｑ和维生素Ｅ维持自由基的正常代谢，以维持人体正常生理机能（陈炳卿，１９９４）。上世纪３０年代，第一次发现了硒化物的生物化学特性——对牛及其它家畜有剧烈的毒性，影响机体中枢神经系统，引起胎儿中毒和胎儿畸形，直到科学家发现机体缺硒会导致大鼠肝坏死和家畜肌营养不良症之后，人们对硒的研究才从早期的毒性研究转变为营养性研究（Ａ１ｉＩ）ｅｍｉｒｃｉ等，
１９９９）。
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谷胱甘肽过氧化物酶（（；ｓＨ—Ｐｘ）由ＳｅＣｙｓ构成，该酶催化氢过氧化物和脂质过氧化物转变为水和各种醇类，降低丙二醛（ＭＤＡ），清除自由基对生物膜的攻击，保护膜免受氧化损伤（ＵｌｋｕＡｒＪ等，１９９１）。研究发现，硒为甲状腺的代谢所必需，碘化甲状腺氨酸脱碘酶是一种硒蛋白，能将甲状腺素（Ｔａ）转化为其活性形式一一三碘甲腺原氨酸（Ｔ，）。最近研究者又发现了另一种硒蛋白酶一一硫氧化蛋白酶，该酶在机体内广泛存在，参与调控二硫基的氧化还原，同时参与多种蛋白质的表达（ＫａｒａｍＥ１一Ｂａｙｏｕｍｖ：２００１）。
硒还具有其它多种功能，如能提高动物繁殖功能；抑制巯基蛋白氧化导致高分子物质聚合；防止晶状体浑浊而形成白内障，降低镉、铅、汞等重金属的毒性；硒还具有一定抗爱滋病的功效，对ＡＩＤＳ病人具有明显的延长生命作用。
硒缺乏可出现脱发、指甲脆、易疲劳、激动及儿童恶性营养不良等。另一方面，硒还是人体的一种抗癌元素，ＷＩｔＯ在２７个国家对硒与乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、赢肠癌、前列腺癌和白血病的调查分析表明：癌症的发病率和死亡率与饮食硒或血硒水平呈反比。血硒水平高的国家（如菲律宾、泰国），癌症的死亡率较低；而血硒水平低的国家（如澳大利亚、英国、新西兰、美国等）和我国江苏启东，癌症的死亡率就高（何邦平等，２００３）。我国科学工作者对全国２０个省市自治区的２００个克山病区和非病区的近万份水、土壤、粮食、蔬菜、毛发及血液样品作微量元素分析，结果表明硒缺乏是克山病发病的原因之一，并且在用亚硒酸钠预防克山病方面获得很大成功。硒缺乏与心血管病、大骨节病也有关。正常人体（体重７０ｋｇ）应维持含硒量１４～２ｌｍｇ，而人体日排硒量约０．１５ｍｇ，因此需要补充，否则易感染疾病。１９７６年国际上推荐硒ＡＤＩ（每日允许摄入量）为６０№，我国推荐为４０№，考虑到体内某些元素的拮抗作用和病区低硒适应性，建议成人供给量标准暂定为４０～２４０№／ｄ（刘胜杰等，１９８６）。１９８８年】０月中国营养学会规定硒的ＲＡＤ（推荐剂量）为５０№。我国膳食结构以谷物蔬菜为主，成人硒的日摄取量仅为２６．６魄（成人日需量约为２００—２５０“ｇ），属于低硒水平。人体主要依赖食物来获得硒，而生物源的有机硒与无机硒相比具有吸收率高、安全无毒等优点。因此，开发生物源有机硒食品或食品添
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加剂是给机体提供硒源的有效途径（尚德静等，１９９９）。
１．３．４食用菌对铁、锌、硒的富集研究进展
了解各种食用菌对不同微量元素的富集能力，对于开发富含微量元素的食用菌产品，并充分利用它们的营养成分和药理活性成分具有非常重要的意义。
１．３．４．１富铁
郭秀君等（郭秀君等，１９９４）证实金针菇有富集铁的能力，它可使加入的无机铁转化为有机铁，铁的吸收率和有机铁转化率均以４０ｐｐｍ为最佳，而菌丝量和多糖产量以加铁２０ｐｐｍ时为最高。潘维新（潘维新等，１９９９）用渗透压法测定铁能增加细胞膜的透性，证明铁可促进细胞膜脂相透入，再与细胞膜内的蛋白质、多糖，经生物转化结合，成为蛋白铁或多糖铁。实验表明，食用菌（金针菇）具有摄取无机盐的能力，有机铁为６８．２％；进一步分析６８．２％有机铁中，多糖铁１５．８％，核糖核酸铁０．２０％，蛋白铁５２％。
１．３．４．２富锌
孙希雯等（孙希雯等，１９９７）对金针菇深层发酵富锌条件进行了研究，结果表明：金针菇深层发酵较好的锌源为ＺｎａＣ。，初始ｐＨ值为６．５，添加０．１％的柠檬酸和０．４％的ＣＭＣ—Ｎａ有利于富锌和提高生物量，通过电镜观察，加锌的细胞核糖体核贮藏颗粒增多，说明锌参与了细胞的生物合成，促进了生物转化，活跃了代谢，这对提高金针菇的营养价值极为有利。魏华等（魏华等，１９９５）研究了锌盐对金针菇ｗＪ菌株生长的影响及ｗＪ菌株对锌盐的吸收，得出１０００ｍｇ／ＬＺｎＳ０４为最佳浓度，７００１。发酵罐放大实验，菌丝体得率为０．９２％，有机锌的含量为４．７８ｍｇ／ｇ。钟恒等（钟恒等，１９９５）在废棉培养料中添加锌，研究锌在草菇子实体内富集和分布的情况，表明当废棉料中锌的含量为２９和４７№／ｇ时，草菇子实体内富集和分布的锌量最大，分别为８．５和１３．８¨ｇ／ｇ，呈正相关；当废棉料的锌含量增多至２６８、４８２、２２１２Ｐｇ／ｇ时，富集的锌量分别只有６．９、５．６和３．６Ｐ－ｇ／ｇ，呈负相关，当废棉料中锌含量达到４３５０Ｐｇ／ｇ时，草菇不产生或很少产生子实体，菌盖锌含量（２５．１Ｐ．ｇ／ｇ）高于菌托和菌柄（８．２和７．９腿／ｇ）。
１．３．４．３富硒