基因工程
第一章基因工程概述
1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT)
基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术.
2、基因工程的历史
基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化
基因工程发展阶段的几个重要事件：
一系列新的基因工程操作技术的出现；
各种表达克隆载体的成功构建；
一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现
3、基因工程的内容（P9）
4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)
第二章分子克隆工具酶
5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答)
概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内
特点（参加PPT）
命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。
如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。
分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。
真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶
原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ
6、几个基本概念
粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为~。
平末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的，称之为~。
同裂酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列。如：BamHI和BstI均可识别GGATCC。
同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。如：TaqI：TCGA；ClaI：A TCGA T；AccI：GTCGAC
星星活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。
DNA物理图谱：（多为质粒图谱）
7、大肠杆菌中甲基化酶的种类
①Dam甲基化酶，在序列GA TC中A的N6位置引入甲基。
②Dcm甲基化酶，dcm基因表达胞嘧啶甲基化酶，它能特异性识别DNA双链上的CCA(T)GG序列，并使第二个C5甲基化，即CmCWGG，避免DNA受到相关限制酶的切断。dcm基因的变异导致胞嘧啶甲基化酶活性缺失，使外源DNA上的C不被甲基化，易于获得非甲基化质粒。
③Eco KI甲基化酶；④Sss I甲基化酶
8、依赖于甲基化的限制系统（McrA,McrBC,Mrr）
依赖于甲基化的内切酶E.coli中至少有3种依赖于甲基化的限制系统
①mcrA基因表达E.coli防御体系中起重要作用的McrA酶，该酶能特异性地作用于外来DNA 上的被甲基化的胞嘧啶序列，即C5mCGG特异序列，使之分解，对大肠杆菌本身起保护作用。mcr A基因的变异，导致上述功能缺失，对外来DNA中被甲基化的胞嘧啶特异序列（C5mCGG）失去作用，有利于限制酶及甲基化酶的克隆体的稳定。
②mcrB, C基因表达McrB和McrC两种特异性蛋白，它们在E.coli的防御系统中起重要作用。一般情况下，只有这两种蛋白同时存在时才表现出活性，McrC具有识别和调节功能，它能特异性的结合到外源DNA被甲基化的胞嘧啶的特异序列G5mC上，然后由McrB蛋白切断（McrB蛋白是特异性切断外来DNA中G5mC序列的限制性核酸内切酶)，防御外来DNA的侵入。
③mrr基因是大肠杆菌细胞防御系统中重要的基因之一，它能严格限制被甲基化的外源DNA 的介入。另外，含有此基因型的菌株也可用于限制酶和甲基化酶的克隆体。
9、几个基本概念
DNA聚合酶，以单链DNA为复制模板，由5'端开始复制到3'端的酶。催化DNA的合成（具备模板、引物、dNTP等）及其相辅的活性。
反转录酶，依赖于RNA的DNA聚合酶,有5’-3’合成DNA活性,无3’-5’外切核酸酶活性（RNaseH水解磷酸二酯键，剪断mRNA，cDNA第二条链合成）。来自AMV(禽成髓细胞瘤病毒)或M-MuLV(鼠白血病病毒)
RNA聚合酶，识别DNA中启动子特异序列，合成RNA，无需引物。
连接酶
①T4 DNA连接酶，反应底物: 黏端、切口、平末端的RNA(效率低)或DNA
②大肠杆菌DNA连接酶，活性与T4连接酶相似，但需烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的参与，与平末端连接效率很低，不连接RNA。
③Taq DNA连接酶，可连接dsDNA中的缺口间的两个寡核苷酸，需NAD+的参与，最适反应温度45-65℃。（VS TaqDNA聚合酶）
④T4 RNA连接酶，可使单链DNA或RNA之间相互连接，可用于标记RNA的3’末端，单链DNA或RNA的连接、增强T4 DNA连接酶的连接活性以及合成寡核苷酸。
T4多核苷酸激酶& 碱性磷酸酶
T4多核苷酸激酶可将ATP的γ-磷酸基团转移至DNA或RNA的5’末端。主要用于对缺乏5’磷酸DNA或合成接头进行磷酸化，同时可对末端进行标记。（探针）
碱性磷酸酶主要来源于牛小肠碱性磷酸酶（CIP或CIAP）能催化除去DNA或RNA5’磷酸的反应，可防止DNA片段自连。
第三章分子克隆载体
10、分子克隆载体必须具备的元件
①在克隆载体DNA分子合适的位置应有1至多个克隆位点（MCS），供外源DNA片段组入克隆载体DNA分子
②克隆载体能携带外源DNA片段（基因）进入受体细胞，或停留在细胞质中能自我复制，或整合到DNA上随染色体DNA的复制而同步复制
③克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记基因
④克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞。
11、表达载体必须具备的元件
克隆载体必备元件+启动子，终止子，核糖体结合位点RBS书本p86-87
12、标记基因的种类及作用原理
选择标记基因：
①氨苄青霉素抗性基因（ampr）
作用机理：Ampicillin可以抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性，即抑制细胞壁肽聚糖的合成。ampr编码一种可分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β-内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。(目的菌落周围出现散点菌落，即次生菌落，通过提高氨苄青霉素的浓度和控制培养时间≤12h减少次生菌落)
②四环素抗性基因（tetr）
作用机理：四环素可与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位过程。
tetr编码一个由399个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。
③氯霉素抗性基因（Cmr）
作用机理：氯霉素可与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质的合成。常用的cat基因编码氯霉素乙酰转移酶，即一个四聚体细胞质蛋白，在乙酰辅酶A存在时，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。
④卡那霉素（新霉素）抗性基因
作用机理：卡那霉素和新霉素是氨基糖苷类抗生素，都可与核糖体结合并抑制蛋白质的合成。该基因（kanr/neor）是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶的基因，该酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。
琥珀突变抑制基因supF 琥珀突变（书本p41）
筛选标记基因：
α -互补（蓝白斑筛选）：现在使用的许多载体都带有一个E.coli DNA的短区段，其中含有β-半乳糖苷酶的-α肽基因（lacZ’）的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。这个编码区中插入了一个MCS，它并不破坏读框，但是可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞，虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可融为一体，形成具有酶活性的蛋白，从而实现互补，这种现象称为~。
插入失活，某段DNA序列的插入，使得被插入的基因功能丧失功能，从而达到筛选的目的。蓝白斑筛选：在lacZ’编码区上游插入一小段DNA片段，不影响β-半乳糖苷酶的功能互补。但是，若在该DNA小片段中再插入一个片段，将不可避免的产生无α互补能力的β-半乳糖苷酶片段
13、λDNA的特点
λDNA在噬菌体中是线状，全长48502bp，左右各有12个核苷酸组成的5’凸出粘性末端（cohesive end），且两者互补。进入宿主细胞后，粘性末端连接成为环状DNA分子，这样能连接的末端称为cos位点。
14、λ载体的选择标记
lacZ基因，在填充片段中带有β-半乳糖苷酶基因片段
cI基因失活
cI基因：全面抑制并阻断裂解生长必须基因的表达，促进λ-噬菌体进入溶原状态。外源基因插入cI基因中，使E.coli进入裂解生长状态。
Spi筛选
野生型λ噬菌体在带有P2原噬菌体的溶原性 E.coli中的生长会受到限制的表型，称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏感。
Spi+ :λ噬菌体不能感染E.coli（P2）
Spi- :λ(red- gam-）噬菌体能感染E.coli（P2）
形成小噬斑
宿主：recA+ ；chi位点
第四章人工染色体载体
15、人工染色体的种类和必备元件（概念PPT，结构，组成，筛选）
酵母人工染色体载体YAC、细菌人工染色体载体、P1载体和PAC载体
YAC（yeast artificial chromosome）克隆载体是最早构建成功的人工染色体克隆载体，能像染色体一样在酵母细胞中正常的复制。它是以pBR322为骨架建立，带有pBR322的复制起点ori和筛选标记基因Ampr，另外还加入作为酵母chr.所必须的一些成分：
一段控制酵母chr.复制的自主复制序列（ARS）；
一段来自酵母chr.的着丝粒序列（能在细胞分裂过程中将chr.载体均匀的分配到子细胞中）；
一对酵母的端粒序列（来自四膜虫chr.），防止chr.载体与其他chr.相互粘连，并避免在DNA复制过程中造成基因的缺失，从而保证了chr.载体在细胞分裂和遗传过程中的相对独立和稳定；
选择标记TRP1和URA3（酵母Trp和U营养缺陷型的野生型等位基因）；
克隆位点存在于酵母酪氨酸tRNA基因赭石突变的校正基因Sup4中。
第五章表达载体
16、表达载体启动子的种类
Plac 启动子（诱导型启动子）、Ptac 启动子（诱导型启动子）、T7启动子（T7噬菌体）和PL启动子（λ噬菌体）
17、T7启动子的工作原理（参见PPT图文）
第六章基因操作中大分子的分离和分析
18、质粒DNA的提取原理及步骤（实验）
碱裂解法提取质粒DNA原理：根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH介于12.0-12.5这个狭窄范围内，线性DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭环质粒DNA的两条链仍保持在一起，因此复性迅速准确，而线性染色体DNA的两条链彼此已经完全分开，复性就不会那么迅速准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。书本p100-101
碱裂解法小量抽提质粒
(1)将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液I (50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris-HCl
pH8.0,10mmol/L EDTA)中,剧烈震荡;
(2)加200μl新鲜配制的溶液II (0.2mol/L NaOH, 1%SDS), 缓和震荡,水浴5min;
(3)加150μl预冷溶液III (50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml)缓和震荡,冰浴5min;
(4)4 ℃以12000g离心5min,将上清转移到另一离心管中
(5)向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1），反复混匀，12000rpm离心5min，将上清转至另一离心管中;
(6)向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5~10min，12000rpm离心5min，弃上清，吸干离心管中的液体;（析出DNA）
(7)用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清，自然干燥;（洗出金属盐离子）
(8)加20μl TE缓冲液，其中含有20μg/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解
(9)凝胶电泳检测抽提结果，剩下的DNA放-20°C冰箱保存。
19、凝胶电泳检测原理、种类、过程、注意事项
凝胶电泳的原理：当一种分子被置于电场中，它们就会以一定的速度移向适当的电极。
这种分子在电场作用下的迁移速度叫做电泳的迁移率，它同电场的强度和电泳分子本身携带的净电荷成正比。在电场中，DNA带有负电荷，向正极泳动。在一定的电场中，DNA 分子的泳动速度取决于核酸分子本身的大小和构型。
种类：琼脂糖凝胶电泳（凝胶浓度越大，孔隙越小，越适合小分子，DNA结构，DNA分子量 , V共价闭环〉V线状〉V开环状）、聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉冲场凝胶电泳20、SDS-PAGE原理、各成分作用
原理：SDS-PAGE(分离蛋白质和寡核苷酸)，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂(巯基乙醇、二硫苏糖醇)能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
各成分作用，
聚丙烯酰胺：丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；
制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCl系统；
TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；
十二烷基磺酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
21、PAGE与琼脂糖凝胶电泳的区别（书本p102-103）
检测大小（PAGE分辨率更高）
支架（琼脂糖，丙烯酰胺聚合（隔绝空气-垂直结构，加促凝剂））
垂直与水平结构
百度完善...
22、分子杂交种类、原理、过程
Southern杂交；
Southern 印迹杂交由E. Southern于1977年建立。它根据毛细管作用原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA或RNA 探针
的杂交作用以检测这些被转移的DNA片段。
过程：1、酶切；2、电泳/照相；3、变性/中和变性试剂：0.4M NaOH 中和试剂：0.5M NaOH /1.5M NaCl 或1M Tris （pH7.4）/1.5M NaCl；4、转移转移方式：毛细管电转移真空转移buffer：6×SSC（或SSPE）；5、固定 80℃ 2hr，或者UV照射，microwave Norther n杂交；
主要针对RNA分子的检测，基本步骤与Southern印迹杂交相似，变性试剂不同等，见作业百度。
Western杂交；转移的是蛋白质而不是RNA
菌落杂交（菌落原位杂交）：
其他分子杂交p109
噬菌斑杂交：书本p109
斑点杂交（斑点印迹杂交）：将通过特殊的加样装置将变性的DNA或RNA核酸样品，直接转移到适当的杂交滤膜上，然后与核酸探针分子进行杂交以检测核酸样品中是否存在特异性DNA或RNA。
狭线杂交：
23、探针种类
同源或部分同源探针、总cDNA探针、特异性cDNA探针、人工合成的寡核苷酸探针
24、E.coli感受态细胞制备过程PPT
25、DNA导入大肠杆菌的方法
影响转化的因素：
DNA分子导入大肠杆菌主要通过转化来完成，λ噬菌体和M13噬菌体感染宿主细胞时分别涉及转导和转染过程
转导，感受态细胞，CaCL2转化法，电转化法
转染:采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法，将重组λ噬菌体DNA分子导入受体细胞的过程。
转导:通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。
26、重组DNA分子导入真核细胞的方法
电穿孔法、基因枪法、显微注射法、脂质体介导法、花粉管通道法，农杆菌介导
27、重组子的筛选方法
（一）遗传表型直接筛选法
1）、根据载体选择标记初步筛选转化子
抗药性筛选；插入失活筛选法；插入表达筛选法；显色互补筛选法
2）、营养缺陷型检测法
根据目的基因在受体细胞中表达产物的性质，筛选含目的基因的克隆子。若目的基因产物能降解某些药物使菌株呈现出抗性标记或基因产物与某些药物作用是颜色反应，则可根据抗性或颜色直接筛选含目的基因的克隆子。该方法的使用前提是待选择的目的基因能在受体菌中进行表达。
3）、形成噬菌斑筛选法
λDNA载体被外源DNA分子插入后，重组 DNA分子大小必须在野生型λ DNA长度的75~105%范围内，才能在体外包装成具有感染活性的噬菌体颗粒。转导受体菌后，转化子在培养基平板上被裂解形成噬菌斑，而非转化子正常生长。噬菌斑中的λ噬菌体即为重组子。（二）依赖重组子结构特征分析的筛选法
1）、快速裂解菌落鉴定分子大小（质粒快检）
此法主要是根据有外源DNA片段插入的重组质粒与载体DNA之间大小差异来区分重组子和非重组子。
2）、限制性核酸内切酶酶解分析法
通过快速裂解菌落鉴定分子大小的方法虽可初步筛选到重组子菌落，但却难以将其中的期望重组子和非期望重组子区分开，因为重组质粒DNA中，质粒载体可能会与一个以上的外源DNA片段连接重组，而采用限制性核酸内切酶分析法不仅可进一步筛选鉴定重组子，而且能判断外源DNA的插入方向及分子质量大小等。
3）、利用PCR方法筛选重组子
载体DNA分子中，外源DNA插入位点的两侧序列多为固定已知，通过与插入位点两侧已知序列互补的引物，以从初选出来的阳性克隆中提取的少量质粒DNA为模板进行PCR反应，通过对PCR产物的电泳分析就能确定是否是重组子菌落。
28、RNAi的概念和作用机制（RNA干扰）
RNAi（RNA interference ）是由双链RNA分子在mRNA水平阻断相应基因表达或使其沉默的过程。它广泛存在于生物界，是生物体抵御病毒或其它外来核酸入侵而保持自身遗传稳定的保护性机制。目前在果蝇、真菌、昆虫、植物以及哺乳动物中均有发现。
RNAi作用机制：长链dsRNA被切割成20-25nt长度的片段，即siRNA。siRNA与核酸诱导的沉默复合物（RISC）结合，作为模板识别目的mRNA。通过碱基互补配对原则，mRNA与siRNA 中的反义链结合，置换出正义链。双链mRNA被相关酶切割产生22nt左右的siRNA，后者与RISC结合，继续反复切割mRNA，从而使基因沉默。
29、miRNA的概念和作用机制
Small RNAs主要包括两大类：
?miRNAs (microRNAs)
? siRNAs (short interfering RNAs)
miRNAs普遍存在于动植物体内，影响基因表达、细胞周期调控和个体发育，它由非编码基因转录物形成的茎环结构加工而来，长度22nt左右；
成熟miRNA的5’端为磷酸基团，3’端为羟基；
表达具有严格的时序性和组织特异性；
无ORF，多存于间隔区，进化中结构高度保守。
第八章 PCR技术及应用
30、PCR的概念、基本要素、具体步骤、反应体系
PCR（polymerase chain reaction）：聚合酶链式反应，是指通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术，它包括变性、退火、延伸三个步骤。基本要素：引物、dNTP、耐热DNA聚合酶、模板DNA
具体步骤：变性（denaturation）：90～98℃；退火（annealing）：37 ～72 ℃；
延伸（extension）：72 ℃。
PCR反应体系
①脱氧核苷三磷酸（dNTP），dA TP、dGTP、dCTP、dTTP是PCR的原材料，通过PCR 过程聚合成互补链DNA。贮存浓度：2.5mM，使用浓度：200μM。使用浓度不当会影响扩增的产量、特异性和保真度。
②缓冲液（buffer）：TAE，TBE，TPE（T-Tris，E-EDTA，A-乙酸，B-硼酸，P-磷酸）PCR标准缓冲液含10mmol/L Tris*HCL，PH8.3-9.0。作用：缓冲PH，提供部分反映成分。
③引物（primer），最佳引物使用浓度为0.1 μM ~1.0 μM 之间。引物浓度太低，扩增产物太少；引物浓度太高，易出现非特异性扩增反应。引物长度＜20nt时：Tm=4×（G+C）+2×（A+T）
引物设计要求:
?设计的引物的核苷酸序列必须与模板链3’端的一段核苷酸序列互补,且3’端必须有游离的-OH基团；(从3端开始接合模板链,PPT上思考题选A，D) ?引物一般由20~30个核苷酸组成，4种核苷酸尽可能随机分布，GC含量应达40~60%；
?引物中应尽量避免回纹序列出现；
?引物中最好含有进一步操作中可利用的限制性核酸内切酶识别序列。
④模板DNA，作为PCR 的靶DNA一般是一个待扩增的特定双链DNA片段，应知道其两端
20~30bp的核苷酸序列，供设计一对引物之用。PCR的模板是一条单链DNA片段，其3’端具有与引物杂交的序列。
⑤耐高温DNA聚合酶
31、耐高温DNA聚合酶的种类、各自的特点
①Taq DNA聚合酶，来自嗜热古细菌Thermus aquaticus。该菌1967年从温泉中分离，最适生长温度70℃。现市场上销售的是该基因在E.coli细胞中的表达产物。
特征：相对分子质量为94×103，为单分子酶，具较强的5’→3’DNA聚合酶活性和较弱的5’→3’外切酶活性，缺乏3’ →5’外切酶活性。最适pH9.0，最适反应温度75℃。合成出错几率8.9×10-5～1.1×10-4。
②Pwo DNA聚合酶
来自喜温性古细菌Pyrococcus woesei。现市场上销售的是该基因在E.coli细胞中的表达产物。
特征：相对分子质量为90×103，具较强的5’→3’DNA聚合酶活性，兼3’→5’外切酶活性。耐热性更高，保真度比Taq DNA聚合酶高10倍。
③Tth DNA聚合酶
来自喜温性真细菌Thermus thermophilus HB8。具较强的5’→3’DNA聚合酶活性，缺乏3’ →5’ 外切酶活性。最适pH9.0，最适反应温度75℃。Mg2+存在时，以DNA为模板合成DNA，Mn2+存在时，可以RNA为模板合成cDNA，用于RT-PCR系统。
④Vent DNA 聚合酶
来自嗜热高温球菌Thermococcus litoralis。相对分子质量85×103。100℃时该酶半衰期为1.8hr，具有3’ →5’外切酶校对活性。合成的准确度比用Taq DNA 聚合酶高5 ～ 15倍。
⑤Pfu DNA 聚合酶
来自激烈热球菌Pyrococcus fariosus。保真度较高。（3’→5’外切酶活性）目前错配率最低。
⑥KOD DNA 聚合酶
特征：①具有强力的3’→5’核酸外切酶活性，与Taq DNA聚合酶相比，保真度比后者高50倍左右。②合成速度比Taq DNA聚合酶快2倍，比Pfu DNA聚合酶快6倍。③耐热性比Taq DNA聚合酶好，在100℃、1小时的热处理后仍可保持约70％的活性，故根据需要可以将热变性步骤的温度设定值提得更高，这对处理GC含量高的模板等具有特异性高级结构的样品非常有利。
⑦高保真 DNA 聚合酶
Phusion 高保真DNA聚合酶 (Finnzymes )，Phusion采用一种新的蛋白融合技术，与一种独特的双链DNA结合蛋白融合后，可以和模板更加紧密的结合，触发更为强劲和快速的扩增，它甚至可以用于结合那些最难被结合的模板, 持续扩增能力（processivity，决定最大扩增长度）是Pfu酶的10倍，Taq酶的2倍。
⑧商用混合 DNA 聚合酶
Ex Taq DNA聚合酶
Ex Taq Hot start DNA聚合酶
LA Taq DNA聚合酶
LA Taq Hot start DNA聚合酶
为了提高扩增的保真度或扩增较长DNA片段，将Taq DNA聚合酶的强启动能力和具有3’→5’外切酶活性高温DNA聚合酶的高持续活性和校正功能结合起来，可以达到很好的效果。
32、PCR平台期的概念、出现平台期的原因
平台期：
出现平台期的原因可能有：
①后期循环酶浓度或聚合时间不足；
②引物耗尽；
③dNTP耗尽；
④产物浓度过高，以致dsDNA解链后又迅速退火，不能与引物结合。
33、PCR产物克隆的几种方式
①在PCR产物两端添加限制性酶切位点；②A/T克隆法；③平末端DNA片段的克隆；④长片段DNA的PCR扩增
34、PCR扩增未知片段的几种方式
①反向PCR；②利用接头的PCR；③热不对称交错PCR
35、RACE、DD-PCR、RAPD、AFLP的概念、原理（参见PPT）
第九章 DNA序列分析
36、两种不同的测序方法的基本原理
ⅠMaxam-Gilbert 化学降解法
将待测DNA片段的5’端磷酸基团作放射性标记，再分别采用不同的化学方法对特定碱基进行化学修饰并在该位置打断核酸链，从而产生一系列5’端被标记的长度不一且分别以不同碱基结尾的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过并列点样的方式用凝胶电泳进行分离，再经放射自显影，即可读出目的DNA的碱基序列。
ⅡSanger双脱氧链终止法
双脱氧核苷酸（ddNTP）分子的脱氧核糖的3’位置的羟基缺失，当它与正常核苷酸混合在同一个扩增反应体系中时，在DNA聚合酶的作用下，虽然它也能参与DNA合成，但由于其3’位置的羟基缺失，使其下面的核苷酸的5’磷酸基无法与之结合。也就是说，一旦双脱氧核苷酸整和到正在合成的DNA链中，该股DNA的合成就到此终止。
37、序列分析的基本步骤
1、模板制备和引物设计
模板：单链或双链DNA，必须保证足够的浓度
引物：18-22nt，55-60℃，尽量避免3个以上碱基重复，
尽量减少发夹结构形成的可能性。
2、经典测序方法的反应步骤
?模板变性
?退火
?标记
掺入标记：[α-32P]dATP、 [α-33P]dATP、 [α-35P]dATP
末端标记： [γ-32P]rATP
?延伸
?电泳分析和数据读取
38、大片段DNA序列测定的方法
①通用引物指导未知序列的测定；②引物步移；③随机克隆测序；④缺失克隆测序
第十章 DNA诱变
39、定向进化的概念
对于某些实验目的，一次突变很难获得满意的结果，通常采用反复多次诱变和循环，其目的是获得满足人们需要的性能改良的蛋白质，又称为试管进化。
40、随机诱变的方法、原理
1）错误掺入突变，在体外DNA扩增中，使用具有错配倾向的DNA聚合酶以及反应条件，使碱基错误掺入到新合成的基因中，又称易错PCR（error-prone PCR）。热稳定TaqDNA聚合酶和突变DNA聚合酶
error-prone PCR的实质：通过改变PCR反应条件来调整PCR反应中突变的频率，降低聚合酶固有的突变序列倾向性，提高突变谱的多样性，使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中，从而得到随机突变的DNA群体，最后用合适的载体克隆突变基因。
2）盒式诱变
①盒式取代诱变；简单的盒式取代诱变是通过限制性酶切除去特定的双链DNA片段，再与含有突变的单一序列双链寡核苷酸连接,得到取代突变，是一种定点诱变。
②混合寡核苷酸诱变；若用于取代的是含有随机突变的混合双链寡核苷酸，则可在限定区域内引入大量的随机突变。
3）增变菌株的诱变作用
概念：与DNA错配校正功能和DNA损伤修复有关的基因突变后，细胞内基因的突变频率大大增加，这样的菌株叫增变菌株（mutator strain）。
常用增变菌株：E.coli XL1 - Red (mutD mutS mutT)
mutD突变造成DNA聚合酶Ⅲ的3’→5’外切核酸酶活性缺陷，失去错配碱基的校正功能；mutS突变使DNA错配修复系统失去功能；
mutT突变不能水解dGTP的氧化产物8-oxodGTP， 8-羟基鸟嘌呤在复制时掺入DNA中，造成突变。
4）化学诱变
用化学诱变剂处理双链DNA片段，将发生随机突变的片段群体克隆到合适的宿主中，构建成一个重组突变体库。用适当的功能分析可鉴别携带突变的重组子。
41、体外重组的种类、概念、特点
①DNA洗牌法（DNA shuffling），是通过对一组序列相关DNA序列，经过超声波处理或在DNaseI的作用下随机切成小片段，然后在没有引物的情况下，采用有性PCR方法进行合成；随着循环数的增加，PCR产物将越来越接近切割前的目的基因的长度；最后用基因两侧的引物合成全长的基因。（筛选瓶颈）有性PCR
DNA shuffling技术的优点：①可在短时间内通过重组有效的突变体发掘所有可能的重组体与突变序列，从而大大加快进化速度；而且对可操作的靶序列没有任何要求，长度可达几十kb;②通过多轮筛选或选择，可以使有益突变迅速积累，导致功能的明显提高；③从表型上早期进行选择，而不必了解DNA片段上序列的信息，简化了操作程序；④比随机突变显著提高了良性突变的概率。
②交错延伸重组
交错延伸重组是一种简化的DNA shuffling技术。它不是由短片段组装全长基因，而是在PCR样反应中将含不同点突变的模板混合，随之进行多轮变性、短暂（5sec）复性/延伸反应，在每一轮PCR循环中，那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重复直到获得全长基因片段，重组的程度可通过调整反应时间和温度来控制。（控制温度，退火，延伸时间）
③随机引发重组
RPR以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA 片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR 反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。
该法可以用一条DNA单链为模板，因此可以直接以cDNA为模板进行随机引发重组。
42、传统的定点诱变的方法、原理
①Kunkel定点诱变法（又称“U”法）（参见PPT）
原理：dut-：dUTP酶（dUTPase）缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP，因此细胞内dUTP 的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下由T占据的位置。
ung-：UDG酶缺陷，UDG酶[尿嘧啶-N-糖基化酶]可除去掺入DNA中的尿嘧啶残基
在体外用诱变引物合成的杂合双链DNA在导入正常ung+ dut+菌株后，只有带有突变位点的新合成链和作模板进一步复制，而野生型不能复制。这样能够生长的细胞就带有突变位点。（插入M13的DNA可以分别回收到两种形式：dsDNA和ssDNA）
②位点选择诱变（参见课本P179）
位点选择诱变法使用了2个寡核苷酸引物，一个是用来引入突变的引物，另一个是用来选择用的。选择性引物可用来恢复有缺陷的抗生素抗性基因，同时可用来选择引入突变的DNA 链。
特点：可正向选择突变链，使用高保真的T4DNA聚合酶合成DNA，可以使用双良DNA作模板，可进行多轮筛选。但需特定载体，即含有一个有缺陷的抗生素抗性基因。
③转化子诱变（参见课本180）
转化子诱变也使用了2个寡核苷酸引物，除了突变引物外，还使用了1个用来剔除单一酶切位点的引物。因此该方法也称酶切位点剔除法。将待突变的DNA片段装载到克隆载体上，该载体上必须存在1个单一酶切位点。当这两个引物同时指导DNA合成时，突变的DNA链将不再含有该单一酶切位点，而模板DNA在该位置能被切割。通过转化大肠杆菌，线性化的模板DNA不能复制，只有突变保持环状，可以获得转化子。
43、PCR介导的定点诱变的方法、原理
大引物PCR诱变；重叠延伸PCR诱变；重叠延伸剪接技术；同源重组法；双向PCR快速定点诱变
44、PCR介导的定点诱变方法中，模板DNA的排除方法
限制性内切酶Dpn I 可特异性切割dsDNA中的Gm6ATC位点，对半甲基化的DNA效率较低，完全不能切割非甲基化DNA。大肠杆菌体内DNA在Dam甲基化酶催化下完全甲基化，对Dpn I 敏感。用4种通用dNTP在体外合成的DNA没有甲基化，可以抵抗Dpn I的切割。
第十章 DNA文库的构建和目的基因的筛选
45、基因组DNA文库、cDNA文库的概念
基因组DNA文库：将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。cDNA文库（针对真核生物）：若这些阳性菌落中所含的外源DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA，则称之为cDNA文库。cDNA不含内含子。
46、构建基因文库的基本程序
提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA；
DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组DNA；
重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；
阳性重组菌落或噬菌斑的选择。
47、鸟枪法的概念（质粒文库）
鸟枪法（霰弹法）：利用机械剪切力和超声波等物理方法或限制性核酸内切酶酶切等生化方法将生物chr.打断，随后通过T4 DNA连接酶把这些片段与适当的质粒载体进行重组，转化受体菌后进行无性繁殖，获得一大群含不同外源DNA片段的克隆，再用简便的筛选方法从众
多的转化菌株中筛选出含有某一目的基因的菌株，从中获得所要的基因。
48、文库的代表性和随机性的意义
代表性：指文库中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段 DNA 。代表性是衡量文库质量的一个很重要的指标。
完整的基因文库所需克隆的计算公式：PPT
49、基因组DNA文库的构建流程及注意事项
1）．基因组 DNA 文库的载体制备
载体的制备要求：①纯度高；②去磷酸化好。
2）．高质量大分子量基因组 DNA 的提取和部分酶切
提取的基因组 DNA 要求保存完整。
分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。
3）．文库的连接转化或包装侵染
在电转化和包装侵染过程中，首先选择转化效率高的感受态细胞或效价高且质量稳定的包装蛋白；同时，研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显地提高其效率。另外，对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入片段的 DNA 的转化效率也有所不同。4）．文库的质量检测
文库的平均插入片段长度是通过 PFGE 电泳检测一定数目的重组子的插入片段大小所得平均值。美国的研究机构对 BAC 文库，一般要求植物的在 130kb 左右，而动物的在150kb 左右。
插入效率：有插入片段的克隆在所有检测的克隆中所占的比例。
基因组覆盖倍数＝平均插入片段长度×克隆数/基因组 DNA 的长度（一般是约数）；
基因组覆盖度是指文库中的克隆覆盖基因组的范围，检测时是通过选择一定数目的已知的单拷贝的基因作探针来筛选文库。由于所使用的每个探针筛选的克隆数目即表明文库中对该基因位点的覆盖倍数，因此，基因组覆盖倍数又等于所有探针筛到的阳性克隆的总个数/使用的总探针数的比值
50、cDNA文库的构建步骤
细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；第一链 cDNA 合成；第二链 cDNA 合成；双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。双链cDNA文库非自然存在，病毒中逆转录成单链DNA。
51、cDNA第一、第二链的合成方法
第二条链：自身引导法；置换合成法；引导合成法；引物－衔接头合成法
52、文库中目的基因的筛选方法
表型筛选法；杂交筛选（差别杂交、mRNA 减法杂交、抑制性差减杂交）；免疫筛选；高表达基因；mRNA差别显示；酵母双杂交系统
53、酵母双杂交的作用原理（参见PPT）
酵母双杂交原理：利用融合蛋白的策略，将蛋白X与BD融合，蛋白Y与AD融合，将它们导入酵母细胞中共表达，如果X和Y相互作用，则会导致BD与AD在空间上接近，形成一个有功能的转录激活因子激活下游报告基因的表达。
一、名词解释: 5’×6
二、填空: 1’ ×28
三、问答: 6’ × 5
四、实验设计: 12’
1.现已知某环境中有一种能产生淀粉酶的细菌，请设计一合理实验，获得该细菌中的淀粉酶基因序列并列出其在大肠杆菌中表达的实验步骤。
2.试设计一合理实验，对克隆于载体pBR322 中的四环素抗性基因（Tet R）内的特定位置碱基序列进行缺失突变，以获得预期的缺失突变体。
一、概念：
Sanger测序法；化解降解测序法；基因组DNA文库；cDNA文库； PCR；A/T克隆；穿梭载体；人工染色体；蓝白斑筛选；.α-互补；限制性内切酶；包涵体蛋白；RNAi；次生菌落；Kunkel定点诱变法；Northern杂交；PCR平台效应；RACE；λ噬菌体载体；表达载体；酵母双杂交系统
1.目前实验室PCR常用的DNA聚合酶有哪些？列出各自的特点。
2. 列出琼脂糖凝胶电泳与聚丙烯酰胺电泳的异同点。
3.请列出五种实验室常用的分子克隆工具酶，并分别说明各自的用途。
4.描述大肠杆菌体内DNA复制与PCR过程的异同点。
基因工程期末试题复习要点整理 基因工程是70年代出现的一门科学，是生物学最具生命力和最引人注目的前沿科学之一，是现代生物技术的代表，是生命科学类专业中的一门重要的专业课。本课程主要介绍基因工程概述、重组DNA基本技术及原理、基因克隆、基因的分离及鉴定、基因工程的表达系统、基因工程的应用等。通过本课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理和了解该技术在动物、植物和微生物等方面的应用，为今后从事生物学教学、生物技术研究和产品开发，或进一步的研究生学习科研打下坚实的理论及专业基础。扬州大学试题纸 一、名词解释：共10题，每题2分，共20分。 1. 基因: 是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 2. 定位克隆: 获取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆 3. 融合基因: 是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。 4. 转化子: 导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞，又称重组体。 5. 人工接头：是人工合成的具有一个或数个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。 6. RT-PCR: 是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。 7. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。 8. MCS: 指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 9. gene targeting : 基因工程中利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源性DNA序列发生重组的性质，来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术 10. 5’RACE: 是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到5’端之间未知序列的方法。 四、简答题：共4题，共20分。 1．简述获得目的基因常用的几种方法。（5分）
生物选修3知识点 专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过，赋予生物以，创造出。基因工程是在 上进行设计和施工的，又叫做。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”—— （1）来源：主要是从中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别的核苷酸序列，并且使每一条链中的两个核苷酸之间的断开，因此具有。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式： 和。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（）的比较： ①相同点：都缝合键。 ②区别：来源于大肠杆菌，来源于T4噬菌体， 只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来； 而能缝合两种末端，但连接的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。 DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 必须需要模板 3.“分子运输车”—— （1）载体具备的条件：①。 ②，供外源DNA片段插入。 ③，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是 ,它是一 种 。
（3）其它载体： (二)基因工程的基本操作程序 第一步： 1.目的基因是指：基因。 2.原核基因采取获得，真核基因是。人工合成目的基因的 常用方_ 和_。 3. 从基因文库中获取 基因文库（1）概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 （2）类型：基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库） （1）原理： （2）过程：第一步：加热至90～95℃； 第二步：冷却到55～60℃，； 第三步：加热至70～75℃，。 第二步：（核心步骤）
2013-2014年度第二学期基因工程期末考试 卷型：A 考试时间：90分钟满分：100分 一、名词解释（3×5） 限制性内切酶(或其它工具酶)：能在特异位点上催化双联DNA分子断裂，产生相应的限制性DNA片段 荧光定量PCR:所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 （半定量PCR:是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量） 星活性：非标准条件下切割相似序列，产生非特异性片段 同裂酶（或同尾酶）：来源不同但具有相同识别序列，产生相同或不同末端 转基因技术（或转基因动植物等）：就是将人工分离和修饰过的基因导入到目的生物体的基因组中，从而达到改造生物的目的。 二、填空（1×15） 1.Cosmid 实际上是由cos 位点和质粒构成的杂合载体，也可以说是带有cos 序列的质粒。 2.超螺旋质粒DNA、开环质粒DNA、线状质粒DNA 在琼脂糖凝胶电泳的特点是：电泳的泳动速度由大到小分别是：超螺旋质粒>线状质粒>开环质粒。 3.质粒DNA的提取方法有碱裂解法、煮沸法、去污法。 4.基因工程中常用载体是质粒、噬菌体、动植物病毒。
5.设计引物是一般要求C+G的比例在40%-60%，长度在17-30bp 。 6.BAC载体与常规载体的区别在于复制单元的特殊性。 三、选择题（2×15，实卷应是1×35） 1.基因工程创始人（D） A A. Kornberg B W. Gilbert C P. Berg D S. Cohen 2.迄今为止所发现的限制性内切核酸酶可以作用于（C） A. 既可以作用于双链DNA ，又可以作用于单链DNA B.只能作用于单链DNA C. 只能作用于双链DNA D.只能作用于RNA 3.氨苄青霉素的工作原理为（A ） A.可以抑制细胞壁肽聚糖的合成 B.可以抑制核糖体的转位 C.可以与核糖体50S 亚基结合并抑制蛋白质合成 D.可以与核糖体30S 亚基结合并抑制蛋白质合成 4.反转录酶是一种（C ） A. 依赖DNA的DNA聚合酶 B. 依赖DNA的RNA聚合酶 C. 依赖RNA的DNA聚合酶 D. 依赖RNA的RNA聚合酶 5.II 类限制性内切核酸酶( A ) A．仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供 B．限制性识别非甲基化的核苷酸序列 C．有外切核酸酶和甲基化酶活性
基因工程各章知识点 第一章绪论 1．基因工程的首例操作实验 三大理论基础：DNA是遗传物质、DNA的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码的破译和遗传物质传递方式的确定 三大技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割、DNA连接酶的发现与DNA片段的连接、基因工程载体的研究与应用 基因工程的诞生： 72年，P.Berg首次实现体外DNA重组：体外用EcoRI分别切割SV40和λDNA,并用T4 DNA连接酶连接成为重组的杂种DNA分子 73年，S.Cohen 体外重组DNA并转化：具Kanr的E.Coli质粒R6－5和具Tetr的E.Coli质粒pSC101切割并连接转化的大肠杆菌具有双重抗性 S.Cohen 和H.Boyer首次实现真核基因在原核中表达：将非洲爪蟾的DNA与E.Coli质粒（pSC101）体外切割并连接，转化大肠杆菌 2．基因工程的基本概念 基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种新物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或具有新性状的DNA体外操作技术，也称为分子克隆或重组DNA 技术。 供体、载体、受体是基因工程的三大基本元件。 3．基因工程的基本操作过程 a分离目的DNA片段：酶切、PCR扩增、化学合成等。 b重组：体外连接的DNA和载体DNA，形成重组DNA分子。 c转化：将重组DNA分子导入受体细胞并与之一起增殖。 d筛选：鉴定出获得了重组DNA分子的受体细胞。 e对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。 第二章载体 1．理解用PBR322和PUC18作载体的克隆外源基因的原理。答案不确定 PBR322作载体的克隆外源基因的原理:PBR322质粒具有12 种限制性内切酶的单一识别位点：Tet r 基因内有7个酶切位点：Bam HⅠ，SalⅠ：Amp r基因内有3 个酶切位点：PstⅠ。Eco RⅠ和HindⅢ不在抗生素基因内，不导致插入失活。 如果在pBR322质粒的Tet r基因内位点插入外源DNA片断，将切断了tet r基因编码序列的连续性，使tet r 失去活性，产生出Amp r Tet s表型的重组pBR322质粒，转化入Amp s Tet s的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Amp r菌落，再将它们影印于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长，这样就找出了含重组质粒的大肠杆菌。如果在pBR322质粒的Amp r基因内位点插入外源DNA片断，则反之。 PUC18作载体的克隆外源基因的原理：
基因工程 绪论 1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础 三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。 三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶 1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单
华东理工大学2004–2005学年第二学期 《基因工程》课程期末考试试卷B2005.6 开课学院：生物工程学院，考试形式：开卷，所需时间：120分钟 考生姓名：学号：专业：班级 一、问答题（共15分） 某表达质粒上含有一个能在大肠杆菌中可溶性表达的基因A，若将外源基因B插入到基因A的3' 末端，使之产生可溶性融合蛋白A-B，试设计合理的重组方案。（15分） ___ 起始密码子 A 基因全序列ATGATCGGGATTCGCTGGGATAAAGTGCACCTCAATATAGCACACGCTTGCAACGCAAAGAGC CCCGATTTCTGTAACCGCCAGCACAAAGATGCGGAACACCCAAAAGTGGCGGCAAACGCCTTC AACCGGATCCCGGGATATCAGCTGAGATCTGCTTTCTAG ___ 终止密码子 ___ 起始密码子 B 基因部分序列TCCCGGGATCCATGCTC.........................CGCTAAGAGGATCCTCCCGGGT ___ 终止密码子 BamHI：G\GATCC BglII：A\GATCT EcoRV：GAT\ATC EcoRI： G\AATTC SmaI：CCC\GGG PvuII：CAG\CTG 二、问答题（共15分） 简述基因洗牌术（DNA Shuffling）的工作原理及用途。 三、问答题（共10分） 为什么说多型汉逊酵母表达系统有可能比巴斯德毕赤酵母表达系统更优越？
四、问答题（共20分） 人促红细胞生长素（EPO）系一糖蛋白，其生物活性严格依赖于糖基侧链的序列和大小，临床上主要用于改善癌症患者由于放疗化疗所引起的红细胞降低症侯群。试设计一种高产人EPO的重组表达系统，内容包括： （1）选择合适的受体系统，并说明理由；（6分） （2）选择合适的载体系统，并说明理由；（6分） （3）确定合适的高效表达方案，并简述其机制。（8分） 五、问答题（共20分） 随着植物转基因技术的日趋成熟，世界范围内被批准上市的转基因农作物也不断涌现，然而人们对转基因产品的安全性仍有争论，至少他们要求对餐桌上的食物是否由转基因植物加工而成拥有知情权。为此，建立一种能区分转基因植物和天然植物的检测方法十分重要。目前，世界各国批准上市的转基因植物种类繁多，但绝大多数使用花椰菜花斑病毒（CaMV）的35S启动子。请设计一种能快速灵敏地检测转基因植物的实验程序，并简述其机制。 六、问答题（共20分） 下图是链霉菌的某段DNA序列，试分析其可能的开放阅读框（ORF），并写出： （1）N端10个氨基酸序列；（7分） （2）C端10个氨基酸序列；（7分） （3）潜在的SD序列。（6分） 5’CGCTTGAATTCGTTCCATCTGGAGTCTGTACATGACCAGCCGATACGGCAGCCGGCAGGAACT CGGCCAGAAGTTCCTCGTCGACCCCGACATCATCAAGCTGATACGCCGAGCCGCCGAACGAACGG AAGGTCCCATCGTTGATCTGGGCGCCGGAGACGGCGCCCTGACGCTGCCCTTGAGTCGATTGGGC CGCCCTGTCACCGCGGTTGAGCTCGATCCCCGCCGGGTCAAACGGCTTTCGGCGCGTGCCCCGGA AAACGTCAAGGTCGTCGGCGAGGACATTCTGCGCTTTCGGCTTCCGACCGTTCCGCACACCGTCG TGGGGAACATCCCCTTCCATGTCACGACGGCCACGATGCGCCGGATCCTGGTGGCTCCCGCATGG GTGTCGGCCGTCCTCGTGGTGCAGTGGGAAGTGGCGCGCCGCCGGGCCGGCATCGGCGGCTGCTC GCTGGTCACGGCGGAGTCCTGGCCGTGGTTCGACTTCTCGGTGCTCAAGCGGGTGCCGAGGTTCG CCTTCCGGCCCGCGCCCTCCGTGGACGGCGGGATCCTCGTCATCGAGCGGCGGCCCGAGCCACTG GTGCGGGAGCGCAGGGAGTACCAGGACTTCGTCAGACAGGTCTTCACCGGGCGCGGTCACGGGCT GCGGGAGATCCTCCAACGCATCGGGCGGGTCCAGGACAGCGACCTGTCCGCGTGGTTCAGGGCAC ATGGAGTCTCGCCGCAGGCGCTGCCGAAGGACCTCACCGCCGAGCAGTGGGCGTCGCTCTGGGGC ATGGCGCGTGGCGGCCGGTCCGTGCCGCGGACGCGGATACTCCGGGACCTGCCGCACCGCACGTC CCTCGGGCCGCGGCGCAACAGCGGCTGACGCGGGCGGCAACCGGCGTGGCGGGCCGG 3’
一、单选 1、第一个实现DNA重组的实验:1972年，美国斯坦福大学医学中心的P.Berg在世界上第一次成功地实现了DNA的体外重组。 2、第一次实现重组体转化成功的实验：1973年，科恩（Coher）和博耶（Boyer）建立的基因工程基本模式。 3、基因工程研究的主要内容：切接转增检。 4、基因工程研究的基本要素：基因、工具酶、载体、受体细胞。 5、DNA在生物体内的存在状态：染色体DNA、病毒DNA（噬菌体DNA）、质粒DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA，有的以线型存在，有的以环状存在。 6、天然DNA提取的步骤：生物材料的准备、裂解细胞、分离抽提DNA。 7、DNA的分离抽提法：酚-氯仿抽提法（常用、经典）。 8、DNA的保存：温度越低越好，同等条件下，温度越低越不容易降解。 9、为了消除在制备RNA过程中RNA酶的污染，应用0.1% DEPC处理过的水配制试剂。 10、人工合成DNA片段的方法有化学合成法和聚合酶链式反应扩增法。 11、紫外分光光度法检测核酸样品的纯度（常用），纯净的核酸溶液的0D260/OD280值应为 1.7~2.0，0D260/OD230值应大于 2.0，如果0D260/OD280小于1.7，可能有蛋白质污染，如果0D260/OD280大于2.0
或0D260/OD230小于2.0时，核酸溶液中可能存在其他干扰物质。12、工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶。 13、 14、通常提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言，限制性核酸内切酶的命名：属名+种名。例如：B acillus am ylolique faciens H、 H aemophilus in fluenzae dⅠ→Bam H、Hind 15、限制性内切核酸酶的本质：细菌细胞的限制—修饰系统。 17、常用的酶切方法：单酶切、双酶切和部分酶切。
基因工程核心知识点 一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶（E?coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E?coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形 成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 *比较有关的DNA酶 （1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的方法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA解旋。（3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。 （4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA 连接酶的异同点。 3.“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 （3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒 【解题技巧】 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 (3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。(4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。 (5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 (6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因，目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。 2.获得目的基因的方法
基因工程期末考试重点知识整理
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg 及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)
第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ
一、单选 1、第一个实现DNA重组的实验：1972年，美国斯坦福大学医学中心的P.Berg在世界上第一次成功地实现了DNA的体外重组。 2、第一次实现重组体转化成功的实验：1973年，科恩（Coher）和博耶（Boyer）建立的基因工程基本模式。 3、基因工程研究的主要内容：切接转增检。 4、基因工程研究的基本要素：基因、工具酶、载体、受体细胞。 5、DNA在生物体内的存在状态：染色体DNA、病毒DNA （噬菌体DNA）、质粒DNA、线粒体DNA利叶绿体DNA,有的以线型存在，有的以环状存在。 6、天然DNA提取的步骤：生物材料的准备、裂解细胞、分离抽提 DNAo 7、DNA的分离抽提法：酚■氯仿抽提法（常用、经典）。 8、DNA的保存：温度越低越好，同等条件下，温度越低越不容易降解。 9、为了消除在制备RNA过程中RNA酶的污染，应用0.1% DEPC处理过的水配制试剂。 10、人工合成DNA片段的方法有化学合成法和聚合酶链式反应扩增法。 口、紫外分光光度法检测核酸样品的纯度（常用），纯净的核酸溶液的 OD260/OD280值应为1.7-2.0, OD260/OD230值应大于2.0,如果OD260/OD280小于1.7,可能有蛋白质污染，如果OD260/OD280大于2.0
或OD260/OD23O小于2.0时，核酸溶液中可能存在其他干扰物质。 12、工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶。 基因工程屮最常用的工具酶 14、通常提到的限制性核酸内切酶主要指II类酶而言，限制性核酸内切酶的命名： 属名+种名。例如：Bacillus amylolique faciens H、Haemophilus influenzae d Bam H> Hind I o“属种株序” 15、限制性内切核酸酶的本质：细菌细胞的限制一修饰系统。 16、限制性内切核酸酶的作用机制识别双链DNA中特定的核昔酸 17、常用的酶切方法：单酶切、双酶切和部分酶切。
专题一基因工程 一【高考目标定位】 1、专题重点：DNA重组技术所需的三种基本工具；基因工程的基本操作程 序四个步骤；基因工程在农业和医疗等方面的应用；蛋白质工程的原理。 2、专题难点：基因工程载体需要具备的条件；从基因文库中获取目的基因； 利用PCR技术扩增目的基因；基因治疗；蛋白质工程的原理。 二【课时安排】2课时 三【考纲知识梳理】 第1节DNA重组技术的基本工具 教材梳理： 知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。 注意：对本概念应从以下几个方面理解： 知识点二基因工程的基本工具 1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀” （1）限制性内切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。 （2）限制性内切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。（3）限制性内切酶的切割方式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.DNA连接酶——“分子缝合针” （1）来源：大肠杆菌、T4噬菌体 （2）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （3）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二
酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。 注意：比较有关的DNA酶 （1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的方法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA解旋。（3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA 聚合酶和DNA连接酶的异同点。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）分子运载车的种类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。 （2）运载体作用：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。 ②是利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 （3）作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制②有多个限制性内切酶切点③有一定的标记基因，便于筛选。 思维探究：知识点3、4、5主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。限制酶──“分子手术刀”，主要是介绍限制酶的作用，切割后产生的结果。在这部分内容学习时，应关心的问题之一是：限制酶从哪里寻找？我们可以联想从前学过的内容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有何保护机制？进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA，而使之失效，达到保护自身的目的”。这样就对“限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的认识提高了一个层次。 基因进入受体细胞的载体──“分子运 输车”的学习内容，不能仅仅着眼于记住这几 个条件，而应该深入思考每一个条件的内涵， 通过深思熟虑，才能真正明确为什么要有这些 条件才能充当载体。 教材拓展： 拓展点一限制酶所识别序列的特点 限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选) 第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。
如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 6、几个基本概念 粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为~。 平末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的，称之为~。 同裂酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列。如：BamHI和BstI均可识别GGATCC。 同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。如：TaqI：TCGA；ClaI：A TCGA T；AccI：GTCGAC 星星活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。 DNA物理图谱：（多为质粒图谱）
2009-2010 学年生命科学学院《基因工程》期末试卷（B）答案要点 一、名词解释题（每题3分，共30分） 1、多克隆位点：一段短的 DNA 序列，含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点，是外源基因插入的位点。 2、穿梭载体：能够在两种以上的受体细胞中繁殖和扩增的载体。 3. DNA连接酶： DNA连接酶负责双链DNA中相邻3`-OH 与5`-磷酸基团之间的磷酸二酯键的形成。 4. 核酸分子杂交：主要是根据两条单链DNA（或DNA与RNA）中互补碱基序列能专一配对的原理进行的。在一定条件下，单链DNA 或RNA 能与另一条单链DNA 上互补的碱基形成氢键，从而使两条单链杂交形成双链DNA 分子。通常利用已标记的某一DNA 或RNA 片段或合成一段寡核苷酸作为探针，探测重组DNA 分子中是否有DNA片段与探针发生同源性杂交，然后利用放射自显影方法进行检测。 5. 融合蛋白：融合表达一般是将克隆化的基因引入某表达载体编码的高表达蛋白一起融合表达。 6. 基因敲除：利用同源重组的原理，通过载体将外源的失活的基因替换掉内源的正常的基因，从而使基因沉默而不表现突变性状的方法。 7. 反义核酸技术：利用反义DNA或反义RNA能够与内源mRNA互补杂交，从而抑制内源基因表达的技术。 8. 荧光定量PCR 通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR 产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析。 9. 基因治疗就是指向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。 10. 显微注射技术将在体外构建的外源目的基因，在显微操作仪下用极细的微吸管注射到处于原核时期的受精卵原核中，外源基因在受精卵繁殖过程中通过DNA 的复制而整合到动物基因组中，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体的子宫内继续发育，进而得到转基因动物。 二、单选题（每题2分，共20分）。 1. ① 2. ② 3. ③ 4. ③ 5. ② 6. ① 7. ④ 8. ④ 9. ② 10. ④ 三、填空题（每空1 分，共10分） 1. 外源基因/载体，载体/外源基因 2. 近, 远 3. 目的基因，表达 4. 质粒/噬菌体，噬菌体/质粒 5. 10kb，20kb 四、简答题（每题6分,共24分） 1. 构建cDNA文库时需要用到哪些工具酶？逆转录酶，DNA 聚合酶I 或Klenow 片断，单链核酸酶S1，末端转移酶，限制性核酸内切酶，DNA连接酶
-高考生物基因工程专项知识点 基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力 的手段，下文是为考生准备的生物基因工程专项知识点的内容。 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 (一)基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶) (1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 (2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯 键断开，因此具有专一性。 (3)结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶(E?coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶)的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E?coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而
T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是??质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。 3.PCR技术扩增目的基因 (1)原理：DNA双链复制 (2)过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链;第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链;第三步：加热至70～
专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外和 ，赋予生物以新的，创造出更符合人们需要的新的和 。基因工程是在上进行设计和施工的，又叫做。 基因工程育种的原理：；优点：、 （一）基因工程的基本工具（工具酶：、） 1.“分子手术刀”—— （1）来源：主要是从中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种的核苷酸序列，并且使每一条链中部位的两个核苷酸之间的断开，因此具有性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：末端和末端。（4）限制酶自身DNA，原因是原核生物中或识别序列已经被。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于，只能将双链DNA片段互补的之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合，但连接平末端的之间的效率较。 (2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端， 形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”—— （1）载体具备的条件：①。 ②。 ③。 （2）最常用的载体是 ,它是一种裸露的、结构简单的、独立于之外，并具有的 DNA分子。 （3）其它载体：、 . (二)基因工程的基本操作程序 第一步： 1.目的基因是指：。
2.获取目的基因的方法有、 和。 3.基因文库是指：将含有某种生物的许多DNA片段，导入 中储存，各个受体菌分别含有这种生物的，称为基因文库。包含了一种生物所有的基因，这种基因文库称为；包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库称为，如。 获取目的基因的依据有哪些？如、、 、、。 4.PCR技术扩增目的基因 （1）原理： （2）特点： （3）条件：（）、、（）、（）。 （4）仪器：。 5.人工合成目的基因的方法有：、。第二步： ----也是基因工程的 1.目的：。 2.组成：＋＋＋ （1）启动子含义及作用： 。 （2）终止子含义及作用：。 注意与终止密码子的区别 （3）标记基因的作用：。 常用的标记基因是、。 第三步： 1.转化的概念：是进入受体细胞内，并且在受体细胞内的过程。 2.常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是，其次还有和 等。其中单子叶常有的方法是。
一、名词解释 引物、克隆、探针、转化率、重组率、基因工程、分子克隆技术、限制性核酸内切酶 、基因工程 基因工程是指重组 技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组 技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 、基因表达 是指细胞在生命过程中，把储存在 顺序中遗传信息经转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子 、限制性核酸内切酶 能特异性识别双链 某段特殊序列，并切割 双链的酶，主要存在于原核细菌中，主要作用是保护自身 不受限制，及破坏外源 使之迅速降解 、重组率：重组率 含有外源 的重组分子数 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为 ；重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化 重组的后续操作 、探针 一小段单链 或 片段，用于检测与其互补的核酸序列，双链 加热变性成为单链，
随后用放射性同位素 常用 、荧光燃料或酶标记成为探针 连接酶的酶活性 在最佳反应条件下 反应 ，完全连接 （ 片段）所需的酶量 二、选择题 、重组乙肝疫苗是 由重组酵母或重组 工程细胞表达的乙型肝炎表面抗原，经纯化、灭活及加入佐剂吸附制成。前者为重组酵母乙型肝炎疫苗，后者为重组 乙型肝炎疫苗 、基因工程用于药物筛选模型的战略 、控制质粒拷贝数的意义是使外源蛋白在细胞内更稳定 、酵母作为受体，比大肠杆菌的优势在于 大肠：原核 酵母：真核，具有多种细胞器，在用于生产需加工分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势 、分子杂交的化学本质是形成氢键 、 定点突变 的方法是 碱基的添加、删除、点突变
基因工程 一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在 二、基因工程的基本工具 1、限制性核酸内切酶-----“分子手术刀” 2、DNA连接酶-----“分子缝合针” 3、基因进入受体细胞的载体-----“分子运输车” 1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）存在：主要存在于原核生物中。 （2）特性：特异性，一种限制酶只能 识别一种特定的核苷酸序列，并且能在 特定的切点上切割DNA分子。 （3）切割部位：磷酸二酯键 （4）作用：能够识别双链DNA分子的 某种特定核苷酸序列，并且使每一条链 中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸 二酯键断开。
（5）识别序列的特点： （6）切割后末端的种类：DNA 分子经限制酶切割产生的DNA 片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA 的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。
2．“分子缝合针”——DNA连接酶 （1）作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。 （2）类型 相同点：都连接磷酸二酯键 3．“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件： ①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。 (4)载体的作用: ①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 【解题技巧】 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 (3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。 (4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。 (5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 (6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。 (7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的
《医用基因工程》复习思考题 第一章基因和基因组及基因工程的概念 一、名词概念 ①移动基因(插入序列；转位子)；②断裂基因；③RNA剪辑； ④内含子(间隔序列)与表达子；⑤重叠基因；⑥重复序列；⑦假基因；⑧启动子与终止子；⑨起始位点、终止位点。 二、讨论题 1.什么叫基因?何谓基因的新概念?基因的主要功能是什么? 2.一种基因一种酶的提法妥否？ 3.基因密码子三联体间是否存在着逗号？ 4.基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 5.何谓转位子和转位作用?转位的后果如何? 6.基因中最小的突变单位和重组单位是什么？ 7.基因工程应包括哪些内容？何谓基因工程的四大里程碑和三大技术发明? 8.真核细胞基因组中常有内含子存在，能否在原核细胞获得表达？能，为什么？不能，为什么？ 第二章基因工程中常用的工具酶 1.什么是限制性核酸内切酶？ 2.什么是R/M现象？如何解释？ 3.II型核酸内切酶的基本特点有哪些？ 4.影响II型核酸内切酶活性的因素有哪些？如何克服和避免这
些不利因素？ 5.DNA连接酶有哪两类？有何不同？ 6.甲基化酶有哪两类？有何应用价值？ 7.什么叫同尾酶、同裂酶？在基因工程中有何应用价值？ 8.平末端连接的方法有哪些？(图示) 9.Klenow酶的特性和用途有哪些？举例说明。 10.反转录酶的特性有哪些？有何应用价值？ 11.列举碱性磷酸酶BAP/CAP的应用之一。 12.列举末端核苷酸序列转移酶的应用之一。 13.质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？ 14.基因片段与载体的平末端连接的方法有哪些？ 15.用寡核苷酸和衔接物DNA的短片段连接时为使基因内部的切点保护，常用何种办法解决？ 第三章基因克隆载体 1.基因工程常用的载体有哪5种？其共同特性如何？ 2.什么是质粒？质粒分哪几种？有哪两种复制类型，质粒的分子生物学特性有哪些？ 3.质粒存在的三种形式是什么？ 4.分离质粒的基本步骤有哪些？ 5.分离纯化质粒的方法有哪几种？简述CsCl密度梯度(浮密度)分离法、碱变性法的原理，如何选择合适的分离方法？ 6.作为理想质粒载体的基本条件有哪些？ 7.什么叫插入失活，举例说明之。 8.构建pBR322质粒载体的亲本质粒有哪些？ 9.什么叫插入型和替换型噬菌体载体?插入型和替换型入噬菌体