第四章蛋白质化学
第一节概述
第二节氨基酸
第三节肽
第三节蛋白质的分子结构
第四节蛋白质的性质
Fig.1 蛋白质的三维结构
第五节蛋白质的分离、纯化和测定
第一节概述
一、蛋白质通论
（一）蛋白质的化学组成与分类
1. 元素组成
碳 50％
氢 7％
氧 23％
氮 16%
硫 0—3％
其他微量
?蛋白质系数：1克氮所代表的蛋白质质量(克数)。即6.25
凯氏定氮法测定蛋白质含量：
蛋白质含量 = 样品蛋白氮 6.25
2.蛋白质的分类（P158)
（二）蛋白质的形状和大小
3.蛋白质的相对分子质量
（三）蛋白质构象和蛋白质结构
1.构象（conformation）
?指具有相同结构式和相同构型的分子在空间里可能的多种形态；构象形态间的改变不涉及共价键的破裂。每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构或三维结构，称之为蛋白质的构象；一个给定的蛋白质可以有多种构象，但只有一种或少数几种在能量上是有利的。
2. 蛋白质结构的不同组织层次
超二级结构和结构域
（四）蛋白质功能的多样性
?蛋白质是构成生物体的基本成分
?蛋白质具有多样性的生物学功能
?催化、调节、转运、贮存、运动、结构成分、支架作用、防御和进攻、其它。
第二节氨基酸
一、氨基酸—蛋白质的构件分子
（一）蛋白质水解
1. 酸水解
2. 碱水解
3. 酶水解
（二） -氨基酸的一般结构
1.结构通式
2. 结构特点：
?除脯氨酸外，与羧基相邻的α-碳原子上都有一个氨基，因而称为α-氨基酸。
?除甘氨酸外R是H,其它所有氨基酸分子中的α-碳原子都为不对称碳原子,所以：A.氨基酸都具有旋光性。B.每一种氨基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。
3. 其它特性：
–每种氨基酸都有特殊的结晶形状，可用来鉴别氨基酸。
–氨基酸在中性pH时，α氨基和羧基以离子形式存。
二、氨基酸的分类
(一)常见的蛋白质氨基酸 (20种)
（1）中性氨基酸（5种）
–R基均为中性烷基，R基对分子酸碱性影响很小，它们几乎有相同的等电点。（6.0±0.03）–Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性
–从Gly至Ile，R基团疏水性增加
（2）R中含有羟基和硫的氨基酸（共4种）
（3）R中含有酸性基团及其酰胺（4种）
（4）R中含碱性基团（3种）
(二)不常见的蛋白质氨基酸
–是在蛋白质合成后由常见的氨基酸经修饰而来的（羟脯氨酸和羟赖氨酸等）。
(三)非蛋白质氨基酸(150多种)
–有一些是重要的代谢物前体或代谢中间物（丙氨酸，鸟氨酸，瓜氨酸等）。
(四)根据人体能否自身合成
必需氨基酸：赖氨酸(Lys)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、色氨酸(Try)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Thr)、苯丙氨酸(Phe)
（婴儿期Arg和His供给不足，属半必须氨基酸）
非必需氨基酸：其余
三、氨基酸的酸碱化学
(一) 氨基酸的兼性离子形式
在晶体和水中以偶极离子形式存在
(二) 氨基酸的解离
依照Bronsted-Lowry的酸碱质子理论
HA A- + H+
氨基酸是一类两性电解质
1．甘氨酸的滴定（解离）曲线
分步解离：
Handerson-Hasselbalch公式
pH = pKa + lg（ [A-]/ [HA] ）= pKa + lg（ [碱]/[酸] ）
可计算出在任一pH条件下一种氨基酸的各种离子的比例。
氨基酸的带电状况与溶液的pH值有关。
表：氨基酸的酸碱化学133页
pK：基团一半解离时的pH。
(三) 氨基酸的等电点
在某一特定pH值溶液时，氨基酸主要以两性离子形式存在，净电荷为零，在电场中不向电场的正极或负极移动，这时的溶液pH值称为该氨基酸的等电点。
等电点的计算
1.侧链不含离解基团的中性氨基酸
p I = (p K1 + p K2 )/2
2.侧链含有可解离基团的氨基酸
酸性氨基酸：pI = (pK1 + pK R)/2
硷性氨基酸：pI = (pK2 + pK R)/2
半胱氨酸： pI = (pK1 + pK R)/2
酪氨酸： pI = (pK1 + pK2 )/2
(四) 氨基酸的甲醛滴定
不能直接用酸、碱滴定来进行定量测定？
四、氨基酸的化学反应
(一) α- 氨基参加的反应
1.与亚硝酸反应
标准条件下测定生成的氮气体积，即可计算出氨基酸的量（Van Slyke 法测定氨基酸）。生成的氮气一半来自氨基酸。
2.与酰化试剂反应
用于多肽链N末端aa的标记和微量aa的定量测定。
在多肽和蛋白质的人工合成中被用作氨基的保护剂。
3.烃基化反应
Sanger反应( DNFB或FDNB )
首先被英国的Sanger用来鉴定多肽蛋白质的N末端氨基酸。
Frederick Sanger(桑格)
英国化学家，在生物化学领域的贡献很大，他两次获诺贝尔奖1958和1980年；1953年确定了牛胰岛素一级结构；1975年和1977年确定了DNA的两种用酶测序的方法加减法和终止法。
4. 生成西佛碱的反应（Schiff）
西佛碱是某些酶促反应的中间产物（如转氨基反应的中间产物）。
(二)α-羧基参加的反应(第138页)
成盐和成酯：羧基被保护，氨基被活化，重金属盐不溶于水。
成酰氯反应：氨基被保护，羧基被活化，在多肽人工合成中常用。
脱羧基反应：
叠氮反应：常用于多肽的合成。
(三)α-氨基和α-羧基共同参加的反应
1.与茚三酮反应
弱酸性溶液中与氨基酸共热生成紫色物质(λ570 ) 。检测和定量氨基酸和蛋白质的重要反应。
脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应生成的是黄色化合物（λ440）。
2.成肽反应
(三)侧链R基参加的反应
蛋白质的化学修饰：就是在较温和的条件下，以可控制的方式使蛋白质与某些试剂起特异反应，以引起蛋白质中个别氨基酸侧链或功能团发生共价化学改变。
功能团：羟基、酚基、巯基(包括二硫键)、吲哚基、咪唑基、胍基、甲硫基、非α- 氨基和非α-羧基等。
(三)侧链R基参加的反应
1.酪氨酸的酚基
?米伦反应（Millon)：酚基与HgNO3、与Hg（NO3)2和HNO3作用呈红色。与浓硝酸作用生成黄色。?Pauly反应：酚基与重氮化合物反应生成橘黄色化合物。
Trp苯环------红色
2.精氨酸的胍基
?坂口反应（Sagakuchi）：胍基与α-萘酚，次溴酸盐作用生成红色物质。
3. Cys侧链上的巯基（－SH）P141
?与卤化烷生成稳定的烷基衍生物
?巯基能打开氮丙啶的环
?巯基能和各种金属离子形成络合物
?巯基易受空气或其他氧化剂氧化
二硫键的打开
?氧化剂：过甲酸
?还原剂：巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇等
五、氨基酸的光学活性和光谱性质P143
(一) 氨基酸的旋光性（课下看第3页）
1.不对称碳原子：
2.旋光性物质：右旋性（＋）、左旋性（－）
3.光学异构体：有一个不对称碳原子就有2个光学异构体，有两个不对称碳原子就有4个光学异构体。
4.比旋光度（旋光率）：旋光度（DtD）的表示方法。即单位浓度和单位长度下的旋光度。是旋光物
质的特征物理常数。
“+”和“-”：分别表示右旋和左旋。
旋光符号和大小：取决于R基性质和溶液pH有关
5.消旋作用（外消旋物与内消旋物）
(二)氨基酸的光谱性质
1.紫外吸收光谱
蛋白质在280nm处有最大吸收峰，用紫外分光光度计可以测定样品中蛋白质的含量。
λmax＝280nm
λmax＝275nm
λmax＝257nm
2. 核磁共振波谱(NMR)（课下自习）
六、氨基酸混合物的分析分离
（一）分配层析法的一般原理
混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在这两相分配系数。
逆流分溶原理：
一定量的某一溶质在一定量的溶剂系统中分配时，转移次数越多，即分溶管数越多，其分溶曲线越集中，即峰形越窄而高，这样有利于混合物中各物质的完全分离。
(二) 纸层析
支持物:纸,纸上的羟基具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常有机溶剂作为流动相。原理：是根据溶质物质的极性进行分离的。
相对迁移率 R f = X/Y 图3－8
(三) 柱层析
填充物：亲水性的不溶物质，如纤维素、淀粉、硅胶等。
洗脱剂：与水不互溶的溶剂，如苯酚、正丁醇等。
(四)离子交换层析
离子交换树脂基质：是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯(单体)-苯二乙烯(交联剂)进行聚合和交联反应生成的具有网状结构的不溶性的高分子化合物。
树脂一般都制成：球形的颗粒。
带电基团：是通过化学反应引入基质。
有阳离子和阴离子两种交换树脂。
氨基酸与树脂的亲和力：取决于它们之间的静电吸引和氨基酸侧链与树脂基质间的疏水相互作用。
(五)吸附层析
–吸附剂：如氧化铝、硅胶、活性炭等
–各种成分的分离过程: 溶解、吸附、再溶解、再吸附
(六)薄层层析
(七)气液层析
–流动相为气体(氢、氦、氮)，固定相为涂渍在固体颗粒表面的液体时称为气液层析或气液色谱，简称为气相色谱。
(八)高效(压)液相层析HPLC
–固定相支持剂颗粒很细，因而表面积很大。溶剂系统采取高压。
本节小结
?20种氨基酸的结构特征；甘氨酸和脯氨酸结构特点
?酸性氨基酸与碱性氨基酸；必需氨基酸与非必需基酸；极性氨基酸与非极性氨基酸
?两性离子；pK值与pI；电泳
?α－氨基、α－羧基和侧链巯基的化学反应；茚三酮反应
?旋光性；苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的紫外吸收特点
?纸层析和离子交换层析的原理及方法（会做题）
第二节肽
一、肽（是氨基酸的线性聚合物）
?肽：一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而成的化合物。其中的氨基酸单位称氨基酸残基。
?肽键：氨基酸间脱水后形成的共价键称肽键（酰氨键）
?寡肽：25（10个）个氨基酸残基以下。
?多肽：多于25个（10个）氨基酸残基的肽链。
?环状肽：
（一）肽和肽键结构
1.肽键的结构特点（P164）：
?肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。
?组成肽键的原子处于同一平面。
?肽键中的C-N键具有部分双键特性，不能自由旋转,呈现相对的刚性和平面化。
?肽键的亚氨基没有明显的解离和质子化。
?除脯氨酸外，多以反式结构存在。
2.肽平面、肽单位、二面角
?肽平面：连接在肽键上的六个原子共处于一个平面上。
?肽单位：肽链主链上的重复结构，Cα- CO – NH – Cα。
?二面角：在多肽链里，Cα碳原子刚好位于互相连接的两个肽平面的交线上。Cα碳原子上的 Cα- C 和 Cα– N 可以绕轴旋转，角度为ψ和φ，这就是α-碳原子上的一对二面角。它决定了由α-碳原子连接的两个肽单位的相对位置。
(二) 肽的物理化学性质
1.肽的晶体是离子晶格，溶点高。
2.具有两性解离和等电点：肽的酸碱性质－－决定于末端α-氨基和α-羧基及R基。
pH > R基pKa →[HA] < [A-]
pH < R基pKa → [HA] > [A-]
多肽链中可解离功能团的pKa值（记）
例：Gly – Glu – Lys – Ala
3.具有旋光性。
4.茚三酮反应、α-氨基和α-羧基及R基的反应。
?茚三酮反应不是肽的特有反应。
?N端是脯氨酸或焦谷氨酸时无α-氨基试剂的反应
5.具有双缩脲反应：（参看实验讲义）
6.具紫外吸收：在280nm处有最大吸收峰，可进行肽类定量测定。
(三)天然存在的活性肽
具有特殊的生理功能，常称为活性肽。
含有非蛋白质氨基酸和肽键。
例1：α- 鹅膏蕈碱（环状八肽，剧毒毒素。能与真核生物的RNA聚合酶II牢固结合而抑制酶的活性）。
谷胱甘肽：γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸
本节小结
?理解并掌握肽键、生物活性肽的概念，肽键的双键性质以及由此带来的对蛋白质肽键构象的影响。?蛋白质的酸碱性质及等电点
第四节蛋白质的分子结构
一、蛋白质的一级结构（共价结构、化学结构）
指多肽链中氨基酸的序列。包括二硫键的位置。
（一）蛋白质一级结构的测定
要求
?样品必须是均一的。纯度在97%以上
?知道蛋白质的相对分子质量
1.测定蛋白质分子中多肽链的数目
?经测定末端基（C端或N端），看蛋白质的摩尔数与末端基的摩尔数的比例？
2.拆分蛋白质分子的多肽链和二硫键
?借助非共价相互作用缔合的（亚基之间）
采用变性剂：8mol/L尿素；6mol/L盐酸胍；SDS处理。
?通过共价二硫桥（S－S）交联的
采用氧化剂或还原剂：将二硫键断裂。
3.分析每一多肽链的氨基酸组成
?待测样品经酸(6mol/L HCl)和碱(5mol/L NaOH)完全水解，用氨基酸分析仪进行测定（或层析法）。?表示方法：每摩尔蛋白质中含氨基酸残基的摩尔数。或100克蛋白质中含氨基酸的克数。
4.测定多肽链的氨基酸序列
多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化
?原理：选用专一性强的、断裂点少的、反应产率高的蛋白水解酶或化学试剂进行有控制的裂解。
后将所得混合物进行分离纯化。
?常用方法：酶解法化学法
酶解法（P174）
?胰蛋白酶：水解Lys、Arg的羧基所形成的肽键。
?糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：R1＝ Phe、Trp、Tyr
?嗜热菌蛋白酶：
?胃蛋白酶：
?氨肽酶
?羧肽酶：
化学法
?溴化氰水解法(CNBr):切割Met的羧基所形成的肽键。
?用羟胺断裂:它断裂－Asn-Gly-,但专一性不高。蛋白质中出现机率低，适于分子量大的蛋白质序列的测定。
5.确定肽段在多肽链中的次序
例：胰岛素B链的测序(180页)
所得资料： N－末端残基H C－末端残基S
第一套肽段OUS PS EOVE RLA HOWT
第二套肽段SEO WTOU VERL APS HO
借助重叠肽确定肽段次序：HOWTOUSEOVERLAPS
6.确定原多肽链中二硫键的位置
采用胃蛋白酶：专一性低，切点多。肽段比较小，分离、鉴定比较容易。作用pH在酸性范围（2）有利于防止二硫键发生交换反应。
肽段混合物进行Brown及Hartly的对角线电泳：
例：有一个A肽：
1）酸水解得到：Ala、Arg、Ser、Glu、Phe、Met；
2）当A肽与FDNB试剂反应后得：DNP-Ala；
3）当A肽用CNBr降解时得到：游离的Ser和一种肽；
4）当A肽用胰蛋白酶降解时得到两种肽：
一种含Ala、Arg，另一种含其它氨基酸
5）当A肽用糜蛋白酶降解时得到两种肽：
一种含Met、Ser，另一种含其它氨基酸；
问A肽的氨基酸排列顺序如何？
答：Ala－Arg－Glu－phe－Met－Ser
二、蛋白质的空间结构
稳定蛋白质三维结构的作用力
?维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键
?维系蛋白质分子的二级结构：氢键
?维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键
?维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键
(一) 二级结构与纤维状蛋白质
二级结构：蛋白质主链的折叠产生由氢键维系的有规则的构象。
常见的二级结构：
?α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲。
?这些结构由R基的短程顺序决定；可在一条多肽链的不同区段形成。
1.α-螺旋（3.613—螺旋）
?最常见、含量最丰富
?结构特点：
?多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离0.15nm.
?肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-CO基与第四个氨基酸
残基酰胺基团的-NH基形成氢键。
?α-螺旋为具偶极距的右手螺旋。
?影响α-螺旋形成的因素：
?溶液的pH、溶剂体系、温度。
?氨基酸组成和排列顺序、R基的电荷性质、R基的大小有关。
?Pro残基和Gly残基处不能形成。
?其他类型的螺旋：310－螺旋、4.416－螺旋或π-螺旋
2. β-折叠
?两条或多条几乎完全伸展的多肽链（或同一肽链的不同肽段）侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的NH和C=0之间形成氢链，这样的多肽构象就是β-折叠片。
?结构特点：
?氢键与肽链长轴接近垂直。
?多肽主链呈锯齿状折叠
?侧链R基交替地分布在片层平面的两侧。
?反平行式：肽链的极性一顺一倒，N端间隔相同
反平行式：φ= -139O，ψ= ＋135O
3.β-转角(β-弯曲)
?在β-转角部分，由四个氨基酸残基组成,含有相当比例的极性残基；存在于球状蛋白分子表面。?甘氨酸和脯氨酸常出现在转角中
4.Ω环形
?由不超过16个残基（最常见的是由6－8个残基）组成的肽段，尤其以8个残基的小环最多。
?这类肽段的外形和希腊字母“Ω”相似，故称为Ω环形。从形式上看，Ω环形可以看成是转角的延伸。
5.无规卷曲
?肽段有更大的任意性。
?受氨基酸残基侧链的影响较大，经常是构成酶活性部位和其它蛋白质特异的功能部位。
纤维状蛋白质
?含大量的α-螺旋，β-折叠片，整个分子呈纤维状，广泛分布于脊椎和无脊椎动物体内，起支架和保护作用。
?纤维状蛋白质可分为
不溶性(硬蛋白)：角蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白
可溶性：肌球蛋白和血纤蛋白原
(1)α-角蛋白
卷发(烫发)的生物化学基础
(2)β-角蛋白
以β-折叠结构为主。
片层结构：反平行式β-折叠片以平行的方式堆积。
链间主要以氢键连接，层间主要靠范德华力维系。
(3)胶原蛋白(P215)
(二) 三级结构与球状蛋白质
?三级结构：指由二级结构元件、超二级结构和结构域构成的总的三维结构，包括相距较远的肽段之间的几何相互关系和侧链在三维空间中彼此间的相互关系。
–三级结构是由氨基酸的长程顺序决定
–维系力有氢键、疏水键、离子键和范德华力等。
–转弯的氨基酸残基（脯、苏、甘和丝氨酸）。
球状蛋白质
根据它们的结构域可分为4大类：全α结构、α,β结构、全β结构和富含金属或二硫键结构。(三) 亚基缔合与四级结构(P242)
?一些特定三级结构的蛋白质通过非共价键而形成的大分子体系时的组合方式。
亚基相互作用的方式
(四) 蛋白质结构与功能的关系
1. 一级结构与功能的关系
?一级结构与生物进化（细胞色素C）
?一级结构的变异与分子病（镰刀状细胞贫血病）
2. 空间结构与功能的关系
?蛋白质的变构现象（血红蛋白）
?免疫球蛋白（抗体）
本节小结
?蛋白质一、二、三、四级结构层次和概念
?维持蛋白质空间结构的主要作用力。
?理解蛋白质结构及与生物功能的关系，能根据实验事实推断简单多肽的一级结构。
第五节 蛋白质的性质、分离和纯化 一、蛋白质的酸碱性质与蛋白质电泳 二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 三、蛋白质的变性与复性
四、蛋白质相对分子质量的测定 五、蛋白质的分离纯化原则 六、蛋白质的分离纯化方法
七、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 一、蛋白质的酸碱性质与蛋白质电泳 1.蛋白质的等电点和蛋白质的等离子点：
? 蛋白质电泳(Electrophoresis)：在不同的pH 环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶
液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳。
? 利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。
2.影响电泳迁移率的主要因素:
? 凝胶的分子筛效应对长短不同的棒形分子会产生不同的
阻力〔主要因素〕 ? 凝胶的浓度和交联度
? 同一电泳条件下，分子小，受阻小，游动快，迁移率大。相对分子质量大者，迁移率小
3. PAGE （非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）：分子的分离是根据蛋白质的大小，以及它的净（负或正）电荷。较小的分子量，较多的净负（或正）电荷向正（或负）极移动的快。
4.SDS －PAGE （变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）：
? 所有蛋白质都带有与质量成比例的相同负电荷。 ? 最小的蛋白质迁移最远。
? 用于测定蛋白质样品的纯化程度、蛋白质的相对分子质
量和蛋白质中多肽亚基的数量。
5.等电聚焦和双向凝胶电泳
? 使用大孔隙聚丙烯酰胺凝胶并含有两性聚电解质，如果将电场加到凝胶上，两性聚电解质迁移并产生pH 梯度。
? 蛋白质混合物是在具有pH 梯度的介质进行的。各种蛋白质到达pH 等于它的pI 位置时，即不再移动成条带。
? 双向凝胶电泳：等电聚焦与SDS －PAGE 相结合的电泳方法。 二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 （一）蛋白质的胶体性质 1.蛋白质溶液是胶体溶液
2.维持蛋白质的胶体系统稳定的因素
? 1－100nm 大小的质点在动力学上是稳定的. ? 某一pH 下质点带有同种电荷，互相排斥。
? 质点能与溶剂（水）形成水化层，相互间不易靠拢。 （二）蛋白质的沉淀作用(P300) 1.可逆沉淀:
Fig. 2 蛋白质的凝胶电泳
Fig.1 蛋白质电泳
2.不可逆沉淀:
3.沉淀蛋白质的方法
?等电点沉淀(可逆，不变性)
?强酸碱沉淀(不可逆):
?蛋白质的盐析(可逆,不变性)：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠。
?有机溶剂沉淀蛋白质(可逆或不可逆):乙醇、丙酮或甲醇。
?重金属盐和生物碱剂沉淀蛋白质：Hg2＋、Ag2＋、苦味酸。
?加热（变性）沉淀蛋白质：
三、蛋白质的变性与复性
1.概念
?蛋白质在某些外界因素的影响下，结构状态被破坏，引起理化性质改变、生理活性丧失的现象称为蛋白质的变性。当环境条件恢复时，蛋白质的生物活性有可能也恢复，这就是蛋白质的复性。
Fig.3 蛋白质的变性与复性
2.变性的实质：次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。变性不涉及一级结构的破坏。
3.蛋白质变性后，往往出现下列现象：
–生物活性丧失。
–硫水基团外露，分子结构伸展松散，易水解。
–溶解度降低、沉淀，粘度增加。
4.变性的因素：强酸、强碱、有机溶剂和去污剂、盐浓度、重金属离子、热、机械力等。
?制备活性蛋白质时严防蛋白质变性。
四、蛋白质相对分子质量的测定
1.化学组成测定法
例1：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为0.335%，计算二者的相对分子质量。
最小M = Fe分子量 / Fe(%)×100 = 55.8 / 0.335 =16700
肌红蛋白M=167000
血红蛋白M=167000 ×4 =668000
2.沉降法
?在60 000～80 000r/min的高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动。蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关。
?沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S表示。一个S单位，为1×10-13秒，相对分子质量越大，S值越大。
?由沉降系数S可根据斯维得贝格〔Svedberg〕方程计算蛋白质分子的相对分子质量：
M=RST/D〔1－iρ〕
R：气体常数 T：绝对温度
D：扩散系数ρ：溶剂的密度
3.凝胶过滤法（分子筛层析，p297-298）
?经常使用的凝胶：交联葡聚糖（44页，Sephadex），聚丙烯酰胺和琼脂糖（49页,Sepharose）。?凝胶过滤的原理：与分子大小和形状有关。
?颗粒大的移动快，颗粒小的移动慢。
?测定方法：
?测几种蛋白质相对分子质量标准物的Ve（洗脱体）。
?再测待测样品的Ve。
4.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)
?SDS: 十二烷基硫酸钠，是一种阴离子去污剂，能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。
?SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合体，每两个氨基酸残基结合一个SDS分子。
?不同蛋白质的SDS复合体具有相同的构象，长椭圆棒，且覆盖有相同的负电荷，具有几乎相同的荷质比，向正极移动。
注意：电泳迁移率不受各种蛋白质原有的电荷、分子形状等因素的影响，而与多肽链分子量大小相关。
分子量大的泳动慢，小的泳动快。
五、蛋白质的分离纯化的原则（步骤）
?前处理：选材、破碎、匀浆、溶解、离心或差速离心。
?粗分级分离：盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离，离心。
?细分级分离：层折法。
?结晶：结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化。
六、蛋白质的分离纯化方法（P301）
1.根据分子大小不同的纯化方法 P301-304
2.密度梯度（区带）离心
3.蛋白质的层析
※凝胶过滤（分子排阻、凝胶过滤层析、凝胶渗透层析）
※离子交换层析
?蛋白质的分离基于它的总净电荷。
?常用离子交换剂（支持物）：纤维素和交联葡聚糖离子交换剂
?阴离子交换层析：用于带负电荷蛋白质的分离。?阳离子交换层析：用于带正电荷蛋白质的分离。?
蛋白质对离子交换剂的结合力取决于：
–彼此间相反电荷基团的静电吸引
–与溶液的pH有关
–保持洗脱液不变、分段洗脱、梯度洗脱、改变
pH
–对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先被洗
脱下来
七、蛋白质的含量测定与纯度鉴定
Fig.4 凝胶过滤法
本节小结
?蛋白质分离纯化的步骤，注意哪些事项。
?盐析、离子交换层析、凝胶过滤层析、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验原理及作用。
?测定蛋白质含量的方法有哪些。
本章掌握内容
?蛋白质的化学组成，20种氨基酸的简写符号
?氨基酸的理化性质及化学反应
?蛋白质分子的结构（一级、二级、三级和四级结构、蛋白质二级结构的折叠特点）及维持空间结构稳定的作用力
?氨基酸序列测定的一般步骤
?蛋白质的理化性质及分离纯化的方法和纯度鉴定
?蛋白质变性作用与沉淀作用
?蛋白质结构与其功能的关系（实例）