禽腺病毒感染 禽腺病毒感染：是由禽腺病毒引起的一种亚临床性传染病，多数为长期潜伏带毒，引起症状不明显的潜伏感染，少数可致病。 禽腺病毒可以分为三群： 第Ⅰ群：包括传统的腺病毒和从鸡、火鸡、鹅和其它禽类获得的腺病毒分离物，它们具有一种共同的抗原群； 第Ⅱ群：包括火鸡出血性肠炎病毒、雉鸡（zhi俗称野鸡）大理石脾和鸡大脾病病毒（有人认为，鸡大肝大脾病的病源为：鸡戊型肝炎病毒，是戊肝病毒科戊肝 病毒属的一个成员），这些病毒共有一种与Ⅰ群病毒不同的抗原群； 第Ⅲ群：是与产蛋下降综合征（EDS—76）有关的一些病毒和从鸭获得的相似病毒，它们只是部分含有Ⅰ群病毒的共同抗原 在此，主要介绍“鸡包涵体肝炎”： 《鸡包涵体肝炎》 一、流行病学： 鸡包涵体肝炎：是由鸡腺病毒引起的鸡的一种急性传染病。 也有人称之鸡（Ⅰ群）腺病毒感染。 其主要特征是：病鸡在发生肝炎的同时，伴有出血性变化和再生不良性贫血。 种鸡发生感染时，本身可能无任何临诊症状，但所产种蛋的孵 化率下降，孵化的雏鸡死亡率显著增高。 试验感染证明，出生雏鸡可感染发病，并且雏鸡的日龄越小易感性越强。但在自然条件下，则以3—15周龄的鸡发生较多，成年鸡也可感染，但一般没有可见的临诊症状。 该病的病原体为禽腺病毒科Ⅰ群禽腺病毒属中的“鸡腺病毒”。 目前，分离到的Ⅰ群禽腺病毒共12个血清型，各型之间大多具有较一致的抗原关系。 目前认为鸡腺病毒2型、3型、4型、5型、8型等血清型是鸡包涵体肝炎的主要病原体。 病毒可以通过病鸡的粪便排出，健康鸡直接与病鸡接触或接触病鸡的粪便而感染，并且可以经蛋传染给下一代。
二、临床症状与剖检病变： 病鸡表现：精神沉郁，食欲减退或不食，翅膀下垂，羽毛蓬乱，双脚麻痹，排灰白色或粉灰色水样粪便等，临死前有的发出鸣叫声，并出现角弓反张 等神经症状。 鸡群一旦感染本病，大部分鸡在7—10天内相继发病，发病3—5天死 亡达到高峰，持续3—5天后突然停息。病程10—16天，死亡率一般 为10%左右，经蛋传递时，雏鸡的死亡率克高达40%。 剖检症状：1、皮下、胸肌和腿部肌肉有明显的出血； 2、尸体表现贫血、黄疸； 3、肝脏肿大，边缘钝圆，质地脆弱，呈黄褐色，肝被膜下有较大面积 淤血和出血灶，出血点或出现斑常呈线状或芒状，在出血点之间有 灰黄色坏死灶，使肝脏外观呈斑驳状； 4、脾脏肿大，常见有灰白色斑点； 5、肾脏肿大、苍白，表面有出血点，肾小管有尿酸盐沉积； 6、长骨骨髓呈黄白色，有的呈灰白色胶冻状。 7、组织病理学的特征性变化是肝细胞发生广泛性的脂肪变性和坏死， 细胞核内有嗜酸性包涵体。 三、临床诊断： 根据本病流行特点、临床症状、病例剖检变化可初步诊断；但要作出确切诊断必须进行实验室检测。 四、鉴别诊断： 诊断时应注意与“传染性法氏囊病”、“脂肪肝综合征”、“弯杆菌性肝炎”等相 区别： 1、传染性法氏囊病：同样有严重的肌肉出血和其他类似的症状； 但法氏囊具有肿胀或萎缩或有胶冻样水肿的特征性病变；腺 胃与肌胃交界处有新鲜的出血带； 2、脂肪肝综合征：虽然表现有突然死亡，营养良好，肝脏肿大，被膜下也有出血 点等，但多是由于饲喂高能量饲料引起的代谢性疾病，多为零 星发生，无传染性。
Ⅰ群4型禽腺病毒灭活疫苗的试制及质量评价1987年,一种由禽腺病毒(Fowl aviadenoviruses,FAdVs)引起的心包积水肝炎综合征(Hydropericardial hepatitis syndrome,HHS)为典型病理变化的疾病在巴基斯坦靠近卡拉奇的安卡拉地区被发现,故该病又称为安卡拉病、安哥拉病(Angola’s disease,ADV)、荔枝病,经鉴定病原为禽腺病毒4型(Fowl adenovirus serotype-4,FAdV-4)。2015年6月以来,该病在我国安徽、河南、辽宁、山东、吉林、河北等部分地区暴发,死亡率高达20%~30%,给我国的养禽业带来了较大的损失。 近几年,在国内报道的主要流行株是血清4型和8b型禽腺病毒,其中血清4型毒株占据主导地位,而目前市场上没有正规商品化疫苗进行针对性预防。因此,血清4型的疫苗研制对防控该病就显得尤为重要。 1.禽腺病毒4型(Fowl adenovirus serotype-4,FAV-4)的培养方式选择:为了能够加快试制进度,避免中间试制过程出现阻碍,在试制开始之前,需要对FAdV-4进行初步的培养特性研究,以选择一种最佳的培养扩毒载体。当前疫苗企业在大生产过程中培养禽病毒的主要方式有两种,一是鸡胚扩毒,二是细胞扩毒,两种方式各有其优缺点。 但是,FAdV-4究竟适合哪种方式培养扩毒,需要通过试验来获悉。本试验通过接种无特定病原体(Specific pathogen Free,SPF)鸡胚与鸡肝癌细胞(LMH细胞)两种方式培养FAdV-4,结果发现从培养的效果来看,接种SPF鸡胚培养FAdV-4,会随着传代次数的增多,病毒的效价会逐渐降低,通过接种卵黄囊能获得较高的效价,通过尿囊腔接种培养获得的FAdV-4病毒液效价并不高。 但,实际的大生产,通过卵黄囊接种的方式比通过尿囊腔接种的方式效率低,
禽腺病毒4型荧光定量PCR检测方法 1 范围 本标准规定了禽腺病毒4型（FAdV-4）荧光定量PCR检测方法。 本标准适用于鸡咽喉和泄殖腔拭子及肝脏组织中FAdV-4的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 试验原理 实时荧光定量PCR检测是在PCR反应体系中，除采用特异的引物外，还加入了与DNA双链非特异性结合的SYBR Green I荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光，从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。随着PCR反应的进行，每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。 4 试剂或材料 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯的试剂，水为GB/T 6682规定的一级水。 4.1 10×磷酸盐缓冲液PBS：pH值7.2。 4.2 研钵。 4.3 病毒DNA提取试剂盒。 4.4 SYBR Green I qPCR混合物。 4.5 阳性对照：浓度为1.0×105拷贝/μL的阳性质粒。 4.6 阴性对照：水。 4.7 DEPC水。 5 仪器设备 5.1 微量可调移液器：最大量程为10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL。 5.2 台式低温高速离心机：最高转速16 000 r/min。 5.3 分析天平：精度为0.01 g。 5.4 荧光定量PCR仪：温度范围4.0 ℃～99.9 ℃。 5.5 冰箱：规格为4 ℃和-20 ℃。 5.6 二级生物安全柜。
血清4型禽腺病毒病诊断技术Diagnostic techniques for the disease of serotype4fowl adenovirus
目次 前言........................................................................................................................................................................V 引言........................................................................................................................................................................V 1范围. (1) 2规范性引用文件 (1) 3缩略语 (1) 4临床诊断 (1) 4.1流行病学 (1) 4.2临床症状 (2) 4.3剖检病变 (2) 4.4临床诊断 (2) 5PCR诊断 (2) 5.1器材 (2) 5.2试剂 (2) 5.3操作方法 (3) 5.4结果判定 (3) 6病毒分离 (3) 6.1器材 (3) 6.2细胞 (4) 6.3试剂 (4) 6.4操作方法 (4) 6.5结果判定 (4) 7间接免疫荧光鉴定 (5) 7.1器材 (5) 7.2细胞 (5) 7.3试剂 (5)
7.4操作方法 (5) 7.5结果判定 (6) 8血清抗体检测 (6) 8.1器材 (6) 8.2试剂 (6) 8.3操作方法 (6) 8.4结果判定 (7) 9综合判定 (7) 附录A（规范性）溶液配制 (8) A.1磷酸盐缓冲液的配制 (8) A.2组织研磨液的配制 (8) A.3细胞培养液的配制 (8) A.4细胞维持液的配制 (8) A.5细胞固定液的配制 (8) A.650×TAE缓冲液的配制 (8) A.71%琼脂糖凝胶的配制 (9) 附录B（资料性）血清4型禽腺病毒感染鸡群临床解剖症状 (10) B.1FAdV-4感染鸡群典型临床解剖症状判定标准图例 (10) 附录C（资料性）阳性对照病毒 (11) C.1阳性对照病毒来源 (11) 附录D（资料性）PCR检测引物及判定标准 (12) D.1血清4型禽腺病毒PCR检测引物 (12) D.2引物的稀释 (12) D.3PCR检测判定标准图例 (12) D.4PCR扩增片段参考序列 (13) 附录E（资料性）间接免疫荧光鉴定用单克隆抗体及判定标准 (14) E.1单克隆抗体的来源 (14) E.2间接免疫荧光鉴定判定标准图例 (14) 附录F（规范性）血清4型禽腺病毒抗体检测ELISA试剂盒使用溶液的配制 (15)
第四章抗感染免疫 一、选择题 【A型题】 1.外毒素的感染免疫是依靠抗毒素的哪种作用机制？ A.调理作用 B.黏附作用 C.灭活作用 D.清除作用 E.以上都不是 2.用于人工被动免疫的生物制品有： A.菌苗 B.疫苗 C.BCG D.类毒素 E.抗毒素 3.霍乱肠毒素的作用机制是： A.激活肠黏膜腺苷酸环化酶使cAMP增多 B.激活肠黏膜腺苷酸环化酶使cGMP增多 C.抑制肠黏膜腺苷酸环化酶使cAMP减少 D.抑制肠黏膜腺苷酸环化酶使cGMP减少 E.以上都不是 4.正常体液中作用革兰阳性菌的抗菌物质是： A.补体 B.防御素 C.溶菌酶 D.白细胞素 E.血小板素 5.能激活补体旁路途径使之发挥防御作用的物质是： A.外毒素 B.内毒素 C.血浆凝固酶 D.组蛋白 E.酯酶 6.sIgA发挥局部抗感染的作用机制是： A.通过免疫调理作用增强免疫力 B.可激活补体旁路途径 C.直接与病原体结合使之不能定植于黏膜 D.直接破坏病原体使之失活 E.中和病原体的毒素作用 7.通过与补体C3b将细菌和吞噬细胞联结而发挥免疫调理作用的抗体是： A.IgM B.IgA C.IgG D.IgD E.IgE 8.在多数情况下IgG的保护作用大于IgM，其原因是： A.IgG分子小，易入炎症区 B.IgG含量高，作用强 C.IgM无免疫调理作用 D.IgM半衰期短 E.IgG可激活补体
9.溶菌酶不能单独破坏革兰阴性菌的原因主要是由于： A.肽聚糖无五肽桥 B.肽聚糖外有外膜保护 C.肽聚糖为二维构型 D.肽聚糖含量少 E.胞质周围间隙中酶可破坏溶菌酶 10.目前尚无特异的防治内毒素致病的措施，其原因是内毒素： A.作用无组织特异性 B.作用于胞内 C.抗原性弱，不能制成疫苗 D.引起化学性中毒 E.一次产量较大 11．病毒入侵机体后最早产生的具有免疫调节作用的免疫分子是： A．sIgA B．IFN C．中和抗体D．IgM E．补体结合抗体 12．抗病毒感染中起局部免疫作用的抗体是： A．IgG B．IgM C．IgA D．SIgA E．IgE 13．常用于制备病毒灭活疫苗的试剂是： A．氯仿B．乙醚C．酚类D．甲醛E．过氧化氢 14．病毒中和抗体的作用是： A．直接杀伤病毒B．阻止病毒吸附C．阻止病毒核酸转录D．阻止病毒脱壳E．阻止蛋白合成 15．下列哪种病毒感染人体后可获得持久免疫力? A．流感病毒B．单纯疱疹病毒C．腺病毒 D．脊髓灰质炎病毒E．人乳头瘤病毒 16．在以下病毒中，机体内虽有特异性抗体,但仍可感染并发病的是： A．脊髓灰质炎病毒B．单纯疱疹病毒C．流感病毒 D．甲型肝炎病毒E．柯萨奇病毒 17．新生儿血中测出下列哪类抗体可诊断为宫内感染? A．IgG B．IgA C．IgM D．IgE E．IgD 18．病毒感染宿主细胞后，产生特异性杀伤的主要免疫细胞是： A．CD4+T B．CD8+T C．MφD．NK E．中性粒细胞 19．下列哪种抗病毒免疫方式属获得性非特异免疫? A．单核吞噬细胞系统B．补体及病毒抑制物C．生理年龄状态 D．干扰素E．屏障作用 20．病毒感染后无法获得持久免疫力的最重要原因是： A．无病毒血症B．抗原易变异C．表浅感染D．短暂感染E．免疫耐受21．干扰素的特性是： A．无种属特异性B．由宿主基因编码C．能直接发挥抗病毒作用 D．抗病毒作用比特异性抗体强E．需IgG和补体辅助抗病毒 22．一般认为抗病毒免疫效应最强的是: A．干扰素B．病毒抑制物C．IgG抗体D．细胞免疫效应E．IgM中和抗体23．下列哪种病毒不会透过血脑屏障? A．乙脑病毒 B.麻疹毒素 C.乳头瘤病毒 D.可萨奇病毒 E.埃克病毒 24．关于干扰素，下列叙述哪项不正确？ A.是一组具有高活性的多功能堂蛋白 B.可由病毒及其它干扰素诱生剂诱生 C.不能由病毒寄生的宿主细胞产生 D.产生后对邻近的细胞可发生作用 E.其作用发生早于抗体 25．关于干扰素的叙述，下列哪项是错误的？ A.由宿主细胞基因编码
DB42/T—2020 4型禽腺病毒抗体ELISA检测规程 1范围 本文件规定了4型禽腺病毒抗体ELISA检测的术语和定义、实验原理、检测条件、检测方法、结果判定、废弃物处理和防止污染的措施。 本文件适用于4型禽腺病毒鸡血清抗体的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法。 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4实验原理 本文件采用酶联免疫吸附法（ELISA），该方法利用抗原抗体反应具有特异性，将特异性的4型禽腺病毒五邻体蛋白（penton）吸附到固相载体的表面后，待测物中若含有相应的4型禽腺病毒抗体，则可与所包被的五邻体蛋白（penton）相结合，并能继续和相应的辣根过氧化物酶标记的鸡IgG抗体结合形成复合物。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与待测物中4型禽腺病毒抗体的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 5检测条件 5.1试剂及耗材 5.1.1试剂 纯化的4型禽腺病毒五邻体蛋白（penton）、酶标记物（辣根过氧化物酶标记的鸡IgG抗体）、底物液显色液、终止液、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、包被液、封闭液。 试剂配方及4型禽腺病毒五邻体蛋白、阳性对照、阴性对照的制备见附录A。 5.1.2耗材 酶标板（96孔）。 5.2设备 1
Ⅰ群禽腺病毒血清4型的分离鉴定及不同代次细胞毒的序列分 析 禽腺病毒（Fowl Adenovirus,FAdV）属于腺病毒科、禽腺病毒属。以限制性酶切图谱以及血清学交叉中和反应性为依据,目前FAdV可以分成5个种（A-E）,12个血清型（血清型1-7,8a、8b、9-11）。流行病学的研究发现,FAdV广泛分布于世界范围内,并易感于不同日龄的家禽。 其中,Ⅰ群血清4型禽腺病毒（Fowl Adenovirus serotype 4,FAdV-4）主要能引起鸡的“心包积液-肝炎综合征”（Hydropericardium hepatitis syndrome,HHS）,该病最早于1963年在美国被发现,随后便流行至全球各个国家。自2013年起,我国的多个省份也相继爆发由FAdV-4感染所引起的HHS,对国内鸡类养殖造成了严重的经济损失。为了解FAdV-4在山东省的流行情况及其演变进化规律,本研究对自山东多个鸡场分离到的FAdV-4毒株开展了相关研究,主要内容如下:1.FAdV-4的分离鉴定和全基因组测序分析本研究收集了山东省内不同 来源的19份疑似感染FAdV-4病鸡的肝脏,首先通过聚合酶链式反应（PCR）扩增Hexon基因,并对扩增产物进行测序分析。 测序结果显示,19份病料均可检测到FAdV-4的存在。随后,选取其中一份病料,研磨过滤后通过卵黄囊途径接种SPF鸡胚,分离到一株Ⅰ群血清4型禽腺病毒并将其命名为SDTA1512株。通过不同引物的设计对不同基因区域进行了扩增和克隆测序,对得到的基因片段进行拼接获得了其全基因组。 将该序列与不同参考毒株进行序列对比,结果显示本次分离株与HB1510和JSJ13全基因组同源性最高,而与其它国家分离株同源性较低。最后,将分离株SDTA1512通过腹腔接种1日龄SPF雏鸡,同时设对照组,研究了该病毒的致病性。
第四章抗感染免疫一、选择题 【 A 型题】 1. 外毒素的感染免疫是依靠抗毒素的哪种作用机制？ A. 调理作用 B. 黏附作用 C. 灭活作用 D. 清除作用 E. 以上都不是 2 .用于人工被动免疫的生物制品有： A. 菌苗 B. 疫苗 C. BCG D. 类毒素 E . 抗毒素 3. 霍乱肠毒素的作用机制是： A. 激活肠黏膜腺苷酸环化酶使cAMP 增多 B. 激活肠黏膜腺苷酸环化酶使cGMP 增多 C. 抑制肠黏膜腺苷酸环化酶使cAMP 减少 D. 抑制肠黏膜腺苷酸环化酶使cGMP 减少 E. 以上都不是 4. 正常体液中作用革兰阳性菌的抗菌物质是： A. 补体 B. 防御素 C. 溶菌酶 D. 白细胞素 E .血小板素 5. 能激活补体旁路途径使之发挥防御作用的物质是： A. 外毒素 B. 内毒素 C. 血浆凝固酶 D. 组蛋白 E. 酯酶 6. sIgA 发挥局部抗感染的作用机制是： A. 通过免疫调理作用增强免疫力 B. 可激活补体旁路途径 C. 直接与病原体结合使之不能定植于黏膜 D. 直接破坏病原体使之失活 E. 中和病原体的毒素作用 7. 通过与补体C3b 将细菌和吞噬细胞联结而发挥免疫调理作用的抗体是： A. IgM B. IgA C. IgG D. IgD E. IgE 8. 在多数情况下IgG 的保护作用大于IgM ，其原因是： A. IgG 分子小，易入炎症区 B. IgG 含量高，作用强 C. IgM 无免疫调理作用 D. IgM 半衰期短 E. IgG 可激活补体
9. 溶菌酶不能单独破坏革兰阴性菌的原因主要是由于： A. 肽聚糖无五肽桥 B. 肽聚糖外有外膜保护 C. 肽聚糖为二维构型 D. 肽聚糖含量少 E. 胞质周围间隙中酶可破坏溶菌酶 10 .目前尚无特异的防治内毒素致病的措施，其原因是内毒素： A. 作用无组织特异性 B. 作用于胞内 15．下列哪种病毒感染人体后可获得持久免疫力 A ．流感病毒 B ．单纯疱疹病毒 C ．腺病毒 D ?脊髓灰质炎病毒 E ?人乳头瘤病毒 16．在以下病毒中，机体内虽有特异性抗体 ,但仍可感染并发病的是： A ?脊髓灰质炎病毒 B ?单纯疱疹病毒 C 流感病毒 D .甲型肝炎病毒 E .柯萨奇病毒 17．新生儿血中测出下列哪类抗体可诊断为宫内感染 ? A ．IgG B ．IgA C ．IgM D ．Ig E E ．IgD 18．病毒感染宿主细胞后，产生特异性杀伤的主要免疫细胞是： A . CD4+T B . CD8+T C . M e D . NK E .中性粒细胞 19 下列哪种抗病毒免疫方式属获得性非特异免疫 ? A 单核吞噬细胞系统 B 补体及病毒抑制物 C 生理年龄状态 D 干扰素 E 屏障作用 20 病毒感染后无法获得持久免疫力的最重要原因是： A 无病毒血症 B 抗原易变异 C 表浅感染 D 短暂感染 E 免疫耐受 21 干扰素的特性是： A 无种属特异性 B 由宿主基因编码 C 能直接发挥抗病毒作用 D 抗病毒作用比特异性抗体强 E 需 IgG 和补体辅助抗病毒 22 一般认为抗病毒免疫效应最强的是 : A 干扰素 B 病毒抑制物 C IgG 抗体 D 细胞免疫效应 E IgM 中和抗体 23 下列哪种病毒不会透过血脑屏障 ? A. 乙脑病毒 B ?麻疹毒素 C.乳头瘤病毒 D.可萨奇病毒 E.埃克病毒 24 关于干扰素，下列叙述哪项不正确？ A. 是一组具有高活性的多功能堂蛋白 B. 可由病毒及其它干扰素诱生剂诱生 C. 不能由病毒寄生的宿主细胞产生 D. 产生后对邻近的细胞可发生作用 E. 其作用发生早于抗体 25 关于干扰素的叙述，下列哪项是错误的？ A. 由宿主细胞基因编码 B. 有广谱抗病毒作用 C. 抗原性弱，不能制成疫苗 D. 引起化学性中毒 E. —次产量较大 11．病毒入侵机体后最早产生的具有免疫调节作用的免疫分 子是： D ? IgM E .补体结合抗体 A ? sIgA B ? IFN C .中和抗体 12．抗病毒感染中起局部免疫作用的抗体是： A ．IgG B ．IgM C ． IgA D ． 13．常用于制备病毒灭活疫苗的试剂是： A ?氯仿 B ?乙醚 C .酚类 14．病毒中和抗体的作用是： A ．直接杀伤病毒 B ．阻止病毒吸附 E ．阻止蛋白合成 SIgA E ．IgE D .甲醛 E .过氧化氢 C ．阻止病毒核酸转录 D ．阻止病毒脱壳