植物组织培养：是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用人工培养基，对离体的植物胚胎、器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。又称为植物离体培养
离体生态学：是指研究离体培养环境条件控制的科学，其研究对象是培养基、植物材料和人工环境条件
外植体：用于离体培养的那部分植物器官、组织或细胞
愈伤组织（callus）：是指外植体因受伤或在离体培养时，其细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织
植物组织培养的特点
1.组培技术是无菌操作技术。
2.组培材料处于完全的异养状态。
3.组培材料可以是离体状态的器官、组织、细胞或原生质体。
4.组织培养物可以形成克隆（clone，无性繁殖系），也可以进行茎芽增殖或生根
5.组培容器内的气体和环境气体可通过封口材料进行交换，相对湿度通常是几乎100％，因此，组培苗叶片表面一般都无角质层或蜡质层，且气孔保卫细胞功能缺乏，气孔始终都是张开的。
6.组培的环境温度、光照强度和时间都是人为设定的，其参数可调
植物组织培养的研究类型
组织培养
器官培养
胚胎培养
细胞培养
原生质体培养
植物组织培养的研究任务
研究离体培养条件下，细胞、组织或器官所需营养条件和环境条件，细胞、组织或器官的形态发生和代谢规律，植物脱毒方法和机理，植物特别是一些难繁植物的大量快速繁殖方法，细胞融合方法和机理，再生个体的遗传和变异，种质资源的离体保存机理和方法等
德国植物学家Schleiden和动物学家Schwann于1838-1839年提出的细胞学说
德国植物学家Haberlandt于1902年提出了植物细胞具有全能性
李继侗和沈同1933年成功培养了银杏的胚。
1952年，Morel和Martin提出了植物脱毒（virus free）技术
Guha和Maheshwari等——花药培养
Cocking等-原生质体培养
Carlson等——原生质体融合
植物组织培养的应用
快繁和脱毒
育种
次生代谢物生产
种质保存
在遗传、生理、生化、病理等研究上的应用
离体快繁（试管苗和人工种子）
试管苗特点
繁殖系数大、速度快，苗木整齐一致，周年生产
人工种子
指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽，被包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒体。
具有试管苗的优点外，还具有以下优点：
1）便于贮藏和运输、可直接播种和机械化操作；
2）可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等成分，提高种子活力和品质
培育新品种或创制新物种
单倍体育种
离体选择突变体
培育远源杂种
基因工程育种
单倍体育种
手段：花药和花粉培养
优点：所有基因均能表现，基因型可快速纯合
成果：已育成大面积种植的品种
离体选择突变体
手段：愈伤组织、悬浮培养细胞易变异、细胞数量大，有利于突变体筛选
优点：多用于抗性筛选
成果：已选出一些抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白的突变体，有些已用于生产
培育远源杂种
胚培养可克服受精后障碍导致的远源杂交不孕，产生远源杂交后代，育成新物种.苹果,梨,大白菜和甘蓝、栽培棉和野生棉
原生质体融合可克服有性杂交不亲和性，获得体细胞杂种.马铃薯和番茄、烟草和龙葵
基因工程育种
农杆菌介导法、基因枪法均基于植物组织培养技术。
抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆性、品质改良
次生代谢物生产:利用组织和细胞的大规模培养，可以生产人类需要的一些天然有机化合物
植物种质资源的离体保存
优点：节约人力、物力和土地，防止有害病虫的传播，便于种质资源的交换和转移
培养基的成分
水
矿质元素
碳水化合物
生理活性物质
生长调节剂
附加物
天然添加物
水
水质软化装置
离子交换
反向渗透蒸馏
矿质元素
大量--氮、磷、钾、钙、镁、硫
微量--铁、锰、硼、锌、铜、钼
碳水化合物
作用：提供碳源、维持渗透压
通常碳源用蔗糖
低浓度（1.5～2.5％）的糖有利于木质部的生长；
高浓度（3～4％）有利于韧皮部
生理活性物质
维生素-----作用：辅酶
肌醇-----作用：帮助活性物质发挥作用，使培养物快速生长，促进胚状体及芽的形成
氨基酸及其酰胺类-----有机氮源、缓冲作用、调节体内平衡
单核苷酸
植物生长调节剂
六大类植物激素
生长素
细胞分裂素
赤霉素
脱落酸
乙烯
油菜素内酯
生长素/细胞分裂素相互作用
生长素－细胞分裂素比率关系，用于组培中决定芽和/或根的形成
细胞分裂素对生长素的浓度比值高时，倾向于形成芽
生长素细胞分裂素的浓度比值高时，倾向于形成根
两种激素的比值处于中间水平时增强愈伤组织的形成
附加物:
胶凝剂
螯合剂
渗透剂
活性炭
其他
天然添加物
椰乳,水解酪蛋白,酵母提取液
作用：提供天然微量营养成分、生理活性物质和生长调节剂等
缺点：成分不确定，影响实验重复性
母液（贮备液）注意事项
各种药品要充分溶解后才能混合。
混合时要注意先后顺序，避免相互结合生成沉淀。
铁盐单独配制，一般用硫酸亚铁和EDTA-Na2通过加热形成稳定的螯合铁贮存。
生长素类先用少量95％乙醇或1mol/L NaOH加热助溶后，用水定容。
细胞分裂素类先用少量1mol/L盐酸溶解，再用水定容
培养基制备
加一定量水，依次加入需要量的母液。
加入需要量的蔗糖，溶解，定容。
调节pH值。
加入需要量的琼脂，加热溶解（要不断搅拌）。
分装：在琼脂未凝时（40℃左右凝固）分装，量一般为容器的1/4～1/3，注意不要沾到容器口。
封口。
灭菌。
存放。
注意事项
不能高压灭菌的物质，在灭菌后温度下降但琼脂尚未凝固时，在无菌条件下，用过滤除菌法加入。
配好的培养基一般应在两周内用完
外植体:从需要培养的母株分离的一小块植物材料
接种体:已经培养的植物材料用于继代培养
外植体的选择
地上部比地下部清洁。
外植体越小，克服特殊植物病理问题的机会越大，但同时也降低了存活率。
内部的组织比外部的不易受到污染。
不同外植体反应不总是相同
外植体的灭菌
1.根据培养容器大小将材料切割成适当大小；
2.流水（自来水）冲洗植物表面；
3.在酒精中晃动几秒钟；
4.HgCL2（0.1～1%）＋吐温（润湿剂）2滴/100ml：3～5min；
5.用经过高压灭菌的蒸馏水冲洗；
6.商业漂白剂7~15%＋吐温2滴/100ml：10～30min；
7.再用经过高压灭菌的蒸馏水冲洗几次
培养条件
温度
光照:光周期和光强
湿度
气相条件
顶部空间气体成分对植物生长发育的影响
矮化或白化
玻璃化
软腐
自养/混合营养
乙烯伤害
矮化或白化
有限的气体交换对组培的效应
组培容器尽可能密闭，以防止污染。然而，在一个完全密闭的容器中可能出现气体的堆积，对植物生长造成不利，如产量减少、白化病或坏疽
玻璃化
产生原因
外植体：种类，继代次数；切割方法；在培养基上的放置情况。
培养基:凝胶的浓度和类型,细胞分裂素的种类及水平；盐浓度。
容器：气体组成和气体浓度
环境：温度；光强和光质，湿度；空气流动
植物细胞全能性：是指任何携带完整遗传信息的植物活细胞都具有表达其所有遗传信息的能
力，能够发育成完整的植株
全能性是一种可能性，变为现实必须满足两个条件：
解除抑制和给予刺激。
细胞需经过脱分化和再分化过程才能表现其全能性
脱分化：成熟细胞或分化细胞转变为分生状态（即形成愈伤组织）的过程。
再分化：成熟细胞或分化细胞脱分化转变为愈伤组织后重新分化成异质细胞的过程。
愈伤组织的形成
愈伤组织起源于母体组织增殖细胞。在培养时，通过把全植株的一小部分（外植体）在无菌条件下放到支持生长的培养基上来产生愈伤组织。激素改变了细胞的代谢使之从静止转变为具有活性
培养条件
固体培养基
暗培养
液体培养基的缺点
污染损失大
不利于气体交换，影响愈伤组织形成
愈伤组织的生长
诱导期后，外植体外层细胞开始分裂，在组织受伤表面形成一种创伤形成层，愈伤组织的细胞数目迅速增加
特点：细胞分裂速率大大超过细胞伸长速率，单个细胞的平均重量下降，体积变小
愈伤组织类型
质地：松脆、致密
高生长素：致密变松脆。
低或无生长素或高细胞分裂素：松脆变致密。
愈伤组织的保持
一段时间后，由于基本培养物的损耗、凝胶的干燥以及代谢物的积累，需要将愈伤组织转到新鲜的培养基上进行继代培养
要点：愈伤组织继代培养时要有适当的大小，以保证在新鲜培养基上可以重建生长
愈伤组织再分化途径
器官发生途径：愈伤组织先产生芽（或根），再在另一种培养基上产生根（或芽），然后形成完整植株。
胚状体发生途径：愈伤组织形成胚状体，再在另一种培养基上同时发展成带有根的苗。也叫无性胚胎发生（无性系）。
胚状体----指愈伤组织中形成的与种子中胚相似的具有苗端和根端的双极性结构。也叫体细胞胚
体细胞胚胎的特征
1.体胚最根本的特征是具有两极性
2.体胚的维管组织与外植体的该组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往住总与愈伤组织的维管组织联系
3.体胚的维管组织的分布是独立的Y字形，而不定芽的维管组织则无此现象
体胚发生的方式
直接发生和间接发生
直接发生是指体胚直接从原外植体的胚性细胞不经愈伤组织阶段发育而成
间接发生是体胚从愈伤组织或悬浮细胞、有时也从已形成的体胚的一组细胞中发育而成
多数体胚是间接发生
胚性细胞-----与分生组织细胞类似，通常较小，近圆形，具有较大的核和核仁并能高度染色，胞质浓厚，可直接发育成体细胞胚胎
胚胎发生丛（EC）:EC是愈伤组织中一种液泡小、胞质浓的小细胞聚集成的丛状结构
人工种子
海藻酸钠作为人工种子的包埋剂。也发展了用新的自裂胶珠的方法
植物组织培养的基本程序
1.无菌外植体的获得
2.初代培养物的建立
3.形态发生和植株再生
4.培养产物的观察记载
无菌外植体的获得
利用各种灭菌剂进行外植体的灭菌。
不同器官的灭菌方法
1.茎尖、茎段、叶片
清水冲洗
70％酒精浸数秒，再在10％次氯酸钙浸泡5～20min
无菌水冲洗3～5次，吸干
适当切块，接种
2.根、块茎、鳞茎
带土，易损伤。
仔细刷洗，切除损伤部位，增加灭菌时间或浓度。
70％酒精浸数秒，再在6～10％次氯酸钙浸泡5～20min。
3.花蕾
花蕾中的花药处于无菌状态，采摘后可直接灭菌
70％酒精浸10～30s，0.1％氯化汞浸泡3～10min
4.果实、种子
有些表面具茸毛或蜡质，需加吐温-80。
果实：70％酒精浸数秒，2％次氯酸钙10～20min。
种子：0.1～0.2％氯化汞浸泡5～10min
培养产物的观察记载
愈伤组织诱导率
胚状体诱导率
芽分化率
发根率
植物器官培养-----是指对植物某一器官的全部或部分或器官原基进行离体培养的技术
植物器官培养
根的培养
茎段和茎尖培养
叶的培养
根的培养意义
根系生理代谢研究的良好实验体系；
研究器官分化、形态建成的良好体系；
建立根无性系，用于制药；
诱变育种。
离体根的培养方法
固体培养法：平放
液体培养法：振荡
固体－液体双层培养法：根段形态学上端插入固体培养基，下端朝上浸露在液体培养基中。其他特殊方法
离体根所用培养基
White
MS、B5等大量元素减半或减2/3
影响离体根生长因素
基因型
营养条件：氮源、碳源、微量元素、维生素B1
激素：生长素
pH
光照和温度：一般黑暗有利于根的形成
植物茎段培养-----是指对植物的带有一个以上定芽或不定芽的外植体（包括块茎、球茎、鳞茎在内的幼茎切段）进行离体培养的技术。
茎段培养的目的
进行植物的离体快速繁殖。
研究茎细胞的分裂潜力和全能性。
诱导细胞变异和突变体的获得
茎段培养的特点和优点
特点：以芽生芽的方法进行增殖。
优点：容易成功、变异小、性状均一、繁殖速度快。
茎段培养产物
单苗
丛生苗
完整植物
愈伤组织
影响因素
基因型
激素配比：生长素、细胞分裂素
茎尖培养---是指对植物顶端的原分生组织和它衍生的分生组织的培养
类型
茎尖分生组织培养
普通茎尖培养
茎尖培养注意事项
取材大小：脱毒小于1mm，快繁可数毫米。茎尖微小趋向于形成愈伤组织。
培养基：多为MS，避免2,4-D（促使外植体愈伤组织化）。
普通茎尖培养与繁殖技术
无菌物的建立
芽的增殖
中间繁殖体的增殖
诱导生根
移栽
生长状态及原因
1.生长太慢：茎尖不见明显增大，但颜色转绿
进入休眠
生长素太低
2.生长过旺：茎尖明显增大，基部产生愈伤组织，茎尖难于伸长，色泽较淡
生长素偏高
用了2,4-D
光照太弱
温度过高
3.生长正常
茎尖逐渐转绿，基部逐渐膨大，有时形成少量愈伤组织，茎尖逐渐伸长，最终形成小枝。
影响茎尖微繁的因素
基因型
外植体的大小
供试植株的生理状态
芽的着生部位
褐变
玻璃化
极性
后生变化
形态发生能力
遗传稳定
叶的培养
意义：
研究叶形态建成、
光合作用、
叶绿体形成等；
叶细胞全能性；
原生质体融合；
无性繁殖系；
诱变育种
影响叶组织培养的因素
基因型
细胞分裂素
细胞分裂素和生长素的组合
供试植株的发育时间和叶龄
叶脉
极性
损伤
离体叶组织发育途径
直接产生不定芽
由愈伤组织产生不定芽
胚状体
植物胚胎培养是指对植物的胚、胚乳、胚珠和子房等进行离体培养，使其发育成完整植株的技术
包括：
胚培养、
胚乳培养、
胚珠培养
子房培养
胚培养
成熟胚培养
幼胚培养
幼胚培养的生长方式
正常胚胎发育，维持胚性生长。
早熟萌发：迅速萌发为幼苗，不能维持胚性生长
胚胎发育过程
异养期：球形期以前，需复杂培养基。
自养期：心形期开始，可用简单培养基。
异养期易夭折，可采用胚乳看护培养，提高成功率
影响幼胚培养的因素
培养基
环境条件：一般黑暗或弱光。
胚柄：胚柄的存在对幼胚的存活是关键，可用赤霉素代替
胚培养的应用
1.克服远缘杂交不亲和性：幼胚培养。
2.打破种子休眠，缩短育种周期
3.提高种子萌发率
4.克服珠心胚的干扰
5.种子生活力的快速测定。
6.诱导胚状体及胚性愈伤组织，用于快繁
胚乳培养---是指将胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术。
培养成熟的胚乳时，果实要进行表面消毒，胚乳和胚在无菌条件下切出来。
培养未成熟的胚乳时，整个果实要进行消毒，在无菌条件下，使用立体显微镜小心将胚乳组织切离。将胚乳从胚组织中分离出来是必须的，这一步骤的失败，将导致胚乳愈伤组织和胚起源（二倍体组织）的组织的污染。
影响胚乳培养的因素
培养基
培养条件
胚：诱导成熟胚乳活化，可用赤霉素代替。
取材时期：胚乳旺盛生长期较易诱导出愈伤组织。
胚乳培养应用
大量生产三倍体植株。
为染色体工程提供不同染色体组合的植株。
研究天然产物生物合成和代谢的实验系统
胚珠培养---是将胚珠从母体分离出来，无菌条件下让其进一步生长发育，使其形成植株的技术
胚珠----种子植物的大孢子囊，是孕育雌配子的场所，是种子的前身
胚珠培养的类型
受精胚珠培养
未受精胚珠培养
胚珠培养的意义
防止杂种胚早期败育，但比幼胚培养容易。
为试管受精提供一项基础技术。
培养单倍体植株
胚珠培养的影响因素
培养基：多用Nitsch。
胎座和子房：有胎座和子房易培养。
胚发育时期：球形胚后较易。
子房培养----是指将子房从母体上分离下来，无菌离体培养，使其发育成幼苗的技术
子房----雌蕊基部膨大部分，由子房壁、胎座、胚珠组成。
植物离体授粉是指将未授粉的胚珠或子房从母体分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术。又称离体受精或试管受精
目的：克服远源杂交的受精前障碍
离体授粉方式
离体柱头授粉
离体子房授粉
离体胚珠授粉
离体授粉成功的标志是授粉后能由胚珠或子房形成有生活力的种子。
影响离体授粉受精的因素
柱头和花柱：存在有利于受精。
胎座：存在有利于受精。
取材时期：最好在雌蕊授粉后和花粉管进入子房前。
培养基：Ca2+能刺激花粉萌发和花粉管生长。
培养条件：一般黑暗和弱光
花药和花粉培养（单倍体诱导）
目的
花药和花粉培养的目的是通过使小孢子或花粉粒反复分裂形成胚状体并获得单倍体植物，或者获得芽的形成，然后通过胚胎发生或芽的生长形成单倍体。其染色体组成可以通过秋水仙碱或再生技术获得可繁殖的同型纯合二倍体
花药培养：将花粉发育到一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养，以诱导其花粉粒改变发育进程，形成花粉胚或愈伤组织，进而分化为苗的技术。
花粉培养：先将花粉从花药中游离出来，再进行离体培养
共同点：利用花粉（小孢子）染色体的单倍性，培育单倍体植株
培养方法
花粉发育时期
四分孢子期、单核期（小孢子期）、二核期和三核期（雄配子期）
其中单核期（尤其中、晚期）是大多数植物花粉诱导的最佳时期。
花粉发育时期的检测
压片法：醋酸洋红；碘－碘化钾染色
外形：
花药培养
材料预处理：低温、花药离心、低剂量辐射、化学试剂（如乙烯利）等。
表面消毒
接种
培养：两条途径（胚状体；器官分化），影响因素（光照、温度等）。
花粉培养
1.花粉的分离
挤压法
磁搅拌法
漂浮释放法
2.培养方法
固体培养
液体培养：
看护培养
微室培养：
条件培养
看护培养
将完整花药接种在琼脂培养基上。
将一片无菌滤纸放在花药上。
将花粉粒接种在滤纸上
MS、H适合双子叶
B5适合豆科、十字花科
Nitsch适合芸苔属和曼陀罗属
N6适合禾本科植物
激素种类和浓度
细胞分裂素
生长素
蔗糖和有机添加物
高蔗糖浓度
有机添加物：椰乳
活性炭
单倍体植株的鉴定
形态学鉴定：形态特征、结实性、花粉粒大小和着色、气孔大小和数目等；细胞学鉴定
分子标记鉴定
单倍体植株的染色体加倍
自然加倍：核有丝分裂和核融合
人工加倍：秋水仙素
愈伤组织再生：组织创伤法
花粉花药培养的优点
1.缩短育种年限。
2.提高选择效率：有利于隐性基因性状的选择。
3.获得单性别特殊材料：如超雄株。
4.作为遗传研究材料。
我国成就：禾本科经济作物。
花粉花药培养的缺点
1.诱导频率低：有的只有百分之几、千分之几甚至更低；
2.体细胞干扰问题；
3.倍性变异问题；
4.白化苗问题。
组培与育种
单倍体育种
突变育种
培育远源杂种
基因工程育种
突变育种
根据突变原因：诱变和无性系变异
根据突变的主体：外植体突变和接种体突变（愈伤组织突变、悬浮细胞突变和不定芽突变等）
诱变---芽诱变、愈伤组织诱变
物理突变剂：X-射线，伽马射线，紫外线等
化学突变剂：EMS（甲基磺酸乙酯）、叠氮钠等
嵌合体植物----是指顶端层一到两层细胞遗传上有差异的植物。
扇形嵌合体
边缘嵌合体
外周嵌合体
离体合成嵌合体
1.愈伤组织混合
2.离体嫁接
嵌合体的离体培养
利用茎尖或腋芽来繁殖嵌合体。不要用不定芽或体胚，因为大多数情况下，它们起源于L1、L2或L3其中一层。
嵌合体分离
嵌合体可以通过诱导不定芽或体胚来分解，因为它们大都起源于一层细胞
杂色植物
定义
杂色＝器官上不同颜色的不连续斑点
类型
细胞系杂色：从一个突变细胞增殖而来的一群单色的细胞。如果这是一个芽顶点的细胞，杂色植物就是嵌合体（不是通过有性遗传获得的）
非细胞系杂色：所有的细胞基因型相同，但色素基因表达不同（有性遗传）
不是所有的嵌合体都是杂色的
不是所有的杂色都是嵌合
多用于筛选杂色植物
香蕉
杜鹃花
玫瑰
杂色原因
基因表达的不同
叶片疱疹：叶片的某些区域细胞与其下层的细胞分离
病毒
基因镶嵌
植物快繁---是指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的技术。也叫植物离体繁殖或微繁。
植物快繁的特点
1.繁殖效率高。周年繁殖，生长速度快。
2.培养条件可控性强。
3.占用空间小。30m2 可培育数十万株苗木。
4.管理方便，利于自动化控制。
5.便于种质保存和交换。
植物快繁的器官形成方式
短枝发生型
丛生芽发生型
不定芽发生型
胚状体发生型
原球茎发生型
短枝发生型---带叶茎段形成完整植株，再剪成带叶茎段继代成苗。
特点：一次成苗，性状稳定，过程简单，成活率高
花卉和葡萄的试管苗生产常用此法。
丛生芽发生型---顶芽或腋芽不断发生腋芽而呈丛生芽，再将单芽诱导生根成苗
特点：性状稳定，增殖率高
大多数植物快繁的主要方式。
不定芽发生型---外植体脱分化形成愈伤组织，再分化产生不定芽，或不经愈伤组织直接形成不定芽，再将芽诱导生根成苗。
特点：增殖率高于丛生芽发生型，但较易变异，并会导致嵌合性状发生分离。
许多植物快繁的主要方式。
胚状体发生型----外植体经愈伤组织发育成胚状体或直接发育成胚状体，直接成苗
特点：增殖率最高，但胚状体发生和发育较复杂。
目前此法应用尚不广泛
原球茎发生型---茎尖或腋芽培养产生原球茎，增殖形成原球茎丛，再切割增殖或培养成完整植株
是兰花唯一有效的大规模无性繁殖方法，促使了兰花工业的形成。
植物快繁的程序
阶段Ⅰ：无菌培养的建立；
阶段Ⅱ：繁殖体的增殖；
阶段Ⅲ：芽苗的生根；
阶段Ⅳ：小植株的移栽驯化
阶段Ⅰ：无菌培养的建立
母株和外植体的选取
无菌培养物的获得
外植体的启动生长
双层培养---固体培养基上面加20ml的液体培养基，避免继代培养。这可以降低成本
经典的双层培养基成分
Knop大量元素1/2浓度
活性炭
蔗糖
生长素
植物细胞培养----是指将植物单细胞或细胞团进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术
植物单细胞培养---是指将植物单细胞进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。
单细胞的分离
机械分离：研磨、过滤、离心
酶解分离：利用果胶酶分解细胞间的胞间层，使其分散。
由愈伤组织分离：液体培养、振荡、过滤、离心
单细胞培养方法
平板培养法
看护培养法
微室培养法
纸桥培养法
平板培养---是指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中培养的技术
悬浮培养---是将游离细胞或细胞团按一定密度，悬浮在液体培养基中不断地搅拌或振荡进行培养的技术
悬浮培养特点
可以使培养细胞快速大量增殖。
双子叶植物比单子叶植物更容易建立悬浮培养。
大多数建立悬浮培养的方法要求首先在离体条件下获得愈伤组织
悬浮培养很少只由单细胞组成。大多数除了单独游离的细胞外，都有细胞团。
建立了悬浮培养后，需要结合过滤，进行反复继代培养，以降低细胞团的大小。
细胞团中的细胞与单独游离的细胞其微环境是不同的。
培养方法
分批培养
半连续培养
连续培养
分批培养--是指将一定量的细胞或细胞团分散在一定量的液体培养基中进行培养
特点：只有气体内外有交换
必须及时继代培养
注意事项
接种密度不能太低。
及时继代（刚进入静止期时）。
充分分散。
振荡。
优点
设备简单：普通摇床
操作简便
重复性好
缺点：
培养基成分不断改变，细胞数目、代谢产物和酶的浓度都不能保持恒定，不适合研究细胞的生长代谢。
半连续培养---当细胞增殖到一定量后，倒出一半细胞悬浮液于另一个培养罐内，再分别加入新鲜培养基继续进行培养，如此这样反复地进行再培养
优点：能够重复获得大量均一的培养细胞
应用：生化研究；为进一步的更大规模的培养提供接种材料
连续培养
特点：体积恒定，营养物质不断得到补充，细胞可长期保持在对数生长期，增殖速度快，适于大规模工厂化生产
类型
封闭型：培养基更换，细胞不排出。细胞数目不断增长。
开放型：培养基更换，细胞也排出。细胞保持高生长速度
恒化式（控制某种营养成分的浓度）和恒浊式（控制细胞密度）
振荡目的：破碎细胞团，使细胞均匀分布，促进空气交换
方法：摇床（水平往复式、旋转式），搅拌器
细胞同步化：指同一悬浮细胞培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期
物理方法：控制细胞物理特性（细胞或细胞团大小）或生长环境（光照、温度等），如低温休克法。
化学方法：饥饿法或抑制法。
细胞增殖的测定
细胞计数
细胞鲜重
细胞干重
细胞密实体积（PCV）或沉淀体积（SCV）
悬浮培养细胞的植株再生
直接形成体细胞胚。
转移到固体培养基上形成愈伤组织再形成体细胞胚。
植物细胞培养的用途
次生代谢物
药用化合物的生产
分化
色素生产
诱导
生物转化
细胞培养中不能生产次生代谢产物的原因可能是：
将过程转到基本新陈代谢。
抑制或减少了关键酶的表达。
缺少合适的存储位置
诱导子----病原体释放的化合物或病原体部分细胞壁可以引起相似的应答。这些化合物称为诱导子，诱导生产植物抗毒素的过程称为诱导。
除了致病源化合物外，还有一些协迫剂也可以诱导产物积累。协迫剂包括：紫外线、暴露于冷或热、乙烯、杀真菌剂、重金属盐或高盐浓度等。
次生代谢物生产的一般步骤
高产细胞系的建立
种子培养
大规模培养（生物反应器）
植物细胞培养与微生物培养的不同特点
细胞大：20～150μm，是微生物细胞的10～100倍。易成团。
生长速度慢，增殖一代需1天到几天。
不耐剪切。
植物的组织培养技术 【学习目标】 1、指导植物组织培养技术的基本原理和基本技术。 2、掌握植物培养过程中使用的无菌技术（重点）。 3、掌握植物知识培养的基本过程及操作。 4、说出被子植物花粉发育的过程及花药例题培养产生花粉植株的两种途径。 5、说出花药离体培养的因素，学习话要例题培养的基本技术。 【要点梳理】 要点一、植物组织培养的基础知识【高清课堂：植物的组织培养技术 高清未发布 课题1：基础知识】 1、植物组织培养的基本过程： 离体的植物器官、组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织。愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化（去分化）。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫再分化。再分化形成的试管苗移栽到地里，可以发育成完整的植物体。植物组织培养的过程可以简要归纳为： 离体的植物器官、组织或细胞（外植体）???→脱分化愈伤组织???→再分化根、芽—→植物体。 2、植物组织培养的理论基础：细胞的全能性 要点诠释： 细胞的全能性与植物组织培养间的关系 ①细胞的全能性是植物组织培养的理论基础。 植物组织培养的理论基础是细胞的全能性。植物细胞只有脱离了植物体，在一定的外部因素作用下，经过细胞分裂形成愈伤组织，才能表现出全能性，由愈伤组织发育、分化出新的植物体。 ②高度分化的植物细胞仍具有全能性的原因是所有体细胞均来自受精卵的有丝分裂，均有和受精卵相同的一整套遗传信息。 ③植物体的组织、器官的形成，是基因选择性表达的结果，其细胞的全能性受到限制，在离体状态下，其全能性才容易得以表达，表达的过程须经过脱分化和再分化。 ④容易进行营养繁殖的植物细胞，其全能性容易表达，易进行植物组织培养。 要点二、影响植物组织培养的因素 1、无机营养 （1）大量元素：除碳（C ）、氢（H ）、氧（O ）外，还有氮（N ）、磷（P ）、钾（K ）、钙（Ca ）、镁（Mg ）、硫（S ）等元素。 （2）微量元素：包括铁（Fe ）、铜（Cu ）、钼（Mo ）、锌（Zn ）、锰（Mn ）、钴（Co ）、硼（B ）和碘（I ）等。 2、有机营养 （1）维生素类：植物组织培养中经常使用维生素C 、维生素B 1（盐酸硫胺素）、维生素B 6（盐酸吡哆醇）、维生素H （生物素）、叶酸和烟酸等，一般使用浓度为0.1～10 mol ／L 。 （2）氨基酸：有甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、水解酪蛋白（CH ）和水解乳蛋白（LH ）等，是重要的有机氮源。 （3）有机添加物：是一些成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等的复杂化合物，它们对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用。 3、植物生长调节物质 植物生长调节物质是培养基中的关键物质，对植物组织培养起着重要、明显的调节作用。植物生长调节物质包括生长素、细胞分裂素及赤霉素等。
植物组织培养报告内部编号：（YUUT-TBBY-MMUT-URRUY-UOOY-DBUYI-0128）
大蒜茎尖的组织培养 谢婷婷江宋青万嫣文吕凌宇一、实验目的 掌握植物组织培养的相关理论知识及操作方法； 通过自行设计并完成实验，提高动手能力和思维能力； 利用植物细胞的全能性，使大蒜茎尖经过脱分化作用形成愈伤组织，再分化为有结构的组织和器官，最终增殖培育出大量品质优良的大蒜试管苗。二、实验原理 植物组织培养是利用植物细胞的全能性原理。植物组织培养是在无菌环境下，将离体的植物器官、组织以至单个细胞，在人工配置的培养基上培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化”。已经脱分化的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化”。 三、实验材料、试剂和器材 1 供试材料 以购于府前菜场的大蒜为实验材料，实验在丽水学院生态学院组培实验室进行。 2 仪器与设备 超净工作台、培养事、电子天平、烧杯、容量瓶、玻璃棒、量筒、移液
管。 3 试剂 70%酒精、95%酒精、0.1%升汞、蔗糖、琼脂条、6-BA（1.5 mg/L；2.0 mg/L）、2,4-D（2.0 mg/L）、NAA（1.0 mg/L；）、IBA（2.0 mg/L）、10倍的大量元素、100倍的微量元素、100倍的铁盐、100倍的有机物。 四、实验步骤 1.培养基的配制及灭菌 诱导培养基：MS+6-BA 2.0 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L 出芽培养基：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L 生根培养基：MS+IBA 2.0 mg/L （1）将MS母液（10倍的大量元素、100倍的微量元素、100倍的铁盐、100倍的有机物）按顺序排列、检查是否失效。 （2）在装有3/4蒸馏水的容器中加入0.7%琼脂和3%蔗糖，加热溶化。（3）依次吸取适量各种母液移到容器中。 （4）用蒸馏水定容到相应体积。 （5）调节pH值(用0.1M的NaOH或HCl调节)至5.8-6.0。 （6）向培养基中加入适量激素。 （7）将配制好的培养基进行分装（20-30ml/瓶）。 （8）用两层称量纸包扎瓶口，并用橡皮筋扎牢，然后在高压灭菌锅中121 ℃下灭菌 20 min 。取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。接种操作所需的一切用具（烧杯、培养皿、灭菌水等），需同时灭菌。 （9）将灭菌后的培养基于常温下放置一星期，观察有无污染。
高中生物植物的组织培养技术知识点总结高中生物植物的组织培养技术基础知识点 1、植物组织培养过程： (1)原理：植物细胞具有全能性。 (2)过程： 2、用途： (1)微型繁殖 微型繁殖就是用于快速繁殖优良品神的植物组织培养 技术，也叫快速繁殖技术。繁殖过程中的分裂方式是有丝分裂，亲、子代细胞内DNA不变，所以能够保证亲、子代遗传特性不变。 (2)作物脱毒 作物脱毒是利用茎尖、根尖等无毒组织，进行微型繁殖，所获幼苗是无毒的。 (3)人工种子：通过组织培养技术，可把植物组织的细 胞培养成在形态及生理上与天然种子胚相似的胚状体，也叫作体细胞胚。这种体细胞胚有于叶、根、茎分生组织的结构。科学家把体细胞胚包埋在胶囊内形成球状结构，使其具备种子机能。所以，人工种子是一种人工制造的代替天然种子的颗粒体，可以直接播种于田间。 ①制作方法：人工种子是利用植物组织培养获得胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等，然后包上人丁种皮就形成了人工种
子，如图： ②优点：可使在自然条件下不结实或种子昂贵的植物得以繁殖;保持亲本的优良性状，因该过程为无性繁殖;节约粮食，减少种子的使用;可以控制添加一些物质，如除草剂、农药、促进生长的激素、有益菌等。周期短，易储存和运输，不受气候和地域的限制。 (4)细胞产物的工厂化生产：从人工培养的愈伤组织细胞中提取某种成分，如紫草素、香料等。 高中生物植物的组织培养技术重要知识点 1、植物细胞的全能性 (1)概念：具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能。 (2)原理：细胞内含有本物种的全部遗传信息。 (3)全能性表达条件：具有完整的细胞结构，处于离体状态，提供一定的营养、激素和其他适宜外界条件。 2、作物新品种培育 (1)单倍体育种： ①过程：植株(AaBb)通过减数分裂得到花粉(AB、Ab、aB、ab四种类型);对花粉进行花药离体培养(技术是植物组织培养);得到单倍体植株;对其幼苗时期进行秋水仙素处理;得到了正常的纯合二倍体植株(AABB、Aabb、aaBB、aabb四种类型)。
1.（2014广东卷）（16分）铁皮石斛是我国名贵中药，生物碱是其有效成分之一，应用组织培养技术培养铁皮石斛拟原球茎（简称PLBs，类似愈伤组织）生产生物碱的实验流程如下： 在固体培养基上，PLBs的重量、生物碱含量随增殖培养时间的变化如图17所示，请回答下列问题： ⑴选用新生营养芽为外植体的原因是，诱导外植体形成PLBs的过程称。 ⑵与黑暗条件下相比，PLBs在光照条件下生长的优势体现在，，。 ⑶脱落酸（ABA）能提高生物碱含量，但会抑制PLBs的生长。若采用液体培养，推测添加适量的ABA可提高生物碱产量。同学们拟开展探究实验验证该推测，在设计实验方案是探讨了以下问题： ①ABA的浓度梯度设置和添加方式：设4个ABA处理组，1个空白对照组，3次重复。因ABA受热易分解，故一定浓度的无菌ABA母液应在各组液体培养基后按比例加入。②实验进程和取样：实验50天完成，每10天取样，将样品（PLBs）称重（g/瓶）后再测定生物碱含量。如初始（第0天）数据已知，实验过程中还需测定的样品数为。 ③依所测定数据确定适宜的ABA浓度和培养时间：当某3个样品（重复样）的时，其对应的ABA浓度为适宜浓度，对应的培养时间是适宜培养时间。
【答案】（1）细胞分化程度低，容易诱导形成PLBs（2分）；细胞的脱分化（2分）（2）生长起始快（2分），快速生长时间较长（2分）；PLBs产量较高（2分）；（3）①灭菌、冷却（2分）；②75（2分）；③PLBs重量和生物碱含量乘积的平均值最大（3分） 【解析】（1）新生营养芽分裂能力强，全能性容易表达；根据题干可知，PLBs类似愈伤组织，外植体形成愈伤组织的过程是脱分化。（2）据图分析，光照下PLBs的重量高于黑暗条件下，原因可能是光照有利于细胞增殖、叶绿体的形成和进行光合作用制造有机物。（3）①由于ABA受热易分解，所以各种液体培养基灭菌后，冷却，再加入不同浓度的ABA ②根据题干可知，实验50天完成，每10天取样，需要取样5次，4个ABA处理组，1个空白对照组，3次重复，因此每次取样需要记录15个样品中的数据，共需要测定样品数75 ③适量的ABA可提高生物碱产量，当样品的平均值最大时，所对应的ABA浓度和时间为最适。 2.（2014江苏卷）（9分）为了获得植物次生代谢产物，先用植物外植体获得愈伤组织，然后在液体培养基中悬浮培养。请回答下列问题： （1）外植体经诱导后形成愈伤组织的过程称为。 （2）在愈伤组织悬浮培养时，细胞干重、蔗糖浓度和pH的变化如右图所示。细胞干重在12d后下降的原因有；培养液中蔗糖的作用是、。 （3）多倍体愈伤组织细胞产生的次生代谢产物量常高于二倍体。二倍体愈伤组织细胞经处理，会产生染色体加倍的细胞。为检测愈伤组织细胞染色体数目，压片前常采用纤维素酶和酶解离愈伤组织。若愈伤组织细胞（2n）经诱导处理后，观察到染色体数为8n的细胞，合理的解释是、。 （4）为了更好地获得次生代谢产物，生产中采用植物细胞的固定化技术，其原理与酵母细胞固定化类似。下列说法正确的有（填序号）。 ①选取旺盛生长的愈伤组织细胞包埋②必须在光照条件下培养
第一章植物组织培养的基础理论与基本知识 第一节植物组织培养的基本概念及类型 一、教学目标： 通过对植物组织培养的概念和植物组织培养的类型的学习,使同学们对植物组织培养技术有大概的了解和认识,让同学们建立起对该学科学习兴趣。 二、教学效果目标： 1、理解、掌握植物组织培养的概念； 2、掌握植物组织培养的类型。 三、教学重点： 1、理解、掌握植物组织培养的概念； 2、掌握植物组织培养的类型。 四、教学难点： 1、理解、掌握植物组织培养的概念； 2、掌握植物组织培养的类型。 五、教学效果评价： 1、为了激发学生的学习积极性和主动性，不宜采用百分制的方法进行评价，而是采用A、B、C、D四个评价等级进行评价。 2、评价标准： A、能用自己的语言对植物组织培养的概念和类型等几个基本概念进行正确的描述，能熟练的判断植物组织培养的类型。能按时按量甚至超量完成
作业，并且无误。 B、能基本用自己的语言植物组织培养的概念和类型等几个基本概念进行正确的描述，能基本会判断植物组织培养的类型。能按时按量完成作业，基本无误。 C、在老师的指引下或参照课本基本用自己的语言对植物组织培养的概念和类型等几个基本概念进行正确的描述，能基本判断植物组织培养的类型。能按时按量完成作业，但错误较多。 D、基本不认真听课，课堂很随意，基本不听老师教导，对所学内容基本不懂，很少作作业。 六、采用理论教学。 七、教学时数： 2学时 教学过程 一、新课导入：约（10分钟） 以同学们感兴趣的动物克隆技术人手，向同学讲述克隆技术基础技术，然后转到植物组织培养技术上来。 二、新课：（约80分钟） 板书： 第一章植物组织培养的基础理论与基本知识
国内外植物组织培养技术的差距 姓名：*** 学号：********* 指导教师：*** 专业班级：生物工程2009级1班 完成日期：2012-06-05
摘要 植物组织培养技术是农业生物技术中最早实现产业化并取得显著经济效益和社会效益的领域，在理论研究和生产实践中具有广泛的应用价值。通过对国内外植物组培的发展概况以及技术差距的分析，指出了我国植物组织培养技术的发展现状、目前存在的主要问题和应采取的措施，并对植物组织培养技术的发展作了展望。 关键词：组织培养概况差距展望 Abstract The plant tissue culture technology is agricultural biotechnology as the first realized industrialization and get a remarkable economic and social benefits of the field, in the theoretical research and production practice has wide application value. Through the domestic and international plant tissue and the development situation of the technology gap analysis, and pointed out the plant tissue culture technology's development present situation, the existing problems and the measures should be taken, and the development of plant tissue culture technology are discussed. Key words：Tissue culture situation gap looking
农业生物技术第二章植物组织培养试卷 班级___________ 姓名___________ 得分______________ 一、单项选择题（60） 1．植物组织培养是（） A．离体的植物器官或细胞培育成愈伤组织B．愈伤组织培育成植株 C．离体的植物器官、组织或细胞培养成完整植物体 D．愈伤组织形成高度液泡化组织 2．由于培养物脱离母株在试管内培养,故将植物组织培养又叫（） C．器官培养 D．离体培养 A.初代培养 B.继代培养 3．细胞形态和功能发生永久性变化过程称为（） A.分生 B.分化 C．脱分化 D．再分化 4．对外植体进行的第一次培养称为（） A.初次培养 B.器官培养 C．初代培养 D．继代培养 5．在人工培养基上通过诱导外植体而形成的一团无序的薄壁细胞团叫（） A.分生组织 B.保护组织 C．同化组织 D．愈伤组织 6．大量生产实践证明,通过（）可以有效地去除植物体内的病毒,获得无毒种苗. A.茎段培养技术 B.茎尖脱毒技术 C．组织快繁技术 D．转基因技术 7．植物体因受伤或生理上分离而失掉组织或器官后,恢复或复制失去的部分,形成新的完整植株的能力,称为（） A.植物细胞全能性 B.植物的极性现象 C．植物的再生功能 D．细胞的分化 8．下列关于细胞全能性叙述正确的是（） A.每个生物体内的所有细胞具有相同的功能 B.生物体内任何一个细胞可完成该生物体全部功能 C．生物体每一个活细胞都具有发育成完整个体的潜能 D．生物体每个细胞都经过产生、分裂、生长、衰老、死亡的全过程 9．构成胚的所有细胞几乎都保持着未分化的状态和旺盛的分裂能力，称为（） A.脱分化细胞 B.成熟细胞 C．胚性细胞 D．再分化细胞 10．愈伤组织表面和内部形成很多胚状体，称为（） B.胚泡C．体细胞胚D．合子胚 A.胚囊 11．植物再生功能的产生是由于植物受伤组织产生了（） A.细胞分裂素 B.赤霉素 C．创伤激素 D．生长素 12．草莓茎尖在4℃黑暗条件下，可以保持生活力达（）年之久 A.4 B.5 C．6 D．8 13．脱毒培养指的是（） A.种苗消毒后的培养 B.种苗及土壤消毒后的培养 D．无毒茎尖的培养技术 C．外植体消毒后的培养
植物组织培养的应用及 发展前景 集团档案编码：[YTTR-YTPT28-YTNTL98-UYTYNN08]
植物组织培养技术应用及进展 摘要：本文综述了植物组织培养理论的发展，重点论述其再脱毒、快繁、育种与有机化合物工业生产以及种质资源的保存等方面的应用，并对应用的前景作简单的展望。 关键词:植物组织培养；应用；进展 中图分类号： 1.理论起源 19世纪30年代，德国家施莱登和德国动物学家创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。1902年，德国植物学家哈伯兰特在的理论是植物组织培养的理论基础。1958年，一个振奋人心的消息从传向世界各地，美国植物学家斯等人，用韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。 植物组织培养的简单过程如下：剪接植物器官或组织——经过（也叫去分化）形成愈伤组织——再经过形成组织或器官——经过培养发育成一颗完整的植株。 植物组织培养的大致过程是：在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，用纤维素酶与果胶酶处理用以去掉细胞壁，使之露出原生质体，然后放在适当的人工上进行培养，这些器官或组织就会进行，形成新的组织。不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做。在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。 植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及,在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科 2.植物组织培养发展简史 植物组织培养是20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术。它是在人工配制的培养基上，于无菌状态下培养植物器官、组织、细胞、原生质体等材料的方法。 植物细胞的全能性是植物组织培养的理论基础。20世纪初，曾有人提出能否将植物的薄壁细胞培养成完整植株研究者从胡萝卜根的韧皮部取下一块组织，并在液体培养基中培养，使其分化出了愈伤组织，从愈伤组织又得到胚状体，胚状体转移到固体培养基上继续培养后，获得了完整的胡萝卜试管植株。经过栽培，此植株能够正常生长并开花结果，其种子繁衍出来的后代与正常植株的种子所繁衍出的后代别无二致。根据此实验可以得出以下结论：即不经过有性生殖过程也能将植物的薄壁细胞培养出与母体一样的完整植株。由于植物的每个有核细胞都携带着母体的全部基因，故在一定条件下，它们均能发育成完整植株，这就是所谓的植物细胞全能性。
植物组织培养的基本步骤 成熟细胞离体——（脱分化）——分生细胞——（分裂）——愈伤组织——（再分化）——形态建成————完整植株。 培养基的主要成分 【水分】 【无机盐】1.大量元素：N，P，K，Ca，Mg，S（由相关的无机盐提供） 2.微量元素：Fe，B，Cu，Mn，Mn，Zn，Co 【有机营养成分】1.糖类 2.维生素 3.氨基酸 4.肌醇 5.天然有机物【植物生长调节剂】1.生长素 2.细胞分裂素 3.其他生长调节剂 【凝固剂】琼脂 【其他物质】1.活性炭 2.抗生素 3.抗氧化物质 4.硝酸银 培养基和组织培养用具的灭菌方式 【培养基，无菌水】高压蒸汽灭菌，0.105MPa灭菌15~30分钟 【移栽基质】曝晒，甲醛熏蒸或高压蒸汽灭菌0.14MMPa灭菌1~2h 【接种室，缓冲室】紫外线灯照射30min，或气雾消毒剂 【超净工作台】紫外线灯30min，之后打开风机过滤除菌 【外植体】不同的化学消毒剂浸泡消毒 【接种工具】70%乙醇浸泡或擦拭，之后用火焰灼烧灭菌 【培养室】3%来苏尔喷雾，或甲醛，气雾消毒熏蒸 【皮肤】先用肥皂洗手，接种前用70%乙醇擦拭 【瓶口，管口】70%乙醇擦拭，用火焰封口
【培养瓶表面】70%乙醇擦拭 【台面，桌面】70%乙醇擦拭或喷雾消毒 植物外植体的灭菌方式 【茎尖，茎段，叶片】1. 用70%乙醇浸泡30秒，再用无菌水冲洗1次。 2.用2%次氯酸钠浸泡15min或0.1%升汞浸泡5~10min。 3.若材料有绒毛，最好在消毒液中加入几滴吐温。 4.消毒时要不断震荡，使植物材料与消毒剂充分接触。 5.最后用无菌水冲洗3~5次。 【果实】1.用乙醇迅速漂洗一下，再用无菌水冲。 2.用2%次氯酸钠浸泡10min，用无菌水冲洗2~3次。 【种子】用10%次氯酸钠浸泡20~30min，或0.1%升汞消毒5~10min，然后再用无菌水冲洗3~5次。 【花蕾】1.用70%乙醇浸泡10~15秒，无菌水冲洗一次。 2.在漂白粉中浸泡10min，用无菌水冲洗2~3次。 【根及地下部器官】用0.1%升汞浸泡5~10min 或用次氯酸钠浸泡10~15min，再用无菌水冲洗3~5次。 【消毒后的外植体应及时按照无菌操作技术接种在适宜的培养基上】
第一章 1、植物组织培养：是指在离体条件下，利用人工培养基对植物的器官、组织、细胞、原 生质体等进行培养，使其长成完整植株 2、外植体：在植物组织培养中，由活体（in vivo）植物上提取下来的、接种在培养基上的 无菌细胞、组织、器官等均称为外植体。 3、愈伤组织：指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。 4、应用 一、农业上的应用 1. 种苗快速繁殖(rapid propagation) 2.无病毒苗(virus free)的培养 3.在育种上的应用(breeding) （1）倍性育种，缩短育种年限，杂种优势明显； （2）克服远缘杂交的不亲合性和不孕性（胚培养）； （3）保存种质 （4）创造变异 二、在遗传学、分子生物学、细胞生物学、组织学、胚胎学、基因工程、生物工程等方面的应用。用于基因工程技术创造植物新种质。用于植物生长发育理论研究，包括生理学、病理学、胚胎学和细胞与分子生物学等。 三、利用组织培养材料作为植物生物反应器 第二章 1、细胞全能性（Totipotency）：指任何具有完整的细胞核的植物细胞都拥有形成一个完整植 株所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。 2、细胞分化（cell differentiation）：指导致细胞形成不同结构，引起功能或潜在的发育方式 改变的过程。 3、脱分化（Dedifferentiation）：指离体条件下生长的细胞、组织或器官逐渐失去原来的结构 和功能而恢复分生状态，形成无组织结构细胞团或愈伤组织 的过程。 4、再分化（Redifferentiation）：指脱分化的细胞重新恢复分化能力，形成具有特定结构和功 能的细胞、组织、器官甚至植株的过程。 5、植物组织培养中常遇到的问题以及解决措施 一、污染及防治： 1、真菌污染后，如果已形成孢子，则必须经高压灭菌后扔掉。但若是细菌污染，只 要及时发现，将材料上部未感菌的部分剪下转接，材料仍可使用。 2、用抗生素等杀菌药剂的处理，会影响植物材料正常生长。 二、褐变及防止 （1）选择合适的外植体 （2）合适的培养条件 （3）使用抗氧化剂 （4）连续转移 三、玻璃化问题及其防止
器官培养：即离体器官的培养。植株培养：对完整植株材料的培养。 组织或愈伤组织培养:是对植物体的各部分组织进行培养或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形成植株. 细胞培养:是对由愈伤组织等进行液体振荡培养所得到的能保持较好分散性的离体单细胞或花粉单细胞或很小的细胞团的培养. 原生质体培养:是用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。 初代培养：芽、茎段、叶片、花器等外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体过程植物组织培养：是指通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。 愈伤组织：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在植物体切面上产生。 外植体：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。 植物细胞全能型：任何具有完成细胞核的植物细胞，能拥有形成一个完整植株所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。 脱分化:已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分生组织状态的过程。 再分化:脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。胚状体：在离体过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。 褐变现象：指在接种后，其表面开始褐变，有事甚至会使整个培养基褐变的现象。 继代培养材料的玻璃化：当植物材料不断的进行离体繁殖时，有些培养物的嫩芽，叶片往往会呈半透明水迹状，这种现象通常成为玻璃化。 人工种子：通过植物组织培养的方法获得的具有正常发育能力的材料，外被有特定的物质，在适宜的条件下可以发芽成苗的植株幼体。 植板密度：形成的细胞团数/植板的细胞总数×100% 对称融合：双方原生质体均带有核基因组和细胞质基因组的全部遗传信息。 非对称融合：指一方亲本的全部原生质与另一方亲本的部分核物质及细胞质物质重组产生不对称杂种。 继代培养：是初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。目的：繁殖出相当数量的无菌苗，最后达到边繁殖边生根的目的。 细胞悬浮培养：将游离的植物细胞按一定的细胞密度悬浮在液体培养基中进行培养的方法。根据培养基的类型分为: 固体培养（琼脂、卡拉胶等固化），半液半固体培养(固液双层)，液体培养（震荡、旋转或静置培养）。 液体培养的优点：不使用凝固剂，节约生产成本，营养吸收充分；操作过程简化。 组织培养按培养对象可分为：植株培养，器官培养，组织培养，细胞培养，原生质体培养。 植物组织培养一般过程:初代培养，继代培养，生根培养，驯化移栽。 植物组织培养的特点：培养条件可以人为控制，生长周期短，繁殖率高，管理方便，利于工厂化生产和自动化控制。 组织培养技术在农业生产上的应用主要体现于以下几个方面：快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；育种上应用；工厂化育苗。 1902年，德国著名的植物生理学家和植物学家哈伯兰特提出了高等植物细胞全能性。1958年，美国植物学家斯图尔德等人，用胡萝卜根韧皮部的细胞进行培养，得到了完整植株，证明了细胞全能性。 怀特于1943年发表了《植物组织培养手册》专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。 腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一，这一比例高时，产生芽，这一比例低时，则形成根，相等则不分化。 标准的组培实验室包括：1、洗涤室，器具的洗涤，干燥和消毒，2、配置室，进行药品的保存，配置，消毒，分装等，3、灭菌室，培养基及使用器具的消毒与灭菌，4、接种室，进行材料的接种，内置超净工作
组培复习材料 一、名词解释 1、培养基：是离体植物（外植体）赖以生长、分化的基础，是根据植物的需求，人工配制的含有各种营养成分的营养液。 2、液体培养：把细胞或生物体的一部分，置于液体培养基中使其发育，并不断振荡，使之均匀地在悬浊液中进行培养的一种方法。 3、种子培养：是成熟种子和发育不全的未成熟种子的无菌培养。 4、叶培养：从母体植株上将叶组织（包括叶原基在内）切下，放在无菌的人工条件下使其生长发育形成植株的技术。 5、热处理脱毒：在一定范围内，用高温处理可部分或完全钝化植物组织中的某些病毒而不伤害或很少伤害植物本身的脱毒方法。 6、花药培养：是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花粉的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成杯状体，然后再生植株，或形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株。 7、连续培养：是利用特别的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式。（培养过程中，不断注入新鲜培养基，排掉等体积用过的培养基，或者抽取悬浮培养物，使培养物的营养物质得到不断补充，从而保持其恒定体积的培养。—— 8、分批培养：指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，建立单细胞培养物的培养方式。（细胞生长在固定体积的培养基中，当主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长即停止。） 二、简答题 1、MS培养基特点。 答：MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，具有高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐用量大，还有一定数量的铵盐，其养分的数量和比例合适，不需要添加更多的有机附加物，就能满足植物组织对矿质营养的要求，加速愈伤组织和培养物的生长，当培养物就不转移时仍可维持其生存。目前应用最广泛。 2、植物组培生产特点。 答：①和传统的生产方式相比，具有不占耕地、生产不受季节限制而且能够整年连续进行、不受灾害性天气和病虫害影响的特点； ②具有人为可控性，可采用更适合于植物生长的“培养基”代替土壤提供养分和生长调节物质；
第2章植物组织培养技术 第二节植物组织培养概述 一、授课章节 第二节植物组织培养概述。 二、学时安排 2学时。 三、教学目标 1．掌握植物组织培养的含义。 2．了解植物组织培养的类型划分。 3．理解植物组织培养的应用原理。 4．掌握植物组织培养的特点和应用。 四、教学重点、难点分析 重点： 植物组织培养的含义、特点和应用。 难点： 植物组织培养的应用原理。 五、教具 电化教学设备，植物组织培养试管苗。 六、教学方法 讲授法，多媒体课件。 七、教学过程 Ⅰ.导入 前面我们学习了有关植物育种的一些知识，今天，请看我给同学们看一样东西(教师拿出试管苗)，问同学们这是什么呢？这就是我们要学的植物组织培养。 II.新课
一、植物组织培养的含义 植物组织培养是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体培养在人工培养基上，给予适宜的培养条件，使其长成完整植株的过程。由于培养物脱离母株在试管内培养，故又称离体培养、试管培养。 二、植物组织培养的类型 植物组织培养由于分类依据不同可划分为不同的类型。 三、植物组织培养的应用原理 （一）植物细胞全能性 植物细胞全能性，是指植物体上每个具有完整细胞核的植物细胞，都具有该植物体的全部遗传信息和产生完整植株的能力。植物的体细胞一旦脱离所在器官或组织的束缚成为离体状态时，在一定的营养、激素和外界条件作用下，就可能表现出全能性，而生长发育成为完整的植株。
（二）细胞的分化和形态建成 （三）植物的再生功能 四、植物组织培养的特点 （一）研究材料来源单一，无性系遗传信息相同 （二）试验经济，管理方便，工作效率高 （三）培养条件人为控制，可周年连续进行试验或生产 （四）生长快，周期短，繁殖率高 五、植物组织培养的应用 （一）优良品种的快速繁殖 （二）脱毒及脱毒苗的再繁育 （三）植物新品种的培育 （四）种质资源的保存和交换 （五）有用次生代谢产物的生产 III.作业 1.简述植物组织培养的概念和培养类型。 2.植物组织培养技术有哪些特点？ 3.植物组织培养在生产上有哪些方面的应用？ 4.通过学习，你对植物组织培养技术是怎样理解的？ 第二节植物组织培养厂房的设计与构建一、授课章节 第二节植物组织培养厂房的设计与构建。 二、学时安排 2学时。
教学目的： 了解植物组织培养培养的培养基种类、成分及其特点，学习植物组织培养基本操作，了解离体培养环境条件，以及炼苗移栽基本方法。 职业技能教学点： 具有植物组织培养基本操作程序的认知。能够识别各类培养基特点，熟悉MS培养基成分；具有制作培养基能力，具有选择外植体、表面灭菌、无菌接种等基本能力；具有植物组织培养条件控制基本能力；有进行组培苗驯化练苗的基本能力。 教学时间： 10学时 教学重点： 各类培养基特点，固体培养基制作，外植体的选择及表面灭菌，外植体培养条件，组培苗驯化原则及常规移栽方法。 教学难点： 各类培养基特点，培养基制作及高压灭菌操作，外植体的表面灭菌，外植体培养中易出现的问题及其解决办法，试管苗的特点。 教学内容： 第一节培养基成分、种类及特点 植物生长必需16种基本元素：N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、B、Cu、Zn、Mo、Cl、C、H、O。离体培养条件下，各种元素主要从培养基中获得：H 和O来源于水，C来源于添加的糖类，其它矿质元素来源于组成培养基的无机盐。 培养基是根据植物生长所需营养成分，配制成的供植物生长的人工制作的营养物质。 一、培养基的成分 不同植物组织器官所需要的营养条件不完全一样，培养基营养成分也有差异，但总的来说，培养基一般包括无机盐、有机化合物和生长调节剂三大基本组
成成分。 1、无机盐类离体组织生长发育的基本成分，根据植物对必需元素需要的量，可以分为以下两类： 大量元素—植物所需元素的使用量一般在每升几十-几千毫克，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。 微量元素—植物所需元素的浓度小于10-5～10-7mol/L，Fe、Cu、Zn、Mn、Mo、B、Cl。 除C、H、O外，其它矿质元素通常以一定浓度的无机化合物形式，按一定比例配 制而成，溶于水中以离子态被吸收，N有硝态氮KNO 3和铵态氮（NH 4 ） 2 SO 4 两类提 供。 2、有机化合物 培养基中只有无机盐叫做基本培养基，为使培养物更好的生长，还需添加有机成分，常用有糖类、维生素、醇类、嘌呤、氨基酸等。 ⑴糖类离体培养物生长与发育不可缺少的有机成分，即作为碳源，又维持培养基的渗透压在1.5-4.1MPa。多使用蔗糖，试管苗生长与繁殖浓度2-3%，幼胚培养4-6%，某些特殊培养中用8-10%。细胞和原生质体培养还用麦芽糖、葡萄糖、果糖。 ⑵维生素类参与酶的形成、蛋白质、脂肪代谢，明显的促进离体培养物 的生长。盐酸硫胺素-VB 1、盐酸吡哆醇-VB 6 、烟酸-Vpp、生物素-VH、维生素C-Vc。 ⑶肌醇促进糖的转化、维生素和激素的利用，对胚状体和芽的形成有良好影响。用量一般50-100mg/L。 ⑷腺嘌呤合成各种细胞分裂素的前体物质之一，利于细胞分裂，促进芽的形成和生长。 ⑸氨基酸蛋白质的成分，是有机氮化合物，常用甘氨酸和多种氨基酸混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白。 ⑹其它复合成分成分尚不清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、酵母提取液、番茄汁、麦芽糖等。3、生长调节物质组织培养中常用： ⑴生长素类-生长素主要促进细胞分裂的生长，促进细胞脱分化，有利于诱导愈伤组织的产生，生长素与细胞分裂素同时使用有协调作用，在离体培养分化
名词解释 1.外植体：由活植物体上切取下来的可以用于组织培养的组织或器官。 2.愈伤组织：在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞（细胞排列疏松、 无规则）。 3. 植物细胞的脱分化：由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，又称去分化。 4. 植物细胞的再分化：脱分化产生的愈伤组织在培养过程中重新分化根或芽等器官的过程。 5. 试管苗的玻璃化 植物组培玻璃化苗的1、叶和嫩梢呈水晶透明或半透明水渍状； 2、整株矮化肿胀、失绿； 3、叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎； 4、叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具栅栏组织，仅有海 绵组织。 玻璃化现象的预防措施： 1、适当控制培养基中无机盐浓度 2、适当控制培养基中蔗糖和琼脂浓度 3、适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度 4、增加自然光照，控制光照时间 5、改善培养皿的气体交换状况 6、控制好温度 7、在培养基中添加其他物质 6.胚性感受态：体胚发生的相对容易程度。 7.人工种子又称合成种子或体细胞种子。任何一种繁殖体，无论是在涂膜胶囊中包裹的、裸露的或经过干燥的，只要能够发育成完整的植株，均可称人工种子。 8.微室培养法：即将细胞培养在很少量的培养基中。 9.看护培养法：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 10.植板效率：已形成细胞团的百分数，即每100个铺在平板上的细胞中有多少个长出细胞团。 11.试管外生根：将生根诱导与驯化培养结合在一起. 试管内生根：茎芽生根诱导有2条途径，其中一途径为试管内生根，在试管内诱导枝条生根叫试管内生根 12.植物离体保存：将离体培养的植物细胞、组织、器官或试管苗，保存于人工环境下，一般需要在低温或超低温条件下进行，以抑制其生长，达到长期保存的目的。 13．超低温保存：低温从4℃往下推，－80℃（干冰温度），－196℃以下的低温称为超低温。 问答题 1. 母液：为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，将培养基中的各种成分按质量的特定倍数称量配制成的浓缩液。 2.植物激素 ⑴生长素类 生长素主要促进细胞分裂的生长，促进细胞脱分化，有利于诱导愈伤组织的产生，生长素与细胞分裂素同时使用有协调作用，在离体培养分化调节中，生长素促进根的形成抑制芽的形成，液体培养中利于体细胞胚胎发生。常用IAA、IBA、NAA、2,4-D。 ⑵细胞分裂素类：促进细胞分裂和扩大，调解器官分化，延缓组织衰老，增强蛋白质合成，能改善其它激素作用，离体培养中，促进不定芽的发生，与生长素协调作用可有效控制培养物的生长与分化。常用6-BA、ZT、KT、2iP。 ⑶赤霉素类：促进细胞伸长生长、诱导花芽形成、打破种子休眠以及诱导单性结实等生理功能。有20多种，目前主要是赤霉酸GA3。离体培养下，还与生长素协调作用对形成层分化有影响，刺激体细胞胚进一步发育成植株。 （4）脱落酸：对某些植物体细胞胚发生的特异基因表达起调控作用，激活相关基因的表达，大量合成贮藏蛋白、晚期胚胎丰富蛋白和少量胚胎发生特异性蛋白。通常低浓度促进体细胞胚发生，高浓度抑制体细胞胚的发生。 3.芽的增殖途径 （一）通过愈伤组织 利用植物细胞在培养中无限增殖的可能性以及它们的全能性，可以对若干种植物类型进行快速繁殖。由这些植物的器官或组织诱导形成的愈伤组织，通过器官发生或体细胞胚胎发生都可以分化出植株。 （二）不定芽形成：产生不定芽的器官：根（福禄考属植物、苹果的某些无性系、悬钩子属植物）、鳞茎（风信子—基部受伤以后）、叶（秋海棠、天竺葵等）。通过培养基中适当配比激素的影响，就是那些在正常情况下不能进行营养繁殖的植物，如芸苔属
植物组织培养知识点总结第一、二章 1植物组织培养概念、分类、应用、创始人、奠基人 2实验室各分室名称、主要设备、主要功能 3无菌操作技术流程 4表面消毒剂种类及作用效果 5培养基成分及各成分的作用 6植物组织培养三大难题 7那些成分要抽滤灭菌 第三、四章 8植物细胞全能性原理 9名词解释：愈伤组织、脱分化、体细胞胚、人工种子 10体细胞胚的特点 11愈伤组织形成发育的三个时期，两种类型，良好愈伤组织的特点 12植物离体微繁，一般过程，各阶段注意事项 13褐变，影响褐变的因素，克服褐变的措施；玻璃化，无糖培养技术第五、六、七章 14植物脱毒方法、原理 15脱毒率包括两种方面含义 16人工诱导单倍体的三种途径 17花药培养得到的再生植株倍性如何，为什么 18花药培养的应用，花药培养力，一般培养过程。 19离体幼胚培养，胚发育有几种类型各有何特点 20离体授粉离体受精 21简述胚乳培养的意义
第八、九章 22原生质体概念，两种分离方法，纯化方法。 23酶法分离植物原生质体的酶液组成及作用 24简述植物原生质体培养基的特点 25原生质体融合，融合的主要方法 26体细胞杂交过程 27融合产物的种类及特点 28植物细胞无性系变异，特点 29提高植物细胞无性系变异频率的方法 30细胞突变体的类型及对应的筛选方法 植物组织培养知识点总结 第一、二章 1植物组织培养概念、分类、应用、创始人、奠基人 概念：是一种将植物的器官、组织或细胞在适当的培养基上进行无菌培养，并重新再生细胞或植株的技术。 分类：（1）按外植体来源和特性分：植株培养胚胎培养器官培养组织或愈伤组织培养细胞或原生质体培养；（2）按培养方法分：固体培养液体培养固体液体两相培养 应用：（1）克服远缘杂交中杂种不育性，种子无活力或配发育不全的植物获得后代，一年多代育种（2）培育三倍体（3）单倍体育种（4）提高突变频率，筛选变异类型（5）经过细胞融合得到体细胞杂种（6）种质资源保存 2实验室各分室名称、主要设备、主要功能 化学实验室（准备室）
题型：填空15分 选择20分 判断10分 名词解释20分 简答35分 附加题未知 一般培养基不含哪种维生素：培养基中的维生素属于B 族维生素，其中效果最佳的有维生素B1、维生素 B6、生物素、泛酸钙和肌醇等。 培养基部分 名称解释： 微室悬滴培养：利用表面张力将细胞培养液置于一张盖玻片表面制成悬滴，将组织或器官外植块接种 培养液中，然后翻转盖玻片使外植块及培养液悬挂在盖玻片下，再置放于一凹形载片之上，最后用熔蜡密封盖玻片四周后放入培养箱中培养的技术。 外植体 由活植物体上切取下来的可以用于组织培养的组织或器官。外植体是指植物离体培养中的各种接种材料。包括植物体的各个器官、组织、细胞和原生质体等。 愈伤组织在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞（细胞排列疏松、无规则）。 体细胞胚（体胚） 体胚-离体培养下没有经过受精过程，但经历了胚胎发育过程所形成的胚的类似物，统称为体细胞胚或胚状体。 体胚还可以从花药或花粉培养、离体器官培养、单细胞悬浮培养中产生。 体胚来源于根、茎、叶和它们的组织和细胞，经离体培养而发生的类胚结构，染色体组为两套，可发育成为正常植物体。 胚性感受态 植物组织或器官对外界环境条件所存在的特殊反应状态。 脱分化再分化 脱分化：由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，又称去分化。再分化：脱分化产生的愈伤组织在培养过程中重新分化根或芽等器官的过程。 指示植物 对病毒反映敏感，症状特征显著的植物 指示植物法 将一些对病毒反映敏感，症状特征显著的植物作为指示植物，用以检验待测植物体内特定病毒的存在。即指示植物法。特点：条件简单，操作方便，经济而有效，只能测出病毒的相对感染力。 试管内生根试管(瓶)内诱导茎芽生根形成小苗时期 试管外生根 瓶外生根技术把生根诱导与驯化培养有机地结合起来，有效缩短育苗周期，节约生产成本，提高了移栽成活率，是一项值得应用与推广的技术。 植物离体保存 将离体培养的植物细胞、组织、器官或试管苗，保存于人工环境下，一般需要在低温或超低温条件下进行，以抑制其生长，达到长期保存的目的。 植物&种质保存 种质保存:在适宜的环境条件下，贮存植物种质，使其保持生命力与遗传性的技术。一般有两种方式，即就地保存与迁地保存。 植物种质资源低温保存意义:防止资源灭绝、节约人力物力、便于交流 范与规