东南大学
硕士学位论文
CpG ODN对人外周血树突状细胞分化、成熟及抗肿瘤作用影响的
实验研究
姓名：刘艳
申请学位级别：硕士
专业：人体解剖与组织胚胎学
指导教师：杨宁
20040601
ｒ１１文摘要
ＣｐＧＯＤＮ对人外周血树突状细胞分化、成熟及抗肿瘤作用
影响的实验研究
研究生：刘艳
中文摘要
导师：杨宁东南大学医学院
目的：分离正常人外周缸树突状细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｉｌｓ，ＤＣ），ＣｐＧＯＤＮ作为刺激物，探讨其对ＤＣ生长、表面抗原（ＨＬＡ．ＤＲ、ＣＤ８６）表达、形态结构及其诱导ＤＣ体外对Ｔ细胞增殖及杀伤活性的影响；同时观察ＣｐＧＯＤＮ对肿瘤细胞上清培养ＤＣ的生长、膜抗原ＨＬＡ．ＤＲ表达的调节作用，揭示ＣｐＯＯＤＮ对ＤＣ的免疫激活作用及增强ＤＣ抗肿瘤活性的机制，为ＣｐＧＯＤＮ可作为免疫佐剂应用于体内免疫调节提供理论依据。
方法：（”止常人外周血Ｄｃ的分离与鉴定：按本室常规分离正常人外周血ＤＣ，细胞悬液涂片经Ｓ．１００蛋白免疫细胞化学染色检测ＤＣ纯度。
（２）ＣｐＧＯＤＮ刺激ＤＣ条件的筛选：采用析因实验设计羽【方筹分析，对ＤＣ培养体系中ＣｐＧＯＤＮ浓度、ＤＣ浓度以及培养时间三囡素不同水平进行筛选。
（３）ＤＣ表面分子检测及电镜分析：流式细胞仪分析ＣｐＧＯＤＮ晟佳条件刺激组、来刺激组ＤＣ表面抗原ＨＬＡ．ＤＲ、ＣＤ８６的表达，采用两样本ｕ检验进行统计学分析；同时透射电镜观察两组ＤＣ的形态特征。
（４）同种异体混合淋巴细胞反麻（ＭＬＲ）：ＣｐＧＯＤＮ晟佳条件刺激组和术刺激组１３（３与新鲜分离的同种异体Ｔ淋巴细胞共培养，ＭＴＴ法检测并计算出各组￡ｆＪ，ｌＪ激指数（ｓＩ），利用Ｅｘｃｅｌ软件分析ＣｐＧＯＤＮ刺激后ＤＣ对Ｔ细胞的激发作用。
（５）抗肿瘤实验：采用析因实验设计，探讨ＣｐＧＯＤＮ对ＤＣ调节Ｔ细胞杀伤肿瘤活性的影响。
（６）肿瘤细胞培养上清对ＤＣ的影响：收集胰腺癌细胞（ＡＳＰＣ．Ｉ）培养上清，以不同浓度与ＤＣ共培养，ＭＴＴ法检测不同培养时间的各孔光吸收值（Ａ４９０）：流式细胞仪分析肿瘤细胞上清培养和正常未用肿瘤细胞上清培养ＤＣ的表型。
（７）ＣｐＧＯＤＮ对肿瘤细胞上清培养ＤＣ的作用：实验分３组：①１ｕｔ００１．一ＣｐＧＯＤＮ组；
②含３０％ＡＳＰＣ．Ｉ培养上清液纽；③１“ｔｏｏｌ。ｌ－ｌＣｐＧＯＤＮ＋禽３０％ＡＳＰＣ。Ｉ培养上渍液组，各组分别与ＤＣ共培养７２ｈ，流式细胞仪分析各组ＤＣ表型，ＭＴＴ法检测各组光吸收值（Ａ４９０）。
结果：｛１）Ｓ－１００免疫细胞化学染色示初分离ＤＣ纯度＞９０％。
（２）析因实验结果示：不同浓度ＣｐＧＯＤＮ对ＤＣ生长产生明显效应（ｐ＜Ｏ０１），且与ＤＣ浓度具有交互作用（ｐ＜Ｏ．０１）。ＣｐＧＯＤＮ刺激ＤＣ的撮佳条件是１ｕｍ０１．Ｉ～ＣｐＧＯＤＮ、６×１０４孔。的ＤＣ、培养３６ｈ。
（３）透射电镜观察ＣｐＧＯＤＮ刺激ＤＣ的超微结构：ＣｐＧＯＤＮ最佳条件刺激组ＤＣ与未刺激ＤＣ相比其表面的突起细、长且规则。粗面山质网增多，空泡减少甚至消失。
（ｄ）ＦＣＭ分析显示ＣｐＧＯＤＮ对ＤＣ表面表型的影响：ＣｐＯＯＤＮ最佳条什刺激组ＤＣ细胞表面ＨＬＡ．ＤＲ、ＣＤ８６表达强度明显高于未刺激组（Ｐ＜０．０１）。
（５）ＣｐＧＯＤＮ对ＤＣ免疫刺激活性的影响：结果显示，ＣｐＧＯＤＮ最佳条件刺激组Ｄｃ可明显刺激Ｔ细胞增殖，与末刺激组相比差异有显著性，且ＤＣ浓度越高，刺激能力越强。
东南大学硕士学位论文
（６）根据ＳＡＳ统计软件数据处理结果得到ＣｐＧＯＤＮ诱导ＤＣ对Ｔ细胞杀伤活性影响的析冈实验趋势：ＣｐＧＯＤＮ明显增强ＤＣ调１７Ｔ细胞杀伤肿瘤的能力（，＜ｏ．０５），虽住组合条什为：ＤＣ数日ｌ×１０４孔～、效靶比１００；１、ＣｐＧＯＤＮ＝【“ｍｏ！．１～。
（７）肿瘤细胞培养上清对ＤＣ生长及表型的影响：ＭＴＴ检测结果显示，含１０％肿瘤细胞～卜清培养的ＤＣ其生长与正常纽无明显差异；含３０％肿瘤细胞上清培养的ＤＣ在第３天、含５０％肿瘤细胞上清培养的ＤＣ在第ｌ大和第３天生长被明显抑制（尸（ｏ．０５），但第５大时，两者的抑制作用均不明显。ＦＣＭ分折显示，肿瘤细胞上清壤养ＤＣ表面ＨＬＡ—ＤＲ表达强度明显低ｒ正常培养组（Ｐ＜０．０１）。
（８）ＣｐＧＯＤＮ对肿瘤细胞上清培养Ｄｃ的作用：结果显示，ＣｐＧＯＤＮ刺激细、俞３０％肿瘤细胞上清组及ＣｐＯｏＤＮ与含３０％肿瘤细胞上清共培养组ＤＣ的存活率分别为１．３５０、１．０２０、０．８４９，三组之间筹异显著（，＜０．０５或０．０１）：同时ＦＣＭ分析显示上述三组ＤＣ表面ＨＬＡ．ＤＲ表达的平均荧光强度为６３．７ｌ、４７．７ｌ、５１．４４，组间差异具有统计学意义（Ｐ（００５）。结论：（１）ＣｐＧＯＤＮ可诱导人外周血ＤＣ分化、成熟．增强ＤＣ调节Ｔ细胞杀伤肿瘤的活性。
（２）肿瘤细胞培养上清抑制ＤＣ的生长和表面抗原的表达。
（３）ＣｐＧＯＤＮ可拮抗肿瘤细胞培养上清对ＤＣ生长的抑制及表面抗原表达的Ｆ调。
（１）上述结果显示，ＣｐＧＯＤＮ对Ｄｃ具有较强的免疫激活作用，对体外诱导Ｄｃ及肿瘤环境ＤＣ作用效果均显著，表现出较强的免疫佐剂功能，为其应用于体内免
疫调节提供了理论依据，其确切的分子机制尚需进一步的研究。
关键词：人：外周血；树突状细胞；ＣｐＧＯＤＮ：抗肿瘤作用；肿瘤细胞培养上清：
英文摘要
ＴｈｅＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔｕｄｙｏｆＥｆｆｅｃｔｏｆＣｐＧＯＤＮＯｎＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、ＭａｔｕｒａｔｉｏｎａｎｄＡｎｔｉｔｕｍｏｒｏｆＨｕｍａｎ
ＰｅｒｉｐｈｅｒａｌＢｌｏｏｄＤｅｎｄｒｉｔｉｃＣｅｌｌｓ
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
ＧｒａｄｕａｔｅＳｔｕｄｅｎｔ：ＬＩＵ＂ｆａｎＴｕｔｏｒ：ＹＡＮＧＮｉｎｇＢａｓｉｃａｌＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ
ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓＯｔＣｐＧＯＤＮｏｆｆｔｈｅｄｌｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、ｍａｔｕｒａｔｉｏｎａｎｄａｎｔｉｔｕｍｏｒｏｆｈｕｍａｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ．ＴｂｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＣｐＧＯＤＮｔｏＤＣｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ。
Ｍｅｔｈｏｄｓ：（１）Ａｆｉｅｒｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｎｏｒｍａｌｈｕｍａｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄ，ＤＣｉｓｅｘａｍｉｎｅｄｉｔｓｐｕｒｉｔｙｂｙＳ－１００ｐｒｏｔｅｉｎｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓｔａｉｎｉｎｇ．
（２）ＴｈｅｆａｃｔｏｒｉａｌｄｅｓｉｇｎｉｓａｐｐｌｉｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｖｅｌｓｏｆＣｐＧｏＤＮｃｏｎｃｅｒｎｔｒａｔｉｏｎ、ＤＣｃｏｎｃｅｒｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｔｉｍｅｏｎＤＣｇｒｏｗｔｈ，ａｎｄｔｈｅｂｅｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆＣｐＧＯＤＮ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄＤＣｉｎｖｉｔｒｏｉｓｓｅｌｅｃｔｅｄ．
（３）ＴｈｅｃｅｌｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆＤＣｔｈａｔｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈａｎｄｗｉｔｈｏｕｔＣｐＧＯＤＮａｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙｔｒａｎｓｍｉｓｓｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ。ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８６ｏｎｔｈｅｍｉｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＣＭ）ａｎｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｍｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｎａｉｖｅＴｃｅｌｌｉｎａｌｌｏｇｅｎｅｉｃｍｉｘｅｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｒｅａｃｔｉｏｎ（ＭＬＲ）ａｎｄａｎｔｉｔｕｍｏｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＭＴＴｔｅｓｔ．
（４）ＴｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆｔｕｍｏｒｃｅｌｌａｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄａｎｄｕｓｅｄａｓｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎａＩｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒＤＣｆｒｅｓｈｌｙｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｈｕｍａｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄ．ＭＴＴｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃａｓｓａｙｉｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｆｆｅｃｔ
ｏｆｄｉｆＩｂｒｅｎｔｃｏｎｃｅｍｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｃｅｌＩｓｕｐｅｍａｔａｎｔｏｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＤＣａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＬＡ—ＤＲｏｎＤＣｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈａｎｄｗｉｔｈｏｕｔｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｉｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙＦＣＭ．（５）ＤＣｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｅｓｈｌｙｉｓｊｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈｌＯ％ＦＣＳＲＰＭｌｌ６４０ｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ，ＣｐＧＯＤＮ（１ｕｍ０１．ｒ），ｔｕｍｏｒｃｏｌＩｓｕｐｅｍａｔａｎｔ（３０％）ａｎｄＣｐＧＯＤＮ（１ｕｍ０１．１。）＋ｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓｕｐｅｍａｔａｎｔ（３０％）ｆｏｒ７２ｈ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅＤＣａｒｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｂｙｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅａｎｄｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＣＩ）Ｓ－１００ｐｒｏｔｅｉｎｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓｔａｉｎｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｓｔｈａｔＤＣｓｐｕｒｉｔｙ’９０％（２）ＴｈｅｆａｃｔｏｒｉａｌｔｅｓｔｅｘｐｌａｉｎｓｔｈａｔＣｐＧＯＤＮｃｏｎｃｅｒｎｔｒａｔｉｏｎｈａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＤＣ（ｐ＜０．０１）．ＡＩｓｏ，ｗｉｔｈＤＣｃｏｎｃｅｍｔｒａｔｌｏｎｈａｓａｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｎｉｔ．ＴｈｅｂｅｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆＣｏＧＯＤＮ—ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄＤＣ：ＣｐＯＯＤＮｉｓ１ｕｔ００１．ｒＩ，ＤＣｉｓ６ｘ１矿ｗｅｌｌ～ａｎｄｆｏｒ３６ｈ，
（３）ＴｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｆｏｎｃｔｉｏｎａｌａｌａｙｓｉｓｏｆＤＣｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｏｆＣｐＧＯＤＮ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄＤＣｈａｓｍａｎｙｔｈｉｎ、ｌｏｎｇａｎｄｒｅｇｕｌａｒｄｅｎｄｒｉｔｅｓｗｉｔｈｎｕｍｅｒｏｕｓｒｏｕｇｈｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍａｎｄｓｃａｎｔｙｖａｃｕｏｌｅ，ｉｎｃｏｎｔｒａｓｔｔｏｎｏｎ—ＣｐＧＯＤＮ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄＤＣ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ＣｐＧｏＤＮｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｓｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８６ｏｎＤＣ，ｉｍｐｒｏｖｅｓ
ＤＣ，
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＴｃｅｌｌｉｎＭＬＲａｎｄｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅａｎｔｉｔｕｍｏｒａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ
ｓｕｐｅｒｉｏｒｉｎｇｔｏｎｏｎ－ＣｐＧＯＤＮ—ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｇｒｏｕｐ．
（４）ＴｈｅｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｓｔｈａｔＤＣｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓｕｐｅｍａｔａｎｔ
ａｎｄＣｐＧｅｘｐｒｅｓｓｌｏｗｅｒｌｅｖｅｌｓｏｆＨＬＡ．ＤＲ，ｗｈｉｃｈｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｉｎｃｅｎｔｒｅｌ
ＯＤＮ＋ｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｇｒｏｕｐｓ．Ａｌｓｏｔｔｈｅｙｄｉｓｐｌａｙｏｆｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅｏａｐａｃｉｔｙｏｆｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆ
Ｉ“
尔南大学颀｝＋学位论文ＤＣ．
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：（Ｉ）ＣｐＧＯＤＮｍａｙｉｎｄｕｃｅｔｈｅｄｉｆｉｅｒｅｒｉｔｉａｔｉｏｎａｎｄｍａｔｕｒａｔｉｏｎｏｆＤＣａｎｄａｎｔｉｔｕｍｏｒｃａｐａｃｉｌｙｏｆＤＣ．
（２）ＴｈｅｔｕｍｏｒｃｅｌｌｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｓｔｈｅｇｒｏｗｌｈａｎｄａｎｔｉｇｅｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＤＣ，ＯＤＮｉｎｈｉｂｉｔｓｔｈｅｄｏｗｎ?ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｃｅｌｌｔｏｔｈｏｓｅｏｆＤＣ．
（３）ＣｐＧＯＤＮｈａｓｇｒｅａｔｉｍｍｕｎｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｃａｐａｃｉｔｙｔｏＤＣｉｎｄｕｃｅｄｉｎｖｉｔｒｏｍｊｃｒｏｅｎｖｌｒｏｎｍｅｎｔｏｆｔｕｍｏｒｃｅｌｌ．ＴｈｉｓｗｉｌｌｓｕｐｐｌｙｔｈｅｏｒｉａｌｂａｓｅｓｆｏｒＣｐＧＯＤＮｎｃｒｃａｓｅｔｈｅｗｈｉｌｅＣｏＧ
ａｎｄｕｎｄｅｒａｓｔｍｍＵｎｅ
ａｄｊｕｖａｎｔｉｓａｐｐｌｉｅｄｔｏｉｍｍｕｎｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎｖｉｖｏ，
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｈｕｍａｎ；ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄ：ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ；ＣｏＧＯＤＮ；ａｎｔｉｔｕｍｏｒａｃｔｉｖｉｔｙ；ｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓｕｐｅｒｎａｔａｎｈ
东南大学学位论文独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
研究生签名：日期：
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研究生签名导师签名：——日期：
缩略词表
缩略词表（Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｓ）
Ａｂ（ａｎｔｉｂｏｄｙ）
Ａｇ（ａｎｔｉｇｅｎ）
ＡＰＣ（ａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｃｅｌｌ）
ＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒｏｆｄｉｆｉｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）
ＣＴＬ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）
ＣｐＧ（ｃｙｔｉｄｉｎｅ—ｐｈｏｓｐｈａｔｅ—ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）
ＣｐＧＯＤＮ（ＣｐＧｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）
ＤＣ（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ）
ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）
ＦＣＭ（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）
ＦＣＳ（ｆｅｔａｌｃａｌｆｓｅｒｕｍ）
ＨＬＡ（ｈｕｍａｎｌｅｕｃｏｃｙｔｅａｎｔｉｇｅｎ）
ＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）
ＬＰＳ（１ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）
ＭＨＣ（ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘ）
ＭＬＲ（ｍｉｘｅｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｒｅａｃｔｉｏｎ）
ＭＴＴ（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）
ＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ）
ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂａｌａｎｃｅｄｓｏｌｕｔｉｏｎ）
ＴＧＦ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｍｒ）
ＴＨ（ｈｅｌｐｅｒＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）
ＴＮＦ（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔ００
ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）
Ｖ抗体
抗原
抗原提单细胞
分化群
细胞毒性Ｔ淋巴细胞
胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸序列
含未甲基化ＣｐＧ序列的寡脱氧核苷酸树突状细胞
二甲基亚砜
流式细胞仪
胎牛血清
人类白细胞抗原
白细胞介素
脂多糖
主要组织相容性复合体
混合淋巴细胞反应
噻唑兰
人外周血单个核细胞
磷酸盐平衡液
转化生跃因子
辅助性Ｔ细胞
肿瘤坏死因子
血管内皮生长因子
前言
前言
恶性肿瘤严重威胁人类的健康，迄今为Ｉｒ尚朱找到治疗癌症的最有效的方法。机体存在多种抗肿瘤免疫机制，其中以Ｔ细胞介导的特异性免疫应答起主导作用，而机体的免疫应答首先必焉由抗原递呈细胞（ａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｃｅｌ（，ＡＰＣ）将抗原（ａｎｔｉｇｅｎ，Ａｇ）捕获，经加工处理后将Ａｇ信息传递给Ｔ淋巴细胞。进而引发特异性免疫应答。ＡＰＣ是机体免疫反应的首要环节，能否进行有效的抗原提里直接关系到免疫激活或免疫耐受的诱导。ＤＣ是目前已知功能撮强的ＡＰＣ，由其激活的Ｔ细胞介导的免疫反应在机体抗舯瘤免疫中起着土导作用．因此。以ＤＣ细胞为基础的肿瘤免疫治疗成为目前医学界研究的热ｆ１课题。
ＤＣ功能的发挥与其分化发育阶段有关。ＤＣ起源丁－骨髓，随血流分布至除脑以外的全身各处．其象峭兵一样，不断摄取周同环境的异己抗原．此时ＤＣ表面低表达ＭＨＣ．ＩＩ类分Ｊ二、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及ＣＤ４０分子：ＤＣ摄取抗原或接触刺激物质后．开始向周闱淋巴组织．ｒ细胞依赖区迁移，迁移过程中，ＤＣ分化成熟，高表达ＭＨＣ．１１类分子、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及ＣＤ４０分子，以ＭＨＣ．ＩＩ类分子－抗原肽复合物的形式提呈抗原，同时提供协同刺激信号．激活初始型Ｔ淋巴细胞，从而诱导特异性的细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）免疫反应【ｌＩ。此外．有关研究表明，肿瘤局部浸润ＤＣ数量和ｆ功能与抗肿瘤免疫密切相关，多数肿瘤患者体内ＤＣ处于免疫抑制状态，ＭＨＣ．ＩＩ类分子、ＣＤ８０、ＣＤ８６表达低Ｆ，并且肿瘤细胞释放ＩＬ一１０、ＴＧＦ．ｔ３ｌ、ＶＥＧＦ等因予抑制ＤＣ成熟和功能，这可能是肿瘤细胞逃避机体免疫监视，诱导免疫耐受的机制之一”‘“。可见ＤＣ的成熟度及表面分子的表达对其功能的发挥起关键作用”ｌ。
目前已发现可诱导ＤＣ成熟的多种阏素，如肿瘤抗原肽、ＴＮＦ—ａ、ＬＰＳ等１４．５．６１，但因它们的毒性作用而限制在体内的应用。近年来研究发现１７】，含未甲基化胞嘧啶鸟嘌岭二核营酸序列（ＣｐＧ）的细菌ＤＮＡ或人一ｒ合成的寡脱氧核苷酸（ＣｐＧＯＤＮ）可激活多种免疫细胞，包括巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞等，具有强大的免疫刺激活性。另外．ＣｐＣＯＤＮ易于人工合成和大规模生产，成本低廉，且作为肿瘤瘦苗佐剂用于动物试验取得了令人满意的疗效Ｉ”。本研究从正常人外周血分离ＤＣ，以对人免疫细胞具有较高刺激活性的ＣｐＧＯＤＮ作为刺激物。观察其对ＤＣ生长、表面抗原（ＨＬＡ．ＤＲ、ＣＤ８６）表达、形态结构及其诱导ＤＣ俸外对Ｔ细胞增殖及杀伤活性的影响。同时．观察ＣｐＧＯＤＮ对肿瘤细胞上清培养ＤＣ的生长及表面分子表达的影响，揭示ＣｐＧＯＤＮ对ＤＣ的免疫激活作用及增强ＤＣ抗肿瘤活性的机制，为ＣｐＧＯＤＮ可作为免疫佐剂应用于体内免疫调节提供理论依据。
尔南大学硕１：学位论文
文献综述
树突状细胞与肿瘤的关系
机体存在多种免疫机制发挥抗肿瘤作用，其中以Ｔ细胞介导的特异性免疫应答起主导作川，面Ｔ细胞的致敏、激活和增殖则依赖于ＡＰｃ提早相应豹抗原肽及共刺激信号。ＤＣ是摄取、加工、早递Ａｇ的重要专Ｉｌ｝ｕ，ＡＰＣ，抗原提呈能力最强，是能够刺激初始型Ｔ细胞的惟一ＡＰｃ，被认为是机体免疫虑答的始动者，在免疫应答的诱导和抗肿瘤免疫中具有独特的地位。
ＤＣ起源丁骨髓，具有迁移能力，形如树突而得名。未成熟ＤＣ主要分布ｒ机体的谁淋巴组织中，其象哨兵一样，不断摄取周围环境的异己抗原，井加Ｔ成ＭＨＣ．抗原肽复合物表达于细胞表面，呈递井激活Ｔ细胞。在ＤＣ俘获、加ＴＡｇ的过程中＋同时伴有ＭＨＣＩＩ类分子、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０等分子的高表达。这些分子与肿瘤抗原共同发挥刺激作用促进ＣＴＬ激活。此外，ＤＣ与Ａｇ相互作用的过程中本身也可产生一些细胞因子，如ＴＮＦ．ａ、ＩＬ—ｌ、ＩＬ．１２等，它们在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。有关研究表明，肿瘤局部浸润ＤＣ数量和功能与抗肿瘤免疫密切相关，多数肿瘤患者体内ＤＣ处于免疫抑制状态，ＭＨＣ．１１类分子、ＣＤ８０、ＣＤ８６表达低下，并且肿瘤细胞释放ｌＬ．１０、ＴＧＦ．１３１、ＶＥＧＦ等因子抑制ＤＣ成熟和功能，此被认为是肿瘤细胞逃避机体免疫监视，诱导免疫耐受的可能机制之一”…。因此，激发ＤＣ细胞功能，采用ＤＣ细胞为基础的肿瘤免疫治疗成为目前医学界研究的热点。
目前国内外广泛应用肿瘤抗原肽、肿瘤细胞提取物或裂解物、凋亡小体、ｍＲＮＡ导入９１及一些危险信号分子【４。”如：ＬＰＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦ．ｎ、ＩＬ．Ｉ等方式诱导ＤＣ成熟后，回输体内，表现出较强的抗肿瘤效应。肿瘤抗原肽作用肯定，但其应用于临床受到以下限制：１）ＭＨＣ的限制；２）绝大多数肿瘤的肿瘤抗原仍未知：３）已知的肿瘤抗原不一定能在体内诱导出最佳的抗肿瘤反应。用整个肿瘤细胞作为Ａｇ来源不失为一种可取的方法．其克服了大部分肿瘤抗原尚不明确的局限，但也存在着不足。其不仅需要大量的瘤体组织．而且肿瘤细胞提取物中抗原成分复杂，其中包括机体自身的正常抗原，刺激ＤＣ后，免疫机体后存在诱发自身免疫性疾病的潜在危险Ｉｌ。Ｉ。将编码肿瘤Ａｇ的ＤＮＡ或ＲＮＡ分子导入ＤＣ，其在体内持续表达肿瘤相关抗原（ＴＡＡ）或肿瘤特异性抗原（ＴＳＡ），不仅可避免ＨＬＡ限制性的抗原选择，而且可以克服由于抗原肽．ＭＨＣ复合物解离或细胞ＭＨＣ分子降解对其诱导Ｔ细胞免疫应答产生的不利影响。但面临的一大难题是基因转染率太低。另外．来自细菌的ＬＰＳ虽具有明确的诱导ＤＣ成熟并影响其功能的作用，但其应用方式尚有待研究。且其特异性不强，易引起交叉反縻，形成免瘦病理损伤；ＴＮＦ．ａ被认为是体外促进ＤＣ成熟的主要细胞因子，但其对ＤＣ的激活程度欠佳，若使用不当将引起全身性反应Ｈ“。上述各种刺激因素由于自身缺点限制了其在体内的应用。近年来研究发现，ＣｐＧＤＮＡ［包括含未甲基化ＣｐＧ序列的细菌ＤＮＡ或人工合成的寡脱氧核苷酸（ＯＤＮ）】可有效激活ＤＣ，
增强抗肿瘤活性，而且其免疫激活作用强，具有佐剂效应．低毒，易于人ｌ：合成，成为目前ＤＣ研究领域的一人热点之一。
ＣＰＧＤＮＡ的结构基础
八十年代，日本学者发现｝介苗（ＢＣＧ）中的寡核苷酸成份具有抗肿瘤活性。进一步研究证实…Ｉ，此ＤＮＡ序列的免ｊ支刺激成份是一些含有未甲基化５１一ＣＧ．３’二核苷酸的六碱蒸序列，此序列在细菌ＤＮＡ＇ｔｌｌ现的频率为１／１６，而在脊椎动物ＤＮＡ出现的频率仅为细菌的ｌ，４，且甲基化程度高。若细菌ＤＮＡ甲基化处理、ｃｐＧ转化为Ｇｐｃ或无ｃｐＧ序列，细菌ＤＮＡ或人一［
２
文献综述
合成的ＣｐＧＯＤＮ将失去免疫刺激作用。Ｂａｌｌａｓ等Ｉ｜“亦发现，ＣｐＧＯＤＮ只要保留一定碱基数目的ＣｐＧ结构．有无回文序列均不政变其免疫刺激性，末端ｐｏｌｙＧ结构和ｏＤ悄骨架硫代磷酸脂修饰对ＯＤＮ免疫刺激作用的发并具有协同作用。敞认为含未甲基化ｃｐＧ二核营酸的六碱基序列是ｃ口ＧＤＮＡ产生免疫刺激作＿【＝Ｉｊ的基础，脊椎动物免疫系统止是通过识别外源性ＤＮＡＵ［，的六碱基序列来诱导机体产生免疫防御。随研究的深入，人们发现对鼠Ｂ细胞、ＤＣ、ＮＫ、
巨噬细胞等多种免疫细胞具有较强刺激佧删的序列为５一ＧＡＣＧＴＴ－３的ＣｐＯＯＤＮ对人免疫细胞作用不火：而对人免疫细胞具有高度刺激活性的ＣｐＧ基序为５－ＧＴＣＧＴＴ－３．但此两种Ｃ：ｐＧ基序对鱼的刺激作用却无著异【１…，提示ＣｐＧＯＤＮ的免疫刺激作＿ｌ＝ｆｊ具有种属特异性．其具体机伟《尚４；清。
ＣＰＧＤＮＡ对外周血ＤＣ的免疫刺激作用
１．ＤＣ亚群及表面标志
随着对ＤＣ研究的深入，人们对ＤＣ的来源、形成及功能有了深入了解。ＤＣ与Ｔ。细
胞一样存在异质性，并不是一类均…的细胞。目前，根据表掣和功能的不同，人外周血朱成熟ＤＣ可分为两型，ＣＤＩＩｃ＋／ＣＤ４‘ＤＣ和ＣＤｌｌｃ＇／ＣＤ４＋ＤＣ。其中，ＣＤＩｌｃ＋／ＣＤ蚪。未成熟ＤＣ与体外ＧＭ．ＣＳＦ和ＩＬ．４培养的单核细胞即单核细胞来源的未成熟ＤＥ（ｉｍｍａｔｕｒｅＤＣ，ｉＤＣｌ）相似㈣，表型为ＣＤＩｌｃ＋、ＣＤｌ３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤｌｌ６＋、ＣＤ４＂；而ＣＤｌｌｃ－／ＣＤ４＋ＤＣ即ＣＤ矿ＣＤｌ２３＋ＣＤ３一浆细胞，义称浆细胞性ＤＣ（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄＤＣ，ＰＤＣ），其与ＩＬ一３作用后可形成不成熟ＤＣ２（ｉｍｍａｔｕｒｅＤＣ２，ｉＤＣ２）．其几乎不表达髓系抗原ＣＤＩｂ、ＣＤｌｌｃ、ＣＤｌ３、ＣＤ３３，而仅表达淋巴系抗原ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤｌ２３、ＣＤ４；ｉＤＣＩ和ｉＤＣ２经ＣＤ４０Ｌ作用后分别可成为成熟的ＤＣｌ和ＤＣ２”……。
ＤＣｌ和ＤＣ２都具有激活初始型Ｔ细胞的能力，影响ＴＨ细胞砸群的分化。一般认为ｌ】“，与抗原或ＣＤ４０Ｌ接触、相互作用时，ＤＣＩ产生大量ＩＬ—１２，诱导ＴＨ０向ＴＨｌ分化；ＤＣ２产生火量１Ｌ．６、ＩＬ．８，以ＩＬ－４非依赖的方式诱导ＴＨｏ向ｒｒＨ２分化””。ＴＨｌ细胞分泌ＩＬ．１２、ＩＦＮ．Ｙ等介导细胞免疫或迟发型超敏性炎症的形成，在抗病毒、抗肿瘤中发挥重要作用；
ＴＨ２细胞分泌ＩＬ－４、ＩＬ．５、ＩＬ．６等介导体液免疫或变态反应性疾病。提示不同的ＤＣ决定了不同的Ｔ细胞应答类型。
２．ＣＰＧＤＮＡ对ＤＣ的免疫刺激作用
ＣｐＧＤＮＡ作为一种免疫佐剂，是近年来免疫学领域研究的热点。Ｈａｒｔｍａｎｎ等１１８１研究发现，ＣｐＧＯＤＮ可上调人外周血ＤＣ（ＣＤ４＋或ＣＤ４。）表面ＣＤ８３、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８６及ＭＨＣ．ＩＩ类分子的表达，增强混合辩巴细胞反应中Ｔ细胞增殖及促进Ｔ细胞释放更多Ｔｈｌ型细胞因子，表现出较强的免疫佐剂效应（其作用优于ＧＭ－ＣＳＦ）。关丁其对人外周血不同ＤＣ亚型是否具有相同的免疫刺激作用．人们进行了大量的研究。Ｋａｄｏｗａｋｉ等【ＩⅥ报道，ＣｐＧＯＤＮ仅诱导人外周血ＣＤｌｌｃ＇／ＣＤ４＋ＤＣＲ日ＰＤＣ释放Ｉ型ＩＦＮ（ＩＦＮ．ａ／Ｂ），而对另一亚型ＣＤＩｌｃ＋／ＣＤ４。ＤＣ无此作用。为了明确ＣｐＧＯＤＮ对人外周血ＤＣ作用的特点。迸一步的研究又发现”““Ｊ，ＣｐＧＯＤＮ特异性诱导ＰＤＣ产生Ｉ型ＩＦＮ的同时，还可上调人外周血ＰＤＣ表面ＣＤ８６、ＣＩＭ０的表达，促进ＭＬＲ中Ｔ细胞增殖及诱导Ｔ细胞释放高水平的ＩＦＮ—Ｙ。而且，ＰＤＣ体外经ＩＬ－３作用历，ＣｐＧＯＤＮ诱导其释放ＩＦＮ．ｎ更明显。相反，对ＬＰＳ敏感的体外单核细胞来源ＤＣ（ｍｏＢｏｃｙｔｅ．ｄｅｒｉｖｅｄＤＣ，ＭＤＤＣ）对ＣｐＧＯＤＮ则无反应。说明ｃｐＧＯＤＮ对人外周血ＤＣ的免疫刺激作用具有选择性，其特异性诱导人外周血ＰＤＣ分化成熟，且对体内赢接分离和体外细胞因子作用下的ＤＣ均有作Ｈｊ。另外，ＣｐＧＤＮＡ也可上调对ＬＰＳ敏感的ＰＢＭＣ、单核细胞表面ＣＤ８６、ＣＤ４０的表
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达，促进ＩＬ．１２、ＩＬ．６、ＴＮＦ的释放，但当去除ＰＤＣ后，ＰＢＭＣ释放ＩＦＮ．ｏ明显Ｆ降，进一步说明ｃｐＧＤＮＡ仅诱导ＰＤｃ释放１犁．ＩＦＮ，故ＰＤｃ义被称；Ｊ【ＪＩＦＮ产生细胞。ＮＹｉＪｊＬＣｐＧＤＮＡ之所以能够诱导ＰＢＭＣ、单核细胞释放ＩＬ－１２、ＩＬ．６、下ＮＦ，ＰＤＣ产生的Ｉ碍ｑ１１７１＂４起关键作用，此有助Ｔ－＆ｆｆｉ理解ＣｐＧＤＮＡ营造ＴＨｌ细胞因子环境的机制㈨”Ｉ。
ＣＰＧＯＤＮ在抗肿瘤方面的应用
机体抗肿瘤的免疫效应机制十分复杂，涉及多种免疫成分。其中以Ｔ细胞、ＮＫ细胞及巨噬细胞介导的免疫反应为主，特别是ＣＤ８＋ＣＴＬ的系伤活性在机体抗肿瘤效应中起荚键作用。
ＯＤＮ强人的免疫刺激作用引起研究者的极人关注，已被应川丁增强抗肿瘤免疫反应的ＣｐＧ
研究中。Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ等１２２１用抗肿瘤的单克隆抗体治疗淋巴瘤时联用ｃｐＧＯＤＮ，发现其可增强单克隆抗体的抗肿瘤作用，单齐ｑ量ｃｐＧＯＤＮ效应与多剂萤ＩＬ．１２相当。主要机制是活化ＮＫ细胞．增强抗体依赖的细胞介导的细胞毒作＿ｌ｛ｊ。
多种方式装载的ＤＣ己被应月ｊ丁肿瘤免疫治疗并取得了可喜的结果。为了进一步改善疫苗没计，Ｂｒｕｎｎｅｒ等１４１在体外片ｊｃｐＧＯＤＮ激活ＧＭ．ＣＳＦ和ＩＬ．４扩增的骨髓来源ＤＣ后，与结肠癌细胞一同免疫小鼠，发现。与对照组ＤＣ鼠相比，ｃｏｏＯＤｉＮ．ＤＣ组鼠肿瘤生长缓慢，存活期延长：ＣｐＧＯＤＮ激活的Ｄｃ作为疫苗回输荷瘤鼠可产生相同效应，疫苗诱导的肿瘤特异性保护性免疫至少可维持６周。但ＣｐＧＯＤＮ激活的ＤＣ对瘤体积较大的鼠作用不明显。
ＣｐＧＯＤＮ也可作为Ｄｅ疫苗的免疫佐剂用于增强特异性的抗肿瘤免疫反应。在鼠结肠癌模型中，肿瘤抗原负载ＤＣ作为疫苗，ＣｐＧＯＤＮ作为佐剂可明显增强肿瘤的杀伤效应，作闩｛优于５．氟尿嘧啶和四氢叶酸：且联用ＣｐＧＯＤＮ时肿瘤周围ＤＣ浸润数量增加，免疫反应以ＣＤ８Ｔ细胞为主．说明，ＣｐＧＯＤＮ在诱导机体抗肿瘤免疫反应中具有强人的免疫佐剂效应¨…。ＣＰＧＤＮＡ作用于ＤＣ的机制
１．Ｔｏｌｌ样受体
１９９７年在哺乳动物中发现了第一个Ｔｏｌｌ样受体（Ｔｏｌｌ．１ｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＬＲ），迄今人类已发现了１０种ＴＬＲ（ＴＬＲＩ－ＴＬＲｌ０），ＴＬＲ能识别病愿微生物及其细胞壁上的一些保守成分如ＬＰＳ等。人们将真核细胞所不具有的而病原微生物及其细胞壁所特有的保守成分统称为痫原相关分子模式（ｐａｔｈｏｇｅｎ．ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｐａｔｔｅｒ．ＰＡＭＰ）１２４］，ＣｐＧＤＮＡ也是特征性的ＰＡＭＰ分子。ＴＬＲ是结合ＰＡＭＰ的受体，表达于参与天然免疫的细胞尤其ＤＣ上。由于ＤＣ具有不同的弧型，且研究发现ｃｐＧＤＮＡ特征性激活人浆细胞性ＤＣ（ＰＤＣ），而对单核细胞来源的ＤＣ（ＭＤＤＣ）无活性，因此推测不同的ＤＣ亚理可能表达不同的ＴＬＲ，从而决定了ＤＣ识别不同的ＰＡＭＰ类型。利用量化实时ＰＣＲ技术和ＲＴ．ＰＣＲ分析ＴＬＲｌ－ＴＬＲｌ０在人ＰＢＭＣ，弧型细胞上的表达时，发现单核细胞、ＭＤＤＣ表达ＴＬＲ２、ＴＬＲ４，对ＴＬＲ２的配体革兰阳性细菌的肽聚糖（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ，ＰＧＮ）和脂磷壁酸（１ｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃａｃｉｄ，ＬＴＡ）及ＴＬＲ４的配体ＬＰＳ起反应；而ＰＤＣ表达ＴＬＲ７、ＴＬＲ９，只能对ＴＬＲ９的配体Ｃ口ＧＤＮＡ起反麻”。４Ｊ。说明ＤＣ细胞上ＴＬＲ表达的不同决定了不同的ＤＣ亚型识别不同的ＰＡＭＰ。
２．分子机制
关于ｃｐＧＤＮＡ作用于ＤＣ的分子机制研究者认为至少有两种信号传导通路：庶激酶
文献综述
通路和ＮＦ—ｋａｐｐａＢ通路参与了ＣｐＧＤＮＡ的信号传导。近年米，又提出ＤＮＡ蛋白激酶信号通路，丰寓Ｔｋ｛ｆ］ｘｊＣｐＧＤＮＡ分予作崩机制的认识。
２ｌ应激酶通路
ＨａｃｋｅｒｐＴｌ等研究发现，ｐ３８抑制荆可明显抑带１］ＣｐＧＤＮＡ对Ｄｃ的活化，证实应激酶参与了ＣｐＧＤＮＡ的信号传导。ＣｐＧＤＮＡ引起ＤＣ胞内Ｊｕｎ氨基末端激酶激酶ｌ（ＪＮＮＫｌ／ＳＥＫ／ＭＫＫ４）磷酸化，激活应激酶ＪＮＫＩｔ２、ｐ３８，继而通过磷酸化活化蛋白１（ＡＰ．１）蛋白组分ｃｊｕｎ及ＡＴＦ２活化转录因子ＡＰ一１，活化的ＡＰ．１通过调控ＩＬ．１２、ＴＮＦ．Ｑ等细胞因子基冈的转录录Ｊ表选．来实现ＣｐＧＤＮＡ对Ｄｃ的激活。且ｐ３８抑制剂可明显抑制ｃｐＧＤＮＡ对ＤＣ的活化．证实应激酶在ＣｐＧＤ悄Ａ信号传导中１Ｆ常重要。同时发现，用：ＩＢＣｐＧＤＮＡ或核内体酸化抑制剂氯喹等复台物竞争性抑制内涵体的成熟可阻断ＣｐＧＤＮＡ对ＤＣ上述活化信号，说明，细胞内吞入胞和内涵体的成熟在ＣｐＧＤＮＡ激活ＤＣ的应激酶信号传导通路中同样起十分重要的作用。
２．２．ＮＦ一－Ｂ通路
Ｋａｉｓｈｏ等ｐｓ］基因敲除鼠实验表明，同ＬＰＳ、ＣＤ４０Ｌ相似，Ｔｏｌｌ样／Ｉ乙一１受体（ＴＬＲ／ＩＬ．１Ｒ）通路中的信号分子ＴＬＲ、髓细胞样分化标志８８（ｍｙｅｌｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｍａｒｋｅｒ８８，ＭｙＤ８８）在ＣｐＧＤＮＡ激活ＤＣ的信号传导中同样起关键性作用。进一步研究发现１２９，７］，ｃ０３ＤＮＡ被ＤＣ非特异性内吞入胞，以氯喹敏感的方式加Ｔ＝后与ＴＬＲ９相互作用，通过ＭｙＤ８８、１Ｌ．１受体相关酶（ｉｎｔｅｒｌｅｉｋｌｎ－１ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｋｉｎａｓｅ，ＩＲＡＫ）、肿瘤坏死因子受体相关踊子６（ｔｕｍｏｕｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ．ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｆａｃｔｏｒ６，ＴＲＡＦ６）级联反应，激活ＮＦ．ＫＢ通路，引起ｌＫＢ激酶复合物（ＩＫＢｋｉｎａｓｅｃｏｍｐｌｅｘ，ＩＫＫ）、ｃ．Ｊｕｎ氨基末端激酶（ＪＮＫ）活化，通过磷酸化ｌｘＢ，摄终引起转录因子ＮＦ．一Ｂ（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ－ｋａｐｐａＢ，ＮＦ．一Ｂ）的活化。但关于ＣｐＧＤＮＡ是否与ＴＬＲ９直接结台尚需进一步探索。
２．３．ＤＮＡ蛋白激酶通路
ＤＮＡ蛋白激酶（ＤＮＡ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ＤＮＡ．ＰＫ）信号通路由Ｒａｚｄ、组…‘提出，在ＤＮＡ．ＰＫ、ＩＫＫ．Ｂ基因无义突变鼠模型中ｃｐＧＤＮＡ刺激释放ＩＬ．１２、ＩＬ．６的能力下降，且重组ＤＮＡ－ＰＫ体外可直接磷酸化ＩＫＫ．Ｂ，证明了这一通路的存在，认为ＤＮＡ．ＰＫ是ＣｐＧＤＮＡ的细胞内受体。Ｉｓｈｉｉ等”“对此提出异议，Ｐ１３激酶（包括ＤＮＡ—ＰＫｃｓ）抑制剂可通过抑制ＣｐＧＤＮＡ的细胞内吞及内吞体ＩＬｌＣｐＧＤＮＡ｝ｔｌＴＬＲ９的相互作用，来抑制ＮＦ－ｘＢ级联反应，而ＤＮＡ．ＰＫ并不介．ＫＣｐＧＤＮＡ的内吞；另外，Ｔ细胞表达ＤＮＡ—ＰＫ．但ＣｐＧＤＮＡ对其却无直接刺激作用；认为．ＴＬＲ９是ＣｐＧＤＮＡ受体的主要组成部分，介导ＣｐＧＤＮＡ的信号传导。总之，关丁＿ｃ０３ＤＮＡ分子作用机制，我们不能排除人免疫细胞同时具有胞外受体（ＴＬＲ）和胞内受体（ＤＮＡ．ＰＫ）识别病原体的可能以及ｃ０３ＤＮＡ激活信号传导通路的交叉作用，这些有待于研究者共同努力深入研究才得以阐明。
展望
ｃ０３ＤＮＡ作为一种新型免疫佐剂具有以Ｆ优点：（１）对ＤＣ等多种免疫细胞具有较强的免ｊ壹激活作Ｈｊ．能同时激活机体先天免疫系统和后天免疫系统；（２）诱导产生ＴＨｌ型细胞因子环境，促进细胞介导的免疫应答的产生，并能诱导强的ＣＴＬ应答，有利于肿瘤防治；（３）ｃ０３ＤＮＡ低毒，副作用小，易丁１人１：合成．与氢氧化铝等其他佐剂具有协同效应；（４）可经皮下、口服、鼻腔、直肠、腹腔等多种途径免疫接种。
东南大学硕士学位论文
另外研究也显示，ＣｐＧＯＤＮ作为免疫佐剂能增强小鼠模型中由卡介苗免疫诱导的Ｔ。Ｉ麻答细胞的数量．并能降低结核杆菌攻击后肺内细菌的负荷：另外．ＣｐＧＯＤＮ还可降低ＳＩＶ感染的短尾猴再感染利什曼原虫的机会，提示ＣｐＧＯＤＮ可望作为感染性疾病患者的免疫保护剂”２”１，同时这种抗感染作用还可望Ｈｊ丁外科手术、化疗、骨髓移植中预防感染１３４］。由此可见，ＣｐＧＯＤＮ作为一种感染危险信号，诱导机体产生天然保护性免疫反应，可用于感染性疾病的预防与治疗。
变应性哮喘是一种常见的ｎ乎吸道疾病，最重要的免疫异常是ＴＨｌ／ＴＨ２细胞比例和功能失撕，表现为Ｔ“２细胞数目增多和功能亢进，而ＴＨｌ细胞所占比例和麻答水平减弱Ｉｊ。”】。研究证明ＣｐＧＯＤＮ具有ｒ。泛的免疫调节作用，它能活化ＮＫ细胞、巨噬细胞、ＤＥ等抗原提呈细胞，使其产生ＩＬ．１２、ＩＦＮ．Ｙ，诱导抗原特异性的ＴＨｌ反应，抑制ＩＬ．４、ＩＬ．５、ＧＭ．ＣＳＦ的产生，并使Ｔｈ２向Ｔｈｌ反应转变口“”。…。由此推测ＣｐＧＤＮＡ可Ｉ｛｝于人类哮喘病的治疗。国外已有报道［３５１ＣｐＧＤＮＡ能抑制卵蛋白致敏小鼠嗜酸性粒细胞气道浸润和气道高反应性，使ＩＬ．４、ＩＬ．５产生减少并诱导ｌＦＮ．Ｙ产生。
总之。ＣｐＯＤＮＡ的出现为ＤＣ＿｝；｜ｊｙ－临床治疗肿瘤、感染性疾病、变态反应性疾病如哮喘等提供了广‘阔的前景。需要指出的是，ＣｐＣＤＮＡ序列设计涉及多个方面（ＣｐＧ模体、侧翼序列、碱基数、骨架修饰等），每一方面对其免疫活性的产生均有影响且序列具有种属特异性。如何设计高活性的ＣｐＧＯＤＮ序列以及ＣｐＧＯＤＮ对人不同亚型ＤＣ及其他免疫细胞的免瘦刺激活性、相互关系、作用机制、安全性等问题尚需进一步探索。
６
材料与方法
第一章
材料与方法
１．Ｉ材料
Ｉ，１１试剂
１）ＣｐＧＯＤＮ２００６（５?ｔｃｇｌｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔ－３。）：由上海生ｊ：生物技术服务公司合成，全链硫代磷酸化修饰，ＰＡＧＥ纯化
２）Ｆｉｃｏｌｌ－４００、Ｐｅｒｃｏｌｌ：ｐｈａｒｍａｃｉａ公司
３１ＭＴＴ：ｓｉｇｍａ公司
４）ＲＰＭｌｌ６４０培养基：美国Ｇｉｂｃｏ公司
５）胎牛血清：杭州四季青公司
６）丝裂霉素Ｃ：协和发酵工业株式会社产品
７）人Ｆ１ＴＣ．ＨＬＡ．ＤＲ单抗、人ＰＥ－ＣＤ８６单抗：Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ公司
８）Ｓ．１００蛋闩抗体：武汉博士德生物工程有限公司
９）羊抗兔ＩｇＧ一过氧化物酶：武汉博十德生物－【程有限公司
１０、ＨＥＰＥＳ：ｓｉｇｍａ公司
１１）胰蛋Ｆｊ酶ｌ；２５０：ｓｉｇｍａ公司
１．１．２细胞株
胰腺癌（ＡＳＰＣ．Ｉ）细胞株
１．Ｉ．３正常人外周血白细胞浓集绢分
由南京市红十字会中心血站提供
Ｉ．１．４主要设备
１）Ｃ０２培养箱；美国ＲＥＮＣＯ
２）酶联免疫检测仪：ＳＰＥＣＴＲＡ型，Ｕ．Ｓ．Ａ
３）流式细胞仪：ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ型．ＢＥＣＴＯＮ．Ｄ１ＣＫＳＯＮＵ．Ｓ．Ａ
４）倒置显微镜：Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ
５）Ｈ．８００透射电镜：日本日立
６）光学显微镜：ＯｌｙｍｐｕｓＪａｐａｎ
１．１．５溶液配制
１）ＣｐＧＯＤＮ稀释：５０Ｄ（Ｉ管）的ＣｐＧＯＤＮ溶丁－Ｉｍｌ注射用水（浓度为２１．４ｕｔ００１．１。），振荡混匀后加入含１０％ＦＣＳ的ＲＰＭｌｌ６４０培养液配制成所需浓度。
２）ＲＰＭｌｌ６４０培养液：１６４０干粉溶于去离子水中．依次加２５ｍＭＨｅｐｅｓ，６２．５ｍｇ青霉素，ｔ００ｍｇ链霉素，１．８９ＮａＨＣ０３，磁力搅拌器搅拌混匀，定容至１０００ｍｌ，过滤，加灭活胎牛血清使其终浓度为１０％，调ＤＨ至７．２．７．４。
３）胰蛋白酶（Ｏ．２５％）：称取胰蛋白酶Ｏ．２５９，先用Ｄ—Ｈａｎｋｓ液调成糊状，然后再用其定容至１００ｍｌ，磁力搅拌器搅拌混匀，使其完全溶解，５％ＮａＨＣ０３调ＰＨ为７．２．７．６，ｏ．２２¨Ｍ微ｉＬ滤膜过滤除菌，．２０℃保存备用。
４）ＭＴＴ（５ｍｇ．ｍｌ。）：称３０ｍｇＭＴＴ溶Ｔ６ｍｌＰＢＳ（Ｏ．０１Ｍ，ｐＨ７．４）中．磁力搅拌器搅拌３０ｒａｉｎ．ｏ．２２ｕＭ微孔滤膜过滤除凿，４＂Ｃ避光保存，有效期为２周。
５）１０×Ｄ?ｈａｎｋｓ及Ｄ—ｈａｎｋｓ液：ＮａＣＬｌ６９，ＫＣＬ０．８９，Ｎａ２ＨＰ０４．１２Ｈ２００．２６９．ＫＨ２Ｐ０４０．１２９依次溶于２００ｍｌ双蒸水中，即为１０×Ｄ。ｈａｎｋｓ液，取２０ｍｌ置于试剂瓶中待用；余下１８０ｍｌ加双蒸水至１８００ｍｌ（稀释１０倍）即为Ｄ．ｈａｎｋｓ液，分装，ｌＯ磅消毒１０分钟，
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调ＤＨ至７．２．７４，４＂Ｃ保存。
６）Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ分离液：常规配制（比重１．ｄ７７—１．０７８），０２２ｕＭ微孔滤膜过滤，４＂Ｃ避光保存备用。
１．２方法
１。２．１止常人外周血ＤＣ的分离
ＨｊＦｉｃｏｌｌ．Ｈｙｐａｑｕｅ分离液从向细胞浓集组分中获取单个核细胞（ＰＢＭＣ），洗涤，继之以不连续Ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度法离心，收集５０％Ｐｅｒｃｏｌｌ层细胞，置３７。Ｃ、５％Ｃ０２培养箱孵育２小时后，收集未贴壁细胞，洗涤，即为富含ＤＣ的细胞组分，Ｏ．４％台盼蓝检测细胞活性＞９５％。
１．２．２分离ＤＣ的鉴定与纯度检测
新鲜分离的ＤＣ细胞恳液涂片行Ｓ－１００蛋白免疫细胞化学染色，同时按常规制作透射电镜标本：Ｓ一１００蛋白染色阳性细胞率作ＤＣ组分纯度检测。
ｌ２，２．１ｓ．１００蛋白免疫细胞化学染色（ＳＰ法）
１）１３Ｈ性、阴性对照组人鼠颌下腺石蜡切片经二甲苯及逐级乙醇脱蜡；
２）细胞涂片与大鼠颌卜Ｉ腺石蜡切片用Ｏ．０１ＭＰＢＳ洗５分钟×３次：
３）ｏ．０３％Ｈ２０２一甲醇液室温孵育３０分钟．消除内源性过氧化物酶：
４）０．ＯｌＭＰＢＳ洗５分钟×３次；
５）２５％胎牛血清．ＰＢＳ稀释液封闭２０分钟；
６）吸去稀释液，不洗；
７）滴加１：２００稀释一抗，４＂Ｃ过夜，阴性对照组以ＰＢＳ液代替一抗；
８）Ｏ．０１ＭＰＢＳ洗５分钟Ｘ３次：
９）滴加过氧化物酶标记二抗（１：２００），室温３０分钟：
１０）０．０１ＭＰＢＳ洗５分钟×３次：
１１）滴加新鲜配制的ＤＡＢ显色液，室温下，显微镜下观察，山现显色反应时终止：１２）自来永冲洗，苏木索复染；梯度酒精逐级脱水；二甲苯透明；封片。
１．２．２．２Ｓ．１００蛋白染色阳性细胞率计算
取三张涂片．每片商倍视野下随机计数２００个细胞，计算阳性率，以均值表示。１．２，３ＣｐＧＯＤＮ刺激ＤＣ条件的筛选
采用析因实验设计（表１），分析培养体系中ＣｐＧＯＤＮ浓度、ＤＣ浓度以及培养时间对ＤＣ生长的影响，筛选最佳刺激条件。
表ｌ影响ＤＣ生长的各因素及水平
各组按上述设计接种于９６孔培养板，另设空白对照组，每组设３个复孔，终体积２００
ｕｌ，置３７℃、５％Ｃ０２温箱孵育，每日倒置镜卜观察。此外＋在不同培养时间结束时每孔加入５ｍｇ．ｍｌ’１的ＭＴＴ液２０ｕｌ，再培养４小时后，离心去上清，每孔加二甲基亚砜１５０ｕ１，振荡１０分钟，酶标仪检测彳｜９０值，计算存活率：存活率（％）＝实验组爿值／对照组爿值（存活率＞１具有刖性意义），采用ＳＡＳ统计软件进行多因素方差分析，观察ＣｐＧＯＤＮ对Ｄｃ生＆的影响及筛选最佳刺激条件。
８
村料与方浊
１．２．４ＤＣ表面分子检测及形态观察
ＣｐＧＯＤＮ最佳条件刺激组ＤＣ和未刺激纽ＤＣ与入ＦＩＴＣ－ＨＬＡ．ＤＲ、ＰＥ．ＣＤ８６单抗在４℃反应３０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗３次后，流式细胞仪检测表面抗原的表达，采用两样本ｕ检验进彳了＿统计学分析；同时收集上述两组ＤＣ按常规制作透射电镜标本，观察其形态结构，井比较之间的差异。
１．２．５同种异体混合淋巴细胞反应（ＭＬＲ）
用Ｆｉｃｏｌｌ．Ｈｙｐａｑｕｅ分离液从自细胞浓集组分中获取单个核细胞（ＰＢＭＣ），洗涤，｝｛ｊ含１０％ＦＣＳ的ＲＰＭｌｌ６４０培养液悬浮，以３×１０６孔。接种２４孔板，置３７℃、５％Ｃ０２温箱孵育２小时．轻轻吸出未黏附的细胞悬掖．＿Ｉ｛ｊ做同种异体Ｔ淋巴细胞。ＣｐＧＯＤＮ最佳条｛，｝＝刺激组和未刺激组ＤＣ用培养液悬浮，加入终浓度为２５ｒａｇ．Ｉ－１丝裂霉素Ｃ灭活后，分别以２×１０４、５×１０３、１×１０３孔。接种９６孔培养板，再加入新鲜分离的同种异体Ｔ淋巴细胞１×１０５孔～，另没完全培养基代替ＤＣ组（空白对照组），每组各设３个复孔，终体积２００ｌａＩ，采用ＭＴＴ法检测并计算出各组别刺激指数（ＳＩ）：ＳＩ＝实验组爿值，对照组一值，利用Ｅｘｃｅｌ软件分析ＣｐＧＯＤＮ刺激斤ＤＣ对Ｔ细胞的激发作＿【｝ｊ。
１．２．６抗肿瘤实验
采用析因实验设计（表２），探讨ＣｐＧＯＤＮ对ＤＣ调节丁细胞杀伤肿瘤活性的影响。
表２析因实验的因素及水平
丁９６孔培养板中加入胰腺癌（ＡＳＰＣ－１）细胞（４×１０３孔’１），再按实验设计逐加ＣｐＧＯＤＮ最佳条件刺激组和未刺激组ＤＣ及Ｔ细胞，另设单纯效应细胞组和单纯靶细胞组，每纽设３个复孔。终体积２００ｐｌ，３７＂（２、５％Ｃ０２培养箱孵育７２ｈ。ＭＴＴ法检测各孔光吸收值（』５７０），计算杀伤活性：杀伤活性（％）＝１１．（实验组Ａ值－单纯效应细胞组Ａ值）／单纯靶细胞组Ａ值１ｘ１００。采用ＳＡＳ统计软件进行多因素方差分析，比较各因素不同水平的效应。
１．２．７ＣｐＧＯＤＮ对肿瘤细胞上清培养ＤＣ的作用
１．２．７．１ＡＳＰＣ．Ｉ细胞培养上清的制备
收集对数生长期的ＡＳＰ（；．１细胞培养２４ｈ．４８ｈ后的上清，微孔滤膜（Ｏ．２２ｐＭ）过滤，．７０℃冻存备用。
１．２．７．２ＡＳＰＣ－Ｉ细胞培养上清对ＤＣ生Ｋ及表犁的影响
按本室常规从人外周皿分离ＤＣ，以６Ｘ１０４孔‘１接种９６孔扳，分三组加入ＡＳＰＣ。Ｉ培养上清液，使其终浓度分别为含１０％、３０％、５０％的肿瘤细胞培养上清，空白对照组加等量ＲＰＭｌｌ６４０培养液，每组设３个复孔，终体积２００ｕｌ，分别丁培养第１天、第３天、第５天，利用ＭＴＴ法检测各孔光吸收值（一４９０），计算细胞存活率：存活率（％）＝实验组Ａ值，对照组爿值，观察肿瘤细胞培养上清对ＤＣ生长的影响并筛选条件组进行ＤＣ细胞表型分析。
１．２．７．３ＣｐＧＯＤＮ对肿瘤细胞上清培养ＤＣ的调节
实验分组：（１）１１１ｍ０１．１－ｌＣｐＧＯＤＮ组：（２）含３０％ＡＳＰＣ—Ｉ培养上清液组｛（３）１ｕｍ０１．１－’ＣｐＧＯＤＮ＋含３０％ＡＳＰＣ．Ｉ培养上清液组，３组分别与６Ｘ１０４孔“的ＤＣ共同加入９６｝Ｌ扳、２４孔板，另设空白对照组．每组设３个复孔，终体积分别为２００ｕＩ、２ｍｌ，３７℃、
９
尔南大学硕｝学位论文
５％Ｃ０２温箱孵育７２ｈ。ＭＴＴ法检测９６孔板备组光吸收值（爿４９０）．计算存活率：存活率（％）＝实验组４值，空白对照组Ａ值；同时收集２４孔板各组ＤＣ，流式细胞仪检测细胞袭型。
１２．７４统计学分析
川Ｅｘｃｅｌ软件和Ｕ检验进行俩样本均数分析：以ｐ＜ｏ．０５为差异具有显著性统计学意义。
０
结果
第二章
结果
２．１初分离ＤＣ的纯度鉴定
Ｓ－１００蛋白染色示，ＤＣ为Ｓ．１００蛋白阳性细胞，其胞体内呈现弥散或颗粒状漩棕黄色Ｓ－１００蛋白阳性反应物（见照片Ｉ．４）；由表３可见，初分离ＤＣ的Ｓ－１００蛋白染色平均阳性率为９０．８％。此外，透射电镜观察，细胞体积大，核不规则，表面存在大量不规则突起，胞质内含较多线粒体，粗面内质网甚少，见大硅空泡，可判定此细胞为ＤＣ（见照片５）。表３Ｓ－１００蛋白染色阳性率（每片计２００个细胞）
２．２析因实验结果及ＣｐＧＯＤＮ刺激ＤＣ最佳条件
根据ＳＡＳ软件统计分析所得三因素不同水平方差分析结果及趋势图（见表４－５，国１）。结果显示，不同浓度ＣｐＧＯＤＮ对ＤＣ生长产生明显效应（ｐ＜０．０１），且与Ｄｃ浓度具有交且作用（ｐ＜０．０１）。另外如图２所示，在ＤＣ体外培养中加入不同浓度ＣｐＧＯＤＮ处理２４ｈ、３６ｈ、７２ｈ后，０．０１ｕｍ０１．１．１ＣｐＧＯＤＮ对Ｄｃ生长影响不明显；ｌｕｍ０１．１～、２ｕｍ０１．１。ＣｐＧＯＤＮ可提高ＤＣ的存活能力，促进其生长；而４ｕｍ０１．一７ｕｍ０１．１。ＣｐＧＯＤＮ对ＤＣ生长则起抑制作用。由此可见．ＣｐＧＯＤＮ在诱导ＤＣ生长方面具有一定的剂量依赖性。ｃｐＧＯＤＮ刺激ＤＣ的晟佳条件是ｌｕｔ００１．一ＣｐＧＯＤＮ、６Ｘｌ矿孔。的ＤＣ、培养３６ｈ（图１）。
表４不同组合条件下ＤＣ的生Ｋ情况
媚畚舔十｝
实验号—＿ｉ５ｉ蔽聂了———｛翥鬲菁｝——ｔｌｉｉ再元；；丁ｉ瓦匿广存活率（％）ｌ１１１０．８６１
２ｌ１２０．９４６
３ｌ１３０．７７０
２２２
．０９３
．１５７
．９７２
．９７２
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东南大学硕十学位论文
２．３ＣｐＧＯＤＮ刺激ＤＣ的形态观察及表型分析
２．３．１ＣｐＧＯＤＮ刺激ＤＣ的形态结构
ＣｐＧＯＤＮ刺激ＤＣ的过程中，每日倒置镜下观察。培养的第一天细胞簇开始形成，并且逐渐增火；第二、三天开始解聚，Ｄｃ呈悬浮散在生长．但仍有一些较小的细胞簇存在，
细胞体积人小不一。未刺激组ＤＣ与ｃｐＧＯＤＮ最佳条件刺激组ＤＣ相比，细胞簇小而少，且细胞体积也小（见照片６．７）。此外．透射电镜观察显示（见照片８）．未刺激组ＤＣ表面呈现突起不明显，胞质内含较多线粒体。粗面内质网甚少，见大量空泡；而ＣｐＧＯＤＮ晟佳条件刺激组ＤＣ表面的突起细、长且规则，粗面内质网清晰可见，空泡甚少。
２．３．２ＣｐＧＯＤＮ刺激ＤＣ的表型
ＦＣＭ分析显示（表６，图３），ＣｐＧＯＤＮ最佳条件刺激纽ＤＣ细胞表面ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８６的平均荧光强度分别为１０２．８２、７９．７８：未刺激组为５２．２２、５２．０９，ＣｐＧＯＤＮ最佳条什刺激组ＤＣ表面ＨＬＡ．ＤＲ、ＣＤ８６的表达强度明显高丁未刺激组，具有显著统计学意义（Ｐ＜０．０１）。
２
结黑
与未刺激组ＤＣ相比：１）Ｐ＜０．叭
２．４ＣｐＧＯＤＮ对ＤＣ免疫刺激活性的影响
结采显示（表７、图４），ＣｐＧＯＤＮ最佳条件刺激组ＤＣ可明显刺激Ｔ细胞增殖，与未刺激组相比差异有显著性，且ＤＣ浓度越高．刺激能力越强。
表７ＣｐＧＯＤＮ对ＤＣ免疫刺激活性的影响（ＳＩ，ｉ＋－－ｓ，ｎ＝３）
与未刺激ＤＣ组相比：Ｉ）Ｐ＜０．０５；２）Ｐ＜０．０ｌ
２．５ＣｐＧＯＤＮ对ＤＣ调节Ｔ细胞杀伤活性的影响
乖ｊ用ＳＡＳ统计软件对敖据进行处理得到析因实验结果及趋势图（表８－９，图５）。结果
显示，ＣｐＯＯＤＮ明显增强ＤＣ调节Ｔ细胞杀伤肿瘤的活性（Ｐ＜０．０１），且与ＤＣ浓度具有交互作用（ｐ＜０．０５）：而不同浓度Ｉ）Ｃ、不同效靶比之间对增强ＤＣ抗肿瘤活性无明显著异
（．Ｐ＞０，０５）。由图５可见ＣｐＧＯＤＮ增强ＤＣ调节Ｔ细胞杀伤活性的最佳组合条件为：ＤＣ
数目１ｘ１０４孔一、效靶比１００：Ｉ、ＣｐＧＯＤＮ＝１ｕｔ００１．１～。
表８ＣｐＧＯＤＮ影响ＤＣ调节Ｔ细胞杀伤活性的结果
表９ＣｐＧＯＤＮ影响ＤＣ调节Ｔ细胞杀伤活性的方差分析表
ＡＢ０．０７２０９２２５
０．０７３４４１００
０．０７２０９２２５
０．０７３４４１００
２．３４
２．３８
０．１６４６
０．１６１２
第十四章常见体表肿瘤 一、概念 肿瘤：细胞异常增生与分化所形成的新生物，不受机体控制和理调节良性肿瘤：生长缓慢，不扩散恶性肿瘤：生长迅速、可浸润和破坏邻近组织，可转移 癌（cancer）:来源于上皮组织的恶性肿瘤 （Carcinoma）:有时泛指恶性肿瘤 其它常见的恶性肿瘤有肉瘤、淋巴肉瘤、白血病、骨髓瘤等 二、常见致癌因素 1、遗传因素 2、家族史 染色体异常 3、环境因素 4、吸烟 5、其它化学物质： 6、过度暴露：电离辐射阳光的紫外线 7、膳食：低膳食纤维、高脂、熏腌食品、饮酒 8地理因素 9、病毒、寄生虫等 10、免疫异常 二、肿瘤生长方式 良性肿瘤：生长缓慢，膨胀性生长，有完整包膜 恶性肿瘤：生长快，浸润性生长，肿瘤沿组织间隙、神经纤维间隙或毛细淋巴管扩展，境界不清 四、肿瘤的扩散 直接曼延 转移：经血管、淋巴管或体腔，被带到它处生长 淋巴道转移：瀑布式转移、跳跃式转移 血道转移种植性转移 五、肿瘤分期 TNM^ 期 T :原发肿瘤 N :区域淋巴结 M远处转移配合数字0~4 0代表无，1代表小，4代表大
宫颈癌：巴氏（Pap）阴道细胞学检查直肠结肠癌：0B直肠检查、结肠镜乳腺癌：乳腺自检、乳腺体检、乳腺X线前列腺癌：直肠检查和前列腺特异抗原宫颈、子宫、卵巢癌：盆腔检查 九、预防 一级预防二级预防三级预防 病因学预防早发现、早诊断、 早治疗 提高生活质量、 生存期 去除环境中致癌剂、改善不良生活方式、饮食习惯普查、咼危人群监测， 提高早期诊断能力 合理综合治 疗、康复治 疗、止痛 十、治疗 综合治疗：：合理地有计划地综合运用现有治疗手段，提高生存率，改善生活质量 （一）手术 根治手术：包括原发癌所在器官的部分或全部，连同周围正常组织和区域淋巴结整块切除 姑息或减症手术：减轻症状,改善生活质量 （二）化疗 1化疗可治愈的肿瘤（治愈率〉30% 淋巴瘤、精原细胞瘤、绒毛膜上皮癌、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、急性淋巴细胞白血病 2、配合手术/放疗可提高治愈率的肿瘤 小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、乳腺癌、大肠癌
癌细胞的十大特征 癌细胞十大特征释义 众所周知，癌细胞几乎肆虐横行在人体的每一个部位，从大脑到各个器官，从表皮到骨骼，我们曾经在进化中得到的、在生物界引以为豪的人体，在癌细胞肆虐下往往显得那么脆弱，有时似乎变得不堪一击。 癌细胞并非入侵的外族，它们与组成人体各个器官的正常细胞同文同种，但不同的是癌细 胞基因结构和功能的变化赋予了它们十种特殊“器物”，从而使得它们能够在人体内纵横 捭阖，所向披靡。 1.自给自足生长信号（Self-Sufficiency in Growth Signals）， 2.抗生长信号的不敏感（Insensitivity to Antigrowth Signals）， 3.抵抗细胞死亡(Resisting Cell Death)， 4.潜力无限的复制能力(Limitless Replicative Potential)， 5.持续的血管生成(Sustained Angiogenesis)， 6.组织浸润和转移(Tissue Invasion and Metastasis)， 7.避免免疫摧毁(Avoiding Immune Destruction)， 8.促进肿瘤的炎症（Tumor Promotion Inflammation）， 9.细胞能量异常（Deregulating Cellular Energetics）， 10.基因组不稳定和突变（Genome Instability and Mutation） 其一：生长信号的自给自足 在人体这个迄今为止最为复杂的系统中，倘若一个细胞想要改变其现有状态（如从静止到 生长分化状态的改变），必须接收到一系列相关指令，这一过程才能进行，就像军队中的 令行禁止一样。就这样，数以万亿计的细胞各司其职，在和谐统一的秩序中维系着人体的 健康。到目前为止，科学家在正常细胞中还没有发现一例例外。 这些改变细胞状态的指令，生物学上称之为信号分子，它们多是外源的，即由另一类细胞 产生，这也是人体保持自我平衡的重要机制。信号分子通过与靶细胞上相应指令接收器 （受体）相结合，细胞状态改变这一过程得以实施。 在这方面，癌细胞是截然不同的，它们通过种种“奇巧淫技”把自己对外源生长信号的依 赖降到了最低限度。首先癌细胞们获得自己发号施令的能力，也就是说它们可以自行其是 的合成生长分化所需的生长信号，无需依赖外源性信号。比如科学家们发现在神经胶母细 胞瘤和恶性肉瘤中的癌细胞就分别获得了合成PDGF（血小板源生长因子）和TGFα（肿瘤 生长因子α）的能力。其次癌细胞还会大量表达其表面的信号接收器，这样就可以富集周 围微环境中的生长信号从而进入生长分化状态（注：正常情况下，未经富集浓度的生长信 号不足以触发生长分化）。此外癌细胞还会改造它周围的一些正常细胞成为生长信号的生 产工厂供其使用，并招募一些帮凶细胞，如成纤维细胞和内皮细胞来帮助它们生长分化。 其二：对抑制生长信号不敏感 平衡似乎是人体系统中最重要的关键词。人体内除了有生长信号外，还存在着生长抑制信号。在细胞分裂的不同阶段，都有一些分子如同看家护院的“爱犬”一般时刻检测这些细 胞的“身体状况”和周边环境，根据情况来决定细胞的未来的命运：或是继续生长分化， 或是仍然处于静止期，抑或丧失生长分化能力进入有丝分裂的后期。这样正常细胞才能保 持动态平衡的状态，进行有序的生长分化。对于癌细胞来说，如果想要扩大自己的地盘， 不断地生长分化，必须逃避这些“爱犬”分子的监控。他们主要策略就是通过基因突变使 得这些“爱犬”分子失去活性，从而实现对抑制生长信号不敏感的目的。 其三：规避细胞凋亡 逃避细胞凋亡几乎是所有类型的癌细胞都具有的能力。负责细胞凋亡的信号分子大体上可 以分为两类：一类如同上文所述的“爱犬”分子，如一种名叫p53的蛋白就是其中最重要 的成员之一；另一类则负责执行细胞凋亡。前者监控细胞内外环境，一旦发现不正常情况 足以触发细胞凋亡，即指挥后者执行。目前科学研究证实，DNA损伤，信号分子的失衡以 及机体缺氧都有可能触发细胞凋亡。
Cancer杂志年终大盘点——2015肿瘤学十大发现 2015年年尾，美国肿瘤学会官方杂志Cancer 对过去一年肿瘤领域预防、诊断和治疗等方面的重大研究做了大盘点。下面，请随我们一起看看，2015年有哪些发现登上了cancer的头条吧！ 1、肿瘤疫苗：未来预防结肠癌的“利器”尽管有了结肠镜等筛查手段，仍然有相当一部分患者（尤其是高危因素患者）死于结肠癌。为了加强结肠癌的预防措施，来自华盛顿大学的Mary (Nora) Disis博士正试图通过将特异性基因导入疫苗激发机体的免疫系统从而预防结肠癌的发生发展。目前Disis博士和她的团队已经研究了上百种可作为结肠癌疫苗靶点的基因，下一步的目标就是明确哪一种基因是肿瘤发生发展过程的关键信号，并且能够被机体的免疫系统较好地识别。 在美国肿瘤学会研究基金会的帮助下，该研究已经进入了筛选阶段，Disis博士认为：“我们预计要花费3年时间对所有的基因疫苗在小鼠体内的有效性进行检测，筛选出最有的肿瘤疫苗，并且预计再花一年的时间进行扩大检测以保证它在人体内的安全性。” 2、中医耳压法：乳腺癌患者最简便的疼痛减轻疗法 疼痛一直是很多癌症患者的梦魇，超过40%的乳腺癌女性患
者称，术后两三年内一直受疼痛困难，严重影响她们的生活质量。Pittsburgh大学的Chao Hsing Yeh教授2015年9月18号在Cancer Nursing发表一篇文章称，一天三次按压贴在耳朵上的带小种子的敷贴可以有效地减轻乳腺癌患者的 疼痛和疲劳。Yeh教授将这种疗法称为“耳压法”（APA）.这种方法类似于中医的针灸，理论也来源于传统中医理论。中医认为人体是一个统一的整体，通过一种看不见的能量，也称之为“气”将内外器官连接起来。耳部的某些特殊穴位与大脑是相通的，刺激这些穴位可以激发脑内神经反应从而减轻疼痛，而且一些研究也通过fMRI找到了耳部某些穴位与大脑神经元活动的关联。 APA疗法简单易行，第一次时需要医生将一种叫vacarria的植物种子贴在特殊部位（这些敷贴可以保持4周左右），并教患者按摩手法，一天三次，一次九分钟，以后患者可以自己在家中操作。Yeh教授在31例一直受疼痛困扰的中年乳腺癌患者中进行了试验，这些患者共接受APA疗法共4周。Yeh教授称7天后接受APA疗法的患者疼痛减轻了51%，4周之后，她们的疼痛程度减轻了71%，而且患者的疲劳感和睡眠都有所改善。 “APA疗法不仅是一种简单而廉价的疗法，而且没有药物带来的副作用，是一种比较适合乳腺癌患者的疼痛疗法。”目前，Yeh教授正在计划开展更大规模的临床试验验证APA
1. 癌症是严重威胁人类健康的疾病之一。引起细胞癌变的内在因素是（） A.细胞中酪氨酸酶活性降低 B.致癌因子激活原癌基因 C.长期受到电离辐射或X射线照射 D.霉变或熏制食物中所含有的致癌物质 2．下列关于细胞分裂、分化、衰老和死亡的叙述，正确的是（） A．细胞分化过程各种的遗传物质没有改变，但导致细胞的形态和功能各不相同 B．个体发育过程中细胞的分裂、分化、和死亡对于生物体都是有积极意义的 C．细胞分裂和细胞分化只存在于受精卵到成体的发育过程中 D．多细胞生物细胞的衰老与机体的衰老总是同步进行的 3．骨髓移植是目前治疗白血病的有效方法。下列有关叙述，不正确的是( ) A.化学致癌因子和物理致癌因子都可以诱发白血病 B.输入患者体内的异体骨髓相当于抗原物质 C.骨髓捐献者提供的有效成分是造血干细胞 D.癌细胞可以进行正常的细胞分裂和分化 4．白血病是一种常见的造血组织肿瘤性疾病。该病是由于造血干细胞中原癌基因发生突变，使之变成了不受机体控制的、连续进行分裂的恶性增殖细胞。而在正常的情况下，人体血液中的红细胞、白细胞、血小板都是通过造血干细胞形成的。正常的造血干细胞通过下列哪些过程完成对血细胞的补充？ ①细胞增殖②细胞分化③细胞凋亡 A.① B.② C. ①② D. ①②③ 5．为了搞清食管癌与长期食用被亚硝胺污染的食物的关系，可选用的方法是 ①利用实验动物进行长期模拟观察；②随机抽样调查吸烟和食用过热食物人群的发病率；③对患病高发区与低发区食物中亚硝胺含量进行对比；④在患者家系中调查统计发病率。A．②③ B．①③ C．①④ D．②④6．连续分裂的动物体细胞的生长即体积增大，发生在细胞周期的 A 分裂间期 B 分裂前期 C 分裂中期 D 分裂后期 7．细胞分化过程中，一般不会发生改变的是 A．蛋白质种类 B．染色体数目 C．细胞的功能 D．基因表达的数目8．细胞衰老是一种正常的生命现象。人的细胞在衰老过程中不会出现的变化是： A．细胞内有些酶活性降低 B．细胞内色素减少 C．细胞内水分减少 D．细胞内呼吸速度减慢 9．下列人体细胞中分化程度最低的是： A．胚胎干细胞 B．造血干细胞 C．胰腺细胞 D．肌肉细胞 10．下列有关细胞凋亡、细胞坏死的说法错误的是 A．人在胚胎时期要经历尾的消失、指间细胞死亡，原因是遗传物质决定的程序性调控 B．细胞的自动更新、被病原体感染的细胞清除是通过细胞凋亡完成的 C．细胞坏死是由于细胞代谢活动受损或中断引起的，如蛋白质合成减慢 D．坏死组织去除伤害因素后能形成正常组织 11．细胞分化、衰老、癌变和凋亡的共同表现是 A．都有遗传物质的改变 B．细胞内酶的活性都降低 C．都有细胞形态、结构和功能上的变化 D．细胞核大小都始终不变 12．（08江苏高考）下列细胞中，可能已发生癌变的是 A．细胞膜上糖蛋白减少的细胞 B．细胞核增大的细胞 C．自由水含量减少的细胞 D．被细菌侵染的细胞 13、(08海南高考)下列有关细胞癌变的叙述，错误的是 A. 细胞癌变后细胞膜表面糖蛋白减少 B. 癌症病人染色体上无抑癌基因 C. 经常食用腌熏制品易导致细胞的癌变 D.癌症的发生与个人的身心状况有关 14．(多选)下列关于细胞增殖、分化、衰老、凋亡、癌变的叙述合理的是 A．细胞总体的衰老导致个体的衰老,但细胞衰老不等同于有机体的衰老 B．体内正常细胞的寿命受分裂次数的限制,细胞增殖受环境影响 C．细胞分化是基因选择性表达的结果,细胞全能性的实现与分化无关 D．不分化与脱分化都可能产生癌细胞,促进细胞凋亡可以治疗癌症
肿瘤的发生与发展 肿瘤的定义：肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致克隆性异常增生而形成的新生物，常表现为局部肿块。 过程：局部组织的细胞—基因突变—细胞异常增生—新生物—局部肿块 发病机制：肿瘤的发病是一个多因素、多步骤参与的过程。 恶性肿瘤的病因（尚未完全了解）， 1.环境因素：化学，物理，生物因素 2.机体因素 化学致癌 化学致癌物：目前认为凡接触引起人或动物形成肿瘤的化学物质，称为化学致癌物（chemical carcinogen）。目前发现对动物有致癌作用的化学物质已达2000余种，其中有些可能和人类肿瘤的形成有关 分类：1。作用分式：直接致癌物，间接致癌物，促癌物 2.与肿瘤的关系：肯定致癌物，可疑致癌物，潜在致癌物 ? 1.直接致癌物：进入机体后与细胞直接作用，诱导细胞癌变的化学物质。 ? 2.间接致癌物：进入体内经微粒体氧化酶活化，变成具有致癌作用的化学物质 ? 3.促癌物：能促进其他致癌物诱发肿瘤形成的化学物质 ? 4.肯定致癌物（defined carcinogen）经流行病学调查确定，临床医师和科学工 作者都承认对人和动物有致癌作用，其致癌作用具有剂量反应关系的化学致癌物。 ? 5.可疑致癌物（suspected carcinogen）具有体外转化能力，而且接触时间和发 病率相关，动物致癌实验阳性，结果不恒定，且缺乏流行病学方面的证据。 ? 6.潜在致癌物（potential carcinogen）是在动物实验中可获得某些阳性结果， 但在人群中尚无资料证明对人具有致癌性的物质。 １、化学致癌物的作用点：为细胞的癌基因和抑癌基因 ２、作用：使癌基因激活，抑癌基因失活。 １、累积作用:(summation effect) 是指两种或多种致癌物同时或相继作用于机体，其复合效应等于单独作用之和２、协同作用:(synergistiic effect) 机体同时暴露于几种致癌物中其致癌作用高于个单独致癌物作用之和 常见的化学致癌物：多环芳香烃类，芳香胺与偶氮染料，亚硝胺类 化学致癌例子。苯胺染料：膀胱癌，烟草：肺癌，黄曲霉素：肝癌 物理致癌 1.电离辐射是最主要的物理性致癌因素 2.放射性同位素：镭、铀、氡等放射性同位素 3.紫外线：皮肤癌，着色性干皮病 病毒致癌 1/3为DNA病毒，2/3为RNA病毒 ?一、乳头状瘤病毒与宫颈癌（HPV） ?二、乙型肝炎病毒与肝癌（HBV） ?三、EB病毒与鼻咽癌和Burkit肉瘤（EBV） ?四、HTL V与人类T细胞白血病（HTL V） 致瘤性DNA病毒
癌细胞的十大特征 2000年，Douglas Hanahan和Robert A. Weinberg在Cell上发表文章：The Hallmarks of Cancer，这篇综述性文章介绍了肿瘤细胞的六大基本特征：自给自足生长信号；抗生长信号的不敏感；抵抗细胞死亡；潜力无限的复制能力；持续的血管生成；组织浸润和转移。这篇论文被称为肿瘤学研究的经典论文，到目前为止，已经被引用了上万次。 在2011年3月出版的Cell杂志上，两位教授又发表了一篇升级版综述：Hallmarks of Cancer: The Next Generation，这篇论文长达29页，简述了最近10年肿瘤学中的热点和进展，在原有的六大特征的基础上，新增了四大特征，包括避免免疫摧毁、促进肿瘤的炎症、细胞能量异常和基因组不稳定和突变。
将原有的肿瘤细胞六大特征扩增到了十个，这十个特征分别是： 1.自给自足生长信号（Self-Sufficiency in Growth Signals）， 2.抗生长信号的不敏感（Insensitivity to Antigrowth Signals）， 3.抵抗细胞死亡(Resisting Cell Death)， 4.潜力无限的复制能力(Limitless Replicative Potential)， 5.持续的血管生成(Sustained Angiogenesis)， 6.组织浸润和转移(Tissue Invasion and Metastasis)， 7.避免免疫摧毁(Avoiding Immune Destruction)， 8.促进肿瘤的炎症（Tumor Promotion Inflammation），
一肿瘤的转移途径： 1 淋巴道转移：（癌多见）。原发癌的细胞随淋巴引流，由近及远转移到各级淋巴结，也可能超级转移；或因癌阻碍顺行的淋巴引流而发生逆向转移。转移癌在淋巴结发展时，淋巴结肿大且变硬，起初尚可活动，癌侵越包膜后趋向固定，转移癌阻碍局部组 织淋巴引流，可能引起皮肤、皮下或肢体的淋巴水肿；如：乳腺癌同侧腋窝淋巴结；肺癌肺门、支气管旁淋巴结；鼻咽癌同侧颈淋巴结。 2 血道转移：癌细胞进入血管随血流转移至远隔部位如肺、肝、骨、脑等处，形成继 发性肿瘤；如：瘤细胞静脉肺和肝等（最多见），形成边缘整齐、散在、多发的球形结节，中央常发生坏死，近脏器表面形成“癌脐”。 3种植性转移：内脏器官的肿瘤，侵犯浆膜后，瘤细胞脱落入体腔，种植在浆膜面 上。如：肺癌胸膜腔；消化道癌或卵巢癌腹膜腔。 形态：浆膜增厚，表面癌结，血性积液，脱落细胞学检查可见癌细胞。 4.直接转移：随着肿瘤体积不断增大，肿瘤细胞可沿周围正常组织的薄弱处，直接延伸，侵入并破坏邻近组织或器官。如：直肠癌前列腺、膀胱、子宫及阴道壁等。 二此例的转移方式： 1.胃卵巢：种植性转移，胃癌浸透到脏器外表面时，随着呼吸或肠蠕动等相应的摩擦，可脱落到体腔继续生长 2.胃、肝、肺淋巴结：淋巴道转移，肿瘤细胞侵入淋巴管后，随淋巴液转移到淋巴结，在淋巴结内生长形成转移瘤，淋巴结肿大且变硬 3.胃肺、肝脏：血道转移，肿瘤细胞侵入血管后，随血流转移到全身各处称血道转移。侵入人体静脉系统的肿瘤细胞，先转移到肺，再经心脏扩散到全身各脏器。消化 道的恶性肿瘤常入侵门静脉系统转移到肝脏。 三 (1)阻塞和压迫：肿瘤的阻塞压迫发展迅速，程度也高，如肝肿大可以压迫神经；淋巴结肿大变硬，淋巴回流受阻。 (2)破坏所在器官的结构和功能：如肝癌由于肝细胞破坏和肝内胆管阻塞，可引起全身性黄疸。 (3)侵袭破坏邻近器官：如胃癌可穿胃壁，侵犯胃周围的器官。
细胞分化、衰老、凋亡和癌变知识点总结 知识点梳理 一、细胞的分化 1、概念：在个体发育中，由_____________________增殖产生的后代，在_________、________ 和_______________ 上发生_______________的过程。 2、意义：生物界普遍存在的生命现象，是_______________基础。细胞分化使多细胞生物体 中的细胞趋向_________，有利于提高_____________________。 3、分化的实质：_______________________________________________________________。 二、细胞的全能性 1、概念：已经分化的细胞，仍然具有发育成_______________的能力。 2、生物体细胞具备全能性的原因：生物体的每个细胞都包含有该物种所特有的 _______________，都有发育成完整个体所必需的_______________。 三、细胞的衰老 1、个体衰老与细胞衰老的关系：个体衰老的过程也是组成个体的_______________的过程。 2、细胞衰老的特征：1)细胞内的水分减少，细胞萎缩，新陈代谢速率减慢。 2)细胞内多种酶的活性降低 3)细胞内的色素会随着衰老而逐渐积累，它们会妨碍细胞内物质的交流 和传递。 4)细胞内呼吸速率减慢，细胞核的体积增大，核膜内折，染色质收缩、 染色加深。 5)细胞膜通透性改变，使物质运输功能降低。 四、细胞的凋亡 指由________所决定的细胞_______________的过程。也称_______________。对于多细胞生物体完成正常发育，维持内部环境的稳定，以及抵御外界各种因素的干扰都起着非常关键的作用。 五、细胞的癌变 1、癌细胞：有的细胞受到__________的作用，细胞中__________发生变化，就变成不受机体 控制的、连续进行分裂__________细胞。 2、癌细胞的特征：1) _____________________；2) _____________________；3) _____________________，由于细胞膜上糖蛋白等物质减少，使得癌细胞彼此之间的黏着性显着降低，容易在体内分散和转移。 3、致癌因子：______________、______________、______________。 经典例题 1、(2009·吉林白山高三模拟)下列关于细胞分化的说法错误的是( ) A．细胞分化与生物发育密切相关 B．细胞分化是细胞在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程 C．细胞分化仅发生在胚胎时期 D．细胞分化是生物界中普遍存在的一种生命现象 解析：本题考查细胞的分化问题，属于基本概念题。细胞分化是生物界中普遍存在的一种生命现象，是指个体发育中相同细胞的后代在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。它是一种持久性变化，发生在生物体的整个生命进程中，但是在胚胎时期达到最大限度。因此选择C。答案：C
.肿瘤的分型、分级和分期 由于诸多因素的影响，全球恶性肿瘤发病率呈现持续升高态势，据推测到2020年前，全球恶性肿瘤发病率将增加50%，不仅如此，恶性肿瘤的死亡人数也在全球迅猛上升[1]，而在我国等发展中国家，这一趋势将更为明显，并具有显著的年轻化趋势。因此，加强恶性肿瘤的防治研究，准确、客观评价肿瘤生物学行为和预后、制定治疗方案显得更为迫切。肿瘤的分型（classification）、分级（grading）和分期（staging）是目前评价肿瘤生物学行为和诊断的最重要的三项指标，其中分级和分期主要用于恶性肿瘤生物学行为和预后的评估。近数十年来，得益于生命科学和医学技术的突破性进展，肿瘤个体化治疗相关靶标的检测及包括靶向治疗在内的个体化治疗药物的临床应用，不仅在很大程度上提高了早期肿瘤的检出率，也明显改善了许多肿瘤的预后。传统肿瘤分型、分级和分期的临床价值和意义也随之产生不同程度的变化。本文拟深入分析肿瘤的分型、分级和分期的生物学依据及临床价值，以期为肿瘤的个体化治疗提供更为精确的分子生物学信息、指导个体化治疗方案的制定和疗效监测。 一、恶性肿瘤的病理分类（分型） 尽管，关于肿瘤起源的干细胞理论和去分化理论的争论仍在持续，但是，机体各器官和组织、细胞均可发生肿瘤的事实却不可否认。肿瘤细胞与其来源组织的相似或接近于正常组织的程度是肿瘤病理
学分类（分型）的重要诊断依据，例如，角化型鳞癌出现不成程度的角化、腺癌具有分泌功能、黑色素瘤能够合成黑色素、滑膜肉瘤具有双向分化特征等等。因此，肿瘤的病理学分型是最能反映肿瘤来源组织细胞的生物学行为和形态学特征的重要参数。不同组织类型的肿瘤具有不同的生物学行为和侵袭转移能力，例如，来源于消化道的粘液性癌粘液性癌（印戒细胞癌或粘液癌）较管状腺癌更易于发生淋巴结转移、预后更差，而乳腺粘液癌预后良好。而从肿瘤细胞分化层面讲，低分化肿瘤较高分化肿瘤具有更强的侵袭转移能力、恶性程度更高。 目前，WHO肿瘤分型标准是公认的肿瘤分型方案，通常按照优势成份分型原则进行恶性肿瘤的分型，即以肿瘤主要组织学类型（＞50%的组织结构）进行分型诊断。然而，异质性(heterogeneity)是恶性肿瘤的重要组织结构特点之一，许多恶性肿瘤（如结直肠癌和胃癌等）均存在不同程度的多方向分化或不同组织学类型并存的现象，肿瘤的异质性也决定了恶性肿瘤复杂的临床生物学行为和预后。显然，按照优势成份分型原则进行的WHO肿瘤分型方法无疑会在某种程度上忽视恶性肿瘤高度异质性的组织学特征，也掩盖了次要组织性类型对肿瘤生物学行为和预后的影响；同时，病理组织学诊断也易受恶性肿瘤千差万别的显微镜下形态学表现以及病理医师主观因素判断的影响，不可避免存在一定的分型不一致性。此外，即使相同分型、分级和分期的肿瘤，由于其分子表型的差异，显示出完全不同的治疗反应和预后。
分化是指从胚胎时的幼稚细胞逐步向成熟的正常细胞发育的过程。肿瘤细胞分化所谓肿瘤细胞分化程度就是指肿瘤细胞接近于正常细胞的程度。病理学家根据显微镜下HE染色后肿瘤细胞的差异性进行判断。多数的分级系统将肿瘤分化程度分为3至4级。 分化得越好（称为“高分化”）就意味着肿瘤细胞越接近相应的正常发源组织；而分化较低的细胞（称为“低分化”或“未分化”）和相应的正常发源组织区别就越大，肿瘤的恶性程度也相对较大。鉴于二者之间称为“中分化”。 按照肿瘤分化的程度，病理学家通常将肿瘤细胞分为4个病理等级，并用英文字母G(代表Grade：即分化)来表示。级别越高表示细胞分化程度越差。 肺癌的分级多用于鳞癌和腺癌。一般分为三级：I级为分化好(又称高分化),Ⅱ级为分化中等(又称中分化),Ⅲ级为分化差(又称低分化)。 鳞癌I级：癌细胞排列有层次,癌巢中有明显角化珠、细胞内角化,发育良好的细胞问桥。 鳞癌Ⅱ级：癌细胞分界尚清,癌巢周边核呈栅状排列,有细胞内角化及个别角化珠。 鳞癌Ⅲ级：癌细胞大小不等,细胞间桥不明显,核异型性明显,核分裂多伴坏死。 腺癌I级：腺上皮排成管状、乳头状、肺泡状,细胞异型不明显,核分裂少见。 腺癌Ⅲ级：肿瘤细胞呈片状、实质状排列,仅有灶性腺样结构或黏液分泌,细胞异型明显,核分裂多见,坏死明显。 腺癌Ⅱ级：介于二者之间。腺鳞癌的分级标准同上。 类癌中的典型类癌属分化好,不典型类癌属分化中、好。 唾液腺型的癌多数属分化好,少数属中等分化。 小细胞癌、大细胞癌及癌具有多形性、肉瘤样或肉瘤成分者属分化差。
应该指出的是分化好、中、差,只是一个人为的标准,肺癌中同一个病变或同一张切片中都可出现不同分化的肿瘤。对于临床分期相同的病人,分化程度往往对病人的预后有影响。 对不同肿瘤来说，肿瘤细胞的分化程度和病人的预后并不一定都有直接关系。从治疗的角度上来说，某些分化程度低的细胞对于化疗和放疗更敏感，换言之，这些分化程度越低的肿瘤越容易通过化放疗来治疗。因此，并非高分化肿瘤的预后都好于低分化肿瘤。 比如常见的血液恶疾淋巴癌，某些中高分化的淋巴癌通过化疗和放疗的联合治疗方法，治愈率可达40%左右。而大多的慢性淋巴癌(属低分化)，病情的发展往往非常缓慢，可持续几年甚至十几年，但药物治疗对慢性淋巴癌却几乎没有治愈的效果。鼻咽癌的诊治中也有类似的情况。又如口腔或咽喉部鳞癌，肿瘤细胞的分化程度和病人的预后则没有直接关联。
肿瘤分化程度越高说明什么 肿瘤分化程度越高说明肿瘤细胞与所来源的组织细胞的生物学特征越接近，分化越成熟，一般恶性度也越低。本质上来讲，某个组织器官的恶性肿瘤就是组成该组织器官的细胞成分，由于发生的基因异常等事件而出现返祖现象，导致细胞幼稚化、原始化，失去进一步生长成熟的特点，而不发生衰老和死亡。肿瘤分化程度可以简单理解为该原始或幼稚的肿瘤细胞与它所来源的正常成熟细胞在生物学行为上的差异度，差异度越小，就是越接近成熟细胞，分化程度就越高；反之，差异度越大，就越幼稚和原始，分化程度就越低。一般分化程度高的肿瘤恶性度低，治疗效果好，预后较好；而分化程度低的肿瘤恶性度高，治疗效果差，预后也差。 肿瘤患者经常会听到类似"高分化鳞癌" ，"低分化腺癌" 等专业术语。大多病人在患病之初往往不了解这些术语的意义。现在我们就来介绍一个关于癌细胞非常关键的一个术语--肿瘤细胞分化程度(Differentiation)。所谓分化程度就是指肿瘤细胞接近于正常细胞的程度。分化得越好(称为"高分化")就意味着肿瘤细胞越接近相应的正常发源组织；而分化较低的细胞(称为"低分化" 或"未分化")和相应的正常发源组织区别就越大，肿瘤的恶性程度也相对较大。按照肿瘤分化的程度，病理专家通常将其分为三个病理等级，并用英文字母G(代表Grade, 即分化) 来表示。级别越高表示细胞分化程度越差。G1，即高分化，细胞分化程度较好。一般来说，G1的肿瘤细胞分裂速度较慢。G2，即中分化，细胞分化程度居中。G3，即低分化，
细胞分化程度较差。肿瘤细胞分裂速度较快。可以说肿瘤细胞的分化程度越差，它的恶性程度就越高，肿瘤体生长较迅速，而且容易发生转移。分化好的肿瘤一般生长较慢，而且在治疗后不易复发。但是，对不同肿瘤来说，肿瘤细胞的分化程度和病人的预后并不一定都有直接关系。从治疗的角度上来说，某些分化程度低的细胞对于化疗和放疗更敏感，换言之，这些分化程度越低的肿瘤越容易通过化放疗来治疗。因此，并非高分化肿瘤的预后都好于低分化肿瘤。比如常见的血液恶疾淋巴癌，某些中高分化的淋巴癌通过化疗和放疗的联合治疗方法，治愈率可达40%左右。而大多的慢性淋巴癌(属低分化) ，病情的发展往往非常缓慢，可持续几年甚至十几年，但药物治疗对慢性淋巴癌却几乎没有治愈的效果。鼻咽癌的诊治中也有类似的情况。又如口腔或咽喉部鳞癌，肿瘤细胞的分化程度和病人的预后则没有直接关联。总之，对于不同的肿瘤来说，细胞的分化程度有着不同的意义。肿瘤细胞的分化程度是癌症诊断和治疗中一个重要的参考的数据，但治疗的效果，还是需要结合癌症的种类，分期，治疗方法来综合判断。
CELL综述: 肿瘤新十大特征 Hallmarks of Cancer: The Next Generation 2011年3月4号，Douglas Hanahan和Robert A. Weinberg在《Cell》发表综述，题目为：Hallmarks of Cancer: The Next Generation。整个综述29页，简述了最近10年肿瘤学中的热点和进展（例如细胞自噬、肿瘤干细胞、肿瘤微环境等），并且将过去的6个特征扩增到10个特征，新增加的4个特征为： 避免免疫摧毁(Avoiding Immune Destruction); 促进肿瘤的炎症（Tumor Promotion Inflammation）; 细胞能量异常（Deregulating Cellular Energetics）; 基因组不稳定和突变（Genome Instability and Mutation）。 并且将过去的回避凋亡(Evading Apoptosis)，调整为抵抗细胞死亡(Resisting Cell Death)。 背景介绍 我们已经提出了总共6种肿瘤标志，组成了一个基本原理，它提供了一个理解肿瘤性疾病显著差异的逻辑网络(Hanahan and Weinberg, 2000)。我们的讨论中包含了这样的概念，肿瘤细胞逐渐进展成新生物，它们获得一系列标志性能力，而人类肿瘤形成的多步骤的过程可以用初始癌细胞获得使它们成为肿瘤并最终表现出恶性肿瘤的特征。 我们注意到由于附属结构的存在，肿瘤不只是癌细胞组成的岛状物。它们是由多种不同类型的细胞组成的复合物，这些细胞之间存在异质的相互作用。我们是这样描述招募来的正常细胞，它们以主要参与者的身份形成肿瘤相关基质，而不是作为旁观者；这样的话，这些间质细胞对于特定能力标志的发展和表达是有贡献的。在接下来的十
抗肿瘤药物5氟尿嘧啶对肿瘤细胞 迁移的影响 欧阳学文 （细胞划痕法） 实验导读 瘤组织的增殖失控、瘤细胞的分化异常、瘤细胞具有侵袭和转移的能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征，而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因。因此研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。 肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，至靶组织或靶器官，长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。前者称为原发瘤，后者称为转移瘤或继发瘤。 图1 肿瘤转移示意图 根据肿瘤异质性理论，大多数恶性肿瘤最初虽属单克隆起源，但它在不断增殖演进至临床明显的肿瘤时，由于瘤细
胞遗传性状的不稳定性(来自基因突变或缺失等)而不断地变异，造成该肿瘤内瘤细胞亚群表型的多样性，诸如瘤细胞的侵袭性、生长速率、转移能力，核型乃至对激素的反应性和抗肿瘤药物的敏感性等，这些瘤细胞亚群具有被此不同的特性即所谓异质性。异质性与肿瘤转移直接有关的就是癌细胞的转移潜能，癌细胞的转移潜能有高低之分，具有高转移潜能的筋细胞易发生转移。 肿瘤细胞的运动性，来源于细胞运动“接触抑制”的概念。通过体外培养正常和恶性结缔组织细胞，发现正常纤维母细胞在移动过程中引起的皱栖脑膜与其他细胞的表面接触时，往往产生细胞膜活动的抑制和移动中细胞的缩短，然后停止。当纤维母细胞生长过程中在培养皿上融合形成一单层时，细胞运动即显著受到抑制。间变的肉瘤细胞则缺乏接触抑制，瘤细胞的运动不会被正常纤维母细胞所抑制。 针对肿瘤转移这一复杂的过程，人们研制了各种抗转移药物，如血小板凝集抑制剂、血管生成抑制因子、内皮稳定因子、干扰素－α以及其他化学药物。
癌细胞如何变回正常的细胞.|细胞分化 癌细胞如何变回正常的细胞. 癌症的主因～超级中毒+组织缺氧+忧伤就超级中毒而言，例如吃入含重金属食品，因为重金属太重，血液搬不动，就留在组织中，而细胞遇到入侵的外来物(重金属)，就会扭曲地团团围住而形成肿瘤(癌症)! 癌细胞就是扭扭曲曲皱皱缩缩的细胞，藉由 1.乐观：例如和志同道合登山队登山大家谈天说地嘻嘻哈哈。 2.补氧：登山会喘气且满身流汗乃最佳的补氧及排毒运动，藉由灌氧，皱缩的细胞癌可像气球打氧一样，膨胀回来，成为正常细胞。 3.偏素食：五榖杂粮加蔬菜可改成硷性体质及排毒。 即可将癌细胞变回成正常圆润的细胞! 癌症(Cancer)正如其拉丁字头「蟹」(Cancri)的意思所指，稍不注意，便不声不响、致人于死地横行。一生中每四个人就有一个人可能得癌，过去十年，台湾叁十至五十九岁的壮年得癌人数成长八一%，但四○%的癌症是可以预防的。然而在第叁期的癌症之后，如从前法务部长陈定南、舞蹈家罗曼菲、王文洋的妻子陈静文、电影导演杨德昌、到鸿海準董事长郭台成，一颗颗舞台上的明星，在正要大放光芒时，因癌倒下。 其实每人每天均会产生七八千个癌细胞，尤其在焦虑、愤怒及压力下，癌细胞大增，放在人体内某部位的潘朵拉盒中;若在愉快的心情下，以氧气灌满皱缩的癌细胞使之膨胀，多吃抗癌食物即可天天修
护皱皱的癌细胞变回成正常圆润的细胞，在第叁期的癌症之前，均能康復。 A.抗癌食物： 柠檬(破坏12种癌细胞：包括结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和胰腺癌…)、地瓜(排毒最佳)、大蒜(治胃癌)、黄豆(治子宫颈癌)、金针菇(治子宫颈癌)、菜花(治胰腺癌)、菠菜(治肺癌)、茭白(治肠癌)、海带(治乳腺癌)、芦笋(治皮肤癌)、花椰菜(治膀胱癌)、毛豆(治乳癌)、蔓越莓(治乳癌)、开心果(防肺癌)、熟番茄(治摄护腺癌)、蘑菇(治肝癌，但含重金属伤肾，每月最多可以吃200g )、甜菜根、胡萝蔔、优格、苹果、绿藻、葡萄、香蕉、奇异果、凤梨、草莓、绿茶、十榖米(治直肠癌：糙米、黑糯米、小米、小麦、荞麦、芡实、燕麦、莲子、麦片和红薏仁)、白芝麻、亚麻子、老姜、枸杞、玉米、杏仁、黑芝麻、南瓜子。 请大家多吃含有这些有效成份的食物，让身体内蠢蠢欲动的癌细胞多多睡觉。 1.咖哩(抗癌成份是「姜黄素」) 2.辣椒(抗癌成份是「辣椒素」) 3.姜(抗癌成份是「姜油」) 4.绿茶(抗癌成份是「儿茶素」) 5.大豆(抗癌成份是「异黄酮」) 6.蕃茄(抗癌成份是「茄红素」) 7.葡萄(抗癌成份是「白黎芦醇」) 8.大蒜(抗癌成份是「硫化物」) 9.高丽菜(抗癌成份是「??」) 10.花椰菜(抗癌成份是「硫化物」) B.以氧气灌满：人坐在椅子上时，每次唿吸进的空气才半公升，只用了肺臟的十二分之一，李丰说，「就像一个人有一栋十二个房间的房子，可是每天
第4题.资料 肿瘤的转移途径： 1 淋巴道转移：（癌多见）。原发癌的细胞随淋巴引流，由近及远转移到各级淋巴结，也可能超级转移；或因癌阻碍顺行的淋巴引流而发生逆向转移。转移癌在淋巴结发展时，淋巴结肿大且变硬，起初尚可活动，癌侵越包膜后趋向固定，转移癌阻碍局部组织淋巴引流，可能引起皮肤、皮下或肢体的淋巴水肿； 如：乳腺癌同侧腋窝淋巴结； 肺癌肺门、支气管旁淋巴结； 鼻咽癌同侧颈淋巴结。 2 血道转移：癌细胞进入血管随血流转移至远隔部位如肺、肝、骨、脑等处，形成继发性肿瘤；如：瘤细胞静脉肺和肝等（最多见），形成边缘整齐、散在、多发的球形结节，中央常发生坏死，近脏器表面形成“癌脐”。 3种植性转移：内脏器官的肿瘤，侵犯浆膜后，瘤细胞脱落入体腔，种植在浆膜面上。如：肺癌胸膜腔； 消化道癌或卵巢癌腹膜腔。 形态：浆膜增厚，表面癌结，血性积液，脱落细胞学检查可见癌细胞。 4.直接转移：随着肿瘤体积不断增大，肿瘤细胞可沿周围正常组织的薄弱处，直接延伸，侵入并破坏邻近组织或器官。 如：直肠癌前列腺、膀胱、子宫及阴道壁等。 此例的转移方式： 1.胃卵巢：种植性转移，胃癌浸透到脏器外表面时，随着呼吸或肠蠕动等相应的摩擦，可脱落到体腔继续生长
2.胃、肝、肺淋巴结：淋巴道转移，肿瘤细胞侵入淋巴管后，随淋巴液转移到淋巴结，在淋巴结内生长形成转移瘤，淋巴结肿大且变硬 3.胃肺、肝脏：血道转移，肿瘤细胞侵入血管后，随血流转移到全身各处称血道转移。侵入人体静脉系统的肿瘤细胞，先转移到肺，再经心脏扩散到全身各脏器。消化道的恶性肿瘤常入侵门静脉系统转移到肝脏。 第3题 (1)阻塞和压迫：肿瘤的阻塞压迫发展迅速，程度也高，如肝肿大可以压迫神经；淋巴结肿大变硬，淋巴回流受阻。 (2)破坏所在器官的结构和功能：如肝癌由于肝细胞破坏和肝内胆管阻塞，可引起全身性黄疸。 (3)侵袭破坏邻近器官：如胃癌可穿胃壁，侵犯胃周围的器官。 (4)坏死、出血、感染：恶性肿瘤生长迅速，癌组织常常因为供血不足而发生坏死，如果癌变组织侵犯血管，可引起出血，肺癌病人常常合并肺部感染。 (5)疼痛：由于癌组织压迫或侵犯神经，可引起相应部位的疼痛，如晚期肝癌、胃癌都有剧烈疼痛。另外，癌症继发感染后，也可以引起疼痛。 (6)发热：肿瘤组织的代谢产物、坏死组织的分解产物、以及继发的细菌感染，都可以引起癌症病人发热，一般表现为中低度热。 (7)恶病质：恶病质也有人称为"恶液质"，是指机体严重消瘦、无力、贫血和全身衰竭的状态，它是癌症病人死亡的重要原因。 第2题 1.胃、肝细胞异型性明显，核分裂象多； 2.胃、肺发生出血、坏死、溃疡、脱落 3.出现浸润性生长 4. 胃肝肺 组织分化程度分化差，异型性大分化差，异型性大分化差，异型性大
肿瘤侵袭及转移 北京大学医学部病理学系方伟岗良性肿瘤仅在原发部位生长扩大，而具有浸润性生长的恶性肿瘤，不仅可以在原发部位继续生长、蔓延(直接蔓延)，而且还可以通过各种途径扩散到身体其他部位(转移)。肿瘤转移是恶性肿瘤最显著的生物学特性之一, 是临床肿瘤病人的主要死因. 一. 转移的基本概念: 肿瘤转移 (tumor metastasis) 是指肿瘤细胞脱离原发生长部位, 通过各种途径的转运, 在机体内远离原发部位的器官 / 组织继续增殖生长, 形成同样性质肿瘤 (转移瘤) 的过程. 在原发部位生长的肿瘤称为原发瘤（primary tumor）,在远隔部位生长的肿瘤称为转移瘤(metastatic tumor).恶性肿瘤中，只有少数肿瘤不发生或很少发生转移，如皮肤的基底细胞癌、脑的恶性胶质细胞瘤。 肿瘤演进 (progression) 是经常遇到的一个概念, 它是指从良性肿瘤转变成恶性肿瘤所必须发生的一系列事件的综合, 至少包括: 失控性生长, 血管化, 抗药性, 浸润, 转移等. 浸润和转移是肿瘤演进的最后阶段. 二. 转移的基本过程: 肿瘤转移是一个复杂的多步骤连续过程, 其中至少包含以下步骤: 原发部位肿瘤细胞脱离原发瘤, 侵袭穿越基底膜并向周围间质浸润性生长, 穿越局部毛细血管 / 淋巴管壁进入管腔, 与血小板聚集或形成小瘤栓, 随血液 / 淋巴液运输到达靶器官毛细血管床, 与该部位的血管 / 淋巴管内皮细胞发生粘附, 穿越管壁和基底膜进入周围间质, 不断增殖形成转移瘤（图1）. 肿瘤细胞的浸润 (invasion)是指肿瘤细胞脱离原发瘤, 侵袭穿越基底膜并向周围间质浸润性生长，但尚未进入局部毛细血管 / 淋巴管的阶段，和转移是相互联系的病理过程. 浸润是转移的前提, 但不一定发生转移; 而转移必定包括浸润过程. 三. 肿瘤转移的主要途径: 1.淋巴道转移： 淋巴道转移是癌转移的重要途径，少数肉瘤如滑膜肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤也可发生淋
cypress1975 wrote: 很多研究生研究肿瘤，但是由于对于肿瘤的认识有限，因此在设计实验方面存在一些误区： 很多研究生认为促进细胞增殖的基因就是癌基因，相反抑制细胞增殖的基因就是抑癌基因，更进一步，促进细胞存活的基因就是癌基因，相反促进细胞凋亡的基因就是抑癌基因。在这样思想的意识指导下，研究基因与癌症的关系就是将基因导入癌细胞，观察对细胞增殖和凋亡等方面的影响，然后得出该基因与癌症的关系，最后推测该基因可能是癌症治疗的靶点。另外一些研究生研究某个基因与癌症的关系，但是出发点是该基因在某个信号转导通路中怎么样，然后推测该基因与肿瘤的关系。 大家看看上述什么地方有误？欢迎讨论 20世纪后半叶，分子生物学的飞速发展大大深化了人们对生命本质的理解，也把对肿瘤的认识推进到了前所未有的高度。癌基因、抗癌基因、周期相关基因及蛋白质、凋亡相关基因及分子、信号传导系统、转移相关基因、耐药相关基因等研究乃至人类基因组计划的蓬勃开展，使人们从分子水平的不同侧面观察和理解肿瘤成为可能。信息学和网络技术的飞速发展，让人们只需鼠标一点，排山倒海般的文献便尽收眼底。尽管如此，人们对癌症的本质以及如何控制这一恶疾的认识却仍未产生质的飞跃，若干推论仍属假想。对此，被普遍接受的解释是，技术的发展及人们对肿瘤细胞分子突变的理解，还没有达到应有的水平。 第二种尚不易被接受的解释则是人们的研究方向发生了偏差。正如美国肿瘤学家哈纳汉（D. Hanahan）所讲：“很多人认为本世纪的前几十年，我们对肿瘤发生及治疗的研究仍要沿袭此前几十年的方式，越来越复杂的文献将继续堆积到本已极为复杂的文献堆中，但我们期待着另一种完全不同的研究方式……诚然，这种改变首先依赖于技术的进步，但最根本的改变还有赖于观念的更新。”[1] 尽管他并未说明“观念的更新”指的是什么，但若干研究结论确实已经暗示，过去几十年的研究思路和思维方式可能已经发生了偏差。 由于坚信肿瘤的发生起源于细胞特定基因的改变，肿瘤发生的机理最终必须在基因水平得到解释，对肿瘤的控制最终也必须通过对基因的干预才能实现，过去几十年大多数肿瘤研究都致力于寻找癌细胞基因的突变或表达异常。尽管大规模、高通量的基因分析技术应用日益广泛，但由于肿瘤细胞基因组结构的高度不稳定性，这些基因突变又总是处于时间依赖性、空间依赖性和个体依赖性的变化之中，如何从成千上万的突变中找出真正有意义的、肿瘤共性而又是肿瘤特异性的改变，实际并非易事。每一个新发现带来的惊喜常常伴有随之而来的矛盾和困惑。 爱因斯坦认为，一种理论正确性的重要标志是其逻辑上的简洁性。基因突变理论由于其日益突出的复杂性和不和谐性，在解释肿瘤的成因时已经遇到了不可回避的矛盾。笔者坚信，肿瘤的发生肯定有其具有普遍意义的、能解释肿瘤各种生物现象的简洁的机理，不必用繁杂多变的基因突变来解释，但基因突变又可被纳入其中。重要的是，这种认识隐含着解决肿瘤问题的最佳思路。正如哥白尼如果不提出日心说，人们仍然要在托勒密地心说的统治下费劲地理解天文；爱因斯坦如果不提出相对论，人们仍然要在牛顿经典力学的限制下费劲地理解时空一样，肿瘤学的研究，也已到了必须在观念上发生改变的时候了。 肿瘤发生：基因外因素的重要作用