检测实验室必须建立测量不确定度的评定程序，并有能力对每一项有数值要求的测量结果进行测量不确定度评定[1]。苯巴比妥东莨菪碱片为抗眩晕药，收载于《国家药品标准》化学药品地方标准上升国家标准第七册，该标准对片剂中的氢溴酸东莨菪碱(1)和苯巴比妥(2)采用HPLC 法测定含量，但未见有对其测量不确定度的相关报道。通过参考文献[2]，本研究建立了苯巴比妥东莨菪碱片中1、2含量测定的数学模型，分析和评价了两种成分测定过程的测量不确定度，以探讨各不确定度分量对测定结果的影响，为药品质量的考察提供了一个重要
HPLC 法测定苯巴比妥东莨菪碱片含量的测量不确定度评价
陈建琴
(南宁食品药品检验所，广西南宁 530001)
摘要：评价了HPLC 法测定苯巴比妥东莨菪碱片含量的测量不确定度。通过不确定度来源分析，建立不确定度的数学模型，并考察测定中的各影响因素。氢溴酸东莨菪碱、苯巴比妥的扩展不确定度分别为2.1％、1.5％，含量测定结果可表示为(108.6±2.1)％、(108.3±1.5)％。
关键词：测量不确定度；苯巴比妥东莨菪碱片；高效液相色谱
中图分类号：R944.9 文献标识码：A 文章编号：1001-8255(2007)05-0368-04
收稿日期：2006-08-07
作者简介：陈建琴(1976)，女，主管药师，从事药品检验。Tel ：0771-*******
E-mail ：cjq3280@https://www.doczj.com/doc/299087803.html,
Evaluation of Measurement Uncertainty of HPLC Method for Determination
of Phenobaribital and Scopolamine Hydrobromide Tablets
CHEN Jian-qin
(Nanning Institute for Food and Drug Control, Nanning 530001)
ABSTRACT: The measurement uncertainty of the HPLC method for determination of phenobaribital and scopolamine hydrobromide tablets was evaluated. The method of evaluation was achieved by analysis of the uncertainty sources arising from the procedure of analysis. The expanded uncertainty of scopolamine hydrobromide and phenobarbital were 2.1％ and 1.5％, respectively. The contents of scopolamine hydrobromide and phenobarbital were (108.6±2.1)％ and (108.3±1.5)％.
Key Words: measurement uncertainty; phenobaribital and scopolamine hydrobromide tablet; HPLC
依据。1 仪器与试药
LC-10AT 型高效液相色谱仪、SPD-10A 型紫外检测器(日本岛津)；AE 240型电子天平(Mettler Toledo 公司)。
苯巴比妥东莨菪碱片(广州光华制药股份有限公司，规格 每片含1 0.2mg 、2 30 mg )；1、2对照品含量均为100％，批号分别为100049-200308和171222-200504(中国药品生物制品检定所)。
2 方法与结果2.1 1的测定
色谱条件及系统适用性试验：C 18色谱柱；流动相为1mmol/L 盐酸-甲醇(30∶70，含8mmol/L 十二烷基硫酸钠溶液)；检测波长 210nm 。理论板数按1峰计不低于2000。
1供试品溶液：精密称取本品20片，研细，精密称取细粉适量(约相当于11mg)置50ml(V1)量瓶中，加甲醇-水(4∶6)(溶剂)适量，超声振荡10min，取出，冷至室温，加溶剂定容，摇匀，离心(4000r/min)15min，取上清液为1供试品溶液。
1对照品溶液：精密称取1对照品约10mg，置100ml(V2)量瓶中，加溶剂溶解并定容，摇匀，精密量取5ml(V3)，置25ml(V4)量瓶中，加溶剂定容，摇匀，作为1对照品溶液。
测定法：分别精密量取对照品溶液与供试品溶液20μl进样测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，所得结果乘以1.141。
2.22的测定
色谱条件及系统适用性试验：C18色谱柱；流动相为1mmol/L盐酸-甲醇(60∶40，含8mmol/L十二烷基硫酸钠溶液)；检测波长 210nm。理论板数按2峰计不低于2000。
2供试品溶液：精密量取“2.1”项下的1供试品溶液5ml(V5)，置200ml(V6)量瓶中，用溶剂定容，摇匀，作为2供试品溶液。
2对照品溶液：精密称取2对照品约18.5mg，置50ml(V7)量瓶中，加溶剂溶解并定容，摇匀，精密量取5ml(V8)，置25ml(V9)量瓶中，用溶剂定容，摇匀，作为2对照品溶液。
测定法：分别精密量取对照品溶液与供试品溶液20μl进样测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。
2.3计算公式与测定结果
1标示量％=A X W0MV X×1.141×100％/(A0W X V0×标示量×20)=108.6％，
2标示量％= A X W0MV X×100％/(A0W X V0×标示量×20)=108.3％，
式中，A X和A0－供试液和对照品的峰面积；W0－对照品的称样量；M－20片总重；V X－供试液的稀释倍数；W X－供试品的称样量；V0－对照液的稀释倍数。
2.4建立数学模型
1标示量％：X= A X W0M V X×285.25×100％/A0W X V0，
2标示量％：X= A X W0M V X×1.67×100％/A0W X V0，
导出方差：u(X)/X=[[u(A X)/A X]2+[u(W0)/ W0]2+[u(M)/M]2+[u(V X)/V X]2+[u(A0)/ A0]2+[u(W X)/W X]2+[u(V0)/V0]2]1/2。
3不确定度分量的分析与计算
3.1对照品称样量的不确定度u(W0)
3.1.1对照品纯度引入的不确定度u(W01)
1、2对照品的含量为100％，u(W01)= 0。
3.1.2 天平示值的不确定度u(W02)
所用电子天平(d=0.01mg)的检定证书给出的最大允差为±0.06mg，假设为均匀分布，则u(W02)= 0.06/31/2= 0.0346mg。
3.1.3 天平称量重复性的不确定度u(W03)
所用电子天平(d=0.01m g)的检定证书给出的重复性误差为±0.05mg，假设为均匀分布，则u(W03)=0.05/31/2=0.0289mg。
3.1.4单次称量的标准不确定度
(0.03462+0.02892)1/2=0.0451mg，因称量使用减重法，u(W0)=(2×0.04512)1/2 = 0.0638mg。
1：u(W0)/W0=0.0638×10-3/ 0.01015=6.286×10-3，
2：u(W0)/W0=0.0638×10-3/ 0.01845=3.458×10-3。
3.2供试品称样量的不确定度u(W X)
所用电子天平(d=0.1mg)的检定证书给出的最大允差为±0.20mg，重复性误差为±0.30mg，假设为均匀分布，天平示值的不确定度为0.20/31/2 =0.115mg，称量重复性的不确定度为0.30/31/2= 0.173mg，则u(W X)/W X=[2×(0.1152+0.1732)]1/2×10-3/1.3787=2.132×10-4。
3.3 20片总重的不确定度u(M)
u(M)= u(W X)=0.294mg，则u(M)/M=0.294×10-3/(0.2750×20)=5.346×10-5，可忽略不计。
3.4 供试品溶液的稀释倍数的不确定度u(V X)
3.4.11数学模型
V X=V1，方差：u(V X)/V X = u(V1)/V1。
玻璃量器(50ml单标线量瓶)的相对标准不确定度u(V1)/V1
校准：量瓶经检定为A级，由文献[3]得容量允差为±0.05ml，假设为均匀分布，其标准不确定度为0.05/31/2= 0.0289ml。
温度：设溶液温度为(20±5)℃，水的体积膨胀系数为2.1×10-4/℃，假设为均匀分布，其标准不确定度为2.1×10-4×5×50/31/2=0.0303ml。
u(V1)/V1=(0.02892+0.03032)1/2/50 = 8.38×10-4。
3.4.2 2数学模型
V X=V1V6/ V5，方差：u(V X)/V X=[[u(V1)/V1]2+ [u(V6)/V6]2+[u(V5)/V5]2 ]1/2。
玻璃量器(200ml单标线量瓶)的相对标准不确定度u(V6)/V6
同上推断得，校准的标准不确定度为0.15/31/2= 0.0866ml；温度的标准不确定度为2.1×10-4×5×200/31/2=0.121ml。
u(V6)/V6 =(0.08662+0.121 2)1/2/200=7.45×10-4。
玻璃量器(5ml单标线吸管)的相对标准不确定度u(V5)/V5
同上推断得，校准的标准不确定度为0.015/31/2 =8.66×10-3ml；温度的标准不确定度为2.1×10-4×5×5/31/2=3.03×10-3 ml。
u(V5)/V5=[(8.66×10-3)2+(3.03×10-3)2]1/2/5= 1.83×10-3，
则u(V X)/V X=[[u(V1)/V1]2+[u(V6)/V6]2+ [u(V5)/V5]2 ]1/2= 2.15×10-3。
3.5对照品溶液的稀释倍数的不确定度u(V0)
3.5.11数学模型
V0=V2V4/V3，方差：u(V0)/ V0=[[u(V2)/V2]2+ [u(V4)/V4]2+ [u(V3)/V3]2 ]1/2。
玻璃量器(100ml单标线量瓶)的相对标准不确定度u(V2)/V2
同上推断得，校准的标准不确定度为0.10/31/2= 0.0577ml；温度的标准不确定度为2.1×10-4×5×100/31/2=0.0606ml。
u(V2)/V2=(0.0577 2+0.06062)1/2/100=8.37×10-4，
玻璃量器(25ml单标线量瓶)的相对标准不确定度u(V4)/V4
同上推断得，校准的标准不确定度为0.030/31/2 = 0.0173ml；温度的标准不确定度为2.1×10-4×5×25/31/2=0.0152ml。
u(V4)/V4=(0.01732+0.01522)1/2/25=9.21×10-4，
则u(V0)/ V0=[[u(V2)/V2]2+[u(V4)/V4]2 +[u(V3)/ V3]2 ]1/2 =[[u(V2)/V2]2+[ u(V4)/V4]2+[u(V5)/V5]2 ]1/2 = 2.21×10-3。
3.5.22数学模型
V0=V7V9/V8，方差：u(V0)/ V0=[[u(V7)/V7]2+ [u(V9)/V9]2 +[u(V8)/V8]2]1/2=[[u(V1)/V1]2+ [u(V4)/ V4]2 + [u(V5)/V5]2 ]1/2=2.21×10-3。
3.6 仪器进样重复性的不确定度u(A X)、u(A0)
仪器进样重复性为B类不确定度，由高效液相色谱仪检定证书给出，其定量重复性为0.76%，按均匀分布，u(A X)= u(A0)=0.76％/31/2=4.388×10-3。
3.7样品重复性测定的不确定度u重复
精密称取本品细粉适量，共5份，按“2.1”、“2.2”项下操作，进样测定，分别计算1、2的含量，为随机测量，属A类不确定度。1的测定结果为：108.2％、108.6％、108.9％、107.8％和109.1％，标准差s= 5.26×10-3；2的测定结果为：108.0％、108.8％、108.3％、107.9％和108.2％，标准差s=3.51×10-3；则样品重复性测定的不确定度分别为u
重复
(1)=5.26×10-3，u
重复
(2)=3.51×10-3。
3.8合成标准不确定度
u(X)/X=[[u(A X)/A X]2+[u(W0)/W0]2+[u(M)/ M]2+[u(V X)/V X]2+[u(A0)/A0]2+[u(W X)/W X]2 +[u(V0)/V0]2]1/2，
1：u(X)=108.6％×[(4.388×10-3)2+(6.286×10-3)2 +(8.38×10-4)2+(4.388×10-3)2+(2.132×10-4)2+(2.21×10-3)2] 1/2=8.85×10-3，
2：u(X)=108.3％×[(4.388×10-3)2+(3.458×10-3)2 +(2.15×10-3)2+(4.388×10-3)2+(2.132×10-4)2+(2.21×10-3)2] 1/2=6.38×10-3，
u c =[u(X)2+ u重复2] 1/2，
1：u c= [(8.85×10-3)2+(5.26×10-3)2]1/2=0.0103→1.03％，
2：u c=[(6.38×10-3)2+(3.51×10-3)2] 1/2=7.28×10-3→0.73％。
表1 各标准不确定度分量所占比例
标准不确定度分量相对标准不确定度u
u 2
u 2所占百分比/％
u (W 0)1
6.286×10-3 3.951×10-54
7.22 3.458×10-3
1.196×10-519.9
u (W X )1 2.132×10-4 4.545×10-80.12 2.132×10-4 4.545×10-80.1u (M )1 5.346×10-5 2.858×10-902 5.346×10-5 2.858×10-90u (V X )18.38×10-47.022×10-70.82 2.15×10-3 4.622×10-67.7u (V 0)1 2.21×10-3 4.884×10-6 5.82 2.21×10-3 4.884×10-68.1u (A X )和u (A 0)
1 4.388×10-3 1.925×10-523.02
4.388×10-3
1.925×10-5
32.1
3.9 扩展不确定度
U =Ku c ，取K =2，P =95%，1：U =Ku c =2×1.03％=2.1％，2：U =Ku c =2×0.73％=1.5％。
综上所述，HPLC 法测定本品1、2的标示量％可分别表示为(108.6±2.1)％、(108.3±1.5)％。
4 讨论
在评估总不确定度时，须分析不确定度的每一个来源并分别处理，以确定其对总不确定度的贡献。现对本品中1、2的测定过程分析影响测量不确定度结果的7个因素，见表1。
中国实验室国家认可委员会. 实验室认可与管理基础知识[M ]. 北京: 中国计量出版社. 2003.魏 昊. 化学分析中不确定度的评估指南[M ]. 北京: 中国计量出版社. 2002.国家质量技术监督局. JJG196-90, 常用玻璃量器检定规程[S ]. 北京: 中国标准出版社, 1990.
[1]
[2]
[3]
ffffffffffffffffffffffffffffffffffffffff
Yang S-C, Lu L-F, Cai Y , et al. Body distribution in mice of
[1]
(上接第356页)
3.2 小鼠静脉注射1-SLN 冻干剂后，在肝、脑中各时间点的DTI 值均大于1，表明1-SLN 能提高药物对肝、脑的靶向性。且小鼠静脉注射1-SLN 冻干剂后在各时间点肝脏中的DSI 值均大于静脉注射1水溶液后相应的DSI 值，说明1-SLN 比1水溶液有更明显的肝靶向性。参考文献：
intravenously injected camptothecin solid lipid nanoparticles and targeting effect on brain [J ]. J Controlled Release , 1999, 59(3): 299-307.
Mehnert W, Mader K. Solid lipid nanoparticles: production, characterization and applications [J ]. Adv Drug Deliv Rev , 2001, 47(2-3): 165-196.
Yu B-T, Sun X, Zhang Z-R. Enhanced liver targeting by synthesis of N1-stearyl-5-Fu and incorporation into solid lipid nanoparticles [J ]. Arch Pharm Res , 2003, 26(12): 1096-1101.
[2]
[3]由表1可见，测定本品中1时，对照品的称样量是定量分析中的最大影响因素，进行两组分测定时结果的不确定度主要来源于仪器进样重复性，因此在实验过程中严格规范操作，控制好对测定有最大影响的不确定度分量，即可得到较可靠的测定结果。采用现代统计学方法并运用具有广泛意义的测量不确定度，使评定结果更具代表性及统计学意义。
参考文献：