PCR 扩增反应的操作 第一节PCR 扩增反应的基本原理 一、聚合酶链式反应（PCR ）的基本构成 PCR 是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA ）的扩增反应，是模拟体内DNA 复制过程，在体外特异性扩增DNA 片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA 作图、DNA 测序、分子系统遗传学等。 PCR 基本原理: 是以单链DNA 为模板，4 种dNTP 为底物，在模板3'末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA 得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA 片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA 膜板、四种dNTP 溶液、耐热Taq DNA 聚合酶、Mg 2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA 在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA 聚合酶的催化下，以dNTP 为原料，引物沿5'→ 3'方向延伸，形成新的DNA 片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR 循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA 聚合酶在适当温度下催化DNA 链延伸合成（见图）。 1．模板DNA 的变性 模板DNA加热到90~95 C时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA 中G-C 含量有关，G-C 间由三个氢键连接，而A-T 间只有两个氢键相连，所以G-C 含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR 中DNA 变性需要的温度和时间与模板DNA 的二级结构的复杂性、G-C 含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO）,并且在PCR循环中起 始阶段热变性温度可以采用97 C ,时间适当延长，即所谓的热启动。 2．模板DNA 与引物的退火 将反应混合物温度降低至37~65C时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复 合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA 的浓度 ,并由于引物的长度显著短于模板的长度, 因此在退火时,引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多,退火时间一般为1?2min。 3．引物的延伸 DNA 模板-引物复合物在Taq DNA 聚合酶的作用下,以dNTP 为反应原料,靶序列为模板, 按碱基配对与半保留复制原理,合成一条与模板DNA 链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72 C条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40?60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环,模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中,新合成的DNA 都可以起模板作用,因此每一轮循环以后, DNA 拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2?4min, —次PCR 经过30?40次循环，约2?3h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时,酶的催化反应趋于饱和,便出现所谓的“平台效应”,即靶DNA 产物的浓度不再增加。 PCR 的三个反应步骤反复进行,使DNA 扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y =（1 + X）n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期, 靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数
什么是固井 一、固井：在已钻出的井眼中下入一定尺寸的套管，并在套管与井壁或套管与套管之间的环形空间内注入水泥的工艺过程。 二、井身结构包括以下几方面的内容：所下套管的层次、直径、各层套管下入的深度、井眼尺寸（钻头尺寸）、各层套管的水泥反高等。 三、设计井深的主要依据：地层压力、地层破坏压力和坍塌压力。 四、套管的类型：⒈导管；⒉表层套管；⒊技术套管；⒋生产套管；⒌尾管。 五、井深结构设计的原则：①能有效的保护油气层，使油气层不受钻井液的损害；②能够避免漏、喷、塌、卡等复杂情况产生，保证全井顺利钻进，使钻井周期达到最短；③钻达下部高压地层时所用的较高密度的钻井液产生的液柱压力，不至于把上一层套管鞋处薄弱的裸露地层压裂；④下套管过程中，钻井液液柱压力和地层压力之间的压差，不至于造成卡阻套管。 六、套管柱的受力：轴向压力、外挤压力和内压力。 七、套管柱的附件：⒈引鞋（套管鞋、浮鞋）；⒉回压法；⒊套管扶正器；⒋磁性定位套管； ⒌联顶节。 八、水泥熟料主要成分：①硅酸三钙（C3S）；②硅酸二钙（C2S）；③铝酸三钙（C3A）；④铁铝酸四钙（C4AF）。 九、水化作用：油井水泥与水混合后，水泥中各种矿物分别与水发生水解和水化反映，某些水化产物还能发生二次反映。 十、水化反映的不断进行水泥浆形成水泥石可分为三个阶段：①胶溶期；②凝结期；③硬化期。 十一、稠化时间：指油井水泥浆在规定压力和温度条件下，从开始搅拌至稠度达100Bc所需要的时间。 十二、稠度：水合水泥混合后会逐渐变稠，变稠的速率。 十三、注水泥的设备：水泥车、水泥混合漏斗、水泥分配器、水泥头、胶塞、储灰罐。 十四、碰压：胶塞被推至浮箍时，泵压突然升高。 十五、注水泥主要工序包括：循环和接地面管汇→打隔离液→顶胶塞→碰压→候凝。 十六、提高泥浆的顶替效率：⒈紊流顶替；⒉打前置液；⒊活动套管；⒋调整完井液和水泥浆的性能；⒌使用扶正器。 十七、引起油、气、水窜的原因：水泥浆在凝固过程中的失重是导致油、气、水窜的主要原因，井壁存在泥饼、水泥硬化过程体积收缩也是造成油、气、水窜的原因。 十八、水泥浆失重：指水泥浆柱在凝固过程中对其下部或地层作用的压力逐渐减小的现象。十九、防止油、气、水窜的措施：①采用两用水泥；②分级注水泥；③减小水泥浆返高；④环空憋压候凝；⑤使用特种水泥。 二十、特殊固井技术：习惯上把除了常规一次注水泥技术方法。 二十一、特殊固井技术的种类：⑴、内管注水泥；⑵、尾管固井工艺；⑶、分级注水泥技术。二十二、完井：指从打开生产层到把井交付给采油生产期间的全部生产过程。 二十三、完井包括：打开生产层、下油层套管固井、射孔到试采的全部工艺过程。 二十四、井下复杂情况：钻井作业过程中，由于钻井液的类型与性能选择不当及井身质量较差等原因造成井下钻具的遇阻遇卡、钻进时严重憋跳钻、井漏、井喷等现象，不能维持钻进与其他钻井作业正常进行。 二十五、钻井事故：由于检查不周到，违章操作，处理井下复杂情况的措施不当或疏忽大意而造成的钻具折断、顿钻及井喷失火等恶果。
提取组织或细胞中的总RNA以其中的mRN作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCF使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量 RNA羊品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 （一）反转录酶的选择 1. Moloney 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活 性相对较弱。最适作用温度为37 C。 2. 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性。 最适作用温度为42 C。 3. Thermus thermophilus 、 Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录 酶：在Mn2存在下，允许高温反转录 RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4. MMLV 反转录酶的 RNase H- 突变体：商品名为 SuperScript 和 SuperScript U。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一 特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的 m 模板合成较长 cDNA 。 （二）合成 cDNA 引物的选择 1. 随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝 其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA 。 用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了 cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源 于 rRNA。 2. Oligo(dT) ：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有
固井施工施工过程井控应急措施；一、固井施工过程中井涌、井喷的应急措施；1、注前置液时发生井涌或井喷，立即停止注前置液，；队工程技术员汇报，有钻井队根据井涌情况决定是否关；2、注入水泥过程中发生井涌、井喷时根据具体情况采；施：；（1）、注放水泥量少时，由钻井队根据井涌情况决定；（2）、已经开始注尾桨时出现井涌或井喷时，由钻井；二、尾管固井井控措施；1、尾管固井 固井施工施工过程井控应急措施 一、固井施工过程中井涌、井喷的应急措施。 1、注前置液时发生井涌或井喷，立即停止注前置液，并向钻井 队工程技术员汇报，有钻井队根据井涌情况决定是否关井并进行压井处理措施，确保压稳地层后重新组织固井施工。 2、注入水泥过程中发生井涌、井喷时根据具体情况采取以下措 施： （1）、注放水泥量少时，由钻井队根据井涌情况决定是否关井，如果关井，要节流循环出注入的水泥浆并采取压井措施。压稳地层后重新组织固井施工。 （2）、已经开始注尾桨时出现井涌或井喷时，由钻井队实施关封井器后节流注水泥作业，抢压胶塞、节流顶替。同时启动固井工程公司井控应急预案。 二、尾管固井井控措施
1、尾管固井封固井段短，要计算前置准的使用量，仔细核算地层压力和环空静液柱压力，实现平衡压力固井。 2、固完尾管后要求将钻具起到安全位置，循环出多余水泥浆。在进行循环泥浆时水泥浆正处于失重时期，地层流体容易窜入到水泥浆中。因此，在起钻过程中一定要注意灌泥浆作业，防止起钻过快造成抽吸现象，降低套管内液柱压力后地层流体窜入到水泥浆中造成固井质量不好，防止环空静液柱压力降低后诱发井涌或进喷。 三、注入水泥过程中，水泥车出现不正常情况。 在注入低密度水泥浆阶段： 1、泥浆泵出现凡尔卡住现象，要判断准确，是哪个凡尔卡住， 及时停泵排除。 2、发动机出现供油不畅，能在（10-15分钟）内排除的，排 除后继续施工。如不能排除时，换车继续施工。 3、出现高能混合器堵塞现象，停泵检查排除，时间在5-10 分钟以内。 4、由于操作不当，出现坐住混浆池和倒灌现象时，及时换车 注泥浆，故障车要抓紧时间处理故障。 在注入高密度水泥时：
目录前言 第一章固井概论 第一节固井概念 第二节固井的目的和要求 第二章套管、固井工具、附件和材料第一节API套管标准和规范 第二节固井工具、附件 第三节固井材料 第三章固井工程技术基础 第一节固井工艺 第二节固井水泥浆 第三节注水泥施工程序
第一章固井概述 一、固井概念 为了达到加固井壁，保证继续安全钻进，封隔油、气和水层，保证勘探期间的封层测试及整个开采过程中合理的油气生产等目的而下入优质钢管，并在井筒于钢管环空充填好水泥的作业，称为固井工程。因此固井包括了两部分：下入套管的工艺和注入水泥浆的工艺叫做固井工艺。 固井作业 固井作业是通过固井设计，应用配套的固井设备、辅助设备及工具，将油井水泥、水和添加剂按一定的比例混合后，通过固井泵泵注入井，并顶替到预定深度的井壁与套管、（套管与套管）的环形空间内，使套管与井壁、（套管与套管）之间形成牢固粘结。
固井设备总体示意图 二、固井目的和要求 1、固井的目的 一口油井深达数千米，在钻井过程中常常遇到井漏、井塌、井喷等复杂情况，影响正常钻进，严重时甚至导致井眼报废。遇到上述情况就应下套管固井，封隔好复杂地层后，再继续钻进，直到建立稳定的油气通道为止。因此,为了优质快速钻达目的层，保证油气田的开采，就要采用固井，固井工程的主要目的为： 1）、在钻进过程中封隔易坍塌、易漏失等复杂地层，巩固所钻过的井眼保证钻井顺利进行。
（如图1-1所示），当从A 点钻进至B 点，如果在A 点井深处没下套管固井，那么随着井深的变化，钻达B 点所用泥浆密度在A 点产生的压力就会大于A 点地层破裂压力，造成A 点地层破裂，发生井漏。同理，当从B 点钻进至C 点，如果在B 点井深处没下套管固井，那么随着井深的变化，钻达C 点所用泥浆密度在B 点产生的压力就会大于B 点地层破裂压力，造成B 点地层破裂，发生井漏。 2）、封隔油、气、水层，防止层间互窜。 固井工程不仅关系到钻进的速度和成本，还影响到油气田的开发。（如图1-2所示），如果油、气层与水层间水泥固结不好，层间互相窜通，那么会给油气田开发带来很大困难。当油、气层压力大于水层压力时，油、气便会窜入水层内，既污染了水层又影响到油气的产 量；当水层压力大于油、气层压力时，水便会 图1-1 下套管固井原理示意图 图1-2 固井防止层间流体互窜示意图
AFLP分子标记实验 扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism（AFLP 是在随机扩增多态性（RAPD和限制性片段长度多态性（RFLP技术上发展起来的DNA多态性检测技术,具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点,不需象RFLP 分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了 RAPD技术重复性差的缺陷。同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。 其基本原理是：以PCR（聚合酶链式反应为基础,结合了 RFLP、RAPD的分子标记技术。把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增（在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的’接头”用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增,只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。 一、实验材料 采用青稞叶片提取总DNA 实验设备 1. 美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统, 2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机， 3. 美国MJ公司PCR仪,
4. 安玛西亚电泳仪等。 三、实验试剂 1. 试剂:请使用高质量产品，推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品 DNA提取试剂盒； EcoRI酶,Msel酶,T4连接酶试剂盒； Taq 酶,dNTP, PCR reactio n buffer; 琼脂糖电泳试剂：琼脂糖，无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料;超纯水（18.2M ? ? cm 2. 其他实验需要物品 微量移液枪（一套及相应尺寸Tip头,PCR管，冰浴等。 四、实验流程 1、总DNA提取 使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。一般来说，100ng的基因组DNA作为反应模板是足够的。 2、EcoR1酶消化（20ul体系/样品 EcoR1 1ul
凯氏定氮仪原理： 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。 1.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成(NH4)2SO4 反应式为： 2NH2+H2S04+2H＝(NH4)2S04 (其中CuSO4做催化剂) 2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中 反应式为: (NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O 3.用已知浓度的H2SO4(或HCI)标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量反应式为： (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O＝(NH4)2SO4+4H3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3 凯氏定氮仪操作步骤： (一)消化
1、准备6个凯氏烧瓶，标号。1、 2、3号烧瓶中分别加入适当浓度的蛋白溶液，样品要加到烧瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶颈上。再依次加入硫酸钾-硫酸铜接触剂，浓硫酸，30%过氧化氢。4、5、6号烧瓶作为空白对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，对样品测定进行校正。4、5、6号烧瓶中加入蒸馏水代替样液，其余所加试剂与1、2、3号烧瓶相同。 2、将加好试剂的各烧瓶放置消化架上，接好抽气装置。先用微火加热煮沸，此时烧瓶内物质炭化变黑，并产生大量泡沫，务必注意防止气泡冲出管口。待泡沫消失停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至溶液澄清后，再继续加热使消化液微沸15min。在消化过程中要随时转动烧瓶，以使内壁粘着物质均能流入底部，以保证样品完全消化。消化时放出的气体内含SO2，具有强烈刺激性，因此自始自终应打开抽水泵将气体抽入自来水排出。整个消化过程均应在通风橱中进行。消化完全后，关闭火焰，使烧瓶冷却至室温。 (二)蒸馏和吸收 蒸馏和吸收是在微量凯氏定氮仪内进行的。凯氏定氮蒸馏装置种类甚多，大体上都由蒸气发生、氨的蒸馏和氨的吸收三部分组成。 1、仪器的洗涤 仪器安装前，各部件需经一般方法洗涤干净，所用橡皮管、塞须浸在10%NaOH溶液中，煮约10min，水洗、水煮10min，再水洗数次，然后安装并固定在一只铁架台上。 仪器使用前，微量全部管道都须经水蒸气洗涤，以除去管道
固井工程技术基础
目录前言 第一章固井概论 第一节固井概念 第二节固井的目的和要求 第二章套管、固井工具、附件和材料第一节API套管标准和规范 第二节固井工具、附件 第三节固井材料 第三章固井工程技术基础 第一节固井工艺 第二节固井水泥浆 第三节注水泥施工程序
第一章固井概述 一、固井概念 为了达到加固井壁，保证继续安全钻进，封隔油、气和水层，保证勘探期间的封层测试及整个开采过程中合理的油气生产等目的而下入优质钢管，并在井筒于钢管环空充填好水泥的作业，称为固井工程。因此固井包括了两部分：下入套管的工艺和注入水泥浆的工艺叫做固井工艺。 固井作业 固井作业是通过固井设计，应用配套的固井设备、辅助设备及工具，将油井水泥、水和添加剂按一定的比例混合后，通过固井泵泵注入井，并顶替到预定深度的井壁与套管、（套管与套管）的环形空间内，使套管与井壁、（套管与套管）之间形成牢固粘结。
固井设备总体示意图 二、固井目的和要求 1、固井的目的 一口油井深达数千米，在钻井过程中常常遇到井漏、井塌、井喷等复杂情况，影响正常钻进，严重时甚至导致井眼报废。遇到上述情况就应下套管固井，封隔好复杂地层后，再继续钻进，直到建立稳定的油气通道为止。因此,为了优质快速钻达目的层，保证油气田的开采，就要采用固井，固井工程的主要目的为： 1）、在钻进过程中封隔易坍塌、易漏失等复杂地层，巩固所钻过的井眼保证钻井顺利进行。
（如图1-1所示），当从A点钻进至B点，如果在A点井深处没下套管固井，那么随着井深的变化，钻达B点所用泥浆密度在A点产生的压力就会大于A点地层破裂压力，造成A点地层破裂，发生井漏。同理，当从B点钻进至C点，如果在B点井深处没下套管固井，那么随着井深的变化，钻达C点所用泥浆密度在B点产生的压力就会大于B点地层破裂压力，造成B点地层破裂，发生井漏。 2）、封隔油、气、水层，防止层间互窜。 固井工程不仅关系到钻进的速度和成本， 还影响到油气田的开发。（如图1-2所示）， 如果油、气层与水层间水泥固结不好，层间互 相窜通，那么会给油气田开发带来很大困难。 当油、气层压力大于水层压力时，油、气便会 窜入水层内，既污染了水层又影响到油气的产 量；当水层压力大于油、气层压力时，水便会 图1-1 下套管固井原理示意图 图1-2 固井防止层间流体互窜示意图
钻井、固井联合办公会议要求 一、资料收集（如实收集以下资料，但不限于）： 1、地质资料：地层岩性、地层压力、易垮易漏易缩径层位、漏失层及其漏失压力、油气水界面、周边注水井情况等 2、井身结构：钻头尺寸、上层套管尺寸钢级壁厚等 3、电测资料：井径、井斜、井温，特别是井径扩大率等 4、钻井资料：钻井进度与钻井工程简况(有无井漏、井涌、气测值)、钻井参数、钻具组合、钻井液体系性能、漏失情况、垮塌与缩径、地破试验、钻井过程中出现事故与复杂情况、钻井提升能力、钻井水储存能力、泥浆储备情况等。 5、固井附件的检查、丈量、合扣，管串的排列等； 6、固井添加剂到井数量、型号、类别； 7、其它相关资料。 以上资料的收集应积极要求钻井、泥浆、地质及其它相关方给予以配合，现场办公中出现疑问的及时向相关方请示，并要求解决。 二、固井协调会 1、在完钻前，由钻井公司组织召开办公协调会，参加人员包括：井队钻井工程师、固井工程师、地质、录井工程师、钻井液工程师等； 2、了解地质、工程、油气水及特殊地层情况； 3、提出固井要求，商讨固井方案； 4、明确固井作业中的各方责职，协调需要解决的问题。 5、安排固井日程及准备工作。 三、固井设计编制及审批 1、固井施工作业应编制固井施工设计； 2、固井施工设计应按规定的程序审批； 3、固井施工设计审批人应出具书面审批意见，并附在固井施工设计书内； 4、无固井施工设计或固井设计没有经过审批，不得进行下套管作业。 四、设备准备 1、注替设备 注替设备主要包括以下几个部分： a）钻井队动力系统：柴油机、发电机、配电系统等； b）钻井队循环系统：钻井泵、循环罐、循环管线、水龙头等； c）固井队配注系统：供水车、压风机、配浆车、批混车、注浆车、管线、闸门、流量计等； d）备用替浆系统：钻井队循环系统、固井队配注系统及连接管线等。 2、井控设备 固井作业时，封井器的闸板应与套管配套，按井控细则要求进行试压合格。 3、工具与材料准备 a）工具与材料准备主要包括：套管、套管附件及固井工具、套管密封脂及水泥和外加剂等，b）所有材料在作业前按设计规格与数量送井，现场检查、登记 c）固井附件在到井后完成检查、尺寸测量、草图绘制、合扣等工作。 d) 中途循环工具、供浆管线、二级循环排污管线的准备。 4、下套管工具的准备 吊卡、B型钳、垫叉、专用吊带、灌浆装置、防掉落物装置、回接作业还应准备长吊环。 五、井眼准备 a）高压油、气、水井，下套管前必须压稳。当地层漏失压力和孔隙压力差值很小容易发生井漏时，对于气井固井应控制油气上窜速度小于15m/h，油井固井应控制油气上窜速度小于25m/h； b）套管与井眼环空间隙一般应不小于19mm时，必要时宜采取扩眼等相应措施； c）下套管前应对不规则井段（小于钻头直径井段；起下钻遇阻、遇卡井段；井斜变化率或全角变化率超过规定的井段），存在积砂和砂桥井段）或油气层、重点封固井段用标准钻头原钻具对不规
3 实验原理 3.1人工抗原的制备原理（以奥沙普秦为例） 奥沙普秦为小分子物质（分子质量小于500），本身不具有诱导产生抗体的能力，必须设法先将奥沙普秦与载体蛋白质偶联制备出相应的人工完全抗原，这是半抗原免疫分析的关键所在。合成人工抗原的机理为：水溶性的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的羟基与奥沙普秦的羧基在脂溶性缩合剂二环己基碳二亚胺（DCC）的作用下，脱水缩合形成活泼酯化奥沙普秦中间化合物，然后载体蛋白在某一PH值下，一般是大于其等电点，是蛋白质中的氨基暴露出来，从而成为提供伯胺的底物，然后亲核进攻活性中间产物活泼酯化奥沙普秦，从而达到小分子化学物偶联到载体蛋白的目的。 3.2 ELISA技术的原理 ELISA 是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。ELISA 法是免疫酶技术的一种，其特点是利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原/抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应都在其中进行。在每次反应后都要反复洗涤，这既保证了反应的定量关系，也避免了末反应的游离抗体/抗原的分离步骤。在ELISA 法中．酶促反应只进行一次，而抗原、抗体的免疫反应可进行一次或数次，即可用二抗(抗抗体)、三抗再次进行免疫反应。 目前常用的几种ELISA 方法有：测定抗体的间接法，测定抗原的双抗体夹心法和测定抗原的竞争法等。 3.3 ELISA竞争抑制法的原理 包被好的抗原与加入的抗原（标准抗原）形成竞争，如果抗体石特异性抗体，它就会与游离的标准抗原结合，而不与板上的检测
流式细胞仪原理及操作步骤 流式细胞仪（FCM）是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起 来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的 研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断， 对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术 是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。 （一）原理一 活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。 （二）操作步骤 制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用 于本法） 用10% FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5X 106?IX 107/ ml 取40卩1细胞悬液加入预先有特异性McAb（5?50卩I） 的小玻璃管或塑料离心管，再加50卩I 1 : 20（用DPBS （或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇 J 4 C 30mi n 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpmx 5mi n J] 加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光 显微镜下观察，视细胞浓度加入100?500 ^1固定液） FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 （标本在试管中可保存5?7天） （三）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10% FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液（见附录）。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
分析仪操作及原理 注意： 1、标定前请确认标气背景气、标定气含量，保证通入仪器的是对应的标气。 2、百分含量仪器通入标气后需稳定10分钟以上方可标定，微量仪器需稳定时间更长一 些，待数值稳定以后再进行标定。 CO2红外气体分析仪(AIA1203) 这台仪器为ABB生产EL2020系列型号为Uras26，测量范围0~5~20ppm.vol.CO2，精度为±1% 一、测量原理（红外式） 根据不同组分气体对不同波长的红外线具有选择性吸收的特性而工作的分析仪表。测量这种吸收光谱可判别出气体的种类；测量吸收强度可确定被测气体的浓度。 各种多原子气体（CO,CO2,CH4等）对红外线某一段电磁波的辐射都能具有一定的吸收能力，而且这种吸收能力对波长具有选择性，只有当红外光谱中某一段光谱的频率与物质分子本身的频率一致时，该物质分子才吸收这一段红外光谱的辐射能。我们把能吸收的这一段红外线光谱称为该气体的特征吸收波段。气体吸收了红外线光谱的辐射能后，一部分可转变成热能，使温度升高。红外线光谱的辐射又特别显著，这就能让我们利用各种元件，如热电堆、热敏电阻等去测量红外线辐射能的大小。 二、标定 1、选择校准菜单：menu calibrate manual calibration. 2、用箭头键选择zero gas。 3、接通零点气。操作零点气钢瓶减压阀组件，使输出压力控制在20kpa，将操作面板上 多通阀（5MV）切向“零点气”，打开测量流量计，调整“测量”转子流量计旋钮，使进气量控制在30L/H左右。 4、确认零点气连接上并且零点气浓度值输入后。按ENTER键确认。 5、当测量示值显示稳定，按ENTER键开始校准零点。 6、接受校准结果按ENTER键；不接受校准结果返回步骤6按BACK键；不接受校准结 果返回测量状态按MEAS键。 7、用箭头键选择SPAN GAS（零点标定完成后会自动跳到zero 和span的选择窗口。 8、按4步骤接通量程气。
长庆石油勘探局固井工程公司 固井标准化施工流程图 ——接到调度指令 ——安排施工车辆 1. 根据施工任务平衡车辆。 2. 按技术要求安排装灰，装灰车俩带好装灰卡片，以便施工前对水泥品种数量进行确认。 ——对施工车辆进行出车前的安全性能检查 安全提示： 1．所有参加施工的车辆全部上地沟进行安全性能检查； 2. 合格通过，不合格整改或更换车辆； 3. 检查合格的灰罐车到灰库装灰； 4. 其它车辆原地待命 ——召开出车前的安全讲话会 安全提示： 1.对执行本次任务进行风险识别并制定削减措施； 2.对参加施工的车辆进行挂牌和编号，并规定行车速度(执行勘探局特殊路段行车规定) 3.指定施工、行车负责人； 4.对此次任务所经过路线的路况进行通报，并制定出相应的安全
——出发 安全提示： 存在的风险： 1.长途行车，驾驶员容易疲劳打瞌睡； 2.超速行驶、无证驾驶、行人或非机动车辆横穿公路； 3.车辆通过街道、十字路口等危险路段时注意来往车辆和行人； 4.队车不能坚持和保持。 应对措施： 1.队车行驶，干部押车带队。车辆在行驶过程中，驾驶员严格遵守《道路交通安全法》、《道路交通安全实施条例》及公司安全管理规定； 2.严格执行《长庆石油勘探局机动车行驶不同路段限速标准》，严格控制车速；禁止强超强在驾驶车辆时吸烟、饮食或接打手机； 3.每行驶100公里停车检查一次。注意：车辆不得停放在悬崖、低洼、河道、窄道、弯道、桥梁、涵洞等不安全地带； 4.在通过城镇、村庄等时要坚持队车行驶，相互照应； 5.危险路段先踏勘后指挥通过。 ——交通应急处理 1、出现紧急状况时，执行<<固井工程公司应急预案>> 2、驾驶员、押车人员应急程序： 如果你卷入一起交通事故中，必须停车，不停车就属于
3D打印工作原理及操作步骤 3D打印机正如其名，是一种能够打印出3D实体的机器。如我们普通的打印机一样，能够在纸面上打印出任意形状的画面。理想的3D打印机能够在3维空间中打印出任意形状的实体模型，能够不受结构工艺限制，直接将零件的3维数据资料打印成实体零件 在传统的机械设计程序上，一个零件需要由设计者设计完成，并绘制好2维图纸（通常是3视图的形式，并且有些细节部位还需要追加详细图）。然后把这个零件的图纸交给机械工艺师，机械工艺师会根据你的零件图纸排列加工制造工序，再然后工人会按照机械工艺师设计安排的工序来制造零件。通常这个流程还不能一次性完成。机械设计者设计的零件可能会有部分结构不容易加工制造，机械工艺师会将信息反馈给机械设计师，机械设计师再修改图纸。而一旦有了3D打印机，整个流程就简化了。设计者设计完成零件后，就可以直接制造。不需要绘制3视图，不需要细节描述的详细图，不需要工艺师的编排工序，不需要工人加班，而且极少有结构工艺限制，只需要3维数据 本文分为两个部分，第一部分将为简要介绍FDM式3D打印机的工作原理，第二部分介绍打印机的硬件和软件操作。 第一部分：FDM式3D打印机原理简介 任何3维物体都可以看成是由一个个面堆叠累积而成的。就像宝塔一样，是由一层一层的楼堆起来的。比如说，一个球形物体，就可以看成是由一个个厚度很小直径不同的圆柱堆在一起形成的。对于任何一个物体，都可以看成是由一个个厚度很小的菱形物体堆起来的。如果引用数学中的概念，那么就是，当这些菱形的厚度趋近于无穷小的时候，这个堆砌起来的实体与目标实体就是完全一致的。遗憾的是，现实中任何物体都是有厚度的。可是我们可以把这个厚度做到很小，小到我们能容忍的误差以下，就够了。FDM式的3D打印机就是利用这个原理，将任意一个三维数据实体，切割成一个个面来分析。那么理论上只要这台打印机能够实现打印出任意形状的面，它就可以打印出任意形状的物体了（不考虑重力对结构的限制因素）。所以FDM式的3D打印机有一个喷嘴，它能够稳定连续的喷出直径一定的塑料（或者其他热融性的材料）。这个喷嘴一般由步进电机来控制移动。就像我们捏牙膏一样，我们一边用力捏牙膏，一边移动牙膏，就可以把牙膏在牙刷上涂一条直线出来。3D打印机的原理就和我们捏牙膏是一模一样的，只是它的运动由3D实体数据来控制，而且喷出来的材料是稳定的，它一边喷一边按照特定的方式移动。这样它就可以打印出特定的形状来了。等热融性的材料冷却下来，这个实体就定形了。那么我们怎么从手头一无所有，到打印出一个实体呢？世界上3d设计软件千奇百怪，我们怎么把自己设计的3维实体做成能够被打印机应用的数据呢？这里一定要感谢世界上的开源组织和标准化组织（通常是行业的龙头老大）。是他们让我们虽然使用不同的软件，但是我们仍然可以用同样的数据来交流。所有的3D模型都可以导出同样格式的数据，比如说stl，x_t，step等等格式。还有控制机床运动的加工语言：G语言。因为这些标准的存在，让我们整个流程可以走得更顺畅。从技术实现角度来看，要实现FDM式3D打印机，就只需要实现以下三个技术： 1、能够将3维数据格式（如：stl,x_t,step）解析成机械加工的G语言。 正如前文所说，这一个步骤实质上就是生成“捏牙膏的方法”。在这个步骤里，3维数据被解析成一层层面，面被解析成一条条线。线被解析成一条条的G代码。这里的解析方法可以有开源社区提供。这里也稍微简介一下G代码：G代码是用来控制机械加工刀具（喷嘴）运动的代码。 2、能够解析G代码的机器。 通过第1个技术手段，我们有G代码。接下来就需要一台能够“读懂”G代码的机器。要
Transwell实验原理与操作步骤 Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解， 这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子， 不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张 有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培 养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内， 由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不 需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择 3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 （2）趋化性实验： 可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细 胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 ①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞 B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 ②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 （3）肿瘤细胞迁移实验： 常用8.0、12.0μm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤 细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
https://www.doczj.com/doc/2410538053.html,
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钻井分直井和定向井。定向井可分为：普通定向井、大斜度井、丛式井、多底井、斜直井、水平井等。 普通定向井：在一个井场内仅有一口最大井斜角小于 60°的定向井。大斜度井：在一个井场内仅有一口最 大井斜角在 60°～86°范围内的定向井。丛式井：在一个井场内有计划地钻出的两口或两口以上的定向井 组，其中可含一口直井。多底井：一个井口下面有两个或两个以上井底的定向井。斜直井:用倾斜钻机或倾 斜井架完成的，自井口开始井眼轨道一直是一段斜直井段的定向井。动画 3-1
一、钻井过程
1、准备工作 定井位：地质师根据地质上或生产上的需要确定井身轴线或井底的位置。 修公路：主要保障能通行重车，有的满载车总重可达 39～40 吨或更多。 平井场：在井口周围平整出一块场地以供施工之用。井场面积因钻机而异，大型钻机约需 120×90m2， 中型钻机可为 100×60m2。 打基础：为了保证施工过程中各设备不因下陷不均匀而歪斜，要打基础。小些的基础用预制件，大的基 础则在现场用混凝土浇灌。 安装：立井架，安装钻井设备。 2、钻进 当前世界各地普遍使用的打井方法是旋转钻井法，此法始于 1900 年。 钻进：钻进直接破碎岩石的工具叫钻头。钻进时用足够的压力把钻头压到井底岩石上，使钻头的刃部吃 入岩石中。钻头上边接钻柱，用钻柱带动钻头旋转以破碎并底岩石广井就会逐渐加深。加到钻头上的压力 叫钻压，是靠钻柱在洗井液中的重量(即减去浮力后的重量)的一部分产生的。 钻柱把地面的动力传给钻头，所以，钻柱是从地面一直延伸到井底的，井有多深，钻柱就有多长。随着 井的加深，钻柱重量将逐渐加大，以致于将超过钻压的需要。过大的钻压将会引起钻头、钻柱、设备的损 坏，所以必需将大于钻压的那部分钻柱重量吊悬起来，不使作用到钻头上。钻柱在洗井液中的重量称为悬 重，大于钻压需要而吊悬起来的那部分重量称为钻重。亦即钻压=悬重一钻重。 井加深的快慢，即钻进的速度，用机械钻速或钻时表示。机械钻速是每小时破碎井底岩石的米数，即每 小时进尺数。钻时是每进尺 1m 所需时间，以分钟表示。此二者互成倒数。 洗井：井底岩石被钻头破碎以后形成小的碎块，称为岩屑。岩屑积多了会妨碍钻头钻切新的井底，引起 机械钻速下降。所以必需在岩屑形成以后及时地把它们从井底上清除掉，并携出地面，这就是洗井。 洗井用洗井液进行。洗井液可以是水、油等液体或空气、天然气等气体。当前用得最多的是水基泥浆， 即粘土分散于水中所形成的悬浮液。也有人称洗井液为钻井液，但多数人则把各种洗井液统称之为泥浆。 钻柱是中空的管柱，把洗井液经钻柱内孔柱入井中，从钻头水眼中流出而冲向井底，将岩屑冲离井底， 岩屑随同洗井液一同进入井眼与钻柱之间的环形空间，向地面返升，一直返出地面，见图 3-1。岩屑在地 面上从洗井液中分离出来井被清除掉，不含岩屑的洗井液再度被注入井内，重复使用。洗井液为气体时则 不再回收。
ELISA方法的基本原理和操作步骤 自己收集整理的 错误在所难免 仅供参考交流 如有错误 请指正！谢谢 ELISA方法的基本原理和操作步骤 基本原理 1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay ELISA）用于IgG定量测定的文章 使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法 这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面 并保持其免疫活性 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体 这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性 又保留酶的活性 在测定时 把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开 最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例 加入酶反应的底物后 底物被酶催化变为有色产物 产物的量与标本中受检物质的量直接相关 故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析 由于酶的催化频率很高 故可极大地地放大反应效果 从而使测定方法达到很高的敏感度 方法类型和操作步骤 ELISA可用于测定抗原 也可用于测定抗体 在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体 ②酶标记的抗原或抗体 ③酶作用的底物 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件 可设计出各种不同类型的检测方法
（一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法 操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接 形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间 让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合 形成固相抗原复合物 洗涤除去其他未结合的物质 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合 彻底洗涤未结合的酶标抗体 此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物 根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量 根据同样原理 将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物 即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体 （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时 如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体 则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5） 这种双位点一步不但简化了操作 缩短了反应时间 如应用高亲和力 的单克隆抗体 测定的敏感性和特异性也显著提高 单克隆抗体的应用使测定抗原的ELIS 在一步法测定中 应注意钩状效应（hookeffect） 类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象 当标本中待测抗原浓度相当高时