第27卷第2期 唐山师范学院学报 2005年3月 Vol. 27 No.2 Journal of Tangshan Teachers College Mar. 2005
────────── 收稿日期：2004-10-20
作者简介：高凤菊（1978-），女，河北乐亭人，四川农业大学生命科学学院硕士研究生。 - 7 -
真菌与细菌纤维素酶研究进展
高凤菊1，李春香2
（1.四川农业大学 生命科学学院，四川 雅安 625014；2.唐山师范学院 生物系，河北 唐山 063000）
摘 要：对分解纤维素真菌及细菌的种类，纤维素酶的组成和分类，分子结构、作用机理，纤维素酶基因工程及研究展望进行了综述。
关键词：真菌；细菌；纤维素酶
中图分类号：Q556+.2 文献标识码：B 文章编号：1009-9115（2005）02-0007-04
资源和环境问题是人类在21世纪面临的最主要的挑战。生物资源是可再生性资源，地球上每年光合作用的产物高达1.5×1011~2.0×1011t ，是人类社会赖以生存的基本物质来源。其中90％以上为木质纤维素类物质，[1]其中的纤维素是地球上最丰富
的多糖物质，
[2]
这类物质是植物细胞壁的主要成分，也是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。我国的纤维素资源极为丰富，每年农作物秸秆的产量
达5.7×108t ，
约相当于我国北方草原年打草量的50倍。目前这部分资源尚未得到充分的开发利用，主要用于燃料，畜牧饲料与积肥，不仅利用率低，还
对环境造成一定的污染。
[3]
随着世界人口迅速增长、粮食、矿产资源日渐枯竭，开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，即化工原料的“绿色化”，具有极其重大的现实意义和光明的发展前景。
在自然界中，许多霉菌[4]和细菌[5]都能产生纤维素酶，但有关细菌纤维素酶的报道很少。由细菌所产生的纤维素酶一般最适中性至偏碱性，因为这类酶制剂对天然纤维素的水解作用较弱，长期以来没有得到足够的重视。近十几年来，随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的使用性能和巨大的经济价值。[6][7][8] 1 纤维素分解微生物
1.1 纤维素分解性细菌 (cellulose decomposingbacteria )
纤维素分解性细菌是能分解纤维素的细菌。由于纤维素酶等的作用，纤维素可一直被分解到葡萄糖为止，有时在分解过程中会积累纤维二糖。这类
细菌多见于腐植土中。好氧性细菌如纤维单胞菌属（Cellulomonas ）、纤维弧菌属（Cellvibrio ）、噬胞菌属（Cytophaga ）等能分解纤维素；但在好氧条件下土壤中纤维素的分解，主要是纤维素分解真菌在起作用。而在厌氧条件下纤维素的分解，一些厌氧性的芽孢梭菌属（Clostridium ）的细菌具有重要作用。纤维素分解细菌亦可栖息于草食动物的消化道、特别是反刍动物的瘤胃中。它们在其中进行分解纤维素的活动，这些细菌是厌氧性细菌，例如产琥珀酸拟杆菌（Bacteroides succinogenes ）、牛黄瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens ）、白色瘤胃球菌（R.albus ）、溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens ）（程光胜 译）等。细菌纤维素酶多数结合在细胞膜上，菌体细胞需吸附在纤维素上才能起作用，使用很不方便，酶的分离提取也较困难。但是细菌主要产生中性纤维素酶和碱性纤维素酶。碱性纤维素酶由于在洗涤剂工业中有良好的应用价值，也成为研究热点，其产生菌主要集中在芽孢杆菌属[9]。由于酶的耐热性在生产中具有现实意义，所以耐热细菌也是研究的热点。 1.2 纤维素分解性真菌
真菌类有黑曲霉、血红栓菌、卧孔属、疣孢漆斑菌QM460、绳状青霉、变幻青霉、变色多空霉、乳齿耙菌、腐皮镰孢、绿色木霉、里氏木霉、康氏木霉、嗜热毛壳菌QM9381和嗜热子囊菌QM9383等[10]；丝状真菌产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物。真菌纤维素酶通常是胞外酶，酶被分泌到培养基中，用过滤和离心等方法就可较容易地得到无细胞酶制品。目前饲用纤
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维素酶的生产多采用真菌，其中木霉纤维素酶产量高、酶系全，故而被广泛应用。 2 纤维素酶的组成及分类
纤维素酶是一种多组分的酶系，采用各种层析、电泳等技术可将纤维素酶分成不同的组分。此酶指的是能降解纤维素β-1，4-葡萄糖苷键的一类酶的总称，因此纤维素酶又有纤维素酶复合物之称，是一个由多种水解酶组成的复杂酶系，主要来自于真菌和细菌。纤维素酶的组成与分类有两种主要的分类形式。第一种分类方法是根据各酶功能的不同主要分为三类：（Ⅰ）葡聚糖内切酶（EC3.2.1.4，1，4-β-D-glucan glucanohydrolase 或endo-1，4-β-D-glucanase ，来自于真菌简称为EG ；来自于细菌简称为Len ），此酶又称Cx 酶（Cx enzyme ）、CMC 酶（羧甲基纤维素酶）（carboxymethyl cellulase ），缩写为EC ：3。（Ⅱ）葡聚糖外切酶（1，4-β-D-glucan cellobilhydrolase 或exo-1，4-β-D-glucanase ，EC3.2.1.91，来自于真菌简称Cbh ；来自于细菌简称
Cex ），此酶又称C 1酶（C 1enzyme ）
、微晶纤维素酶（avicelase ）、纤维二糖水解酶（cellobihyddrolase ），缩写为：CHB ：2。（Ⅲ）β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21，β-1，4-glucosidase 或glycosidase ），又称为纤维二糖酶（cellobiase ），缩写为：BG ，这类酶将纤维二糖和短链纤维寡糖水解成葡萄糖分子。对纤维二糖和纤维三糖的水解很快，随葡萄糖聚合度的增加水解速度下降。该酶的专一性差，实际上可作用于所有的葡萄糖β-二聚物。[11]
第二类通常认为主要包括C 1酶、C X 酶和β-葡萄糖苷酶。C 1酶主要作用天然纤维素，将其转变成水合非结晶纤维素；C X 酶又可分为C X1酶和C X2酶，C X1酶是内断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子内部作用于β-1，4-葡萄糖苷键，生成纤维糊精和纤维二糖，C X2酶为外断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子的非还原性末端作用于β-1，4-葡萄糖苷键，逐步切断β-1，4-糖苷键生成葡萄糖。纤维二糖酶又称β-葡萄糖苷酶，其作用于纤维二糖，生成葡萄糖。这些酶协同作用可将纤维素彻底降解为还原糖——葡萄糖。[12][13] 3 纤维素酶的分子结构
纤维素酶分子是由球状的催化结构域Catalytic Domain （CD ）通过一个富含脯氨酸或羟基氨基酸的连接桥（Linker ）和没有催化作用纤维素结合结构域，被称为Cellulose Binding Domain （CBD ）三部分组成。
纤维素酶分子的催化结构域（CD ），主要体现
酶的催化活性及对特定水溶性底物的特异性。内切
酶的活性位点位于一个开放的裂口（cleft ）中，它可结合在纤维素链的任何部位并切断纤维素链。外切酶的活性位点位于一个长环状通道中，它只能从纤维素链的非还原性末端切下纤维二糖。
纤维素结合结构域（CBD ）在纤维素酶中位于肽链的氨基端或羧基端，通过连接桥与催化结构域相连。纤维素结合结构域不具备水解纤维素的功能，但有助于纤维素酶与底物的结合，它的三维结构极其复杂，对酶的催化活力起决定作用。人们推测，CBD 可能通过芳香环与葡萄糖环的堆积力吸附到纤维素上，由CBD 上其余的氢键形成残基与相邻葡萄糖链从纤维素表面脱离开来，以利于催化区的水解作用。但有一些纤维素酶并没有CBD ，如热纤梭菌是依靠纤维素酶系中的纤维小体(celluosome)吸附纤维素的。CBD 执行着调节酶对可溶和非可溶性底物专一性活力的作用，对酶的催化活力是非常必需的。CBD 是一面亲水，另一面疏水的楔形结构，能插入和分开纤维素的结晶区，在其吸附于纤维素分子链表面后，酶分子连接到纤维素上，可能提高了底物表面有效酶的浓度，或者可能促进了纤维素表面单个葡聚糖链的增溶溶解，具有疏解纤维素链的作用。不同的CBD 以不同的拓扑学结构与结晶纤维素结合，都具有相似的刚性支柱结构，以便进行识别和结合所需的侧链能正确定位。[14]
连接桥（Linker ）是一段相当长、高度糖基化的连接肽，此区大多富含脯氨酸和羟脯氨酸，它的作用可能是保持CD 和CBD 之间的距离；有助于同酶分子间形成较为稳定的聚集体。[15]
虽然真菌和细菌产生的纤维素酶分子差别很大，但它们的催化区在一级结构上氨基酸数量和三维结构上的大小却基本一致。但它们的Linker 和CBD 却存在明显的差异。真菌和细菌来源的纤维素酶的CBD 的三维结构也得到了解析，真菌CBD 由33－36个氨基酸组成，且具有高度的同源，而细菌由100－110个氨基酸组成，同源性较低。真菌的外切酶的CBD 的结构形状呈“楔型”，一面亲水，另一面疏水；结构中芳香族氨基酸只有3个Tyr ，它们位于平坦的亲水面，执行吸附纤维素的功能；细菌外切酶的CBD 很大，且包含很多芳香族氨基酸，它们中的Trp54和Trp72暴露于蛋白分子表面，执行吸附功能。
细菌纤维素酶linker 富含Pro 和Thr ，完全由Pro-Thr 这样的重复顺序组成，而真菌的纤维素酶linker 富含Gly ，Ser 和Thr 。不同维素酶linker 的糖
高凤菊，李春香：真菌与细菌纤维素酶研究进展
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基化程度和糖链也不同，糖化不是纤维素酶活力所必需的。在高级结构的分子形状上，细菌纤维素酶CD 与CBD 夹角为135°；真菌纤维素酶CD 与CBD 夹角为180°[17][18][19]。有限酶切时，真菌纤维素酶只具有一个酶切位点，在靠近CD 与连接桥边结区，酶切时可将CBD 与连接桥一并切去；而细菌的外切酶具有两个酶切位点，有限酶切时，可将CBD 和连接桥分别切去。[15]
4 纤维素酶对纤维素的作用机理
1950年，Reese 等曾阐明没有一种纤维素酶生产菌能生产出分解棉花中的天然纤维素的酶，但发现有的菌株生产的酶能分解膨润的纤维素或纤维素诱导体等非晶体性纤维素，因而提出了由于天然纤维素的特异性而必须以不同的酶协同作用才能分解的C 1—Cx 假说。其中C 1是一水解因子，作用于纤维素的结晶区，使氢键破裂，呈无定形可溶态，再由Cx 催化它们形成纤维二糖，再由β-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。协同作用一般认为是内切葡萄糖酶首先进攻纤维素的非结晶区，形成外切纤维素酶需要的新的游离末端，然后外切纤维素酶从多糖链的非还原端切下纤维二糖单位，β-葡萄糖苷酶再水解纤维二糖单位，形成葡萄糖。一般地说，协同作用与酶解底物的结晶度成正比，当酶组分的混合比例与霉菌发酵滤液中各组分比相近时，协同作用最大，不同菌源的内切与外切酶之间也具有协同作用。
近年来，人们应用凝胶过滤、离子交换层析、凝胶电泳以及等电聚集等生化分离分析手段，发现纤维素酶非常复杂。Shoemaker 、Goeran 和Jinshce 等人相继发现，内切葡萄糖酶、纤维二糖水解酶及β-葡萄糖苷酶均存在2～4个同功酶，对于这些同功酶的功能，目前尚未见有明确的阐述，因此酶解机理还有待进一步研究和探讨。[21][22]
真菌通过分泌到胞外的游离纤维素酶，以水解酶机制和氧化酶机制降解纤维素；而细菌纤维素酶则是以形成多酶复合体结构而起作用。细菌纤维素酶复合体能够更加彻底有效降解天然纤维素。纤维小体（Cellulosome ）是研究较多的细菌纤维素酶复合体。目前已经在许多细菌中发现纤维小体，[23][24]最初认为纤维小体只是介导细菌与纤维素相连的一种结构，故称之为纤维素结合因子（cellulose binding factors ，CBF ）。后来发现能高效降解结晶纤维素、非结晶纤维素以及木质素，以多酶复合体的形式存在，功能上类似真菌线粒体，于是改称纤维小体。有关纤维小体的结构、组成、高效催化机制是天然纤维素降解中令人感兴趣的内容。细菌降解天然纤维素的主要产物是纤维二糖，但是仅仅只有内切纤维素酶是不可能做到这一点的。外切纤维素酶与纤维二糖水解酶的作用主要是从纤维素的非结晶区及
结晶区产生纤维二糖。
[25][26]
真菌纤维素酶合成后分泌到胞外，它们对纤维素的降解通过内、外切酶之间的协同作用。枯草杆菌、假单孢杆菌、纤维单孢菌可产生胞外内切纤维素酶，而无外切纤维素酶的形成。高温厌氧纤菌一般形成“纤维素酶小体”（celluosome ）并在胞壁上形成一个外凸的“小刺”来降解底物。通常，细菌纤维素酶的降解效率低于真菌。[27] 5 纤维素酶基因的克隆及表达
目前有近100多个纤维素酶及木聚糖酶基因都可在大肠杆菌中克隆和表达，主要是内切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶。纤维素酶合成调节、纤维素降解机制和新酶分子的构建等研究可通过基因克隆来实现。细菌纤维素酶DNA 提取、酶切、构建重组质粒和转化已无特殊困难。真菌纤维素酶基因克隆，因基因序列表达及转录后酶的糖基化修饰、分泌后可能存在蛋白质水解等问题都可能对各种纤维素酶活力的检测造成一定困难。 6 结束语与展望
细菌纤维素酶和真菌纤维素酶具有显著不同的性质，它必须在细菌与纤维素相接触的情况下才能水解纤维素。虽然在培养基中可以发现少量的纤维素酶，但不具活性。这是因为细菌所产的纤维素酶绝大多数是胞内酶，活力也较低，因此直接从细
菌分泌物中提取纤维素酶基本上是不可行的。[28][29]
但是随着基因工程技术的发展，特别是重组DNA 技术的引入，从细菌来生产纤维素酶的可行性日益增加。众所用知，由于细菌具有结构简单、繁殖快等特点，因此它是基因工程的主要材料。近年来，由于对纤维素酶的基因研究取得了相当大的进展，因此从细菌中提取纤细素酶将可能以其高效性而成为提取纤维素酶的一个重要发展方向。[30][31][32]
纤维素物质是年产量巨大的可再生资源，如何成功的开发这一资源，对人类的可持续发展具有非常重要的意义。在对环境和生态问题高度重视的今天，人们利用微生物降解纤维素来实现生物量的转化利用，同时如何成功利用纤维素酶始终是研究者的目标。纤维素酶在饲料、食品、采油、医药、化工、纺织等方面有巨大的潜在市场。
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Studies on Cellulase from Eubacterium and Bacterium
GAO Feng-ju1, LI Chun-xiang2
(1. School of Life Sciences, Sichuan Agriculture University, Sichuan Yaan 625014, China;
2. Biology Department, Tangshan Teachers College, Hebei Tangshan 063000, China)
Abstract: Studies on the classification of eubacterium and bacterium to decompose cellulose, the constitution, classification, molecular structure, mechanism, gene engineering and research expectation of cellulase were summarized in this paper.
Key words: eubacterium; bacterium; cellulase
责任编辑、校对：李春香
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纤维素酶的作用机理及进展的研究 摘要：纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，本文论述了纤维素酶的性质，重点介绍了纤维素酶的作用机理、应用及其研究进展，并对其研究前景做了展望。关键词：纤维素酶；纤维素；作用机理； 0引言 纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国内外业内人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。 纤维素占植物干重的35%-50%[1],是世界上分布最广、含量最丰富的碳水化合物。对人类而言，它又是自然界中最大的可再生物质。纤维素的利用和转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义[2]。 1 纤维素酶的性质 纤维素酶是一种重要的酶产品，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶活力。纤维素酶是四级结构，,产生纤维素酶的菌种容易退化，导致产酶能力降低。由于纤维素酶难以提纯，实际应用时一般还含有半纤维素酶和其他相关的酶，如淀粉酶（amylase）、蛋白酶（Protease）等。 纤维素酶的断键机制与溶菌酶一样，遵循双置换机制。纤维素与酶相互作用中，是酶被底物分子所吸附，然后进行酶解催化，酶的活性较低，仅为淀粉酶的1/100[3] 纤维素酶对底物分子的分解，必须先发生吸附作用。纤维素酶的吸附不仅与自身性质有关，也与底物密切相关，但纤维素酶的吸附机制总体并未弄清，仍需进一步研究[4]。 2 纤维素酶的作用原理 （1）、纤维素酶在提高纤维素、半纤维素分解的同时，可促进植物细胞壁的溶解使更多的植物细胞内溶物溶解出来并能将不易消化的大分子多糖、蛋白质和脂类降解成小分子物质有利于动物胃肠道的消化吸收。 （2）、纤维素酶制剂可激活内源酶的分泌，补充内源酶的不足，并对内源酶进行调整，保证动物正常的消化吸收功能，起到防病，促生长的作用。 （3）、消除抗营养因子，促进生物健康生长。半纤维素和果胶部分溶于水后会产生粘性溶液，增加消化物的粘度，对内源酶造成障碍，而添加纤维素酶可降低粘度，增加内源酶的扩散，提高酶与养分接触面积，促进饲料的良好消化。 （4）、纤维素酶制剂本身是一种由蛋白酶、淀粉酶、果胶酶和纤维素酶等组成的多酶复合物，在这种多酶复合体系中一种酶的产物可以成为另一种酶的底物，从而使消化道内的消化作用得以顺利进行。也就是说纤维素酶除直接降解纤维素，促进其分解为易被动物所消化吸收的低分子化合物外，还和其他酶共同作用提高奶牛对饲料营养物质的分解和消化。
从土壤中分离产几丁质酶的真菌 作者：王春学号:11101680 摘要：几丁质是自然界中储量仅次于纤维素的生物多聚体,它广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物体中,是绝大多数真菌细胞壁的结构物质,同时还是昆虫中肠围食膜的主要成分[1].几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)[2]可催化水解几丁质的β21,4糖苷键生成N2乙酰2D2氨基葡萄糖(NAG),它在植物病虫害,尤其是对真菌病的防治方面,以及在几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视.通过几丁质作为碳源,从土壤中筛选产几丁质酶菌株. 1 材料与方法 1.1 培养基 1.1.1 平板培养基 (1)细菌几丁质培养基(分离用):蛋白胨10g,K2HPO40.7g,MgSO40.5g,KH2PO40.3g,胶体几丁质5.0g,琼脂15～20g,蒸馏水1L,pH值为7. 2.(2)纯几丁质培养基:胶体 几丁质 5.0g,KNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.1.1.2 摇瓶培养基 (1)种子培养基(LB培养基):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1L,pH值为7.0.(2)发酵培养基:用细菌几丁质培养基(分离用),但不加琼脂 1.2 菌株的分离 1.2.1 菌株初步分离从生产几丁质的工厂排污沟附近土壤采集土样,经过烘干及风化干燥,置于60目分样筛过筛,备用.称取1g土样放入加有9mL无菌水的离心管,分别稀释制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释倍数的土壤溶液.从10-3,10-4,10-5,10-6不同稀度倍数的4管土壤稀释液中各吸取0.1mL,接种在纯几丁质培养基和细菌几丁质培养基的平板上,用涂布棒涂布均匀,在30℃下培养72h. 1.2.2 菌种的二次筛选从第1次稀释涂布的平板中挑取可以产生透明圈的菌落,再一次通过稀释涂布的方法,将其接种于纯几丁质平板和细菌几丁质平板上,培养72h,以取得纯菌落平板.从第2次筛选的纯菌平板上选取水解圈直径与菌落直径比最大的菌种,将其接种于50mL的LB种子培养基上,12h后以2%的接种量接于100mL的细菌几丁质发酵培养基中,在30℃下进行扩大培养. 1.3 菌种的鉴定 1.3.1 细菌染色体DNA提取从新培养产几个质酶活性高的革兰氏阴性细菌平板上,挑取一环菌落至加有500μLTE缓冲液的1.5mL微量离心管中,混匀后沸水浴1.5min,迅速低温离心(12000r?min-1)10min,取上层清液分装后,置4℃下保存备用. 1.3.2 16SrDNA引物根据16SrDNA的结构,应用B2/B3做引物,该引物扩增片段包含V8和V9两个高变区,扩增产物大小为1050bp(basepair,碱基对)左右.这两个引物序列为B2:5’2ACGGGCGGTGTGTAC23’;B3:5’2CCTACGGGAGGCAGCAG23’. 1.3.3 聚合酶链反应(PCR)检测 PCR反应体系为20μL,二次蒸馏水1 2.6μL,10倍扩增缓冲液2.0μL,25mmol?L-1Mg2+1.6μL,各2.5mmol?L-1的脱氧核苷三磷酸(dNTP)0.4μL,20μmol?L-1引物各1.0μL,DNA模板1.0μL,5GU?L-1Taq酶0.4μL.PCR循环:94℃预变性5min,94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸90s,循环30次,并在72℃后延伸15min. 1.3.4 扩增产物的电泳分析用1倍的TAE缓冲液配制质量分数为1%琼脂糖凝胶.取PCR 扩增产物10μL,加2μL溴酚蓝指示剂,混匀后加样,于100V下电泳1.5h,紫外灯下观察电泳结果. 1.3.5 序列测定与分析将观察到的PCR产物切胶,用胶回收试剂盒回收后,连接到
第27卷第2期 唐山师范学院学报 2005年3月 Vol. 27 No.2 Journal of Tangshan Teachers College Mar. 2005 ────────── 收稿日期：2004-10-20 作者简介：高凤菊（1978-），女，河北乐亭人，四川农业大学生命科学学院硕士研究生。 - 7 - 真菌与细菌纤维素酶研究进展 高凤菊1，李春香2 （1.四川农业大学 生命科学学院，四川 雅安 625014；2.唐山师范学院 生物系，河北 唐山 063000） 摘 要：对分解纤维素真菌及细菌的种类，纤维素酶的组成和分类，分子结构、作用机理，纤维素酶基因工程及研究展望进行了综述。 关键词：真菌；细菌；纤维素酶 中图分类号：Q556+.2 文献标识码：B 文章编号：1009-9115（2005）02-0007-04 资源和环境问题是人类在21世纪面临的最主要的挑战。生物资源是可再生性资源，地球上每年光合作用的产物高达1.5×1011~2.0×1011t ，是人类社会赖以生存的基本物质来源。其中90％以上为木质纤维素类物质，[1]其中的纤维素是地球上最丰富 的多糖物质， [2] 这类物质是植物细胞壁的主要成分，也是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。我国的纤维素资源极为丰富，每年农作物秸秆的产量 达5.7×108t ， 约相当于我国北方草原年打草量的50倍。目前这部分资源尚未得到充分的开发利用，主要用于燃料，畜牧饲料与积肥，不仅利用率低，还 对环境造成一定的污染。 [3] 随着世界人口迅速增长、粮食、矿产资源日渐枯竭，开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，即化工原料的“绿色化”，具有极其重大的现实意义和光明的发展前景。 在自然界中，许多霉菌[4]和细菌[5]都能产生纤维素酶，但有关细菌纤维素酶的报道很少。由细菌所产生的纤维素酶一般最适中性至偏碱性，因为这类酶制剂对天然纤维素的水解作用较弱，长期以来没有得到足够的重视。近十几年来，随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的使用性能和巨大的经济价值。[6][7][8] 1 纤维素分解微生物 1.1 纤维素分解性细菌 (cellulose decomposingbacteria ) 纤维素分解性细菌是能分解纤维素的细菌。由于纤维素酶等的作用，纤维素可一直被分解到葡萄糖为止，有时在分解过程中会积累纤维二糖。这类 细菌多见于腐植土中。好氧性细菌如纤维单胞菌属（Cellulomonas ）、纤维弧菌属（Cellvibrio ）、噬胞菌属（Cytophaga ）等能分解纤维素；但在好氧条件下土壤中纤维素的分解，主要是纤维素分解真菌在起作用。而在厌氧条件下纤维素的分解，一些厌氧性的芽孢梭菌属（Clostridium ）的细菌具有重要作用。纤维素分解细菌亦可栖息于草食动物的消化道、特别是反刍动物的瘤胃中。它们在其中进行分解纤维素的活动，这些细菌是厌氧性细菌，例如产琥珀酸拟杆菌（Bacteroides succinogenes ）、牛黄瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens ）、白色瘤胃球菌（R.albus ）、溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens ）（程光胜 译）等。细菌纤维素酶多数结合在细胞膜上，菌体细胞需吸附在纤维素上才能起作用，使用很不方便，酶的分离提取也较困难。但是细菌主要产生中性纤维素酶和碱性纤维素酶。碱性纤维素酶由于在洗涤剂工业中有良好的应用价值，也成为研究热点，其产生菌主要集中在芽孢杆菌属[9]。由于酶的耐热性在生产中具有现实意义，所以耐热细菌也是研究的热点。 1.2 纤维素分解性真菌 真菌类有黑曲霉、血红栓菌、卧孔属、疣孢漆斑菌QM460、绳状青霉、变幻青霉、变色多空霉、乳齿耙菌、腐皮镰孢、绿色木霉、里氏木霉、康氏木霉、嗜热毛壳菌QM9381和嗜热子囊菌QM9383等[10]；丝状真菌产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物。真菌纤维素酶通常是胞外酶，酶被分泌到培养基中，用过滤和离心等方法就可较容易地得到无细胞酶制品。目前饲用纤
湖北农业科学2009年（责任编辑郑威） mineral forming elements ［C ］．Amsterdam ：Elsevier ，1979． 253－292．［6］ NEALSON K H．The microbial manganese cycle ［A ］． KRUMBEIN W E．Microbial geochemistry ［C ］．Oxford ：Blackwell Scientific Publications ，1983．191－221．［7］ TEBO B M ，BARGAR J R ，CLEMENT B G ，et al．Bio-genic manganese oxides ：properties and mechanisms of forma-tion ［J ］．Annu．Rev．Eath．Planet Sci ，2004，32：287－328． ［8］田美娟，邵宗泽．深海抗锰细菌的分离鉴定［J ］．厦门大学学报 （自然科学版），2006，45（2）：272－276． ［9］ SOLOMON E I ，SUNDARAM U M ，MACHONKIN T E．Multicopper oxidases and oxygenases ［J ］． Chem Rev ， 1996，96：2563－2605． ［10］ TONER B ，FAKRA S ，VILLALOBOS M ，et al．Spatially Resolved Characterization of Biogenic Manganese Oxide Pro-duction within a Bacterial Biofilm ［J ］．Appl Environ Micro-biol ，2005，71（3）：1300－1310． 第48卷第1期 2009年1月 湖北农业科学 H ubei A gricultural S ciences Vol．48No.1 Jan ．，2009 收稿日期：2008－10－18 基金项目：鲁东大学基金项目（20053305） 作者简介：冯培勇（1977－），男，山东日照人，硕士，主要从事微生物产酶的研究工作，（电话）132********（电子信箱）fengpeiyong2004＠yahoo．com．cn 。 纤维素是广泛存在于自然界中的一种由许多葡萄糖基组成的大分子物质，可被存在于微生物中的纤维素酶所降解。纤维素酶指的是降解纤维素酶生成葡萄糖的一组酶的总称。目前认为，完全降解纤维素至少需要3种功能不同且互补的纤维素酶组分，即内切葡聚糖酶（C1酶或EG ）、外切葡聚糖酶（Cx 酶或CBH ）、β－葡萄糖苷酶（简称βG ）［1］。纤维素酶的应用随着工业的发展而日趋广泛，不仅能用于生产葡萄糖、酿酒、饲料工业、纺织行业、环卫污物的处理、农产品加工及生物工程等方面［2］，而且可用于服装加工行业［3］。由于野生型菌种的纤维素酶 活力不高，因此，利用各种诱变手段选育高产纤维素酶生产菌一直是国内外研究的热点。本研究通过化学诱变剂NTG 、硫酸二乙酯和LiCl 对一株黑曲霉菌株进诱变，获得了纤维素酶活性显著提高且遗传性状稳定的突变株。 1 材料与方法 1．1材料 1．1．1出发菌株黑曲霉（Aspergillus niger F1）， 本实验室分离保存。 1．1．2 培养基 ①斜面培养基（PDA 培养基）：马铃 高产纤维素酶黑曲霉菌株的化学诱变选育 冯培勇，宿红艳，张 丽，王艳华 （鲁东大学生命科学学院，山东烟台 264025） 摘要：以1株黑曲霉（Aspergillus niger F1）为出发菌株，经过亚硝基胍、硫酸二乙酯和氯化锂诱变处理，选育出1株纤维素酶高产菌株L1。在适宜条件下，其产CMCase 活力为出发菌株的150．2％。关键词：纤维素酶；化学诱变；黑曲霉中图分类号：Q933 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2009）01－0088-03 Breeding of High-Yield Cellulase Aspergillus niger Mutated by Chemicals FENG Pei－yong ，SU Hong－yan ，ZHANG li ，WANG Yan－hua （College of Life Science ，Ludong University Yantai 264025，Shandong ，China ） Abstract ：A strain ，Aspergillus niger F1，was used as starting strain and mutated by NTG ，DES and LiCl．The strain named L1was bred which could produce high－yield cellulase．Under suitable conditions ，its CMCase activity was 150．2％of the starting strain． Key words ：cellulase ；chemical mutatation ；Aspergillus niger !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
从土壤中分离产几丁质酶的真菌 摘要：几丁质是自然界中储量仅次于纤维素的生物多聚体,它广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物体中,是绝大多数真菌细胞壁的结构物质,同时还是昆虫中肠围食膜的主要成分[1].几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)[2]可催化水解几丁质的β21,4糖苷键生成N2乙酰2D2氨基葡萄糖(NAG),它在植物病虫害,尤其是对真菌病的防治方面,以及在几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视.通过几丁质作为碳源,从土壤中筛选产几丁质酶菌株. 1材料与方法 1.1培养基 1.1.1平板培养基(1)细菌几丁质培养基(分离用):蛋白胨10g,K2HPO40.7g,MgSO40.5g,KH2PO40.3g,胶体几丁质5.0g,琼脂15～20g,蒸馏水1L,pH值为7. 2.(2)纯几丁质培养基:胶体 几丁质5.0g,KNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.1.1.2摇瓶培养基(1)种子培养基(LB培养基):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1L,pH值为7.0.(2)发酵培养基:用细菌几丁质培养基(分离用),但不加琼脂 1.2菌株的分离 1.2.1菌株初步分离从生产几丁质的工厂排污沟附近土壤采集土样,经过烘干及风化干燥,置于60目分样筛过筛,备用.称取1g土样放入加有9mL无菌水的离心管,分别稀释制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释倍数的土壤溶液.从10-3,10-4,10-5,10-6不同稀度倍数的4管土壤稀释液中各吸取0.1mL,接种在纯几丁质培养基和细菌几丁质培养基的平板上,用涂布棒涂布均匀,在30℃下培养72h. 1.2.2菌种的二次筛选从第1次稀释涂布的平板中挑取可以产生透明圈的菌落,再一次通过稀释涂布的方法,将其接种于纯几丁质平板和细菌几丁质平板上,培养72h,以取得纯菌落平板.从第2次筛选的纯菌平板上选取水解圈直径与菌落直径比最大的菌种,将其接种于50mL的LB种子培养基上,12h后以2%的接种量接于100mL的细菌几丁质发酵培养基中,在30℃下进行扩大培养. 1.3菌种的鉴定 1.3.1细菌染色体DNA提取从新培养产几个质酶活性高的革兰氏阴性细菌平板上,挑取一环菌落至加有500μLTE缓冲液的1.5mL微量离心管中,混匀后沸水浴1.5min,迅速低温离心(12000r?min-1)10min,取上层清液分装后,置4℃下保存备用. 1.3.216SrDNA引物根据16SrDNA的结构,应用B2/B3做引物,该引物扩增片段包含V8和V9两个高变区,扩增产物大小为1050bp(basepair,碱基对)左右.这两个引物序列为B2:5’2ACGGGCGGTGTGTAC23’;B3:5’2CCTACGGGAGGCAGCAG23’. 1.3.3聚合酶链反应(PCR)检测PCR反应体系为20μL,二次蒸馏水1 2.6μL,10倍扩增缓冲液2.0μL,25mmol?L-1Mg2+1.6μL,各2.5mmol?L-1的脱氧核苷三磷酸(dNTP)0.4μL,20μmol?L-1引物各1.0μL,DNA模板1.0μL,5GU?L-1Taq酶0.4μL.PCR循环:94℃预变性5min,94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸90s,循环30次,并在72℃后延伸15min. 1.3.4扩增产物的电泳分析用1倍的TAE缓冲液配制质量分数为1%琼脂糖凝胶.取PCR扩增产物10μL,加2μL溴酚蓝指示剂,混匀后加样,于100V下电泳1.5h,紫外灯下观察电泳结果. 1.3.5序列测定与分析将观察到的PCR产物切胶,用胶回收试剂盒回收后,连接到
湖南农业大学课程论文 学院：生物科学技术学院班级： 姓名：学号： 课程论文题目：纤维素酶高产菌株的诱变育种 课程名称：工业微生物育种学 评阅成绩： 评阅意见： 成绩评定教师签名： 日期：年月日
纤维素酶高产菌株的诱变育种 ( ) 【摘要】纤维素酶是一种重要的工业酶制剂，是一种复合酶，它将纤维素及类似物水解成葡萄糖。近年来，对产纤维素酶菌株的鉴定、诱变育种、筛选等方面取得了长足的进展。本文对这些研究进展进行了归纳和总结. 【关键词】产纤维素酶菌株；纤维素酶；筛选；诱变育种 Mutation Breeding of Cellulase High-yield Strain TAO Mi-lin (College of Biological Science and Technology, Hunan Agriculture University, Hunan 410128) 【Abstract】Cellulase is a kind of complex enzyme. Due to the ability of hydrolyzing cellulose or the similarity of cellulose into glucose. A great effort has been made until now on the research such as identification, mutation breeding and filter of cellulose-producing strain. This paper focused a brief induction and summary on advancing about these aspects. 【Key words】cellulose-producing strain ; cellulase ; filter ; mutation breeding 随着石化燃料由短缺变枯竭，能源是人类面临的共同问题。寻找新的能量来源关系到经济的可持续发展乃至人类的生存问题。纤维素与石化燃料不同，它是一种可再生的资源。地球上每年光合作用可产生大于100亿吨的植物干物质，其中一半以上是纤维素和半纤维素。另外，人类活动产生的废弃物中也含有大量的纤维素，如农业废物( 稻草、稻壳、麦杆、花生壳、玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣等)、食品加工废物(果皮、果渣等)、木材废物(木屑、树皮)以及城市废弃物(40%~60% 固体废物是垃圾和废纸)等。如果能有效地利用生物转化技术将这些纤维素转化成简单糖，再发酵产生乙醇等能源物质，不仅可以变废为宝，而且还可以避免由于化石燃料燃烧所带来的环境污染，更重要的是可以缓解或解决石化能源短缺乃至枯竭所带来世界性能源危机。纤维素酶的特异性高，反应条件比较温和，可避免化学转化所导致的环境污染等，是将这些纤维素物质转化成简单糖的关键。因此，在再生能源利用方面具有很广阔的应用前景。另外，自然界中细菌、真菌、某些无脊椎动物，直至高等植物中都有纤维素酶的存在，因此，纤维素酶的研究还具有普遍的生态意义。 1、纤维素酶 纤维素酶最早由Seilliere于1906年研究发现，我国约从20世纪70年代开始纤维素酶的研究，且已被正式批准为饲料添加剂在动物生产中应用。 1.1 纤维素酶的结构 不同来源的纤维素酶理化性质不相同，纤维素酶分子一般由球状的催化结构域(CD)、连接桥(Linker)和纤维素结合结构域(CBD)3部分组成。纤维素酶是由葡聚糖内切酶(endo-1,4-β-D-glucanases，EC3.2.1.4，简称EG)、葡聚糖外切酶
纤维素酶的基因克隆研究进展 摘要：纤维素酶是一种高活性生物催化剂，具有广阔的开发和应用前景。本文对纤维素酶的特性、研究进展、应用以及纤维素酶基因克隆等方面进行了综述，并对今后的研究趋势作了预测和展望。 关键词：纤维素酶；分子生物学；基因克隆；前景展望 前言 纤维素是植物细胞壁的主要成分，约占植物干重的1/3—1/2，它是地球上分布最广、含量最丰富、生成量最高的有机化合物。纤维素的利用与转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。利用纤维素酶将纤维素彻底水解是纤维素的有效利用途径。纤维素酶(cellulase)是指能水解纤维素β—l，4葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，它不是单一酶，而是起协同作用的多组分酶系。近年来对纤维素酶的基础研究，包括酶的氨基酸序列、基因的克隆与表达、酶蛋白的空间结构与功能以及酶蛋白的基因调控等诸多方面，并且均取得了显著进展。由于纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国内外业内人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。 1.1 纤维素酶的组成 纤维素酶是由许多高协同作用的水解酶组成的，根据其催化反应功能的不同可分为内切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan glucanohydrolase或endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4,即C1酶），来自真菌的简称EG,来自细菌的简称Cen、外切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan cellobilhydrolase或exo-1,4-β-D-glucannase，EC.3.2.1.91），来自真菌的简称CBH,来自细菌的简称Cex) 和β-葡聚糖苷酶（β-1,4- glucosidase，EC.3.2.1.21）简称BG。 (1)外切葡聚糖酶，这类酶作用于纤维素分子的末端，一次从纤维素分子中切下纤维二糖，它可以作用于纤维素分子内的结晶区、无定形区和羧甲基纤维素。对于外切纤维素酶，传统上认为是从纤维素链的非还原端切下纤维二糖。可是，从一些微生物的外切酶的研究中发现了另一种纤维素酶，它们优先从纤维素分子的还原末端切下纤维二糖。这些研究说明存在两种不同功能的外切酶，它们分别从还原端和非还原端水解纤维素分子[ 1 ]。 （2）内切葡聚糖酶，这类酶是纤维素酶中最重要的酶，可作用于纤维素分子内的无定形区，随机水解糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量的小分子纤维素，即纤维素末端。
文献综述 生物工程 纤维素酶的概述 【摘要】纤维素作为地球上分布广，含量丰富的碳水化合物，它的降解是自然界碳素循环的中心环节。纤维素的利用和转化对于解决目前世界能源危机，粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。本文就纤维素酶的应用进行一个简要的概述。 【关键词】纤维素酶；纤维素酶的实际应用：应用前景 1. 纤维素的概况 1.2 纤维素酶的分类 纤维素酶的组成比较复杂,通常所说的碱性纤维素酶是具有3～10 种或更多组分构成的多组分酶。根据其作用方式一般又可将纤维素酶分为3 类: 外切β- 1, 4-葡聚糖苷酶( 简称CBH) 、内切β-1, 4- 葡聚糖苷酶( 简称EG)和β- 1, 4- 葡萄糖苷酶( 简称BG) [1]。在这3 种酶的协同作用下,纤维素最终被分解成葡萄糖。到目前为止, 还没有能够在碱性条件下分解天然纤维素的纤维素酶。碱性纤维素酶是一种单组分或多组分的酶, 只具有内切β- 1, 4- 葡聚糖苷酶( 又称CMC酶) 的活性, 有的还与中性CMC 酶组分共存[2]。 1.3 纤维素酶的作用机理 纤维素酶在提高纤维素、半纤维素分解的同时, 可促进植物细胞壁的溶解使更多的植物细胞内溶物溶解出来并能将不易消化的大分子多糖、蛋白质和脂类降解成小分子物质, 有利于动物胃肠道的消化吸收[3]。同时, 纤维素酶制剂可激活内源酶的分泌, 补充内源酶的不足, 并对内源酶进行调整, 保证动物正常的消化吸收功能, 起到防病、促生长的作用, 消除抗营养因子,促进生物健康生长。半纤维素和果胶部分溶于水后会产生粘性溶液, 增加消化物的粘度, 对内源酶造成障碍, 而添加纤维素酶可降低粘度, 增加内源酶的扩散, 提高酶与养分接触面积, 促进饲料的良好消化。而纤维素酶制剂本身是一种由蛋白酶、淀粉酶、果胶酶和纤维素酶等组成的多酶复合物, 在这种多酶复合体系中一种酶的产物可以成为另一种酶的底物, 从而使消化道内的消化作用得以顺利进行[4]。也就是说纤维素酶除直接降解纤维素, 促进其分解为易被动物所消化吸收的低分子化合物外, 还和其他酶共同作用提高奶牛对饲料营养物质的分解和消化[5] 2. 纤维素酶的一些历史及研究成果 在吴琳,景晓辉,黄俊生[3]的产纤维素酶菌株的分离，筛选和酶活性测定中，他们利用“采样—培养—分离单菌落—初筛—复筛—测OD值”的方法筛选出分解纤维素能力较强的菌株。[结果]经反复培养和划线分离从80份样品中初选出35株具有分解纤维素能力的菌株。其中10株由白转绿,长势较
纤维素酶的研究进展及应用前景 摘要 我国近年来在纤维素酶研究应用领域取得了很大进展。纤维素酶是一组能够分解纤维素产生葡萄糖的酶的总称，按照功能可以分为内切葡糖聚酶，外切葡糖聚酶和β-葡聚糖苷酶。它在纺织，酿酒，食品与饲料行业的市场潜力是巨大，受到国内外业内人士的看重。本文综述了纤维素酶的组成，结构，分类，理化性质与作用机理，阐明了生产纤维素酶的微生物种类，纤维素酶的发酵工艺及高效分解菌。介绍了纤维素酶的特性，重要意义，在各领域的应用，并对其未来研究趋势进行了展望。 关键字：纤维素酶研究应用 前言：因为资源枯竭、能源短缺及环境污染等问题日益加剧，世界各国都在寻找开发新能源。纤维素类物质是自然界中分布最广泛、含量最丰富、生成量最高的有机化合物，也是自然界中数量最多的可再生类质。但这些纤维素大部分没有被开发，造成巨大的资源浪费和环境污染。近年来关于纤维素酶的基础研究获得了显著的进展，主要包括酶的组成部分和结构、发生降解的机理、基因的克隆和表达、酶的发酵和生产、应用等方面。由此可见生产纤维素酶对人类生存环境的改善和可持续发展有着举足轻重的地位。 1，纤维素酶的来源和分类 纤维素酶的最主要来源是微生物，用其生产是最为有效和方便的。不同微生物合成的纤维素酶在组成上差异明显。对纤维素的降解能力也不尽相同。细菌与放线菌生产的纤维素酶产量均不高，在工业上很少应用。而真菌具有产酶的诸多优点：产酶能力强，产生的纤维素酶为胞外酶，便于酶的分离和提取，且产生纤维素酶的酶系结构较为合理；酶之间有强烈的协同作用，降解纤维素的效率高。纤维素酶是一类能够把纤维素降解为低聚葡萄糖、纤维二糖和葡萄糖的水解酶。根据纤维素酶的结构不同，可把纤维素酶分为两类：纤维素酶复合体和非复合体纤维素酶。纤维素酶复合体是一种超分子结构的多酶蛋白复合体，由多个亚基构成。由四个部分构成：脚手架蛋白、凝集蛋白和锚定蛋白结合体、底物结合区域和酶亚基。非复合体纤维素酶主要由好氧的丝状真菌产生，如子囊菌纲和担子菌纲等的一些种属。它是由不同的三种酶所构成的混合物，即内切葡聚糖酶、外切葡苷糖酶和B一葡萄糖苷酶。 2，纤维素酶的组成与结构 因为种类和来源的不同，纤维素酶的结构存在较大差异，但是通常均具有2
纤维素酶研究进展及固定化技术 摘要: 纤维素酶是一类能够水解纤维素的β-D-糖苷键生成葡萄糖的多组分酶的总称。传统上将其分为3类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶属于糖苷水解酶类，近年来，根据氨基酸序列的同源性以及纤维素酶结构的相似性，将其分成不同的家族。本文介绍了纤维素酶的研究进展，主要包括纤维素酶的性质及作用机理，应用与发展趋势，来源及生产技术，分离纯化方法，最后介绍几种常用的纤维素酶固定化方法。 关键词: 纤维素酶；研究进展；固定化 引言： 纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的生物质，也是最廉价的可再生资源。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，它们协同作用，分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖。自1906年Seilliere在蜗牛的消化液中发现纤维素酶至今已有一百余年了，随着在工业上的广泛应用，特别是在纺织工业、能源工业上的应用，纤维素酶已成为最近十几年酶工程研究的一个焦点。近年来有关纤维素酶的研究，包括酶的氨基酸序列、基因的克隆与表达、酶蛋白的空间结构与功能，以及酶蛋白的基因调控等诸多方面都取得显著进展。到目前为止，登记在Swiss-Protein数据库的纤维素酶的氨基酸序列有649条，基因序列有433条。我国对纤维素酶的研究始于上世纪50年代，迄今已有50多年的历史。在纤维素酶的菌种开发、发酵培养、基因的克隆与表达、纤维素酶的固定化，以及纤维素酶在纺织、能源等方面的应用都取得较大进展。 1 纤维素酶的性质及作用机理 纤维素酶分子的大小因来源不同而不尽相同，三大类酶分子量一般在23Kda～146Kda之间。多数真菌和少数细菌的纤维素酶都受糖基化，糖基与蛋白之间以共价键结合，或呈可解离的络合状态。糖基化作用在一定程度上保护酶免受蛋白酶的水解，而纤维素酶正是由于糖基化，使其所含碳水化合物的比率在不同酶之间发生差异，导致酶的多形式和分子量的差别。通过比较分析，人们发现许多不同纤维素酶间表现出一定的同源性，且纤维素酶分子普遍具有类似的结构。由球状的催化结构域(CD)、连接桥和纤维素结合结构域(CBD)三部分组成。(1)连接桥，可能是保持CD和CBD之间的距离，也可能有助于不同酶分子间形成较为稳定的聚集体；(2)纤维素结合结构域，它对酶的催化活力是非必需的，但它执行调节酶对可溶性和非可溶性底物专一性活力的作用，其结合纤维素的作用机理目前尚不十分清楚；(3)催化结构域，它体现酶的催化活性及对特定水溶性底物的特异性。尽管不同来源纤维素酶的分子量大小差别很大，但它们催化区的大小却基本一致。 研究表明，EG和CBH能引起纤维素的分散和脱纤化。纤维素酶通过打乱纤维素的结晶结构，使其变形，深入纤维素分子界面之间，从而使纤维素孔壁、腔壁和微型隙壁的压力增大，水分子的介入又使纤维素分子之间的氢键被破坏，产生部分可溶性的微结晶，利于进一步被降解。（1），对纤维素分子的吸附作用：纤维素酶对纤维素的降解，一般首先吸附到纤维素上，但并不是吸附的越好催化效果约好。纤维素酶的吸附不仅与酶本身性质有关，也与底物的特性密切相关。其吸附能力大小与酶的含糖量和疏水性均有关联。此外，纤维素酶的吸附机理并未弄清，仍需做进一步研究。（2），单一纤维素酶的作用机制：纤维素酶的断键机理
产纤维素酶细菌的筛选及培养 一、筛选步骤 1、菌种的采集 采集山上距湿润的表层10cm处的土壤样本40g左右，用研钵研成粉末称取1g样本加入灭菌的250mL锥形瓶中，加入99mL无菌水摇匀静置。 2、菌种初筛 （1）按照配方配制200mL CMC培养基，取1 X 250mL空锥形瓶和6 X 15mL试管，塞上棉塞并用报纸、棉线包扎，用报纸、棉线将试管包扎成一捆；取12套培养皿码齐包扎。将上述器材与培养基、无菌水121℃高压蒸汽灭菌20min。 （2）于无菌台上倒9个CMC培养基备用。 （3）另取6支15mL经灭菌的试管，用移液枪吸取土壤溶液（上清液）加入1号试管，加无菌水。混匀后吸取加入2号试管，重复上述操作，进行6次梯度稀释。 （4）待CMC培养基冷却后，在超净工作台分别吸取104、105、106倍稀释液于CMC 培养基上稀释涂布，每种稀释液涂布三份。 （5）将上述培养基置于37℃培养箱中培养24小时，标记菌落并记录各菌落形态（菌落高度、质地、颜色、气味、着生状态、边缘及表面纹理等）。 （6）配制200mL刚果红家别培养基，与三套培养皿一起121℃灭菌20min。 （7）在无菌操作台上倒3个鉴别培养基备用。 （8）将各菌落用牙签接种到冷却了的刚果红鉴别培养基上，37℃培养24h，挑选5株透明圈直径与菌落直径比最大的菌株进行摇瓶复筛。 3、菌种复筛 （1）配制500mL基础发酵培养基，分装到5只250mL的锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（2）将初筛得到的菌株用接种环接种于液体培养基上（2环），37℃、150r/min 下培养2—3天，转入4℃冰箱保藏。 二、培养方法 1清洗实验器具 2灭菌 3配培养基（纤维素作唯一能量源的培养基） 4倒平板 +选择培养原菌（可能会用摇床） 5稀释菌样 6涂布平板或平板划线 7放入恒温箱（调制均适宜的温度）12-24h ，之后就可以收获细菌了 8观察记录（数量、分布等） 三、培养基种类及其组成 1、初筛 CMC培养基：CMC 5g、蛋白胨 1 g、FeSO4·7H2O 0.005 g、NaCl 0.25 g、琼脂粉10g 于1000mL锥形瓶中加蒸馏水至500mL、调节pH 7．2～7．6，加棉塞121℃灭菌20min。 刚果红培养基： (NH4)2S04 2 g，MgS04·7H20 0.5 g，K2HP04 1 g，NaCl 0.5 g，微晶纤维素2 g，刚果红0.4 g，琼脂20 g，加水至1000 mL。 无菌水：取1只1000mL的锥形瓶，各加水1000mL，加棉塞与CMC培养基一起灭菌20 min。另取1只250mL空锥形瓶、6支15mL试管和12套培养皿灭菌备用。 2、复筛 基础发酵培养基：羧甲基纤维素钠10g，蛋白胨10g，KH2PO419，MgSO4 0．29，Nacl 10g水1000mL，pH调至7，121℃灭菌20min
Vol.15,No.18精细与专用化学品第15卷第18期 Fine and Specialty Che m icals2007年9月21日技术进展 生物技术生产纤维素酶 及其应用研究进展 刘 颖3 张玮玮 (哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江哈尔滨150076) 摘 要:简要介绍纤维素酶的酶学性质、降解机制、生产工程菌的选育、纤维素酶的应用情况,以及对纤维素酶生产与应用方面存在的问题和未来发展趋势进行了分析与探讨。纤维素酶在食品、酿造行业、农副产品深加工、饲料、医药、环境保护和化工等领域有着非常广阔的应用前景和应用潜力。我国纤维素酶的生产及应用研究近年来取得了很大进展,今后必将在应用深度和广度上进一步扩展。 关键词:纤维素酶;发酵;克隆;生物技术 Cellul a se Produced by B i otechnology and Its Appli ca ti on Progress L I U Ying,ZHAN G W ei2w ei (College of Food Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin150076,China) Abstract:The enzy mol ogical p r operties of cellulase,degradati on mechanis m,the selecting culture of engineering m i2 cr oorganis m and the app licati on p r os pect of bi otechnol ogy in cellulase industry are intr oduced briefly.The existing p r oble m s in cellulase p r oducti on and app licati on and the devel opment trend in the future are analyzed and discussed.The p r os pect and potential of app licati ons of cellulase are wide,es pecially in the fields of f ood industry,fer mentati on industry,deep2p r o2 cessing of far m ing p r oducts,f orage,medicine,envir on mental p r otecti on and che m ical industry.A great p r ogress has been made in the cellulase devel opment and app licati on recently in China,and in the future it will be certainly expanded deep ly and comp rehensively. Key words:cellulase;fer mentati on;cl one;bi otechnol ogy 纤维素是地球上数量最大的可再生资源,微生物对它的降解、转化是自然界中碳素转化的主要环节。纤维素酶(Cellulase)是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称。纤维素的生物转化与利用对当前世界能源危机、粮食短缺和环境污染等问题具有重要的意义。近年来,我国纤维素酶的应用研究十分活跃,已筛选到一批高产菌株。随着分子生物学、遗传工程的迅猛发展,国内外均在尝试应用基因工程技术来改造和构建高效纤维素降解菌。这些菌具有独特的酶学性质,扩大了纤维素酶的应用范围。根据纤维素酶遗传特性而构建的高效纤维素分解菌开辟了纤维素酶生产的新途径。 1 维素酶的性质及其降解机制 纤维素酶是一种糖蛋白,它是一个多组分的诱导酶系,采用层析分离和电泳技术等可将纤维素酶分成不同的组分。目前普遍认为,完全降解纤维素至少需要由3种功能不同但又互补的纤维素酶协同作用才能将纤维素水解至葡萄糖,它们是EG(内切葡聚糖酶)、CBH(外切葡聚糖酶)和CB(纤维二糖酶或β2葡萄糖苷酶)。纤维素的降解过程,首先是纤维素酶分子吸附到纤维素表面,然后,EG(内切 ? 8 ? 3收稿日期:2007207212 作者简介:刘颖(19682),女,副教授,研究方向为食品生物技术。
纤维素酶的检测方法 摘要：本文主要介绍了纤维素酶的降解原理，通过实验比较了四种常用纤维素酶的检测方法的稳定性，以及纤维素酶的发展前景，为纤维素酶的应用提供了进一步的参考价值。 关键词：纤维素酶酶活测定葡萄糖回归方程 一、纤维素酶及其降解原理 纤维素是高等植物细胞壁的主要成分，占植物总干重的30%-50%，是地球上分布最广，含量最丰富的可再生性碳源化合物，占地球总生物量的40%。据报道，我国每年光作物秸秆，稻梗等含纤维素较丰富的物质就有5亿吨之多，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.55X109吨，其中尚有89%未被人们利用，而大量的秸秆，稻梗等含纤维素丰富的物质的利用率也很低。大多采用燃烧的方式来处理，这样就造成了环境污染，破坏了土壤的理化性质和丧失了有机质成分。所以，纤维素的充分利用与有效的转化对于解决当前的能源危机，粮食短缺，环境污染等有重大意义。 纤维素酶是分解纤维素的一类酶，它能将纤维素分解为葡萄糖，充分的利用了纤维素。自1906年Sellieres 在蜗牛消化液中发现纤维素酶以来，纤维素酶的研究和应用受到了国内外学者的极大关注，取得了很大进展。目前，国内外学者通过筛选产酶菌株来发酵产酶，再应用纤维素酶到食品，医药，饲料，洗涤等工业中，不仅解决了纤维素的再利用问题还取得了很可观的经济效益。 纤维素酶是由许多具有高协同作用的水解酶组成的。习惯上将纤维素酶分成三种主要成分：内切酶（内切β-1,4-葡萄糖酶，也称Cx酶）、外切酶（外切β-1,4葡萄糖酶，也称C1酶）、β -1,4葡萄糖酶（即为纤维二糖酶）[1]。C1酶主要作用于天然纤维素，使之转变为非结晶的纤维素。Cx酶又分为Cx1酶和Cx2酶。Cx1酶是一种内断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子内部作用于β-（1,4）糖苷键，生成纤维糊精和纤维二塘。Cx2酶是一种外断型纤维素酶，它从水合性纤维素分子的非还原端作用于β-（1,4）糖背键，逐步切断β-（1,4）糖节键生成葡萄糖。纤维二糖酶则作用于纤维二糖，生成葡萄糖。 纤维素酶在降解纤维素过程中的作用机理至今还不是很清楚。目前关于Cx酶、C1酶和β -1,4葡萄糖酶这3种酶的作用机理的假说比较公认的是以下3种，其中协同理论最为广泛接受。（1）C1-Cx假说。该理论认为首先由C1酶作用于纤维素酶的结晶区，再由外切酶和β-葡萄糖苷酶联合作用产生二糖和葡萄糖。其水解模式如图1所示。