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环境中微生物的检测和分离纯化

实验四环境中微生物的检测和分离纯化

一实验目的

1.熟悉常用微生物培养基的配置、灭菌方法和原理。

2.掌握微生物的分离、纯化。

3.用平板划线法和稀释法分离微生物。

4.认识微生物存在的普遍性,对无菌操作的必要性、何时应该进行有大致理解。

二实验原理

1.微生物的分离和纯化

土壤是微生物多样性的重要场所,可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的是平板分离法。为了获得某种微生物的纯培养,一般是供给它适宜的培养条件,或提供抑制其他菌生长而有利于此菌生长的环境。再用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离,纯化该微生物,直至得到纯菌株。

2.平板菌落计数法

平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释成单个细胞,接种培养,一个单菌落代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数,根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品含菌数。三实验仪器、材料和用具

1.实验材料:

菌源:土样10g、大肠杆菌

培养基:牛肉膏蛋白胨培养基24个

2.实验仪器:

取液器(1000μl 、200μl各一支);培养箱;平皿;涂棒; 1.5ml离心管;记号笔;

酒精灯;无菌200ul, 1000ul吸头;

3.实验试剂:

牛肉膏;蛋白胨;NaCl;蒸馏水;0.9% 无菌生理盐水;

四实验步骤

(一)配置培养基(上次课完成,灭菌,实验开始前倒平板)

(二)周围环境中微生物的检测

在牛肉膏蛋白胨培养基上作如下实验:

1.取一个平板,分为4区,做好标记。分别用未洗过的手指头,用肥皂洗过、用洗涤液洗过、用酒精擦过的食指指头(不用毛巾擦)在平板的1、2、3、4区上涂抹(用

力一致);

2.取一个平板,分为2区,做好标记。分别用纸巾和硬币擦;

3.取一个平板,做好标记。往培养基上放一根头发;

4.取一个平板,分4区,分别涂布饮用水、清华豆浆、泡菜水、自来水。

5.取一个平板,做好标记。用无菌牙签取一点牙垢与自来水混合制成溶液涂于平板上。

6.取一个平板,做好标记。打开皿盖,置于空气中20min

7.取一个平板,在点燃的酒精灯旁开盖20min

8.取一个平板,分2区,分别用烧过和没烧过的涂布棒涂。

9.取一个平板,嘴唇碰一下

(三)从土壤中分离微生物

1.采土样:选择较肥沃土壤(生物系旧馆周围土地),去表层土,挖5-20cm深度的土壤。

取土壤数10g,装入烧杯,带回实验室。

2.制备土壤悬液:称取土样1.0g,放入盛99ml无菌水的三角瓶中,用手振荡5min使土壤均匀分散成为土壤悬液(10-2)。

3.稀释:用200ul的无菌吸头从中吸取0.1ml土壤悬液,注入事先分装有0.9ml生理盐水的Ep管中,吹吸3次,摇匀(10-3)。类推制得10-4、10-5的土壤悬液。

4.涂布:用无菌吸头,分别吸取10-3、10-4、10-5浓度土壤稀释液100ul,较均匀地放入已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上,用无菌玻璃涂棒涂匀。每个浓度做3个平板。

5.培养:将牛肉蛋白胨培养基平板倒置于37℃温箱中培养24小时,统计所长出的菌落数。

菌落计数:取出平板,算出统一稀释度三个平板上的菌落平均分布,换算出土样中的菌含量。选择平均菌落数在30~300间的平板。

(四)准备下一次实验的培养基

五实验结果和分析

1.周围环境中微生物的检测

表一周围环境中微生物检测结果

组图:环境中微生物的检测(从左到右、从上到下依次为图一至图九,具体描述见表一)

2. 土壤中分离微生物

表二 平板菌落计数法统计土壤中微生物含量

计数要求是:选择平均菌落数在30~300间的平板。只有一个符合此范围时,以该平均菌落数乘稀释倍数即为该样品中微生物总数;有两个在30~300间时,按两者菌落总数比值决定:比值小于2,取平均;比值大于2,取较少的菌落总数。

就计数结果来看,

只有10-4和10-5稀释倍数平板上的菌落数可记,但都不符合30~300的要求,故取最接近的5。由公式计算得:

土壤

个稀释浓度

个平板平均菌落数

同一稀释度土壤)土壤中的菌含量(个

g /100.510

1.050.13g /6

5

?=?=

?=

-故土壤中的菌含量为5.0×106

(个/g 土壤)

3. 单菌落划线

第一次划线,划得不是很好,但是可以看到10个以上的单菌落(主要集中在5区)。

图十 单菌落划线

六实验小结

1.通过对环境中维生物的观察,意识到身边的微生物是很多的,了解了无菌操作的有

效性和重要性;同时也认识到周围的微生物也不是想象中那么多,比如空气中不是

多满满地悬浮着菌,它的密度其实不是很大的。

2.在土壤微生物的检测中,涂板很重要,我们的板中有5个是无法计数的,这给实验

结果带来很大影响,推测原因是涂板没有涂开,下次应该涂久一点,看着有液体的

地方涂。

3.划线法分离单菌落是第一次操作,实验下来,觉得这个方法是很好的,操作上要注

意:挑菌的时候轻轻蘸一下就好,不用挑很多;划线第一次可以来回涂抹,后几次

都要保持一个方向划线,把前一个区的菌划出来;力道要控制;盖子上有很多水,

不要让它滴到平板里。

七思考题

1.所取的土壤中细菌数量级为多少?

根据稀释涂布平板法得到的结果,所取土壤中细菌数量级大约为106个/g土壤。

2.从你周围环境中微生物的观察,你认为无菌操作应注意什么?

1)操作前,用酒精棉擦拭手和移液器。

2)取菌和接种前后接种环或涂布棒一定要在火焰上充分灼烧灭菌。

3)左手拇指和食指打开平皿盖子,其余三个指头托平皿,不要把盖全打开。

4)做实验的过程中,不要说话,特别不要对着开口的培养皿说话。

3.说明饭前洗手,饭后刷牙的重要性

手上一般都带着不少细菌,如果饭前不洗手,很可能污染食物;牙垢里的细菌也很多,如果饭后不刷牙,相当于为它们提供了培养基,会导致细菌大量繁殖。所以一定要饭前洗手,饭后刷牙。

4. 在日常生活中如何讲究饮食卫生?

未洗的手菌是很多的,所以一定要勤洗手,洗完手后要先干燥再接触食物。

同时,我们日常接触的纸巾、硬币等也带着很多菌,所以不要用它们接触食物。

要多刷牙,因为牙垢也是菌落滋生的地方。

5. 试解释夏天时煮好的饭如果放在锅中保持盖着锅盖不动,不容易变质,而一旦

盛在碗里的饭就容易变质,如果是吃剩的剩饭就最容易变质的原因。

煮好的饭相当于刚灭完菌,这个时候锅里属于无菌环境,放在锅里不动的话和外界有菌环境接触就少,所以不容易变质。当饭盛到碗里就意味着它暴露在了有菌环境里,空气中的菌随时都落在上面,夏天温度适宜,剩饭就像培养基一样,时间一长就形成菌落了。

6. 根据实验结果,试批驳“洁僻行为”。

过高频率地拖地擦桌子是不必的,因为在不长的时间内,空气中的菌能落到一定面积的平面上的数目是不多的。

7. 为何倒置培养?

1)防止有菌落进去,如果正置的话,由于培养皿盖更大,会有菌落到边缘,污染。

2)培养过程中水分蒸发,倒置培养保证了蒸发的水在盖子上凝结而不是在培养基里阻碍菌落形成。

八参考文献

1.陈金春陈国强微生物学实验指导清华大学出版社2005

微生物菌种的分离和纯化方法

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中,不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物,而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”,防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体,称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时,便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征,可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落,采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板,即培养平板的简称,它是指固体培养基倒入无菌平皿,冷却凝固后,盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基,每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落,形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行,100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释(如1:10、1:100、1:1000、1:10000),然后分别取不同稀释液少许,与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合,摇匀后,倾入灭过菌的培养皿中,待琼脂凝固后,制成可能含菌的琼脂平板,保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当,在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落,这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落,或重复以上操作数次,便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡,且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长,因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿,

微生物菌种的分离和纯化方法

在从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。 不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特分子生物学的研究及应用中,防止其他微生物的混入。定的微生物,而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”, 、用固体培养基分离和纯化1 有繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、便成称为菌落。一定形态结构的子细胞生长群体,当固体培养基表面众多菌落连成一片时,可以成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征,以及许多真菌和单细胞藻鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、为对该微生物进行分类、所谓平板,类能在固体培养基上形成孤立的菌落,采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。即培养平板的简称,它是指固体培养基倒入无菌平皿,冷却凝固后,盛固体培养基的平皿。固体培养基用琼脂或其它凝这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。胶物质固化的培养基,每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落,形成的菌落便于移植。建立的采用Kock最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。平板分离微生物纯培养的技术简便易行,100 稀释倒平板法1.1 ),然后分别取不、1:100001:1000首先把微生物悬液作一系列的稀释(如1:10、1:100、50℃左右的琼脂培养基混合,摇匀后,倾入灭过菌的培同稀释液少许,与已熔化并冷却至如果养皿中,待琼脂凝固后,制成可能含菌的琼脂平板,保温培养一定时间即可出现菌落。这个菌落可能就是由一个在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落,稀释得当,细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落,或重复以上操作数次,便可得到纯培养。涂布平板法1.2 且采用稀释因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡,因此在微生物倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长,学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿,再用无菌玻璃涂棒将将一定量的微生物悬液滴加在平板表面,制成无菌平板,冷却凝固后,)。菌液均匀分散至整个平板表面,经培养后挑取单个菌落(图1供参 考. 涂布平板法1 图平板划线法1.3 最简单的分离微生物的方法是平板划线法,即用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料,),微

实验二微生物的分离、纯化和接种

实验二微生物的分离、纯化和接种 微生物的分离、纯化 1、目的要求 1.1了解微生物分离和纯化的原理 1.2掌握常用的纯化分离微生物的方法 2、基本原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。本实验采用平板分离法:该方法操作简便,普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件,如营养成分、pH值、温度和溶解氧等要求,或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长,而抑制其它微生物生长的环境,从而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体,因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。而纯培养的确定除观察其菌落特征外,还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定,有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 本实验将在混合有几种微生物菌液中分离纯化出两种微生物来。 3、实验材料 3.1培养基 肉汤培养基(固体)。

3.2溶液或试剂 盛4.5ml无菌水的试管,其中有一只盛有玻璃珠。 3.3仪器或其他用具 无菌玻璃涂棒,无菌吸管,接种环,无菌培养皿,涂布器等。 4流程 倒平板制备梯度稀释液涂布(或划线法)培养挑单菌落保存。 5、步骤 5.1平板划线分离法 5.1.1倒平板 倒平板的方法:右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边,用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出,试管或瓶口保持对着火焰;然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝,迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿,使培养基均匀分布在培养皿底部,然后置于桌面上,待凝固后即成平板(教材p367图13-14)。并用记号笔标明培养基名称、菌液编号和试验日期。 5.1.2划线 在近火焰处,左手拿皿底,右手拿接种环,挑取菌悬液一环在平板上划线(教材p367图13-15)。划线的方法很多,但无论采用哪种方法,其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释,使之形成单个菌落。

微生物的分离和纯化

实验十四微生物的分离和纯化 一、目的要求 掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物的基本操作技术。 二、基本原理 在土壤、水、空气或人及动、植物体中,不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起,当我们希望获得某一种微生物时,就必须从混杂的微生物类群中分离它,以得到只含有这一种微生物的纯培养,这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。 为了获得某种微生物的纯培养,一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同,而供给它适宜的培养条件,或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其他菌生长的环境,从而淘汰其他一些不需要的微生物,再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物,直至得到纯菌株。 土壤是微生物生活的大本营,在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的,因此,土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地,可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。 三、器材 高氏1号琼脂培养基,肉膏蛋白胨琼脂培养基,马丁氏琼脂培养基,盛9ml无菌水的试管,盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶,无菌玻璃涂棒,无菌吸管,接种环,10%酚,无菌培养皿,链霉素,土样等。 四、操作步骤 1.稀释涂布平板法 (1)倒平板将肉膏蛋白胨培养基、高氏1号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基溶化,待冷至55—60℃时,向高氏1号琼脂培养基中加入10%酚数滴,向马丁氏培养基中加入链霉素溶液,使每毫升培养基中含链霉素30μg。然后分别倒平板,每种培养基倒三皿,其方法是右手持盛培养基的试管或三角烧瓶,置火焰旁边,左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞,用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出,如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完,则管塞或瓶塞不必夹在手指中。试管(瓶)口在火焰上灭菌,然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝,迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿,使培养基均匀分布,平置于桌面上,待凝后即成平板。也可将平皿放在火焰附近的桌面上,用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿,再注入培养基,摇匀后制成平板,如图Ⅶ-1所示。最好是将平板放室温2—3天,或 37℃培养24小时,检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。 (2)制备土壤稀释液称取土样10g,放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中,振摇约20分钟,使土样与水充分混合,将菌分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中,吹吸三次,使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从

微生物菌种的分离和纯化方法

微生物菌种的分离和纯 化方法 https://www.doczj.com/doc/2517547693.html,work Information Technology Company.2020YEAR

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中,不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物,而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”,防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体,称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时,便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征,可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落,采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板,即培养平板的简称,它是指固体培养基倒入无菌平皿,冷却凝固后,盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基,每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落,形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行,100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。 1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释(如1:10、1:100、1:1000、1:10000),然后分别取不同稀释液少许,与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合,摇匀后,倾入灭过菌的培养皿中,待琼脂凝固后,制成可能含菌的琼脂平板,保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当,在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落,这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落,或重复以上操作数次,便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法

【实验】微生物的分离与纯化

微生物的实验室培养——自酿葡萄酒中酵母菌的分离与纯化 一、实验目的:掌握无菌技术的操作,尝试用平板划线法和稀释涂布平板法分离纯化酵母菌。 二、实验步骤 (1)制备培养基(马铃薯琼脂培养基):计算→称量→溶化→灭菌→倒平板(已完成) (2)分离纯化 实验 步骤 操作流程流程叙述操作目的、作用 接种方法一:点燃酒精灯 ↓ 1.灼烧接种 环并冷却 ↓ 2.沾取菌液 ↓ 3.平板划线 ↓ 4.转动培养 皿约70°角 ↓ 5.灼烧并冷 却接种环 ↓ 6.平板划线 ↓ 7.倒置培养 用火柴点燃酒精灯,保证实验操作在酒精 灯火焰进行 将接种环放在火焰上灼烧,直至烧红, 让接种环自然冷却 打开装有菌液的试管,塞子要拿在手上, 将试管口通过火焰灭菌,将冷却的接种环 伸入菌液中,沾取菌液。将试管口通过火 焰灭菌,用塞子塞住试管 左手将皿盖打开一条缝隙;右手把沾有菌 种的接种环迅速伸入平板内,划3到5条 平行线(不要划破培养基),盖上培养皿盖 逆时针旋转培养皿约70°角 将接种环放在火焰上灼烧,直至烧红让接 种环自然冷却 从第一区域划线的末端开始往第二区域划 线,重复以上操作,在三、四、五区域划 线,注意不要将最后一区的划线与 相连。(也可以用连续划“Z”字形线的方 法 倒置培养皿,放入培养箱中培养 避免周围环境中微生物的 污染 清除; 防止杀死菌种 防止塞子被污染; 清除的杂菌 接种到培养基表面 调整角度,准备第二区域 的划线 在琼脂固体培养基表面连 续划线的操作,将聚集的 菌种逐步稀释分散到培养 基的表面 减少培养基内的水分蒸 发,使培养基保持湿润; 防止水珠回流打散菌落 在右图所示 的培养皿内 用笔模拟接 种环画出两 种平板划线 法的划线轨 迹 接种 方法 二: 1.系列稀 释操作 准备六只试管 ↓ 分别加入4.5mL蒸馏水并灭菌,编号 ↓ 取 mL菌液放入第1支试管并混匀 ↓ 从第1支试管取0.5ml菌液放入第2只试管并 混匀 ↓ 重复步骤,直至最后一支试管 2.涂布平 板操作 滴加100μL菌液到培养基表面 ↓ 引燃涂布器,待酒精燃尽后,冷却8~10s ↓ 把培养皿打开一条缝 ↓ 在培养皿盖内侧进一步冷却涂布器,均匀涂布 菌液,转动培养皿,涂匀 ↓ 盖上皿盖,放置10min ↓ 倒置培养皿,放入培养箱中培养 清除涂布器上的杂菌 使菌液均匀分布在培 养基表面 使液体被充分吸收 结果 观察 观察划线平板和涂布平板上的菌落形态、颜 色、大小,可挑取少量菌落制成临时装片,显 微镜下观察。 对菌落进行初步鉴定 1

大学土壤微生物分离实验报告

从土壤中分离纯化培养微生物并作初步观察鉴定 【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化,根据细菌在选择培养基的存活情况,确定该菌种的固氮解磷解钾属性。 【关键词】细菌芽孢杆菌培养基、选择培养基的配制高压蒸汽灭菌 前言: 在自然条件下,微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。群落是不同种类微物的混和体。为了生产和科研的需要,人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物;或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株;或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。 分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。 实验目的: 1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。 2、学习、掌握微生物的鉴定方法。 3、对提取的土样进行微生物选择培养、分离、纯化,根据菌落的存活状况来判断未知 菌的属性。 实验原理: 菌种来源:选择无机磷农药含量较高的土壤,有机磷农药化工厂 旁边的土壤和排污口区的污水. 培养基的选取:五组选择培养基,分别以辛硫磷、甲胺磷、敌敌畏、草甘膦及五种有机磷农药混合为微生物生长的唯一氮源磷源。 分离纯化微生物:稀释倒平板法、涂布平板法、稀释摇管法、平板划线分离法。 此次实验采取的是平板分离法,该方法操作简便,普遍用于微生物的分离与纯化,其基本原理主要包括两个方面:(一)选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长,而抑制其它微生物生长的环境,从而淘汰大部

分不需要的微生物。(二)微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体,因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。 微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态,也可以用肉眼观察其菌落形态。前者是微生物的显微镜观察技术,后者是微生物的肉眼观察技术。 1. 实验器材、试剂与实验方法: 1.1器材: 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、培养皿、自动立式压力蒸汽灭菌器、烘箱、玻璃珠、移液枪、枪头、称量纸、药匙、试管架、接种环、酒精灯、超净工作台, 粉碎机,接种环,移液枪配枪头。 1.2试剂: 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、1mol/L NaOH、1mol/LHCl、NaCl、95%乙醇、75%酒精,草甘膦,甲甘磷,敌敌畏,辛硫磷。 1.3土样、样品: 取自二十三冶草莓园的土壤,建设北路的大棚蔬菜菜地土壤,化工厂污水口。 1.4 实验方法 1.4.1配制培养基: (一)配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基200ml(用2个100ml三角瓶和2支试管分装)牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基。 配方如下:牛肉膏 0.6g 蛋白胨 2g NaCl 1g 琼脂 3~4g 水 200ml pH 7.4-7.6 1、称药品按实际用量计算后,按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏和蛋白 胨可分别放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶解后倒入大烧杯。蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速。 2、加热溶解在烧杯中加入少于所需的水量,然后放在石棉网上,小火加热,并用 玻璃棒搅拌,待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基,则将称好的琼脂放入已溶解的药品中,再加热融化,在此过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出,最后补充所失水分。 3、调pH 用pH试纸或酸碱度计检测培养基的pH值,若pH偏酸,可滴加1mol/L NaoH, 边加边搅拌,并随时检测,直至达到所需pH范围。若偏碱,则用1mol/l HCL进行调节。 pH调节通常放在加琼脂之前。注意pH值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的

设计实验:微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定 以及保藏技术

设计实验:微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定以及保藏技术 一.实验目的 1.学习大肠菌群分离纯化、鉴定的原理。 2.掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。 3.学习掌握菌种保藏的原理和方法。 二.实验原理 菌种的分离纯化 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中,不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物,而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”,防止其他微生物的混入。 1.涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡,且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长,因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。 2.平板划线法 最简单的分离微生物的方法是平板划线法,其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多,常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。 大肠菌群的培养鉴定 大肠菌群能在乳糖胆盐液体培养液中生长,并且产气产酸,使培养液变色。还能在伊红美兰固体培养上生长,形成黑紫色的菌落,有的还有金属光泽。其他病原菌的菌落呈粉红色。再做镜检观察是无芽孢的革兰氏阴性杆菌(呈红色)。即可鉴定是有大肠菌群的菌存在。 菌种保藏 菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存,不污染其它杂菌,及可保持其形态特征和生理性状,减少变异,防止衰老,以便于将来使用。 保藏菌种一般是选用它的休眠休,如孢子;芽孢等等,并且要创造一个低温;干燥;缺氧;避光和缺少营养的环境条件,以利于休眠体能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物,应使其新陈代谢处于最低状态,又不会死亡,从而达到长期保存的目的 三.实验器材 1.菌种:污水中的大肠菌群、酵母菌和霉菌 2、培养基:乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂(EMB)、营养琼脂培养基、麦芽汁固体斜面培养基 和马铃薯固体斜面培养基。 3.器材:接种环、安培瓶、干燥器、冰箱、产气管、试管、培养皿、无菌平皿、无菌玻璃涂棒移液管、电炉、双目显微镜、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅、恒温干燥箱等。 4.试剂:革兰氏一(草酸铵结晶紫)、革兰氏二(路哥氏碘液) 、革兰氏三(95%乙醇)、 革兰氏四(蕃红);试剂:医用液体石腊(比重0.83~0.89)。 四.试验方法及步骤 1.大肠菌群的分离纯化 第一天 a.涂布平板法:将已熔化的营养琼脂培养基倒入无菌平皿,制成无菌平板,冷却凝固后,将一定量的含大肠菌群的污水滴加在平板表面,再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面,置培养箱中37℃培养24小时。经培养后挑取单个菌落。 第二天 b.平板划线法:经培养后挑取单个菌落,接种环以无菌操作沾取少许菌落,在无菌伊红美兰琼脂培养基平板表面进行连续划线,微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少,并逐步分散开来,如果

微生物的接种、分离纯化与培养方法

微生物的接种、分离纯化与培养方法 实验目的:学习掌握无菌操作技术;学习接种方法;学习常用的分离、纯化菌种的方法。实验内容: 一、接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。1、接种工具和方法 在实验室或工厂实践中,用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同,接种针的针尖部常做成不同的形状,有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时,需要用到涂布棒。(图3-3) 图3-3接种和分离工具 1.接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种: 1)划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动,就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环,接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。2)三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上,成等边三角形的三点,让它各自独立形成菌落后,来观察、研究它们的形态。除三点外,也有一点或多点进行接种的。 3)穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时,用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是:用接种针蘸取少量的菌种,沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺,如某细菌具有鞭毛而能运动,则在穿刺线周围能够生长。 4)浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中,然后再倒入冷却至45° C左右的固体培养基,迅速轻轻摇匀,这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后,置合适温度下培养,就可长出单个的微生物菌落。 5)涂布接种与浇混接种略有不同,就是先倒好平板,让其凝固,然后再将菌液倒入平板上面,迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布,让菌液均匀分布,就可长出单个的微生物的菌落。 6)液体接种从固体培养基中将菌洗下,倒入液体培养基中,或者从液体培养物中,用移液管将菌液接至液体培养基中,或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中,都可称为液体接种。

土壤微生物的分离和纯化

土壤微生物的分离和纯化 一、实验目的 1、掌握从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。 2、学会根据微生物培养特征初步判断未知菌的类别。 3、练习微生物接种、移植和培养的基本技术,掌握无菌操作技术。 二、实验原理 土壤是微生物生长和栖息的良好基地。土壤具有绝大多数微生物生活所需的各种条件,是自然界微生物生长繁殖的良好基地。因此,土壤是微生物资源的巨大宝库。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基,可用于培养细菌。链霉素可以抑制细菌和放线菌的生长,对酵母菌和霉菌不起作用。加入一定量链霉素的培养基可以从混杂的微生物群体中分离出酵母菌和霉菌。重铬酸钾或苯酚对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用,可用于选择分离放线菌。 三、实验器材 1、材料:10cm左右深层土壤。 2、培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏Ⅰ号培养基 3、其他物品:试管、三角瓶、烧杯、量筒、电子天平、精密pH试纸、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、移液枪、枪头、接种环、酒精灯、链霉素(1万单位/ml) 、10%苯酚、无菌水。 四、实验步骤 1、土样采集:取10cm左右深层土壤10g备用。 2、制备土壤稀释液:称取土壤1g,放入有99mL无菌水的三角瓶中,振荡均匀,即为稀释10-2的土壤悬液。然后进行十倍梯度稀释,依次制备10- 3、10- 4、10- 5、10- 6、10-7 稀释度的土壤稀释液。 3、培养基平板制备:按培养基配方各配置牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏Ⅰ号培养基各100ml。灭菌后分别倒3个平板。(高氏Ⅰ号培养基灭菌前加入10滴10%苯酚;马丁氏培养基倒平板前加入2ml去氧胆酸钠(2%)和0.4ml 1万单位/ml链霉素) 4、接种:用无菌吸管吸取0.1ml相应浓度土壤稀释液,以无菌操作技术接种在平板上,涂布均匀。细菌选用10-4、10- 5、10-6 三个稀释度接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,放线菌与霉菌选用10-2 、10-3、10-4三个稀释度,分别接种于高氏Ⅰ号培养基、马丁氏培养基。(一个稀释度一个平板) 5、培养:细菌平板于37℃恒温培养1~2d,放线菌于30℃培养2~3d,霉菌于30℃培养3~5d ,观察。 6、计数:用稀释水样检测平板的菌落计数方法进行计数,报告细菌总数/(CFU·ml-1) 7、纯化:挑取典型菌落接种于相应平板,培养条件同上,培养纯化。 五、思考题

微生物的分离与纯化

一、实验目的:掌握无菌技术的操作,尝试用平板划线法和稀释涂布平板法分离纯化酵母菌。 二、实验步骤 (1)制备培养基(马铃薯琼脂培养基):计算→称量→溶化→灭菌→倒平板(已完成) (

三.巩固检测 1.获得纯净培养物的关键是( ) A.在无菌环境中培养B.接种纯种细菌 C.接种环灼烧灭菌D.防止外来杂菌的污染 2.巴氏消毒法常用于酒、奶等食品的消毒,该消毒法就是加热到70~75 ℃、保持30 min,或加热到80 ℃、保持15 min,能杀死一般杂菌和病原菌。这与灭菌的要求相比,巴氏消毒法( ) A.不能杀灭芽孢和孢子B.只能杀灭芽孢等休眠状态的细菌 C.能杀灭各种细菌,包括芽孢D.能杀灭各种真菌,包括孢子 3.细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理,这些方法依次用于杀灭哪些部分的微生物() A.接种环、手、培养基 B. 高压锅、手、接种针 C. 培养基、手、接种环 D. 接种环、手、高压锅 4.下列操作与消毒或灭菌无关的是() A. 接种前用酒精灯火焰灼烧接种环 B. 接种前用酒精擦试双手 C. 接种在酒精灯水焰旁完成 D. 培养基在冷却到50℃ 时倒平板 5.制备固体培养基的步骤是( ) A.计算、称量、倒平板、溶化、灭菌 B.计算、称量、溶化、倒平板、灭菌 C.计算、称量、溶化、灭菌、倒平板 D.计算、称量、灭菌、溶化、倒平板 6.平板冷却凝固后要将平板倒置,其意义是() A. 防止菌种死亡B.利于培养基的冷却 C.利于大肠杆菌的接种D.防止皿盖上的冷却水倒流入培养基 7.将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入恒温箱培养的目的是()A.为了检测温度是否最适宜B.检查培养基是否灭菌彻底 C.为了下次接种时再使用D.没必要放入未接种的培养基 8. 下列关于平板划线操作的叙述正确的是() A.使用已灭菌的接种针、培养皿,在操作过程中不再灭菌 B.打开含菌种的试管,需通过火焰灭菌,取出菌种后,需马上塞上棉塞10. 稀释涂布平板法是微生物培养中的一种常用的接种方法。下列相关叙述错误的是() A.操作中需要将菌液进行一系列的梯度稀释 B.需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面 C.不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落 D.操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理 11. 下列关于平板划线法和稀释涂布平板法纯化大肠杆菌的叙述,正确的是() ①可以获得单个的菌落②都需要使用接种环进行接种 ③都需要在火焰旁进行接种④都可以用来计数活菌. A.①② B. ③④ C.①③ D. ②④ 12. 下列有关实验室中微生物培养和分离的叙述,错误的是() A. 获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵 B. 高温灭菌的目的是杀死所有微生物 C. 划线分离可在培养基上获得均匀分布的单菌落 D. 稀释涂布平板法可用于计数活菌数目 13. 平板划线法:通过在琼脂固体培养基表面的操作,将聚集的菌种逐步 到培养基的表面。在数次划线后培养,可以分离到由繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是。 14. 稀释涂布平板法:将菌液进行一系列的,然后将不同稀释度的菌液分别 在琼脂固体培养基的表面,进行培养。在稀释度的菌液里,聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞,从而能在培养基表面形成。 15.大肠杆菌是生存在人体肠道中的正常菌群,每克粪便中含有109 个,且能够与致病菌混杂生长。如果食品和饮用水中出现大肠杆菌,就意味着食物可能被粪便污染而带上致病菌,因而常将大肠杆菌的数量作为食品卫生的检测指标之一。请据此回答下列问题: (1)测定街边出售的奶茶中大肠杆菌的数目,常用稀释涂布平板法进行测定。 该方法首先配置LB 培养基,进行高压蒸汽灭菌后冷却至60℃,在 旁倒在培养皿中形成平板;对奶茶样品进行一定倍数的稀释,取0.1mL 奶茶稀释液,加在培养皿的固体培养基上,用涂布在培养基平面上,然后进行培养;观察统计培养皿中的数目;该数据比实际数值要(高、低),原因是 C.将培养皿盖全部打开后,用沾有菌液的接种环进行划线接种 D. 接种时,接种环在培养基上迅速划线后盖上皿盖 9. 在农业生产研究上,常需要进行微生物的培养和计数,下图是利用平板划线法进行微生物接种过程中的部分操作,有关叙述不正确的是() A.每次划线前都需要灼烧接种环 B.接种环冷却后从上一区划线的末端开始划线 C.最后一区和第一区要保证不重叠 D.只有在图中的5 区域才可以得到所需菌落 。实验完成后需要对培养基进行处理,然后才能倒掉。(2)若要对上述培养基中的菌种进行扩大培养,则需配置LB 培养基,灭菌后,将在酒精灯火焰上烧红后冷却,然后蘸取单菌落中的菌体接种到新的培养基中,在适宜环境中培养。

微生物的分离与纯化

常用的微生物分离纯化方法 1. 稀释混合倒平板法 平板是指经熔化的固体培养基倒入无菌培养皿中, 冷却凝固而成的盛有固体培养基的平皿。该法是先将待分离的含菌样品, 用无菌生理盐水作一系列的稀释(常用十倍稀释法, 稀释倍数要适当), 然后分别取不同稀释液少许(0.5-1.0ml)于无菌培养皿中, 倾入已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基, 迅速旋摇, 充分混匀。待琼脂凝固后, 即成为可能含菌的琼脂平板。 于恒温箱中倒置培养一定时间后, 在琼脂平板表面或培养基中即可出现分散的单个菌落。每个菌落可能是由一个细胞繁殖形成的。挑取单一个菌落, 一般再重复该法1-2次, 结合显微镜检测个体形态特征,便可得到真正的纯培养物。若样品稀释时能充分混匀,取样量和稀释倍数准确,则该法还可用于活菌数测定。 2. 稀释涂布平板法 采用上述稀释混合倒平板法有两个缺点,一是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间,缺乏溶氧而生长受影响,形成的菌落微小难于挑取;一是在倾入熔化琼脂培养基时,若温度控制过高,易烫死某些热敏感菌,过低则会引起琼脂太快凝固, 不能充分混匀。 在微生物学研究中, 更常用的纯种分离方法是稀释涂布平板法。该法是将已熔化并冷却至约50℃(减少冷凝水)的琼脂培养基, 先倒入无菌培养皿中, 制成无菌平板。待充分冷却凝固后,将一定量(约0.1 ml)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面, 再用三角形无菌玻璃涂棒涂布,使菌液均匀分散在整个平板表面, 倒置温箱培养后挑取单个菌落。 另一种简单快速有效的涂布平板法, 可省去含菌样品悬液的稀释, 直接吸取经振荡分散的样品悬浮液l滴加入1号琼脂平板上, 用一支三角形无菌玻璃涂棒均匀涂布, 用此涂棒再连续涂布2号、3号、4号平板(连续涂布起逐渐稀释作用,涂布平板数视样品浓度而定), 翻转此涂棒再涂布5号、6号平板, 经适温倒置培养后挑取单个菌落。该法可称之为玻璃涂棒连续涂布分离法。 3. 平板划线分离法 先倒制无菌琼脂培养基平板,待充分冷却凝固后,用接种环以无菌沾取少量待分离的含菌样品,在无菌琼脂平板表面进行有规则的划线。划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其它形式的划线。通过这样在平板上进行划线稀释, 微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少, 并逐步分散开来。经培养后,可在平板表面形成分散的单个菌落。但单个菌落并不一定是由单个细胞形成的,需再重复划线1-2次, 并结合显微镜检测个体形态特征, 才可获得真正的纯培养物。该法的特点是简便快速。 4单细胞分离 采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。①较大的微生物,可采用毛细管提取单个个体,并在大量的灭菌培养基中转移清洗几次,除去较小微生物的污染;②对于个体相对较小的微生物,需采用显微操作仪,在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。 5.选择培养分离 利用选择平板进行直接分离:根据该微生物的特点,包括营养、生理、生长条件等,采用选择培养分离的方法。或抑制使大多数微生物不能生长,或造成有利于该菌生长的环境,经过一定时间培养——如要分离高温菌,可在高温条件下进行培养;要分离某种抗菌素抗性菌株,可在加有抗菌素的平板上进行分离等。

常用的微生物分离纯化方法

(一)常用的微生物分离纯化方法 菌种分离纯化的方法有:稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法、选择培养分离法等。其中前三种方法最为常用,不需要特殊的仪器设备,分离纯化效果好,现分别简述如下 1.稀释混合倒平板法 平板是指经熔化的固体培养基倒入无菌培养皿中,冷却凝固而成的盛有固体培养基的平皿。该法是先将待分离的含菌样品,用无菌生理盐水作一系列的稀释(常用十倍稀释法,稀释倍数要适当),然后分别取不同稀释液少许(0.5-1.0ml)于无菌培养皿中,倾入已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基,迅速旋摇,充分混匀。待琼脂凝固后,即成为可能含菌的琼脂平板。 于恒温箱中倒置培养一定时间后,在琼脂平板表面或培养基中即可出现分散的单个菌落。每个菌落可能是由一个细胞繁殖形成的。

挑取单一个菌落,一般再重复该法1-2次,结合显微镜检测个体形态特征,便可得到真正的纯培养物。若样品稀释时能充分混匀,取样量和稀释倍数准确,则该法还可用于活菌数测定。 图4混合倒平板操作法示意图图5涂布平板操作法示意图 2.稀释涂布平板法 采用上述稀释混合倒平板法有两个缺点,一是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间,缺乏溶氧而生长受影响,形成的菌落微小难于挑取;一是在倾入熔化琼脂培养基时,若温度控制过高,易烫死某些热敏感菌,过低则会引起琼脂太快凝固,不能充分混匀。

在微生物学研究中,更常用的纯种分离方法是稀释涂布平板法。该法是将已熔化并冷却至约50℃(减少冷凝水)的琼脂培养基,先倒入无菌培养皿中,制成无菌平板。待充分冷却凝固后,将一定量(约0.1ml)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面,再用三角形无菌玻璃涂棒涂布,使菌液均匀分散在整个平板表面,倒置温箱培养后挑取单个菌落。 另一种简单快速有效的涂布平板法,可省去含菌样品悬液的稀释,直接吸取经振荡分散的样品悬浮液l滴加入1号琼脂平板上,用一支三角形无菌玻璃涂棒均匀涂布,用此涂棒再连续涂布2号、3号、4号平板(连续涂布起逐渐稀释作用,涂布平板数视样品浓度而定),翻转此涂棒再涂布5号、6号平板,经适温倒置培养后挑取单个菌落。该法可称之为玻璃涂棒连续涂布分离法。 3.平板划线分离法 先倒制无菌琼脂培养基平板,待充分冷却凝固后,用接种环以无菌沾取少量待分离的含菌样品,在无菌琼脂平板表面进行有规则的划线。划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其它形式的划线。通过这样在平板上进行划线稀释,微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少,并逐步分散开来。经培养后,可在平板表面形成分散的单

常用的微生物分离纯化方法

(一) 常用的微生物分离纯化方法 菌种分离纯化的方法有:稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法、选择培养分离法等。其中前三种方法最为常用,不需要特殊的仪器设备, 分离纯化效果好, 现分别简述如下 1. 稀释混合倒平板法 平板是指经熔化的固体培养基倒入无菌培养皿中, 冷却凝固而成的盛有固体培养基的平皿。该法是先将待分离的含菌样品, 用无菌生理盐水作一系列的稀释(常用十倍稀释法, 稀释倍数要适当), 然后分别取不同稀释液少许(0.5-1.0ml)于无菌培养皿中, 倾入已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基, 迅速旋摇, 充分混匀。待琼脂凝固后, 即成为可能含菌的琼脂平板。 于恒温箱中倒置培养一定时间后, 在琼脂平板表面或培养基中即可出现分散的单个菌落。每个菌落可能是由一个细胞繁殖形成的。挑取单一个菌落, 一般再重复该法1-2次, 结合显微镜检测个体形态特征,便可得到真正的纯培养物。若样品稀释时能充分混匀,取样量和稀释倍数准确,则该法还可用于活菌数测定。

图 4 混合倒平板操作法示意图图 5 涂布平板操作法示意图 2. 稀释涂布平板法 采用上述稀释混合倒平板法有两个缺点,一是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间,缺乏溶氧而生长受影响,形成的菌落微小难于挑取;一是在倾入熔化琼脂培养基时,若温度控制过高,易烫死某些热敏感菌,过低则会引起琼脂太快凝固, 不能充分混匀。 在微生物学研究中, 更常用的纯种分离方法是稀释涂布平板法。该法是将已熔化并冷却至约50℃(减少冷凝水)的琼脂培养基, 先倒入无菌培养皿中, 制成无菌平板。待充分冷却凝固后,将一定量(约0.1 ml)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面, 再用三角形无菌玻璃涂棒涂布,使菌液均匀分散在整个平板表面, 倒置温箱培养后挑取单个菌落。

微生物的分离纯化

微生物的纯化分离方法 自然界中的微生物几乎都是混杂在一起的。分离和纯化的目的是从各种样品来源混杂的微生物群体中获得纯种微生物,即在一定的条件下培养、繁殖得到只有一种微生物的培养物(也称为纯培养物),要找出化妆品生产各环节造成微生物污染的原因,明确污染菌的数量和组成,了解污染菌的生理生化特性,首先必须进行样品中微生物的分离纯化技术。 一、实验目的 1.掌握常用微生物分离纯化方法 2.了解样品的预处理方法 二、实验原理 将样品进行一定的稀释,使得每一个细胞尽量能够单独分散存在,通过适当的方法将某个细胞挑选出来,这个细胞就成为纯种。 常用菌种分离纯化的方法有稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、亨盖特稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法和选择培养分离法等。其中前三种方法最为常用,不需要特殊的仪器设备,分离纯化效果好。 三、实验材料 1.含菌样品 2.培养基:营养琼脂培养基 3.培养皿、接种针、涂布棒、试管、移液管、天平、三角瓶、称量纸 四、实验方法与步骤 1. 稀释混合倒平板法 平板是指经熔化的固体培养基倒入无菌培养皿中,冷却凝固而成的盛有固体培养基的平皿。该法是先将待分离的含菌样品用无菌生理盐水作一系列的稀释(常用10倍稀释法,稀释倍数要适当),然后分别取不同稀释液少许(0.5~1mL)于无菌培养皿中,倾人已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基,迅速旋摇,充分混匀。待琼脂凝固后,即成为可能含菌的琼脂平板于恒温箱中倒置培养一定时间后,在琼脂平板表面或培养基中即可出现分散的单个菌落。每个菌落可能是由1个细胞繁殖形成的。挑取单个菌落,一般再重复该法1~2次,结合显微镜检测个体形态特征,便可得到真正的纯培养物。若样品稀释时能充分混匀,取样量和稀释倍数准确,则该法还可用于活菌数测定。稀释混合倒平板法有两个缺点,一是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间,缺乏溶氧而生长受影响,形成的菌落微小难以挑取,二是在倾入

微生物菌种的分离和纯化方法

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物得过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学得研究及应用中,不仅需要通过分离纯化技术从混杂得天然微生物群中分离出特定得微生物,而且还必须随时注意保持微生物纯培养物得“纯洁”,防止其她微生物得混入。 1、用固体培养基分离与纯化 单个微生物在适宜得固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见得、有一定形态结构得子细胞生长群体,称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时,便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成得菌落或菌苔一般都具有稳定得特征,可以成为对该微生物进行分类、鉴定得重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌与单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立得菌落,采用适宜得平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板,即培养平板得简称,它就是指固体培养基倒入无菌平皿,冷却凝固后,盛固体培养基得平皿。这方法包括将单个微生物分离与固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化得培养基,每个孤立得活微生物体生长、繁殖形成菌落,形成得菌落便于移植。最常用得分离、培养微生物得固体培养基就是琼脂固体培养基平板.这种由Kock建立得采用平板分离微生物纯培养得技术简便易行,100多年来一直就是各种菌种分离得最常用手段。 1、1稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列得稀释(如1:10、1:100、1:1000、1:10000),然后分别取不同稀释液少许,与已熔化并冷却至50℃左右得琼脂培养基混合,摇匀后,倾入灭过菌得培养皿中,待琼脂凝固后,制成可能含菌得琼脂平板,保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当,在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散得单个菌落,这个菌落可能就就是由一个细菌细胞繁殖形成得.随后挑取该单个菌落,或重复以上操作数次,便可得到纯培养。 1、2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫得培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌得死亡,且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长,因此在微生物学研究中常用得纯种分离方法就是涂布平板法。其做法就是先将已熔化得培养基倒入无菌平

菌种的分离与纯化

接种、分离纯化和培养技术 一、接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 1、接种工具和方法 在实验室或工厂实践中,用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同,接种针的针尖部常做成不同的形状,有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时,需要用到涂布棒。(图3-3) 图3-3接种和分离工具 1.接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种: 1)划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动,就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环,接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 2)三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上,成等边三角形的三点,让它各自独立形成菌落后,来观察、研究它们的形态。除三点外,也有一点或多点进行接种的。 3)穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时,用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是:用接种针蘸取少量的菌种,沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺,如某细菌具有鞭毛而能运动,则在穿刺线周围能够生长。 4)浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中,然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基,迅速轻轻摇匀,这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后,置合适温度下培养,就可长出单个的微生物菌落。

5)涂布接种与浇混接种略有不同,就是先倒好平板,让其凝固,然后再将菌液倒入平板上面,迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布,让菌液均匀分布,就可长出单个的微生物的菌落。 6)液体接种从固体培养基中将菌洗下,倒入液体培养基中,或者从液体培养物中,用移液管将菌液接至液体培养基中,或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中,都可称为液体接种。 7)注射接种该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内,如人或其它动物中,常见的疫苗预防接种,就是用注射接种,接入人体,来预防某些疾病。 8)活体接种活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法,因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物;也可以是某个离体活组织,例如猴肾等;也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射,也可以是拌料喂养。 2、无菌操作 培养基经高压灭菌后,用经过灭菌的工具(如接种针和吸管等)在无菌条件下接种含菌材料(如样品、菌苔或菌悬液等)于培养基上,这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。 实验台面不论是什么材料,一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒剂擦洗;水平是倒琼脂培养基时利于培养皿内平板的厚度保持一致。在实验台上方,空气流动应缓慢,杂菌应尽量减少,其周围杂菌也应越少越好。为此,必须清扫室内,关闭实验室的门窗,并用消毒剂进行空气消毒处理,尽可能地减少杂菌的数量。 空气中的杂菌在气流小的情况下,随着灰尘落下,所以接种时,打开培养皿的时间应尽量短。用于接种的器具必须经干热或火焰等灭菌。接种环的火焰灭菌方法:通常接种环在火焰上充分烧红(接种柄,一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次),冷却,先接触一下培养基,待接种环冷却到室温后,方可用它来挑取含菌材料或菌体,迅速地接种到新的培养基上。(图3-4)然后,将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌,复原。不要直接烧环,以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。平板接种时,通常把平板的面倾斜,把培养皿的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养基或接种时,试管口或瓶壁外面不要接触底皿边,试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。 图3-4斜面接种时的无菌操作

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