生物化学实验讲义
实验一蛋白质的性质实验——蛋白质及氨基酸的呈色反应及蛋白
质的沉淀反应
实验目的
1．了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。
2．了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3．学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
4．加深对蛋白质溶液的胶体性质的认识，了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。，
一、茚三酮反应
1.实验原理
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。
β-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应。尿素、马尿酸、二酮吡唪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。
该反应十分灵敏，1∶1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。
此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
2.材料、仪器与试剂
蛋白质溶液；新鲜鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；0.5%甘氨酸溶液；0.1%茚三酮水溶液；
0.1%茚三酮-乙醇溶液
3.实验操作
①取2支试管分别加入鸡蛋清溶液和0.5%甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1~2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。
②在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。
二、黄色反应
1.实验原理
含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。
2.材料、仪器与试剂
鸡蛋清溶液；大豆提取液(将大豆浸泡充分吸胀后，研磨成浆状用纱布过滤)；头发；指甲；0.5%苯酚溶液；浓硝酸；0.3%色氨酸溶液；0.3%酪氨酸溶液；10%氢氧化钠溶液
3.实验操作
向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或
用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变
三、蛋白质沉淀反应
蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶性盐类后，即自溶液中沉淀析出，此现象叫蛋白质的沉淀反应。
（一）蛋白质的盐析作用
1.实验原理
盐析现象是指—般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降，故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时，蛋白质即自溶液中沉淀析出。盐析作用与两种因素有关：①蛋白质分子被浓盐脱水；②分子所带电荷被中和。
蛋白质的盐析作用是可逆过程，用盐析方法沉淀蛋白质时，较少引起蛋白质变性，经透析或用水稀释时又可溶解。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及 pH 有关。分子量大的蛋白质(如球蛋白)比分子量小的(如清蛋白)易于析出。球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中即可析出，而清蛋白需在饱和硫酸铵溶液中才能析出。
2.材料、仪器与试剂
鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；固体硫酸铵；饱和硫酸铵溶（称取377 g硫酸铵溶于20℃500ml 的蒸馏水中。硫酸铵在20℃水中的溶解度为754g/L水。配制时需称取稍过量的硫酸铵使溶液中有少量固体存在，同时可加热助溶）。
3.实验操作
取鸡蛋清溶液约 5ml 于试管中，再加入等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静止数分钟则析出球蛋白沉淀。将管内混合液过滤，向滤液中加入硫酸铵粉末，至硫酸铵饱和不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。
（二）重金属盐类沉淀蛋白质
1.实验原理
溶液 pH 在蛋白质等电点以上时，重金属盐类(如 Pb 2+ 、Cu 2+ 、Hg 2+ 及 Ag + 等)易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀。重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，故常用重金属盐除去液体中的蛋白质。但应注意，在使用某些重金属盐(如硫酸铜或醋酸铅)沉淀蛋白质时，不可过量，否则将引起沉淀再溶解。
2.材料、仪器与试剂
鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；5％CuS04 溶液；3％AgNO3 溶液
3.实验操作
取试管 2 支各加蛋白质溶液 1ml，向各管分别滴加 2-3滴加 5％CuS04 溶液、3％AgNO3 溶液，观察各管所生成的沉淀。在硫酸铜产生蛋白质沉淀的试管中，倒掉大部分沉淀，留少量沉淀，继续加入 5％CuS04 溶液，观察沉淀的溶解。
（三）有机酸沉淀蛋白质
1.实验原理
生物碱是植物中具有显著生理作用的—类含氮的碱性物质。凡能使生物碱沉淀，或能与生物碱作用产生颜色反应的物质，称为生物碱试剂。如鞣酸、苦味酸和磷钨酸等。当蛋白质溶液 pH 值低于其等电点时，蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合成中性盐而沉淀。溶液中的蛋白亦能被有机酸沉淀，其中以三氯醋酸的作用最为灵敏而且特异，因此广泛的被用于沉淀蛋白质。
2.材料、仪器与试剂
鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；10％三氯醋酸溶液；
3.实验操作
取蛋白质溶液 1ml 于试管中，加数滴三氯醋酸溶液，观察现象。
思考题
1．茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调？并说明原因。
2．能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在？
3．哪些芳香基因（蛋白质中的、非蛋白质中的）可以与浓硝酸作用呈现黄色反应的阳性结果？
实验二考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
【实验目的】
蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。
【实验原理】
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，
红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下
呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结
合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋
白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为
595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定
595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右的时
间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。
【实验试剂和器材】
1.仪器
电子天平、试管、试管架、移液管、容量瓶、721型分光光度剂
2.试剂
（1）标准蛋白质溶液：称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，制成100μg/m L 牛血清白蛋白溶液
（2）考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90%乙醇中，
加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。
（3）鸡蛋清1ml定容至50mL
【实验步骤】
1、标准曲线绘制
加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定，记录A595。以各管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。
2、样品测定
试管中加自制蛋白质样品1.0mL ，再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，在595nm波长下比色，记录A595。
根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量。
【实验结果】
根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg），按下式计算：
查得的蛋白质含量（μg）×提取液总体积（mL）
样品蛋白质含量（μg/g鲜重）=
样品鲜重（g）×测定时取用的提取液体积（mL）
【注意事项】
（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。比色反应需在1h内完成。
（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
实验三糖的性质实验及总糖和还原糖含量测定
一. 实验目的
1.加深对单糖、二糖、多糖化学性质的认识，进一步体会糖类化合物的分子结构与其化
学性质的关系。
2.了解3，5—二硝基水杨酸法测定还原糖的基本原理。
3.区分还原糖和总糖测定过程的异同，掌握具体的操作方法。
二. 实验原理
糖是多羟基醛、多羟基酮或它们的缩合物。单糖及分子中含有半缩醛（酮）羟基的
二糖都具有还原性，能将班氏试剂还原成砖红色的Cu2O 沉淀。蔗糖等不含有半缩醛（酮）羟基的糖则无还原性。但蔗糖经水解生成了葡萄糖和果糖，因而水解液具有还原性。多糖是由许多单糖缩合而成的高分子化合物，无还原性。但多糖在酸存在下加热水解，可生成单糖，随之具有还原性。淀粉为一多糖，经水解先生成糊精，再水解成麦芽糖，最终水解产物是葡萄糖，因此水解液也具有还原性，能与班氏试剂发生反应。淀粉遇碘显蓝色，此反应很灵敏，常用于检验淀粉或碘。
糖在浓酸存在下，可与酚类化合物产生颜色反应。糖在浓硫酸的作用下与α-萘酚反应
显紫色，常用于糖类化合物的检出。己酮糖与间-苯二酚-盐酸试剂反应很快出现鲜红色， 而己醛糖显色缓慢，两分钟后可出现微弱的红色，因此常用于区别酮糖（果糖）和醛糖（葡 萄糖）。
还原糖是指含有自由醛基或酮基、具有还原性的糖类。单糖都是还原糖。3，5—二硝基水杨酸与还原糖共热后可生成棕红色氨基化合物，在一定范围内，该棕红色化合物颜色的深浅与还原糖的量呈正比关系，可用分光光度计进行比色测定。
因此3，5—二硝基水杨酸法可用于还原糖的测定，且具有快速、杂质干扰小的优点。
不具还原性的部分双糖或多糖经酸水解后可彻底分解为具有还原性的单糖。通过对样品中的总糖进行酸水解，测定水解后还原糖含量，可计算出样品的总糖含量。对于非还原性的双糖（如蔗糖）以及还原性很小的多糖（如淀粉），应先用酸水解法将它们彻底水解成单糖。再借助于测定还原糖的方法，可推算出总糖的含量。由于多糖水解时，在每个单糖残基上加了一分子水，因而在计算时，须扣除加入的水量，当样品里多糖含量远大于单糖含量时，则比色测定所得总糖含量应乘以折算系数（1-180
18= 0.9），即得比较接近实际的样品中总糖含量。
三．试剂
（1） 班氏试剂的配制：称取柠檬酸钠20g ，无水碳酸钠11.5g ，溶于100ml 热水中，
在不断搅拌下把含2g 硫酸铜晶体的20ml 水溶液慢慢加入。溶液应澄清，否则需过滤。 （2）2%葡萄糖 （3）2%果糖 （4）2%麦芽糖
（5）2%蔗糖（所用蔗糖必须纯净）
（6）2%淀粉溶液：将2g 可溶性淀粉用10ml 蒸馏水调成糊状，加入 90ml 沸水中煮沸后冷却。 （7）3mol ·Lˉ1H2SO4溶液 （8）10%Na2CO3 溶液
（9）0.1%碘液：在1g 碘和5g 碘化钾中，加入尽可能少的蒸馏水使其溶解，然后用蒸 馏水稀释为1000ml 。 （10）浓盐酸
（11）α-萘酚试剂的配制：将10g α-萘酚溶于95%乙醇中，再用同样的乙醇稀释至100ml ，
COOH
OH
NO 2O 2N 还原糖
COOH
OH
O 2N 2
3,5-二硝基水杨酸
（黄色）
3-氨基-5-硝基水杨酸
（棕红色）
C C H O OH OH C H C H 2OH OH
( )n ( )n C H C OH
OH C H C H 2OH OH
糖酸
贮于棕色瓶中，一般用前才配制。
（12）浓硫酸
（13）间-苯二酚-盐酸试剂的配制：将0.05g 间-苯二酚溶于50ml 浓盐酸中，再用蒸馏水稀释至100ml。
（14）3，5—二硝基水杨酸试剂(DNS)：6.3gDNS 和262mL2mol/LnaOH 加入到500mL 含有182g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加入5g 重蒸酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容至1000mL，贮存于棕色瓶中，7~10天后使用。
（15）葡萄糖标准溶液(300μg/mL)：准确称取干燥恒重的葡萄糖0.3g，以蒸馏水定容至1000mL。
（16）6mol/L 盐酸:取500mL12NHCl，用水稀释至1000mL。
（17）10%NaOH
（18）6mol/LNaOH：取240gNaOH，加水溶解，定容至1000mL。
（19）碘试剂：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL水中。
（20）酚酞试剂:称取0.1g酚酞，溶于250mL 70%（V/V）的乙醇中。
四．实验方法和步骤
（一）糖的还原性：取5 支大试管，编号后各加入1ml 班氏试剂，再分别加入2%葡萄糖、2%果糖、2%麦芽糖、2%蔗糖和2%淀粉溶液各10滴。振荡后，将试管用橡皮筋捆好放入沸水浴中，加热3～5分钟，观察那几个试管中生成砖红色沉淀。
（二）蔗糖的水解：取2 支大试管，各加入2%蔗糖溶液1ml，然后于一支试管中加入
3mol·Lˉ1H2SO42 滴，将此支试管置于沸水浴中加热5～10 分钟，冷却后，用10%Na2CO3中和，直到没有气泡发生为止。将两支试管各加入班氏试剂1ml，再在沸水浴中加热3～5分钟，观察并比较两管的结果。
（三）淀粉与碘的作用：取1 支大试管加10 滴2%淀粉溶液和1滴0.1%碘液，观察呈现的颜色。然后将此试管放入沸水浴中加热5～10 分钟，观察有何现象。取出试管，放置冷却，又有何变化，为什么？
（四）淀粉的水解：取1支大试管，加2%淀粉溶液2ml ,再加入浓盐酸3 滴，在沸水浴中加热10～15分钟，加热时每隔1～2 分钟取出1滴反应液，置于白瓷滴板上，加1滴碘液，注意观察其颜色的变化过程，直到无蓝色出现为止。取出试管，冷却后，用10%Na2CO3中和，直到没有气泡发生为止，加入班氏试剂5～10滴，然后在沸水浴中加热3～5 分钟，观察结果。（五）糖的颜色反应
⒈α-萘酚反应：取4 支小试管，分别加入2%葡萄糖、2%果糖、2%蔗糖和2%淀粉溶液1ml，然后各加入新配制的α-萘酚试剂2 滴，混合均匀后，将试管倾斜沿管壁徐徐注入浓硫酸各1ml,切勿摇动。然后竖起试管，静置10 分钟，观察两液界面之间出现紫色环。如无紫色环生成，可在水浴中温热后再进行观察。
⒉间-苯二酚反应：取4 支大试管，分别加入间-苯二酚-盐酸试剂1ml，然后在三支试管
中各加入2%葡萄糖、2%果糖、2%蔗糖溶液5滴，第4 支试管留作对照。将4 支试管摇匀
后，同时放入水浴中加热2 分钟，观察各管出现颜色的顺序。
（七）样品中总糖和还原糖的测定
1.还原糖的制备
准确称取1g玉米粉，放在100ml烧杯中，先以少量蒸馏水(约4ml)调成糊状，然后加入80ml蒸馏水，混匀，于50℃恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。过滤，将滤液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。2．样品总糖的水解及提取
准确称取1g玉米粉，放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl 20ml，蒸馏水30ml，在沸水浴
中加热0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100ml，过滤，取滤液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。
3．葡萄糖标准曲线的制作及样品测定
（1）标准葡萄糖梯度溶液的配制：
取8支大试管，分别按下表加入试剂。
（2）绘制标准曲线
由0～5号管的数据，以葡萄糖含量(mg)为横坐标，A540为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，从标准曲线中求样品管中葡萄糖的含量(mg)；按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量：
还原糖(%)=糖量(mg)×样品稀释倍数×100/样品量(mg)
总糖（%)=糖量(mg)×样品稀释倍数×100/样品量(mg) ×0.9
思考题
1.糖都包括哪些化合物？
2.为保证样品中糖测定的准确性.，应注意哪些操作事项？
3.标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么要同步进行？
实验四氨基酸的分离鉴定－纸层析法
【实验目的】
通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。
【实验原理】
层析法又称色谱法。1903年，发现用挥发油冲洗菊粉柱时，可将叶子的色素分成许多颜色的层圈。此后，把这种利用有色物质在吸附剂上因吸附能力不同而得到分离的方法称为色谱法（Chromatography）。虽然后来将色谱法应用于无色物质分离，但是这个名字一直沿用下来。
层析法除了吸附层析以外，还有离子交换层析和分配层析。一般认为纸层析是分配层析中的一种，但也并存着吸附和离子交换作用。
分配层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。通常用α表示分配系数。
α=
()()L S C C 溶质在流动相的浓度
溶质在固定相的浓度
一个物质在某溶剂系统中的分配系数，在一定的温度下是一个常数。
纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的OH 基具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动，称为下行层析；自下而上流动，称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到分离。
显然两个物质的分配系数差得越大，则越易分开。纸层析的实际操作是在滤纸的一端（通常距纸边缘2厘米），点上样品，干后，在密闭的容器内，待纸饱和了适当的溶剂蒸气后，令溶剂从有样品的一端经过毛细管的作用，流向另一端，使样品中的混合物得到分离。这种操作常称单向层析。为了得到更好的分离，还可以作双向操作或称双向层析。即在滤纸的一角上点样品，先用一种溶系统展层后，使滤纸干燥，将纸调转90°，再用另一个溶剂系统展层
物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在纸上的移动速率，用R f 表示。
R f =
原点到溶剂前沿的距离
离
原点到层析点中心的距
每一物质的R f 值决定于该物质在两相间的分配系数（α）和两相的体积比（A S /A L ）。这两种相即是水（固定相）和有机溶剂（流动相）。
两相体积比在同一实验情况下是不变的，所以R f 值的主要决定因素是分配系数（α）。对于某一物质在一条件下的α值是固定的。因此R f 值为其特征常数。
现将影响R f 值的因素概括如下：
1、物质结构的影响：极性物质是易溶于极性溶剂（水）中，非极性物质是易溶于非极性溶剂（有机溶剂）中，所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸，所以前者在水（固定相）中分配较多，因此R f 低于后者。
—CH 2—基是疏水性基团，如果分子中极性基数目不变，则—CH 2—基增加，整个分子的极性就降低，因此易溶于有机溶剂（流动相）中，R f 值亦随之增加，例如氨基酸的R f 值：甘氨酸＜丙氨酸＜亮氨酸，二羧基氨基酸中，天冬氨基酸＜谷氨酸。
极性基团的位置不同也会引起R f 变化，例如在正丁醇-甲酸-水系统中层析时，α-丙氨酸的R f 值大于β-丙氨酸。
2、溶剂的影响：同一物质在不同溶剂中R f 值不同，选择溶剂系统时应使被分离物质在适当R f 值范围内（0.005到0.85之间），并且不同物质的R f 至少差别为0.05才能彼此分开。
溶剂的极性大小也影响物质的R f 值。在用与水互溶的脂肪醇作为溶剂时，氨基酸的R f
值随着溶剂碳原子数目增加而降低。
3、pH 的影响：溶剂系统的pH 会影响物质极性基团的解离形式，例如氨基酸在酸性或碱性溶剂中变化如下：
对于酸性氨基酸则在酸性时所带净电荷比碱性时少。带电荷越少亲水性越小，因此在酸性溶剂中R f 值较碱性中大。而碱性氨基酸则与此相反。借此性质用酸相和碱相溶剂进行双向层析，可使酸碱性不同的氨基酸达到分离的目的。
溶剂的pH 还可影响有机溶剂（流动相）含水量，溶剂酸碱度大，则含水量多。对于极性物质如（氨基酸）来说R f 值增加，非极性物质则减少。若pH 不适合，使同种物质有不同解离形式，其R f 也略有不同，则此物质层析呈带状图谱。因此溶剂中的酸或碱的含量必须
足够，并且层析缸（或箱）中用酸或碱的气体饱和才可以防止上述现象，使物质得到圆点状图谱。
4、滤纸的影响：层析滤纸必须质地均匀、紧密，有一定机械强度，并且杂质较少，如纸中含有Ca2+、Mg2+、Cu2+等金属离子杂质，可与氨基酸形成络合物使层析图谱出现阴影，可用稀酸（0.01mol·L—1或0.4mol·L—1HCl）洗涤滤纸除去之。
5、温度的影响：温度不仅影响物质在溶剂中的分配系数，而且影响溶剂相的组成及纤维素的水合作用。温度变化对R f值影响很大，所以层析最好在恒温室中进行，控制温度相差不超过±0.5℃。
除上述因素影响R f值外。样品中含有盐份和其他杂质以及点样过多均会影响样品的有效分离。
无色物质的层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定，氨基酸层析图谱常用茚三酮或吲哚醌作显色剂。
茚三酮显色反应受温度、pH、时间影响较大，如果要使实验结果能很好重复，必须严格控制上述条件。样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不易显色，如含有大量盐时显色点上会出现白斑，此外空气中的杂质如氨、硫化氢或酚等都会影响显色结果。
铜离子可以与氨基酸-茚三酮显色物形成络合物，颜色较稳定。用硫酸酮乙醇溶液洗脱层析后的显色斑点，借比色法可定量测定氨基酸含量。
【实验器材及试剂】
1．器材：
①层析缸②毛细管③喷雾器④培养皿⑤层析滤纸
2．试剂：
①扩展剂：4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20毫升正丁醇和5毫升冰醋酸放入分液漏斗中，与15毫升水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5毫升置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。
②氨基酸溶液：0.5%的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各组份浓度均为0.5%）。
③显色剂：0.1%水合茚三酮丙酮溶液。
【操作步骤】
1．将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。
2．取层析滤纸（长18—20厘米，宽14厘米）一张。在垂直于纸的纹路一端距边缘2—3厘米处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2厘米作一记号，作为点样位置，并用铅笔在点样点下端写出所点氨基酸的名称。
3．点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这五个位置上。电吹风吹干后再点一次，共点三次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3毫米。
4．扩展：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20毫升扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中，点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1厘米。待溶剂上升15厘米左右时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。
5．显色：用喷雾器均匀喷上0. 1%茚三酮丙酮溶液；然后置烘箱中烘烤5分钟（100℃）或用热风吹干即可显出各层析斑点。
【结果与讨论】
1．计算出各种氨基酸的R f值，并根据R f值鉴定出混合氨基酸中的各组分，在层析图谱上标出各氨基酸名称。
2．对氨基酸移动快慢的原因给予简要分析。
试验五DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测
DNA的提取
目的要求
学习掌握浓盐法提取制备DNA的原理和操作。
原理
DNA主要集中在细胞核内，因此，通常选用细胞核含量比例大的生物组织作为提取制备DNA的材料。本实验选用猪脾作为材料，用浓盐法制备DNA。
在细胞内的核酸通常是与蛋白质形成复合物而存在的――DNP和RNP，这两种复合物在不同电解质溶液中的溶解度有较大的差异。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随NaCl浓度的增加而逐渐降低，当NaCl浓度达到0.14mol/L时，DNP的溶解度为纯水中溶解度的1％，当NaCl浓度增至0.5mol/L时，DNP在水中的溶解度约等于在纯水中的溶解度，当NaCl浓度继续增至1.0mol/L时，DNP的溶解度为在纯水中溶解度的两倍。但RNP则不同，在0.14mol/LNaCl溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相当大，因此在制备DNA时，利用0.14mol/L稀盐溶液使DNP和RNP分开。由于DNP在浓盐溶液中的溶解度比稀盐大的多，所以采用浓盐溶液尽量抽提DNP。分离得到DNP后进一步将蛋白质等杂志除去。
除去蛋白质的方法很多，本实验采用氯仿法。用含有异戊醇的氯仿溶液振荡DNP溶液，使其乳化，然后离心，此时蛋白质凝胶停留在水相和有机相之间，DNA则停留在上层水相。取出蛋白后的核酸盐溶液，在利用其不溶于有机溶剂的性质，应用适当的有机溶剂使DNA 呈絮状析出。
试剂和器材
1．材料
新鲜猪脾脏
2．试剂
（1）0.1mol/L NaCl－0.05 mol/L柠檬酸钠混合液（含1mmol/L EDTA）：称取0.58克NaCl，1.47克柠檬酸三钠，0.041克EDTA-Na·2H2O，定容到100ml。
（2）10％NaCl溶液
（3）氯仿－异戊醇溶液（21:1，V/V）
（4）无水乙醇
（5）95％乙醇
（6）20％SDS
3．器材
离心机，剪刀，研钵，恒温水浴锅，试管，移液管
操作方法
1．称取新鲜猪脾脏20克，剔去结缔组织，用0.1mol/L NaCl－0.05 mol/L柠檬酸钠混合液冲洗除去血水，剪成碎块，用研钵磨成粉末。
2．加入40mL0.1mol/L NaCl－0.5 mol/L柠檬酸钠混合液冲，获得组织浆液。
3．组织浆液于3000r/min离心15分钟，弃去上清液，收集沉淀。
4．用50mL上述混合液洗涤沉淀两次，每次用研钵研磨沉淀30S，同上离心。
5．最后向沉淀中加入10％NaCl溶液120mL，使沉淀充分溶于溶液中，置冰箱内过夜，充分抽替DNP。
6．次日将所得到的半透明粘稠状液体连续注入预冷的1320mL蒸馏水中，轻轻摇匀，DNP 即成絮状沉淀析出，置冰箱中1小时。
7．将上清液小心吸出，剩下含有沉淀的少量溶液离心，3000r/min离心10钟后，收集DNP
沉淀。
8．将DNP沉淀再溶于80mL的10％NaCl溶液中，轻轻搅拌加速溶解。
9．加入40mL氯仿-异戊醇溶液和20％SDS 0.3mL，剧烈振荡10分钟，使组蛋白分离，于3000r/min离心10分钟，吸出上层含有DNA和DNP的水相，弃去两层间的变性蛋白，回收下层有机相。
10．上层水相再次加入40mL氯仿-异戊醇溶液，继续抽提去除蛋白，离心。
11．吸出上清液并将它连续注入2倍体积已经预冷至4℃的95％的乙醇中，即可得到纤维状的DNA钠盐沉淀。最后用少量无水乙醇洗涤沉淀，室温风干。
思考题：
如何防止大分子核酸在提取过程中被降解和断裂？
糖凝胶电泳检测DNA
目的和要求
掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法
原理
琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片断的典型方法，其特点为简便、快速。DNA 片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同，DNA分子在高于其等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构想有关。对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加入少量溴化乙锭（有毒！），其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种光络合物，在254~365nm波长紫外光照射下，呈现桔红色的荧光，因此可对分离的DNA进行检测。电泳时以溴酚蓝及二甲苯氰（蓝）作为双色电泳指示剂。其目的有：①增大样品密度，确保DNA均匀进入样品孔内；②使样品呈现颜色，了解样品泳动情况，使操作更为便利；③以0.5×TBE做电泳液时溴酚蓝的泳动率约与长300bp 的双链DNA相同，二甲苯氰（蓝）则与4bp的DNA相同。
线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系
琼脂糖凝胶的百分浓度（%）分离线状DNA分子的有效范围（kb）
0.3 60~5
0.6 20~1
0.7 10~0.8
0.9 7~0.5
1.2 6~0.4
1.5 4~0.2
2.0 3~0.1
试剂和器材
1、试剂
40ⅹTAE缓冲液：Tris193.6g，NaAc·3H2O 108.9g，EDTANa2·22O 15.2g，用醋酸调pH7.2，定容1L。
6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。
配制：10 ml
溴酚蓝 25 mg
二甲苯青FF 25 mg
甘油 3 ml
用6×TAE缓冲液定溶至10 ml，分装成1 ml/管。-20℃保存。
溴化乙锭溶液：5mg/ml的溴化乙锭，避光保存。
0.7%琼脂糖，用1×TAE配制。
2、器材
电泳仪、水平电泳槽、紫外分析仪。
操作方法
（1）琼脂糖溶液的制备：配0.7%琼脂糖适量，将溶液冷却到约50~60℃，加入溴化乙锭到终浓度为0.5ug/ml。
（2）将琼脂糖溶液倒入电泳支架上，放上梳子，梳子须离开电泳支架底部1mm左右。待凝胶凝聚后，小心拔去梳子，将支架放入装有电极缓冲液的电泳槽中，电极缓冲液应淹没过胶。
（3）电泳
取薄膜，滴加上样缓冲液和DNA样品5~10ul，混匀，用微量移液器加入样品槽中。点样端朝负极，通电。电压为10v/cm。至溴酚蓝移到距边1cm处，取出凝胶，紫外灯下检测。
思考题
DNA在电场中的迁移率取决于哪些因素？
实验六碱性磷酸酶的分离纯化，比活性测定及动力学性质分析一. 实验目的
1．掌握碱性磷酸酶分离纯化的实验方法。
2．掌握酶活性测定的一般实验方法。
(一)碱性磷酸酶的分离提纯
实验原理
本实验采取有机溶剂沉淀法从肝匀浆液中提取分离碱性磷酸酶(AKP)，利用乙醇、丙酮、正丁醇等有机溶剂可以降低酶的溶解度，使酶蛋白沉淀析出。
在制备肝匀浆时采用低浓度醋酸钠，可以达到低渗破膜的作用，而醋酸镁则有保护和稳定AKP的作用。匀浆液中加入正丁醇能使部分杂蛋白变性，再通过过滤，可以除去变性杂蛋白。含有AKP的滤液可再进—步用冷丙酮和冷乙醇进行分离纯化。根据AKP在终浓度33％的丙酮或终浓度30％的乙醇中是溶解的，而在终浓度50％的丙酮或终浓度60％的乙醇中是不溶解的性质，采用离心的方法分离提取，可使AKP得到部分纯化；
试剂及器材
试剂
1．0.5M醋酸镁溶液(分子量214.45)
称取醋酸镁107.25g溶于蒸馏水中，稀释至1000ml。
2．0.1M醋酸钠溶液(分子量82.03)
称取醋酸钠8.2g溶于蒸馏水中，稀释至1000ml。
3．0.01M醋酸镁-0.01M醋酸钠溶液：
量取0.5M醋酸镁20ml，0.1M醋酸钠100ml，混合后加蒸馏水稀释至1000ml。
4．丙酮(分析纯)
5．95％乙醇(分析纯)
6．Tris缓冲液(pH8.8)
称取Trisl2.1g，用蒸馏水溶解成1000ml，为0.1MTris液，取0.1MTris液100ml，加0.5M 醋酸镁20ml，和蒸馏水800ml，再用1％醋酸调节pH至8.8，然后用蒸馏水稀释至1000ml。7．复合基质液：
称取磷酸苯二钠·2H20 6g，4-氨基安替比林3g，分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中。两液混合并稀释至1000ml，加4ml氯仿防腐，盛于棕色瓶中，冰箱内保存，可用一星期。临用时将此液与等量0.1MpHl0碳酸盐缓冲液混合即可。
8．酚标准液(0.05mg／m1)
称取结晶酚50mg溶于1000ml蒸馏水中
9．0.1M碳酸盐缓冲液pHl0(37℃时)
称取无水碳酸钠3.18g及碳酸氢钠1.68g溶解于蒸馏水中，稀释至500m1。
10．碱性溶液：量取0.5mol／LNaOH溶液与0.5mol／LNaHC03溶液各20m1，混合后加蒸馏水至100ml。
11．0.5％铁氰化钾溶液：称取铁氰化钾5g和硼酸15g，各溶于400ml蒸馏水中，溶解后两液混合，再加蒸馏水至1000ml，置棕色瓶中暗处保存。
12．蛋白质含量测定试剂配制法见实验二。
[器材]
1。721分光光度计
2．台式离心机
3．恒温水浴箱
4．匀浆器
四．实验方法和步骤
加0.01M醋酸钾-0.01M醋酸钠12ml
取4g剪碎研磨好的鸡肝——————————————→充分混合，倒入小烧杯中（A液）吸取A液0.1ml置于另一试管中，加4.9ml pH8.8Tris缓冲液，此为A′，待测比活之用。
加入4ml正丁醇
———————→玻璃棒充分搅拌5min，室温放置30min，单层滤纸过滤。滤液加等体积冷
丙酮（8ml左右）———————→2000rpm离心5min———————→（上清弃去）沉淀
加0.5M醋酸镁8ml溶解
—————————→B液。取B液1ml置于另一试管，加入4ml pH8.8Tris缓冲液，此为B′，待测比活之用。B液加95%冷乙醇至30%（4ml），2000rpm离心5min→上清液（7ml）加95%冷乙醇至60%（6ml）—→2500rpm离心5min—→沉淀加入0.5M醋酸钾5ml—→加冷丙酮至33%（2.5ml）—→2000rpm离心5min—→弃去沉淀，上清加入冷丙酮至50%（2.5ml）—→3500rpm 离心10min—→沉淀加入5ml pH8.8Tris缓冲液，此为C液。吸取C液1ml置于另一试管中，加1ml pH8.8Tris缓冲液，此为C′，待测比活之用。
注意：
1．各步加入有机溶剂量要准确。否则会影响整个实验结果。
2．有机溶剂应预先冷却到-l0℃～15℃左右。
3．加入有机溶剂时要慢慢滴加，充分搅拌，避免局部浓度过高而引起升温和变性。
4．加入有机溶剂混匀后不宜放置过久，应立即离心。
5．采用短时间的离心以析出沉淀，而且最好立即将沉淀溶于适量的缓冲液中，以避免酶活力的丧失。
6．凡弃去上清液中含有丙酮及乙醇者均需倒入回收瓶中回收。
(二)碱性磷酸酶的比活性测定
实验原理
比活性是指单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。因此，随着酶被逐步纯化，其
比活性也随之逐步升高，所以测定酶的比活性可以鉴定酶的纯化程度。
根据国际酶学委员会的规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。因此测定样品的比活性必须测定：(1)每毫升样品中的蛋白质毫克数。(2)每毫升样品中的酶活性单位数。其中碱性磷酸酶活性用磷酸苯二钠法测定，即以磷酸苯二钠为底物，被碱性磷酸酶水解后产生游离酚和磷酸盐，酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，可生成红色的醌衍生物，根据红色的深浅就可测定酚的含量，从而计算出酶的活性大小。
反应如下：
酶活性单位表示：在37℃下保温15分钟产生1μg酚者为1个酶活性单位。样品中的蛋白质含量用Lowry法测定(见实验二)。
实验方法和步骤
1．样品中碱性磷酸酶活性测定：
(1)取试管5支，编号，按下表操作：
混匀，37℃水浴中准确保温15分钟。
保温结束后，各管立即加入1.0ml碱性溶液终止反应，再加入0.5％铁氰化钾2.0毫升，立即混匀，静置10分钟，在5l0nm波长下比色。
(2)酶活性单位计算
附注；
a．从上述操作过程中可知A’管稀释50倍、B’管稀释5倍，C’管稀释1倍。
b．酶活性单位数，也可通过标准曲线求得：
标准曲线制备如下：
取试管6支，分别加酚标准液(1ml=0.1mg)，0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4ml，各管依次加复合基质液3.1、3.05、3.0、2.9、2.8、2.7ml。混匀后37℃水浴保温5分钟，各管加入1.0ml 碱性溶液，再加0.5％铁氰化钾2.0ml，立即混匀。静置10分钟，510nm波长下比色。将以上各管所得读数与其相应的碱性磷酸酶单位<依次为0.5、10、20、30、40单位)在坐标纸上作图，绘制成标准曲线。
2．样品中蛋白质含量的测定：
(1)测定蛋白质A’B’C’的浓度。各用1.0ml进行测定。
标准曲线绘制
记录A595。以各管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。样品测定
试管中加自制蛋白质样品1.0mL ，再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，在595nm波长下比色，记录A595。根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量。
(2)蛋白质浓度计算：
从标准曲线查得的蛋白质毫克数，乘以稀释倍数，即为每毫升样品中蛋白质毫克数。3．比活性的计算
碱性磷酸酶比活性＝每毫升样品中碱性磷酸酶活性单位数／每毫升样品中蛋白质毫克数
4．实验结果：
将上述各实验计算结果填入下列表内
碱性磷酸酶的动力学分析
(一)进程曲线的制作和初速度的测定
实验原理
要进行酶的活力测定，首先要确定酶的反应时间。酶的反应时间并不是任意规定的，应该在初速度范围内进行选择。要求出代表酶反应初速度的时间范围就必须制作酶反应的进程曲线。所谓进程曲线是指酶反应时间与产物生成量(或底物减少量)之间的关系曲线。它表明酶反应随反应时间变化的情况。本实验的进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每间隔一定的时间测定产物生成量的方法，以酶反应时间为横座标，产物生成量为纵座标绘制而成的。从进程曲线可以看出，曲线的起始部分在某一段时间范围内呈直线，其斜率代表酶反应的初速度。但是，随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，曲线的斜率不断下降，说明反应速度逐渐降低。反应速度随反应时间的延长而降低这—现象可能是由于反应时间延长以后底物浓度的降低和产物浓度的增高致使逆反应加强等原因所引起的。因此，要真实反映出酶活力的大小，就应该在产物生成量与酶反应时间成正比的这一段时间内进行初速度的测定。换言之，测定酶活力应该在进程曲线的初速度时间范围内进行。制作进程曲线，求出酶反应初速度的时间范围是酶动力学性质分析中的组成部分和实验基础。
实验方法和步骤
(1)取12支试管按下表操作
(2)以0号管调零，测出A510后，以反应时间为横座标，A510为纵座标绘制进程曲线，由进程曲线求出碱性磷酸酶反应初速度的时间范围。
(二)米氏常数的测定
实验原理
米氏常数是酶促反应动力学中的一个相当重要的常数，通过实验，可理解并掌握利用实验求出Km的方法。
在酶促反应中，当反应体系的温度、pH及酶浓度恒定时，反应初速度V随底物浓度[S]的增加而增加，最后达到极限，此速度称为最大反应速度Vmax。Michaelis和Menten根据反应速度和底物浓度的这种关系推导出如下方程：
上式称为米一曼氏方程，式中Km为米氏常数。根据上式，当V＝Vmax／2时，Km＝[S]。即Km系指反应速度等于最大反应速度一半时的底物浓度，Km是酶的特征性常数，测定Km值是研究酶的特性的重要方法之—。
Lineweaver和Burk取米氏方程的倒数，推导出如下方程：
上式称为双倒数方程。根据此方程，以1／V为纵座标，1／[S]为横座标，作图可得一直线(如图3-1)。
图中直线在1／V轴上的截距为1／Vmax，斜率为Km／Vmax。在l／[S]轴上的截距为-1／Km。因此根据直线在纵轴和横轴上的截距，可分别求出Vmax和Km。
本实验以碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase．AKP)为材料，用磷酸苯二钠为其底物。AKP 催化磷酸苯二钠水解产生游离酚和磷酸盐。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，可生成红色的醌衍生物。根据红色的深浅可测出酚的含量。从而算出相应的酶活性(V)。再根据Lineweaver-Burk法作图，计算其Km值。
反应式如下：
试剂
（1）40mmol／L底物溶液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2·2H2O)10.16g，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并稀释至1000ml加4ml氯仿防腐。贮存于棕色瓶内，冰箱保存此试剂可用1周。（2）0.1mol／L碳酸缓冲液pHl0
A液：0.1mol／L无水碳酸钠MW＝105.91，称取5.3克加水溶解至500ml。
B液：0.1mol/L碳酸氢钠MW＝84.01，称取4.2克加水溶解至500ml。
取A液300ml与B液200ml混合，用精密试纸9.5-13.0测应为pHl0.3。
（3）碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol／L碳酸氢钠溶液各20ml，混合后加蒸馏水至100ml。
（4）0.3％4-氨基安替比林溶液称取4-氨基安替比林3g，用蒸馏水溶解并稀释至1000ml，置棕色瓶中，冰箱内保存。
（5）0.5％铁氰化钾溶液称取铁氰化钾5g和硼酸15g，各溶于400ml蒸馏水中，溶解后两液混合，再加蒸馏水至1000ml，置棕色瓶中，暗处保存。
（6）pH8.8Tris缓冲液称取Tris(三羟甲基氨基甲烷)12.1g，用蒸馏水溶解成1000ml，为0.1mol／LTris液。取此液100ml，加0.5mol／L乙酸镁20ml和蒸馏水800ml。用1％乙酸调pH至8.8，再加蒸馏水至1000ml。
（7）酶液称取纯制的碱性磷酸酶5mg，用pH8.8的Tris缓冲液配制成100ml，冰箱内保存。
（8）酚标准液(50μg／m1)
(a)称取结晶酚1.50g，用0.1ml盐酸溶液溶解并稀释至100ml，为储备液。
(b)标定：取上述酚液25ml，加0.1mol／L氢氧化钠溶液55ml，水浴加热至65℃，再
加入0.05mol／L碘液(＝0.1N)25.0ml，盖好放置30min后，加浓盐酸5ml，再加0.1％
淀粉lml为指标剂。用0.1mol／L硫代硫酸钠滴定。反应式如下：
根据反应，3分子碘(分子量为254)与1分子酚(分子量为94)起作用，因此每毫升0.1 mol ／L碘溶液(含碘12.7mg)相当于酚的毫克数为：(12.7×94)／(3×254)=1.567mg。
25ml碘液中被硫代硫酸钠滴定者为xml，则25ml酚溶液中所含酚量为：(25-x)×1.567 mg。
(c)应用时按上述标定结果用蒸馏水稀释至50μg／ml，作为酚应用标准液。
实验方法和步骤
1．底物浓度对酶促反应速度的影响
(1)(1)取试管8支，按下表操作(应特别注意准确吸取底物溶液及酶液)：
加入酶液立即计时，混匀后置37℃水浴准确保温15min。
(2)保温结束，各管立即加入碱性溶液1.0ml以终止反应。
(3)各管中分别加入0.3％4-氨基安替比林溶液1.0ml及0.5％铁氰化钾2.0ml，充分混匀，放置l0min，以第8管调零点，于510nm波长处比色，测定各管吸光度。
2．2．酚含量标准曲线的制备，取试管6支，按下表操作：
各管混匀后，室温放置10min，于510nm处比色。以第1管调零点，读取各管的吸光度，然后以酚含量(μg)为横座标，吸光度为纵座标，绘制酚含量标准曲线。
3．酶促反应速度计算酶促反应速度以每15分钟所产生酚的微克数(μg／15min)来表示。根据酚标准曲线查出各管的酚含量，即各管在不同底物浓度下的反应速度。
4．作图
(1)以底物浓度[S]为横座标，酶促反应速度V为纵座标，在座标纸上描点并连接各点，观察该图的形状。
(2)以酶促反应速度的倒数1／V为纵座标，以底物浓度[S] 的倒数l／[S]为横座标，在座标纸上描点并连成直线，延伸该直线。查出-l／Km，从而求出该酶的Km值。
[注意事项]
(1)底物浓度和酶浓度都对酶促反应速度产生巨大影响，故该实验的成功与否，在很大程度上取决于各种试剂(特别是底物溶液和酶液)吸液量的准确性。
(2)不同底物浓度所产生的酚量，均应在酚标准曲线范围内，如超出此范围，应将酶液适当稀释。
(3)本实验亦可不制作酚标准曲线，而以1／[S]对1／A作图，因各管吸光度与其酚含量成正比，故可用吸光度代表酶促反应速度。
生物化学实验报告 动物营养研究所 树润 2015.10.12 猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定一．实验目地 1.通过实验了解活性物质的分离提取。 2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。 二．实验原理 超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物 的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅 基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。 该酶首次从牛红细胞中分离得到，是一种蓝色含铜蛋白，之后， 研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力，因此将其 命名为超氧化物歧化酶1-2。超氧化物歧化酶是一种能专一地清 除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、 抗炎抗癌等作用，因而在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的 治疗3）、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业（SOD灵芝菌5 等）等方面具有了广泛的应用前景。 超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体的一种金属酶, 可催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和 O2。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。
超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同，可分为 Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈 蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。 SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。 该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单 位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率 达50%的酶量定义为一个酶单位。 样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮 蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一 定围，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可 用比色法测定，测定围1-1000μg。 三．实验试剂与器材 1.实验试剂 ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯 亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐 溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等 2.实验器材
实验一 蛋白质及氨基酸的颜色反应 一、目的意义 1、学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。 2、学习和了解一些鉴定蛋白质的特殊颜色反应及其原理。 二、实验原理 1、双缩脲反应 当尿素加热到180℃左右时，2分子尿素发生缩合放出1分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。 蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键，因此也具有双缩脲的颜色反应。借此可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量。应当指出，双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应，因为凡含有肽键的物质并不都是蛋白质。 2、茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色化合物，此反应为一切蛋白质及α-氨基酸（除脯氨酸 和羟脯氨酸）所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反应。 该反应十分灵敏，1:浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。因此，此反应广泛用于氨基酸的定量测定。 3、黄色反应 含有苯环侧链的（特别是含酪氨酸）蛋白质溶液与硝酸共热时，呈黄色（硝基化合物），再加碱则变为橙黄色，此反应也称为黄蛋白反应。 OH + HNO 3 HO NO 2 + H 2O HO NO 2 + O N OH OH
三、仪器与试剂 1、试剂 (1) 蛋白质溶液：取10mL鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100mL，搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。 (2) 0.3%色氨酸溶液、0.3%酪氨酸溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液、0.5%苯酚溶液。 (3) 0.1％茚三酮－乙醇溶液：称取0.1g茚三酮，溶于100mL 95％乙醇。 (4) 10％NaOH溶液、1％硫酸铜溶液、尿素、浓硝酸。 2、仪器：试管及试管夹、酒精灯。 四、操作方法 1、双缩脲反应 (1) 取一支干燥试管，加入少量尿素，用微火加热使之熔化，待熔化的尿素开始变硬时停止加 热。此时，尿素已缩合为双缩脲并放出氨气（可由气味辨别）。待试管冷却，加入约1mL10％NaOH溶液，振荡使其溶解，再加入1滴1％硫酸铜溶液。混匀后观察出现的粉红色。(2) 另取1支试管，加入1mL蛋白质溶液，再加入2mL 10％NaOH溶液摇匀，然后再加入2 滴1％的硫酸铜溶液。摇匀观察其颜色变化。 (3) 注意事项 加入的硫酸铜不可过量，否则会产生蓝色的氢氧化铜，从而掩盖了双缩脲反应的粉红色。 (4) 记载上述实验过程和结果，并解释现象。 2、茚三酮反应 (1) 取3支试管，分别加入蛋白质溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液各1mL，再加0.5mL 0.1％茚三酮－乙醇溶液，混匀后在小火上加热煮沸1－2min，放置冷却，观察颜色变化。 (2) 在滤纸的不同部位分别滴上一滴0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液，风干后再在原处滴 一滴0.1％茚三酮－乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察斑点出现及其颜色。 (3) 记载上述实验过程和结果，并解释现象。 3、黄色反应 向6个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。
《生物化学实验》内容 课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个 适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事求是的科学态度。 二、实验内容
三、成绩 包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求 （1）实验过程中同组人可以配合进行； （2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据；（3）实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4）对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。
3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体内可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电 加热板或电炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻 璃棒1根；100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）； 不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3.药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。 4.其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若
实验一基因的PCR扩增技术 一、实验目的与原理简介 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。 常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。二、复性。降低温度使DNA单链分子同引物结合。温度为55℃，时间1min。三、延深。升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。 PCR反应包含的七种基本成分： 1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg. 2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。 3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。 4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。 5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。 6）一价阳离子：标准PCR缓冲液内含有50mmol/L的KCl，它对扩增大于500bp长度的DNA是有益的。 7）模板DNA：含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合液中，闭环DNA的及增效率略低于线性DNA。 学习PCR反应的基本原理和基本技术。 了解引物设计的一般要求。 二、材料和试剂 10Х扩增缓冲液 4种dNTP贮存液（20mmol/L，PH 8.0） Tap DNA 聚合酶 5端引物（20μmol/L）及3端引物（20μmol/L） 模板DNA 琼脂糖凝胶 PCR仪（Bio-Rad公司）移液枪（0.5-10μL 5-50μL）枪头微量移液管 一、实验操作 1）按照以下次序，将各成分加到微量离子管内混合： 10Х扩增缓冲液2.5μl M g2+1.5μl 5端引物1μl
生物化学实验讲义 赵 国 芬 2010年9月
实验之前说明 1.各班学习委员将成员分成10个大组,每个大组中2人一小组,大组采用循环实 验的方法,同时开出不同的10个实验. 2.共开出10个不同的实验 实验一温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响 实验二牛奶中蛋白质的提取与鉴定 实验三血液葡萄糖的测定-福林（Folin）-吴宪氏法 实验四双缩脲测定蛋白质的含量 实验五血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳 实验六植物组织中还原糖和总糖的含量测定 实验七应用纸层析法鉴定动物组织中转氨基作用 实验八植物组织中维生素C的定量测定 实验九琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察 实验十植物组织中DNA的提取和鉴定 3.穿着要利索,做好实验记录 4.注意实验室卫生和安全. 一. 实验室规则:按照实验室的规则给学生讲解. 二. 生物化学所用的实验技术 1.样品: :血液、血浆、血清、组织 植物样品：果实、花蕾、茎等 无论用什么做材料，为了提取物质，需匀浆 2．移液管的使用： 移液管吸管 移液管 奥氏吸管 读数时视线与凹面相平，取液时要用吸管嘴吸，放出液体时注意嘴部液体的残留问题。 3．离心机的使用： 平衡（管平衡、机器平衡）缓起和慢停 4．分光光度计 机器原理和测定原理（比尔定律） 5．水浴锅的使用 三、实验报告的书写（用教务处统一印刷的报告纸写） 目的、原理、仪器、药品、步骤、结果及结论、讨论
实验一、温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响 一、实验目的 通过本实验了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十分重要的意义。 二、实验原理 酶的化学本质是蛋白质。凡是能够引起蛋白质变性的因素，都可以使酶丧失活性。此外，温度、pH和抑制剂、激活剂对酶的活性都有显著的影响。酶的活性通常是用测定酶作用底物在酶作用前后的变化来进行观察的。 本实验用唾液淀粉酶作用的底物—淀粉，被唾液淀粉酶分解成各种糊精、麦芽糖等水解产物的变化来观察该酶在各种环境条件下的活性。 淀粉被酶水解的变化，可以用遇碘呈不同颜色来观察。淀粉遇碘呈蓝色;糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色;最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈现颜色反应。 三、试剂 1.0.5%淀粉溶液 2.碘化钾－碘溶液 3.1%尿素溶液。 4.1%CuSO4溶液 5.磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液pH5.0-8.0: 6.0.5%NaCl溶液。 7.唾液淀粉酶制备每人用自来水漱口3次，然后取20m1蒸馏水含于口中，半分钟后吐入烧杯中，纱布过滤，取滤液lOml，稀释至2Oml为稀释唾液，供实验用。 四、操作步骤 一、温度对酶活性的影响 （一）淀粉酶的观察 1、取3支大试管，编号后按表操作 2、在白色比色板上，置碘液2滴于各孔中，每隔1分钟，从第二管中取出反应
生物化学实验报告 姓名： 专业： 院系： 学号：
实验一蛋白质分子量测定------凝胶层析法 一、实验原理 凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分开的一种方法，又叫做分子筛层析法，排阻层析法。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒放在适宜溶剂中浸泡，使其充分戏液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的缝隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，无论是天然凝胶还是人工凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶，人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶和葡聚糖凝胶，后者的商品名为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。 这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低得孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。 以下进一步来说明凝胶层析的原理。将凝胶装载柱后，柱床总体
积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，即Vt=Vi+Vg+Vo。Vo称为“孔隙体积”或“外体积”又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面孔隙之间的水相体积，相应于一般层析柱法中内流动相体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，Vg为凝胶本身的体积，因此Vt-Vo等于Vi+Vg。 洗脱体积与Vo及Vi之间的关系可用下式表示： Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无光，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd 可通过实验求得，上式可改写成： Kd=(Ve-Vo)/Vi 上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液通过实际测量求出；Vi可由g.Wr求得。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积Ve就可算出它的Kd值。 Vo表示外体积；Vi内体积；Ve II、Ve III分别代表组分II和III的洗脱体积。Kd可以有下列几种情况： 1、当Kd=0时，则Ve=Vo。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质，洗脱体积等于空隙体积。
实验1 氨基酸纸层析 一、实验目的 通过对氨基酸的分离和鉴定，掌握纸层析的基本原理及操作方法。 二、实验原理 层析法又称色谱法。是一项重要的分离技术。利用混合物中各组分理化性质的不同，使各组分以不同程度分配在两相中。 层析的种类： 根据原理分为： a 分配层(纸层析) b 吸附层析 c 亲和层析 d 离子交换层析 根据支持物分为： a 纸层析 b 柱层析 c 薄层层析 d 凝胶过滤层析 分配层析的原理： 各种物质在两种互不溶解的溶剂中的分配系数不同，从而达到分离的目的。 分配层析用于分离在水和有机溶剂中都可溶的混合物。 一种物质在两相中达到平衡时，在两相中的浓度之比是一个常数。 物质在流动相里的浓度 物质在固定相里的浓度 纸层析: 分配的过程：一部分溶质随有机相移动离开原点进入无溶质区，并进行重新分配，不断向前移动。随着有机相不断向前移动，溶质不断地在两相间进行可逆的分配。由于各种物质的分配系数不同，随展层溶剂移动的速率也不同，从而达到分离的目的。移动速度可用比移（Rf ）值表示： 色斑中心至上样原点中心的距离 K D = 图1 氨基酸纸层析示意图 R f =
溶剂前缘至上样原点中心的距离 载体：滤纸 固定相：滤纸吸附的水 流动相：水饱和酚 极性：谷氨酸＞丙氨酸＞脯氨酸 对于水－饱和酚的溶剂体系，氨基酸极性越小，KD 值越大，Ｒｆ值也越大，一定时间内随流动相迁移的距离远，反之迁移距离小。 三、实验材料 仪器 ⑴层析缸；⑵层析滤纸；⑶电吹风机；⑸喷雾器；⑹毛细管。 试剂 ⑴氨基酸标准液（6mg/mL）；⑵氨基酸混合液（6mg/mL) ⑶展层剂：水饱和苯酚溶液。 ⑷显色剂：0.3%茚三酮丙酮溶液 四、操作步骤 1、层析滤纸的准备 用铅笔在层析滤纸上距离一端2-3cm处划线并标记点样位置。 2、点样(少量多次) 用毛细管平口端蘸取少量样品溶液，点样于滤纸的相应位置，要求样品斑点直径不超过0.5cm，干燥后再点样，重复3次。 3、展层 将滤纸放入层析缸，使滤纸浸入液面以下，但不要使液面没过点样线。展层50-60分钟，取出，用铅笔绘出前沿线。 4、显色 滤纸吹干，用喷雾器把茚三酮溶液均匀细致地喷洒在滤纸有效面上，吹干。
1．火 （1）酒精及其它可溶于水的液体着火时，可用水灭火 （2）汽油、乙醚、甲苯等有机溶剂着火时，应用石棉布或砂土扑灭，绝对不能用水，否则反而会扩大燃烧面积。 （3）电起火，不能用水和二氧化碳灭火器，应切断电源或用四氯化碳灭火器。 2．烧伤 （1）强碱烧伤：先用大量水冲洗，再用5%的硼酸溶液和2%的乙酸溶液冲洗。 （2）强酸烧伤：先用大量水冲洗，再用5%的碳酸氢钠或5%的氢氧化铵冲洗。 氨基酸的分离鉴定纸层析法 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层 析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的： 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大 小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量 和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨 基酸。 在操作过程中，手不要摸滤纸。 点样直径不超过3mm 。 点样的一端朝下, 扩展剂的液面需低于点样线1cm。 即时取出滤纸, 以免出现氨基酸层析跑到滤纸的外面不能检测。 蛋白质及氨基酸的呈色反应 双缩脲反应 紫红色肽键可用于蛋白质的定性或定量测定一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。 茚三酮反应 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH 条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。 与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。该反应十分灵敏，1∶1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。 黄色反应 含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。
生物化学实验讲义 化学工程与技术学院 基础部
实验一酪蛋白的制备 一、目的 学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 二、原理． 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 三、器材 1 、离心机2、．抽滤装置 3、精密pH试纸或酸度计 4、电炉 5、烧杯 6、温度计． 四、试剂与材料 1、牛奶2500mL 2、95％乙醇1200mL 3、无水乙醚1200mL
4、0.2mol／L pH 4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL 5、．乙醇—乙醚混合液2000mL 五、操作 1、将100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入 预热至40℃、pH 4.7的醋酸缓冲液100 mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3 000r／min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 2、用水洗沉淀3次，离心10分钟(3000r／min)， 弃去上清液。 3、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬 浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 4、将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯晶。 5、准确称重，计算含量和得率。 含量：酪蛋白g／100mL牛乳(g％)
得率： 测得含量 100 % 理论含量 思考题 1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？ 实验二小麦萌发前 后淀粉酶活力的比较 一、目的 1.学习分光光度计的原理和使用方法。 2.学习测定淀粉酶活力的方法。 3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 二、原理 种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。 2（C6H10O5）n +nH2O nC12H22O11 麦芽糖有还原性，能使3，5---二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计测定。
实验一糖类的性质实验 （一）糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 （一）α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶内。用前配制。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 1％淀粉溶液100 mL ％糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、％糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。 观察记录各管颜色。 （二）间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 塞氏试剂：％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 4、实验操作
实验一、转录增强因子在DNA转录中的调控作用– 16学时 一.目的和要求 1. 掌握转录增强因子对启动子控制下报告基因调控的工作原理，了解常见的报告基因种类及启动子种类。 2. 学习PCR克隆转录增强因子CRE，构建报告基因表达载体、细胞培养、细胞转染和荧光素酶活性检测技术。 二.基本原理 报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。把它的编码序列和其它基因相融合形成嵌合基因，当在调控序列控制下进行表达时，利用报告基因的表达产物可以来标定目的基因的表达调控。 作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。 在动物基因表达调控的研究中，常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、β-半乳糖苷酶基因、荧光蛋白、荧光素酶基因等。荧光素酶(Luciferase) 是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。自然界有许多发光生物, 1956年, McElroy 等首次从萤火虫中提取到荧光素酶, 此后各国研究人员相继报道了对各种发光生物中荧光素酶的研究。萤火虫荧光素酶是分子量为60～64kD的多肽链,在Mg2+、ATP、O2存在时,催化D-荧光素(D-Luciferin)氧化脱羧,发出光(λ=550～580nm)。荧光素酶作为新型报告基因，与传统报告基因相比，具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，因此在基因工程方面得到了广泛的采用，同时荧光素酶在发光免疫分析及环境监测、微生物检测等方面的应用也愈来愈受到关注。 调控元件的选择依赖于特定的信号转导途径。很多情况下，GPCRs的活化信号可通过特定的信号转导途径将信息传递至细胞核，调控特定基因的转录。多种自然和合成的调控元件都广泛用于报告基因系统。自然启动子，如c-fos启动子，含有Serum inducible element(SIE)、Serum response element（SRE）、cAMP response element（CRE）等一系列转录因子结合位点，这些调控元件使得该启动子同时受多重信号转导事件的调控。人工合成的启动子中可加入多个单一调控元件，如cAMP反应元件（CRE）。
生化检测实验讲义 实验一粮食、油料检验-脂肪酸值测定法 一、实验目的 粮食在储藏过程中受到温度、水分和酶的影响，其脂类物质易发生水解和氧化反应。水解造成粮食游离脂肪酸含量增加，对粮食的种用品质和食用品质产生不良影响。粮食游离脂肪酸含量以脂肪酸值表示,即中和100g粮食试样中的游离脂肪酸值所需氢氧化钾的毫克数。通过脂肪酸值的测定，可以判断粮食品质的变化情况，推测储藏方法是否适当。 通过本实验要求掌握测定脂肪酸值的技术。 二、原理 浸出法。脂肪酸能溶于有机溶剂，利用苯来浸出脂肪酸，然后在酒精溶液中用标准KOH溶液中和脂肪酸，根据滴定时所消耗的碱液数量，就可求出脂肪酸值。 三、材料、仪器和试剂 1、材料 大米 2、仪器 带塞锥形瓶，量筒，移液管，微量滴定管，表面皿，天平，振荡器，漏斗 3、试剂 （1）、0.01N KOH（或NaOH）乙醇(95%)溶液 先配制约0.5N的KOH水溶液，再取20 ml,用95%乙醇稀释至500mL （2）、苯，95%乙醇 （3）、0.04%酚酞乙醇溶液 0.2g酚酞溶于500ml 95%乙醇溶液中。 四、操作方法 1、浸出 称取事先磨细的大米粉20±O.Olg于200ml或250ml锥形瓶中，加入50ml苯，加塞摇动几秒钟后，打开塞子放气，再盖紧瓶塞置振荡器振荡30min(或用手振荡45min)，取出，将瓶倾斜静置数分钟，使滤液澄清。 注：粉碎后样品如在20℃以上室温放置，脂肪酸值会很快增加，因此，必须及时进行测定。 2、过滤 用快速滤纸过滤，弃去最初几滴滤液后用量筒收集滤液25ml。 3、滴定 将25ml滤液移入锥形瓶中，再用原量筒取25m1 0.04%酚酞乙醇溶液加入锥形瓶中，立即用氢氧化钾乙醇溶液滴定至呈现微红色半分钟内不消失为止。记下所耗用氢氧化钾乙醇溶液毫升数V1。 4、空白试验 取25m1 0.04%酚酞乙醇溶液，用氢氧化钾乙醇溶液滴定，记下耗用氢氧化钾乙醇溶液毫升数V2。 五、结果计算 脂肪酸值以中和100g大米样品中游离脂肪酸所需氢氧化钾毫克数表示。 脂肪酸值=（V1-V2）×N×56.1×50/25×100/W（1-M） V1：滴定样品所用的氢氧化钾乙醇溶液体积，ml， V2：滴定25ml酚酞乙醇溶液所用氢氧化钾乙醇溶液的体积，ml,
生化大实验 实验报告 姓名： 学号： 专业： 班级： 实验班级： 单位： 指导老师：
实验1 多酚氧化酶（PPO）的分离提取 一、实验原理： 多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌，它是植物组织广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体，可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节，属于末端氧化酶的一种。 植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外，多酚氧化酶也可以与细胞其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。 蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出，且大分子蛋白质不能通过透析膜。 二、实验目的： 通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。 三、材料与试剂： 1.材料：马铃薯（两小组共称200g） 2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮）配制是配x10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2） 3.设备：试管与试管架；烧杯、玻璃棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆机；pH计和pH试纸；高速冷冻离心机； 四、操作步骤： 1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块，加入300ml缓冲液A，两者按1:1(W/V)比例匀浆1min； 2.用两层纱布将所得的浆液过滤； 3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min； 4.上清液两组平分，每组150ml，加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min； 5.取上清液定容至150ml，加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min，倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min； 6.将所得溶液倒入透析袋中，用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。 五、结果和分析： 实验所得的初酶液颜色为浅黄色，颜色浅，主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少，从而最大程度的保留了PPO的活性；经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体，这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。 六、讨论与结论： 1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化； 2．实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净； 3.加入硫酸铵固体时一定要小心缓慢，同时伴有玻璃般的搅拌，在溶解蛋白的过程中避免溶液局部盐离子浓度过大，使蛋白变性，并注意用量的计算，第二步加入的时候起点浓度是40%而不是0，否则会加入过量，影响实验的结果； 4.透析时，提前检查透析袋是否完整，避免透析时出现孔洞导致样品丢失。
生化实验讲义思考题参考答案 实验一淀粉的提取和水解 1、实验材料的选择依据是什么？ 答：生化实验的材料选择原则是含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低。从科研工作的角度选材，还应当注意具体的情况，如植物的季节性、地理位置和生长环境等，动物材料要注意其年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等，微生物材料要注意菌种的代数和培养基成分的差异等。 2、材料的破碎方法有哪些？ 答：(1) 机械的方法：包括研磨法、组织捣碎法； (2) 物理法：包括冻融法、超声波处理法、压榨法、冷然交替法等； (3) 化学与生物化学方法：包括溶胀法、酶解法、有机溶剂处理法等。 实验二总糖与还原糖的测定 1、碱性铜试剂法测定还原糖是直接滴定还是间接滴定？两种滴定方法各有何优缺点？ 答: 我们采用的是碱性铜试剂法中的间接法测定还原糖的含量。间接法的优点是操作简便、反应条件温和，缺点是在生成单质碘和转移反应产物的过程中容易引入误差；直接法的优点是反应原理直观易懂，缺点是操作较复杂，条件剧烈，不易控制。 实验五粗脂肪的定量测定─索氏提取法 （1）本实验制备得到的是粗脂肪，若要制备单一组分的脂类成分，可用什么方法进一步处理？ 答：硅胶柱层析，高效液相色谱，气相色谱等。 （2）本实验样品制备时烘干为什么要避免过热? 答：防止脂质被氧化。 实验六蛋白质等电点测定 1、在等电点时蛋白质溶解度为什么最低？ 请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。
蛋白质是两性电解质，在等电点时分子所带净电荷为零，分子间因碰撞而聚沉倾向增加，溶液的粘度、渗透压减到最低，溶解度最低。结果中pH约为4.9时，溶液最浑浊，达到等电点。 答： 2、在分离蛋白质的时候，等电点有何实际应用价值？ 答: 在等电点时，蛋白质分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以处于等电点的蛋白质最容易沉淀。在分离蛋白质的时候，可以根据待分离的蛋白质的等电点，有目的地调节溶液的pH使该蛋白质沉淀下来，从而与其他处于溶液状态的杂质蛋白质分离。 实验七氨基酸的分离鉴定－纸层析法 1、如何用纸层析对氨基酸进行定性和定量的测定？ 答: 将标准的已知氨基酸与待测的未知氨基酸在同一张层析纸上进行纸层析，显色后根据斑点的Rf值，就可以对氨基酸进行初步的定性，因为同一个物质在同一条件下有相同的Rf 值；将点样的未知氨基酸溶液和标准氨基酸溶液的体积恒定，根据显色后的氨基酸斑点的面积与点样的氨基酸质量成正比的原理，通过计算斑点的面积可以对氨基酸溶液进行定量测定。 3、纸层析、柱层析、薄层层析、高效液相层析各有什么特点？ 答:
《生物化学实验》容 课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个 适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事的科学态度。 二、实验容
包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求 （1）实验过程中同组人可以配合进行； （2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据； （3）实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4）对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。 3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性
糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电加热板或电 炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻璃棒1根； 100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）；不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3.药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。 4.其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若干。每个洗 手池常规配置烧杯刷、毛巾、洗手液。 四、实验操作 取新鲜植物叶片，洗净表面污物，用滤纸吸去表面水分。称取0.5g，剪碎，加入5～10ml蒸馏水，在研钵中磨成均浆，转入锥形瓶中，用蒸馏水少量多次冲洗研钵，洗出液也转入锥形瓶中，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min，提取液冷却后过滤到100ml容量瓶中，同法残渣再提取2~3次，将提取液合并至容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。贴好标签，保存至冰箱中，用于实验二。 五、实验结果与讨论 1、观察产品颜色是否与理论相符，若不符合，分析原因。 2、结合实验二结果计算含量 六、实验注意事项 （1）若有干扰，可滴加饱和中性醋酸铅以除去溶液中的蛋白质，乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质，若色素较多可脱脂。 （2）加热时应小心，避免灼伤皮肤。 七、思考题 1、可溶性糖在植物物质代中的作用。
生物化学实验报告 姓名：吴瑞 学号： 3120016004 专业年级： 2012级临床医学（妇幼保健) 组别：第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
一、实验室规则 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。
实验一蛋白质和氨基酸的呈色反应 一、目的要求 (1)学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。 (2)学习几种鉴定特定氨基酸的特殊颜色反应及其原理。 二、原理 ㈠蛋白质和氨基酸鉴定常用方法 蛋白质所含有的某些氨基酸及其特殊结构，可以与某些试剂反应、生成有色物质。 1．双缩眠反应 当脲(即尿素)加热至l80℃时．两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲(biuret)。 然后在碱性溶液中与铜离子(cu2+)结合生成复杂的紫红色化合物。这一呈色反应称为双缩脲反应。 紫红色铜双缩服复合物分子结构见下页图。 蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双缩脲反应。应当指出，含有—个CS—NH2、一CH2一NH2，一CRH—NH2，一CH2一NH2—CHNH2一CHOH-CH2NH2，-CHOH—CH2NH2等基团的物质，甚至过量的铵盐也干扰本实验。
2．Salkowski(1888)蛋白黄色反应 它是芳香族氨基酸，特别是有酪氨酸和色氨酸蛋白质所特有的呈色反应。苯丙氨酸和苯 反应很困难。皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸变黄，原因在此。 硝基苯衍生物呈黄色，在碱性溶液中，它进一步形成深橙色的硝醌酸钠。参考反应是： 3．茚三酮反应 蛋白质、多糖和各种氨基酸具有茚三酮反应。除无α—氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色 外．其他氨基酸生成紫红色．最终为蓝色化合物。
三、器材与试剂 ㈠器材 ⒈试管及试管架⒉水浴锅⒊量筒⒋滴管⒌滤纸片⒍移液管 ㈡试剂和材料 ⒈10％NaOH溶液⒉1％CuSO4溶液⒊0.5％苯酚溶液⒋浓HNO3 ⒌卵清蛋白溶液（蛋清：水＝1︰20）⒍尿素⒎0.1％茚三酮乙醇溶液 四、操作步骤 1.双缩脲反应 （1）取一支干燥的试管，加入少量尿素，用微火加热使尿素熔化，待融化的尿素重又开始硬化时停止加热，此时尿素已缩合成双缩脲并放出氨（可由其嗅味辨别或见红色石蕊试纸变色）。试管冷却后，加入约1毫升10％氢氧化钠溶液，振荡使双缩脲溶解，再加入2滴1％硫酸铜溶液，混匀后观察有无紫色出现。
《生物化学》实验教学大纲 课程类别：专业基础 适用专业：本科临床学专业 课程总学时：实验学时：32 实验指导书：生物化学与分子生物学实验教程 开课实验室名称：生化实验室 一、目的和任务 生物化学是一门在分子水平上研究生命现象的学科，也是一门重要的实验性较强的基础医学课程．随着医学的发展，该学科已渗透到医学的各个领域。生物化学实验技术已被广泛地应用于生命科学各个领域和医学实验的研究工作。生物化学实验是生物化学教学的重要组成部分，它与理论教学既有联系，又是相对独立的组成部分，有其自身的规律和系统。我们根据国家教委对医学生物化学课程基本技能的要求，开设了大分子物质的常用定量分析法、酶活性分析、电泳法、层析技术、离心技术及临床生化，使学生对生物化学实验有一个比较系统和完整的概念，培养学生的基本技能和科学思维的形成，提高学生的动手能力。 二、基本要求 1.通过实验过程中的操作和观察来验证和巩固理论知识，加深学生对理论课内容的理解。 2.通过对实验现象的观察，逐步培养学生学会观察，比较，分析和综合各种现象的科学方法，培养学生独立思考和独立操作的能力。 3.通过对各类实验的操作和总结，培养学生严谨的科学态度。 4.进行本学科的基本技能的训练，使学生能够熟练各种基本实验方法和实验技术的操作。 三、考试方法及成绩评定方法 四、说明 实验教材及参考书： 1.揭克敏主编：生物化学与分子生物学实验教程（第2版）。科学出版社，2010 参考资料： 1..袁道强主编：生物化学实验（第1版）。化学工业出版社，2011 五、实验项目数据表
2）要求：0：必修1选修 3）类型：0：演示1：验证2：综合3：设计 4）每组人数：指教学实验项目中一次实验在每套仪器设备上完成实验项目的人数。 六、各实验项目教学大纲 实验一蛋白质的沉淀反应 【预习要求】 预习四个小实验的具体实验原理和操作内容。 【实验目的】 1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识； 2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 【实验内容】 （一）蛋白质的盐折 1. 原理 大量中性盐类如硫酸铵((NH4)2SO4)、硫酸钠(Na2SO4)和氯化钠(NaCl)等加入到蛋白质溶液后，可引起蛋白质颗粒因失去水化膜和电荷而沉淀。各种蛋白质分子的颗粒大小和电荷数量不同，用不同浓度中性盐可使各种蛋白质分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中沉淀。当硫酸铵浓度达到饱和时血清中的白蛋白使沉淀下来。盐析沉淀蛋白质时能保持蛋白质不变性，加水稀释降低盐浓度，能使沉淀的蛋白质重新溶解，并保持其生物活性。因此，利用盐析法可达到分离提纯蛋白质的目的。 2. 操作步骤 ①取小试管1支、加入5％鸡蛋清溶液20滴，饱和硫酸铵溶液20滴，充分摇匀后静置5min，记录结果。