染色质免疫共沉淀技术的发展
姚汪劲松发育生物学2013级2013110046
摘要：本文主要介绍了染色质免疫沉淀技术的发展历程、基本原理和优缺点，并且介绍了反向染色质免疫沉淀技术，并对两种方法进行了比较。
关键词：染色质免疫共沉淀；反向染色质免疫共沉淀；应用，研究前景。
目前，不断发展的DNA和蛋白质相互作用的方法和技术已经成为研究DNA复制、重组、修复和转录的核心。其中凝胶阻滞实验（EMSA），报告基因分析，DNA微阵列，质谱分析法MS，酵母单杂交系统和染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是被广泛应用于研究DNA 和蛋白质相互作用的方法。
真核生物基因组DNA以染色质形式存在，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达调控机制的基本途径。生物体内基因表达调控主要发生在转录过程中，转录调控是顺式作用元件(Cis-acting elements)如启动子(Promoter)、增强子(Enhancer)与反式作用因子(Trans-acting factors)相互作用的结果。基因组DNA的甲基化、组蛋白甲基化、乙酰化和磷酸化修饰，核小体重新定位及染色体结构重建都影响调控。转录调控具有细胞类型、发育阶段和外界环境刺激的差异性，哺乳动物转录调控序列分散在较大区域，组蛋白修饰状态达100多种，这些因素都增加了转录调控的复杂性。
ChIP是一种在体内研究转录因子和靶基因启动子区域直接相互作用的方法，可以在体内直接确定它们之间相互作用方式的动态变化，能够得到转录因子结合位点的信息，确定其直接靶基因。它早期多被用于研究核小体上的DNA和组蛋白的相互作用以及组蛋白的修饰等方面。近年来，随着生物技术的迅速发展，ChIP技术不断发展和完善，被广泛应用于体内转录调控因子与靶基因启动子上特异核苷酸序列结合方面的研究，并成为在染色质水平研究基因表达调控的有效方法。特别是，此技术与DNA芯片和分子克隆技术相结合，可用于高通量筛选已知蛋白因子的未知DNA靶位点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况，这将有助于深入研究DNA与蛋白质相互作用的调控网络。
ChIP技术由Orlando等于1997年创立。其基本原理为将处于适当生长时期的活细胞用甲醛交联后将细胞裂解，染色体分离并打碎为一定大小的片段；然后用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白与DNA交联的复合物，对特定靶蛋白与DNA片段进行富集。采用低pH值条件反交联，DNA与蛋白质之间的Schiff键水解，释放DNA片段。通过对目标片段的纯化与检测，获得DNA与蛋白质相互作用的序列信息。在上述ChIP过程中，甲醛能够进入细胞并使蛋白质与DNA或蛋白质与蛋白质之间通过希弗(Scihff)键交联，形成稳定结合的复合物。如果交联效果不太好，可以先用交联剂DMA(Dimethyl adipimidate)或DSG (Disuccnimidyl glutarate)处理细胞，以加强后续甲醛交联的效果。破碎DNA可采用超声物理破碎或特定酶切消化，以获得所需长度的DNA片段。由于DNA片段长度将影响抗体免疫沉淀效率，因此破碎DNA是ChIP实验成功与否的重要因素。超声效果与细胞裂解是否充分、细胞浓度及裂解液成分等因素有关。超声处理后的液体应从浑浊状态变为透明状态。选择专一性及亲和力较高的抗体是ChIP成功的关键。非特异性抗体将增加大量的非目标靶点DNA片段信息，从而掩盖了真实的蛋白质结合位点信息；而亲和力较差的抗体，则无法获得高信噪比靶点DNA片段。另一方面，在甲醛交联过程中可能会掩盖一些蛋白质的表位，这会影响到一部分蛋白质和DNA复合体的免疫沉淀反应。因此，用Western印迹或免疫组化等常用的实验方法证明的能够对目标蛋白质进行免疫结合的抗体，并不能保证一定能够成功地进行ChIP实验。例如，Weitsman 等检验了不同的雌激素受体β抗体在ChIP中的免疫沉淀能力，发现有的抗体虽然能够在标准免疫沉淀条件下与抗原结合，但不适合ChIP条件下使用，并
且不同抗体的结合效率也有差异。对于某一目标蛋白采用多种抗体组合来进行ChIP实验是一种有效的方案。例如，Chen 等针对CTCF在人类基因组中的结合位点研究，采用了多种不同单克隆抗体的混合物进行免疫沉淀。另外，有人利用表位附加标记技术表达融合蛋白进行免疫沉淀实验。常用的表位附加标记有红血球凝集素(Hemagglutinin)、生物素和c-Myc等。但哺乳动物细胞中难以引入表位附加标记的融合蛋白，并且其表达往往不同于其内源转录因子。染色质免疫沉淀获得的DNA数量往往很多，其中包含大量的非特异结合造成的背景噪音，采用严格的洗涤条件可以降低背景。Ogryzko等将靶蛋白与生物素受体片段融合表达，通过抗生物素磁珠免疫沉淀，二者较强的结合力便于进行更为严谨的洗涤，达到降低背景的目的。
与传统的研究转录因子和DNA相互作用的方法相比，染色质免疫共沉淀技术是一种在体内研究DNA与蛋白质相互作用的理想方法。ChIP的优点在于能够在体内捕获转录因子和靶基因的相互作用，能同时快速地提供一种或者多种基因的调控机制，因此有巨大的应用价值。ChIP技术也有一定的局限性：第一，该技术需要抗目的蛋白或者特殊修饰标签的高度特异性抗体。第二，假阴性信号可能源于无效的抗体结合或者在交联过程中抗原受到干扰。第三，甲醛固定可能是暂时的，甚至是非特异的，可能导致相邻的蛋白形成假阳性信号。针对以上三方面，推荐在交联之后和抗体沉淀之前绘制一条标准曲线，以确定每次实验所需染色质的最佳量，确保材料的起始量相等。当检测的染色质模版（目的抗体的染色质免疫沉淀物）扩增出可检测的条带时，将染色质样品连续稀释以确定关键点；而此时对照（mock ChIPed）染色质模版需要浓缩以扩增出可见的条带。总之，染色质免疫共沉淀的步骤是需要精确的且要求一系列的预实验。第四，难以同时得到多个蛋白质对同一序列结合的信息等。反向染色质免疫共沉淀技术（reverse chromatin immunoprecipitation assay，Reverse ChIP）可以弥补这个缺陷，并且能定性、定量地准确鉴定目的蛋白质。Reverse ChIP是一种在体内状态下分析DNA和蛋白质相互作用的新方法。它用特异的核酸探针捕获靶DNA片段及与其相结合的蛋白质。蛋白质用质谱仪检测，以确定靶DNA位点全部相关的蛋白质。这种技术可对靶DNA位点相关蛋白质进行全面、系统地鉴定，特别能找到已知DNA元件相应的调节蛋白。其在发现鉴定、靶DNA位点相关蛋白质和研究DNA和蛋白质相互作用方面有重要的应用价值。
研究DNA-蛋白质相互作用的技术方法有多种，但研究体内状态下的方法仅有染色质免疫共沉淀技术(ChIP)。而该方法尚存在不足，如：难以同时得到多个蛋白质对同一序列结合的信息等。Reverse ChIP技术正好能弥补这些缺陷，并且可定性定量地准确鉴定目标蛋白质。由于DNA探针杂交技术和质谱方法的进步，Kingston和Déjardin于2009 年1 月建立了PICh(proteomics of isolated chromatin segments)技术，来验证端粒相关蛋白质。Mittler，Butter 和Mann于2009年1月建立了SILAC(stable isotope labeling with amino acids in cell culture)技术，来分析靶DNA位点相关蛋白质。2009年3月，Rusk把这两种方法综合到一起，做了简要介绍，并将其命名为reverseChIP技术。
ReverseChIP技术的核心是用DNA探针捕获靶DNA片段及与其相关的蛋白质。其基本原理是在活细胞状态下用甲醛固定细胞，以交联DNA-蛋白质的复合物。然后将此复合物超声切断为一定长度的染色质片段，用以脱硫生物素为标记物的DNA探针与靶DNA片段杂交，形成稳定的DNA探针-靶DNA片段及其相关蛋白质的杂交体。之后用亲和素磁珠结合脱硫生物素，以捕获此杂交体，离心得到的磁珠与杂交体被洗脱液洗脱，杂交体被游离出来。加入交联反转液，使DNA-蛋白质复合物解交联，电泳得到靶DNA位点相关蛋白质，经纯化后，再进入质谱仪进行检测，以达到确定靶DNA位点全部相关蛋白质的目的，进而获得DNA-蛋白质相互作用的定性定量信息。
与目前其它研究DNA-蛋白质相互作用的技术方法相比，Reverse ChIP技术具有以下优
点：(1)可以同时得到靶DNA位点上多个蛋白质结合的信息；(2)此技术不使用抗体，只需要合成特定序列的DNA探针，以用来分析任何靶DNA位点上的相关蛋白质；(3)Reverse ChIP 技术具有很高的灵敏度，可以用来分析低丰度的相关蛋白质；(4)能定性定量地鉴定相关蛋白质。由于该项技术发明时间尚短，亦存在一定的不足。如依赖核酸杂交以检测与靶DNA 相结合的蛋白质，可能因探针与某些非靶DNA杂交而产生干扰.又如该技术需要纯化足够量的蛋白质，以满足质谱检测的需要，这可能要求大量的起始材料，也就是说需要处理大量的细胞。
随着功能基因组学研究的深入开展，在染色质水平研究基因的表达调控，是全面阐明真核基因表达调控机制的必经之路。染色质免疫共沉淀技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。该技术被广泛应用于组蛋白转录后调控，组蛋白变体，转录因子，位于基因组或已知基因座上的染色质调控酶的定位等方面的研究。ChIP技术的应用使核蛋白和DNA的相互作用在基因表达、细胞分化或者抗病性等方面的研究有了很大的突破。特别是，ChIP技术能够揭示转录因子的结合位点和确定直接的靶基因序列，可在体内分析特定启动子的分子调控机制，因此被广泛应用于转录调控机制的研究方面。另外，以ChIP技术为基础的多种技术的应用，能够确定转录因子的结合基元，为转录因子生物学的研究提供了重要方法。染色质免疫共沉淀技术与其它方法的结合，扩大了其应用范围。近年来，ChIP技术与DNA微阵列芯片技术或高通量测序技术结合已经广泛应用于特定反式因子靶基因的高通量筛选方面，能够作出组蛋白修饰，组蛋白变体，整个基因组范围内转录因子的图谱。RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着ChIP技术的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。
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染色质免疫沉淀分析ChIP技术介绍 染色质免疫沉淀分析ChIP 技术介绍 (Chromatin Immunoprecipitation Assay, ChiP) (Abcam 公司与Upstate 公司都提供ChIP 抗体产品) 染色质免疫沉淀法(Chromatin immunoprecitation,ChIP)就是研究体内DNA 与蛋白质相互作用的重要工具。它可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA 片段的结合情况,还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。核小体组蛋白可以发生多种翻译后的共价修饰,如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等,这些共价修饰与真核基因的表达密切相关。根据“组蛋白密码”假说,组蛋白的各种共价修饰的组合会以协同或拮抗的方式诱导特异的下游生物学功能,因此,ChIP 也为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用,全面阐明真核基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具。 真核生物细胞状态就是由内源与外源因素共同影响的,所有信号传递途径的终点都就是DNA。DNA 通过核蛋白复合物组成染色质,染色质就是基因调控的一个重要作用位点。转录激活因子与辅助抑制因子的研究显示存在一种新的调节机制--“组蛋白密码”,其信息存在于组蛋白的转录后修饰等过程中。该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。随着越来越多组蛋白核心结构区域与羧端修饰的确定,组蛋白密码在控制与调节基因功能过程中的作用越来越明确。参与修饰的酶根据其作用的不同而分类:如组氨酸乙酰转移酶(HATs)可以将乙酰基团转到组蛋白上;组蛋白去乙酰酶(HDACs)可以去除氨基酸上的乙酰基团;组蛋白甲基转移酶(HMTs)可以将甲基基团转移到组蛋白上等不同组氨酸修饰标记对应于不同的生物学过程,它可以作为调节因子的作用位点,也可以用来改变染色质结构。 染色质免疫沉淀分析(ChiP)就是基于体内分析发展起来的方法,它的基本原理就是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA 复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA 片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA 相互作用的信息。它能真实、完整地反映结合在DNA 序列上的调控蛋白,就是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。CHIP 不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,CHIP 与其她方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP 与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP 与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP 用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见,随着CHIP 的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。 凝胶电泳迁移率改变分析(EMSA)就是目前研究转录调控蛋白与相应核苷酸序列
染色质免疫沉淀(ChIP) 染色质免疫沉淀技术是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 近年来，这种技术得到不断的发展和完善，帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰，也可结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。 实验前准备 在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂盒和相关常规试剂，如本次实验分装Pierce Agarose ChIP Kit，此试剂盒，提供了简化的方法来实现交联反交联、蛋白消化、免疫沉淀和DNA纯化。相关试剂从冰箱里取出，室温解冻或冰上解冻待用。还需要16%甲醛，5M NaCl及RNase- free water等本次实验所需的耗材和仪器有：赛默飞公司的Thermo Scientific全波长扫描式多功能读数仪、QSP盒装吸头及冰盒，芬兰百得公司提供的各个量程单通道移液器，离心机，恒温水浴锅等。 接下来进入实验部分，本实验操作流程为：首先用甲醛处理细胞，使蛋白质与DNA交联，然后用微球菌核酸酶进行消化，进行免疫反应之后，解除蛋白质DNA的交联，最后回收得到的DNA。 甲醛处理使蛋白质与DNA交联 在实验前需将待用细胞，用胰酶消化，进行细胞计数后，调整细胞密度到所需的密度后，方可进行实验。在含相应细胞数量的细胞悬液中，根据细胞培养基的体积，加入16%的甲醛至终浓度为1%。 轻柔颠倒混匀，通风橱中室温孵育10min。在含1%甲醛的培养基中加入10×Glycine Solution至终浓度为1×，混匀，室温孵育5min，目的是终止交联。3000 ×g离心5min，弃掉培养基，用适量预冷的PBS洗细胞，离心去除废液。
关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结 ChIP实验原理 在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 可以利用ChIP研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）的关联性。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。 一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。 ChIP实验步骤 第一天：
（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。 1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml） 2、37摄氏度孵育10min。 3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。 450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。 4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。 6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。 假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。 将2管混在一起，共800ul。 7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。当然，如果实验室有Bioruptor这种神器的话那就轻松了。 （二）、除杂及抗体哺育。 8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。 留取300ul做实验，其余保存于－80度。 300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul 加入4ul 5M NaCl （NaCl终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，
https://www.doczj.com/doc/306276059.html, 染色质免疫共沉淀全套解决方案——ChIP试剂盒 染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）作为最佳的研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法，它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，ChIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；ChIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着ChIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。 当前国内科研情况而言，研究分化，转录，发育，iPS，肿瘤干细胞，表观遗传学等等领域的老师都会做ChIP实验，还有部分老师会自己买抗体，手工配置试剂。但由于这个实验本身实验步骤比较繁琐而且其中很多步骤都非常关键，所需的试剂较多，容易造成配置间的误差，实验周期较长，若未设置阴性和阳性对照，更会导致结果无法分析，从而进入无休的困惑。 经典染色质免疫共沉淀(ChIP)试剂盒(p-2002)：提供了对细胞样品进行染色质免疫沉淀反应所需的所有试剂。并且本试剂盒中含有一种阳性对照抗体(RNA聚合酶II抗体)、一种阴性对照抗体(正常小鼠的IgG)、GAPDH引物(可以作为阳性对照来保证试剂盒中试剂和操作步骤没出现问题)。在大多数生长期的哺乳动物细胞中，RNA聚合酶II会在GAPDH基因启动子上富集，准备起始转录，因此该启动子能与RNA聚合酶II发生免疫沉淀反应，而不能与正常小鼠IgG发生。在本染色质免疫沉淀反应中，细胞耦合了甲醛，提取出其中的染色质。染色质进行适当的打断，然后加入到微孔中与其表面上吸附的抗体发生免疫反应。特异性结合到微孔上的DNA从抗体-捕获蛋白-DNA复合物上释放出来，翻转后，通过本公司专门设计的高速离心柱纯化。洗脱下来的DNA可直接用于随后的各种分析。本试剂盒是基于96孔板的，市场上同类产品中最快捷的试剂盒，对CHIP过程进行了彻底的简化，操作简捷，方便易学整个处理过程不到5小时，同时可拆卸式的96孔板模式使研究人员能根据自己需要选择手工或是高通量分析。
染色质免疫共沉淀（ChIP）实验具体方法及步骤 在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。 IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。 目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。 一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天） 1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。 2. 37℃孵育10 min。 3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5 min即可。 4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。 6. 倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2x106个细胞。这样每100 ul溶液含1x106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5x106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为 4x106个细胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800 ul。 7. 超声破碎：VCX750，25%功率，4.5 s冲击，9 s间隙。共14次。 二、除杂及抗体哺育（第一天） 1. 超声破碎结束后，10 000 g 4℃离心10 min。去除不溶物质。 2. 留取300ul做实验，其余保存于-80℃。 3. 300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M），65℃处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
染色质免疫沉淀（ChIP）技术自我总结 实验原理： ChIP是一项比较流行的研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。 ChIP的流程是： 甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。 PCR验证： 在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q－PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA 逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。 具体实验步骤： 第一天： （一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。 1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml） 2、37摄氏度孵育10min。 3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。 450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。 4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。 6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul 溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。 假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。 将2管混在一起，共800ul。 7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。 （二）、除杂及抗体哺育。 8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。 留取300ul做实验，其余保存于－80度。 300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul 5M NaCl （NaCl终浓度为0.2M），65度处理4h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
染色质免疫共沉淀技术的发展 姚汪劲松发育生物学2013级2013110046 摘要：本文主要介绍了染色质免疫沉淀技术的发展历程、基本原理和优缺点，并且介绍了反向染色质免疫沉淀技术，并对两种方法进行了比较。 关键词：染色质免疫共沉淀；反向染色质免疫共沉淀；应用，研究前景。 目前，不断发展的DNA和蛋白质相互作用的方法和技术已经成为研究DNA复制、重组、修复和转录的核心。其中凝胶阻滞实验（EMSA），报告基因分析，DNA微阵列，质谱分析法MS，酵母单杂交系统和染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是被广泛应用于研究DNA 和蛋白质相互作用的方法。 真核生物基因组DNA以染色质形式存在，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达调控机制的基本途径。生物体内基因表达调控主要发生在转录过程中，转录调控是顺式作用元件(Cis-acting elements)如启动子(Promoter)、增强子(Enhancer)与反式作用因子(Trans-acting factors)相互作用的结果。基因组DNA的甲基化、组蛋白甲基化、乙酰化和磷酸化修饰，核小体重新定位及染色体结构重建都影响调控。转录调控具有细胞类型、发育阶段和外界环境刺激的差异性，哺乳动物转录调控序列分散在较大区域，组蛋白修饰状态达100多种，这些因素都增加了转录调控的复杂性。 ChIP是一种在体内研究转录因子和靶基因启动子区域直接相互作用的方法，可以在体内直接确定它们之间相互作用方式的动态变化，能够得到转录因子结合位点的信息，确定其直接靶基因。它早期多被用于研究核小体上的DNA和组蛋白的相互作用以及组蛋白的修饰等方面。近年来，随着生物技术的迅速发展，ChIP技术不断发展和完善，被广泛应用于体内转录调控因子与靶基因启动子上特异核苷酸序列结合方面的研究，并成为在染色质水平研究基因表达调控的有效方法。特别是，此技术与DNA芯片和分子克隆技术相结合，可用于高通量筛选已知蛋白因子的未知DNA靶位点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况，这将有助于深入研究DNA与蛋白质相互作用的调控网络。 ChIP技术由Orlando等于1997年创立。其基本原理为将处于适当生长时期的活细胞用甲醛交联后将细胞裂解，染色体分离并打碎为一定大小的片段；然后用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白与DNA交联的复合物，对特定靶蛋白与DNA片段进行富集。采用低pH值条件反交联，DNA与蛋白质之间的Schiff键水解，释放DNA片段。通过对目标片段的纯化与检测，获得DNA与蛋白质相互作用的序列信息。在上述ChIP过程中，甲醛能够进入细胞并使蛋白质与DNA或蛋白质与蛋白质之间通过希弗(Scihff)键交联，形成稳定结合的复合物。如果交联效果不太好，可以先用交联剂DMA(Dimethyl adipimidate)或DSG (Disuccnimidyl glutarate)处理细胞，以加强后续甲醛交联的效果。破碎DNA可采用超声物理破碎或特定酶切消化，以获得所需长度的DNA片段。由于DNA片段长度将影响抗体免疫沉淀效率，因此破碎DNA是ChIP实验成功与否的重要因素。超声效果与细胞裂解是否充分、细胞浓度及裂解液成分等因素有关。超声处理后的液体应从浑浊状态变为透明状态。选择专一性及亲和力较高的抗体是ChIP成功的关键。非特异性抗体将增加大量的非目标靶点DNA片段信息，从而掩盖了真实的蛋白质结合位点信息；而亲和力较差的抗体，则无法获得高信噪比靶点DNA片段。另一方面，在甲醛交联过程中可能会掩盖一些蛋白质的表位，这会影响到一部分蛋白质和DNA复合体的免疫沉淀反应。因此，用Western印迹或免疫组化等常用的实验方法证明的能够对目标蛋白质进行免疫结合的抗体，并不能保证一定能够成功地进行ChIP实验。例如，Weitsman 等检验了不同的雌激素受体β抗体在ChIP中的免疫沉淀能力，发现有的抗体虽然能够在标准免疫沉淀条件下与抗原结合，但不适合ChIP条件下使用，并
知无不“研”|一文读懂染色质免疫共沉淀技术（ChIP） 染色质免疫共沉淀技术（ChIP） 基于体内分析而发展的染色质免疫沉淀分析（Chromatin immunoprecipitation assay kit,ChIP）技术可以真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，因此能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来，这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管病以及中央神经系统紊乱等疾病主要通路的一种非常有效的工具。 染色质免疫沉淀分析（ChIP）的基本原理是在活细胞状态下，当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白、蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合时，它们必然靠的比较近或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。固定的蛋白质－DNA复合物通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。通过qPCR或二代测序，筛选与目的蛋白互作的未知DNA信息。 今天小编将珍藏多年的ChIP实验心得拿出来与大家一同探讨。 应用领域 1、判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰 2、检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位 3、研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系 4、转录因子研究 技术流程
染色质免疫共沉淀（ChIP） 染色质免疫共沉淀可以：（1）组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”；（2）转录调控分析；（3）药物开发研究；（4）DNA损失与凋亡分析。 1实验方法原理： 在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。 IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。 目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。 2实验材料、试剂、仪器耗材： 细胞样品 甲醛、甘氨酸、PBS、SDS、Lysis Buffer、洗脱液、RNaseA、蛋白酶K、omega胶回收试剂盒等 离心管、超声仪、电泳仪、离心机等 3实验步骤： 一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天） 1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。 2. 37℃孵育10 min。 3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5 min即可。
4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。 6. 倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100 ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800 ul。 7. 超声破碎：VCX750，25%功率，4.5 s冲击，9 s间隙。共14次。 二、除杂及抗体哺育（第一天） 1. 超声破碎结束后，10 000 g 4℃离心10 min。去除不溶物质。 2. 留取300ul做实验，其余保存于-80℃。 3. 300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M），65℃处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。 4. 在100 ul的超声破碎产物中，加入900 ul ChIP DilutionBuffer和20 ul的50×PIC。再各加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4℃颠转混匀1 h。 5. 1 h后，在4℃静置10 min沉淀，700 rpm离心1 min。 6. 取上清。各留取20 ul做为input。一管中加入1 ul抗体，另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。 三、检验超声破碎的效果（第一天） 1. 取100 ul超声破碎后产物，加入4 ul 5M NaCl，65℃处理2 h解交联。 2. 分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。 四、免疫复合物的沉淀及清洗（第二天）
Chip步骤 组织裂解： 1.新鲜组织。切成1-3 mm3小块。 2.转移组织到50ML试管里。加入10 ml of 1X PBS. 3.加甲醛至终浓度为1%。室温下转动15—20mins。（10ul） 4.加2.5 M Glycine至终浓度为0.125 M(终止交联)。4°C下转动10mins。（0.5ml） 5.100 g, 4°C 离心样本5mins。 6.弃上清，取沉淀。用45 ml 冰冻1X PBS和25 ml 冰冻1X PBS各洗一次。离心弃上清。 7.再加入2 ml 冰冻1X PBS。匀浆机裂解组织。1000 rpm，4°C ，离心5 min。弃上清。 8.细胞裂解液重悬细胞。加入蛋白酶抑制剂PMSF (10 ul per ml), aprotinin (1 ul per ml) and leupeptin (1 ul per ml).冰上孵育10-15mins 9.5,000 rpm ，4°C离心5分钟。取沉淀 10.细胞核裂解液重悬细胞加入（8）中的蛋白酶抑制剂。冰上孵育10-20mins。 11.接下来就进去超声过程了。（接下来第一天的5） 第一天 1.细胞中加入1%的甲醛，8ml的培养液加入216 ul的甲醛，37度十分钟。 2.配制含有蛋白酶抑制剂的PBS 20 ml和含有蛋白酶抑制剂的SDS溶液1ml 3.将细胞拿出来，迅速的移除含甲醛的培养基，加入含蛋白酶抑制剂的PBS洗两遍。胰酶 消化20秒，加入含蛋白酶抑制剂的PBS 1ml。用细胞刮刀把细胞刮下，收集到1.5ml的离心管里面。 4.4度2000rpm离心10min，弃上清液，加入200ul含蛋白酶抑制剂的ＳＤＳ溶液。吹打 重悬细胞，冰上孵育１０分钟。 5.超声切割ＤＮＡ，总切割时间４min30sec，超声10sec,间隙10sec。 6.4度13000rpm离心10min，转移上清液到一个新的2ml的离心管，弃沉淀。 7.稀释超声后的上清液到10X的CHIP稀释液，200ul的上清液加入1.8ml的CHIP稀释液， 达到最终体积2ml。 8.为去除非特异性，加入75ul的Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，4度旋 转30分钟。 9.1000rpm离心3min沉淀Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，收集上清液。 10.上清液加入1抗，4度振荡过夜。（5—10大概一个小时） 第二天（1—8大概两个半小时） 1.加60ul的Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，沉淀抗体/抗原复合物，4度 旋转一小时。 2.1000rpm 4度3min收集沉底，移除上清液，开始洗脱过程。 3.低盐免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀 4.高盐免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀 5.Licl免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀 6.TE Buffer，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀，两次 7.现在得到的是protein A/antibody/histone/DNA complex，新制备elution buffer (1%SDS, 0.1M NaHCO3)。加250ul elution buffer到沉淀，混匀后室温旋转15min。1000rpm离心 3min沉淀，移上清液到新的离心管，重复上面的过程，最后上清液体积大约500ul。8.加入20ul的5M的nacl反转交联，65度过夜。 第三天（大概3个小时）
染色质免疫共沉淀技术（ChIP） 真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究体内DNA 与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA 复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP 用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。 染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来，这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。 它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。其次，要注意溶解抗原的缓冲液
ChIP试剂盒染色质免疫共沉淀全套解决方案 染色质免疫沉淀-芯片试剂盒 染色质免疫沉淀(芯片)的完整溶液是研究体内DNA与蛋白质相互作用的最佳方法。其基本原理是将蛋白质-DNA复合物固定在活细胞状态，将其随机切割成一定长度范围内的小染色质片段，然后通过免疫学方法沉淀复合物，特异性富集与靶蛋白结合的DNA片段。通过目标片段的纯化和检测，可以获得关于蛋白质和DNA之间相互作用的信息。 芯片不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态相互作用，还可以研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。此外，芯片与其他方法的结合扩大了其应用范围:通过芯片与基因芯片的结合建立的芯片-芯片法已广泛用于高通量筛选特异的反式因子靶基因；芯片结合体内足迹法寻找反式因子的体内结合位点；核糖核酸芯片用于研究核糖核酸在基因表达调控中的作用因此，随着ChIP的进一步完善，它必将在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。 就目前国内研究状况而言，教师在研究领域有分化、转录、发育、诱导多能性、肿瘤干细胞、表观遗传学等。会做ChIP实验，一些老师会自己购买抗体，手动配置试剂。然而，因为实验本身具有复杂的实验步骤，并且其中许多步骤非常关键，需要更多的试剂，所以很容易导致配置之间的错误，并且实验周期长。如果没有设置阴性和阳性
对照，结果就无法分析，从而导致无休止的混乱。 经典染色质免疫沉淀(ChIP)试剂盒(p-2002):提供细胞样品上染色质免疫沉淀反应所需的所有试剂此外，试剂盒包含阳性对照抗体(核糖核酸聚合酶2抗体)、阴性对照抗体(正常小鼠的IgG)和GAPDH引物(可用作阳性对照，以确保试剂盒中的试剂和操作步骤没有问题)在大多数生长中的哺乳动物细胞中，核酸聚合酶II富集在GAPDH基因启动子上，为启动转录做准备，因此启动子可以与核酸聚合酶II进行免疫沉淀反应，但不能与正常的小鼠IgG进行免疫沉淀反应。在该染色质免疫沉淀反应中，细胞与甲醛偶联以提取其中的染色质染色质被适当破坏，然后加入微孔中，与吸附在微孔表面的抗体反应特异性结合在微孔上的DNA从抗体-捕获蛋白-DNA复合物中释放出来，通过我们公司专门设计的高速离心柱进行翻转和纯化。洗脱的DNA可直接用于后续分析该套件基于96孔板，是市场上同类产品中最快的套件。CHIP过程完全简化，操作简单，整个处理过程在不到5个小时的时间内就很容易学会。同时，可拆卸的96孔板模式使研究人员能够根据自己的需要选择手动或高通量分析。用于 组织样本的芯片套件(P-2003):专为组织样本开发，更专业，使用更方便！ 植物芯片研究的福音:独特的植物染色质免疫沉淀试剂盒(p-2014)，极大地拓展了染色质免疫沉淀的应用领域，给从事植物研究的教师带来了新的希望。植物染色质免疫沉淀(ChIP)试剂盒提供植物细胞样品
染色质免疫沉淀（ChIP）技术的难点及应用 序言 随着人类基因组测序工作的基本完成，功能基因组学的研究逐渐成为研究的热点。而基因表达的调控又是功能基因组学的一个重要研究领域。研究某个蛋白因子的调控功能，可以通过对蛋白活性（激活或抑制其活性），蛋白数量（过表达Overexpression或基因缺陷型Knockout）, 以及蛋白功能（功能缺陷型蛋白Dominant-negative mutation）的控制，影响下游基因的表达，而下游基因的变化又可以通过基因芯片（cDNA Microarray），抑制消减杂交（Suppression Subtractive Hybridization），差异显示RT-PCR等方法进行研究[1]。然而这些方法都无法提供证据证明这些变化是受某个蛋白因子直接调节的，还是间接的其他变化导致的结果。所以，要想提供蛋白因子直接调控的证据，就要直接检测蛋白质-DNA的相互作用。传统的方法包括转录因子结合实验（Transcription Factor Assay），电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay），DNase I 足印法（DNase I footprinting），酵母单杂交系统等。但这些方法都有一定的局限性，不能充分反映生理情况下DNA与蛋白相互作用的真实情况，而且很难捕捉到在染色质水平上基因表达调控的动态瞬时事件[2]。 染色质免疫沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，简称ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。特别是近年来由于该技术不断的发展和完善，其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用，发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用；从研究一个目的蛋白与DNA 的相互作用，发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用；从研究启动子区域的组蛋白的修饰，发展到研究结合在DNA序列上的蛋白复合物。随着对基因功能研究的不断深入，这项技术正越来越多的被应用于科研的各个领域。目前已经有成熟的ChIP试剂盒出售，如Millipore公司提供的EZ-ChIP 试剂盒，使得越来越多的研究者更容易地采用染色质沉淀技术在许多研究领域取得了成功。 ChIP技术的原理 染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA 的纯化，以及DNA的鉴定。因为ChIP实验涉及的步骤多，结果的重复性较低，所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照，而且对结果的分析也需要有一定的经验。对于刚刚开始使用ChIP技术的研究人员来说，使用成熟的商品化试剂盒和相关的技术服务会达到事半功倍的效果，比如Millipore 公司的EZ-ChIP试剂盒就是专门为初学者设计的入门产品。下面我们就最基本的实验步骤，实验中的小技巧以及需要注意的问题简单介绍一下。 1. 细胞固定 甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。交联所用的甲醛终浓度为1%，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据实验而定。值得注意的是，交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。 2. 染色质断裂
一、染色质免疫共沉淀简介 真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术 （chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。 由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。 染色质免疫共沉淀可以：（1）组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”；（2）转录调控分析；（3）药物开发研究；（4）DNA损失与凋亡分析。 二、ChIP的一般流程 甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。 三、PCR分析 ChIP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著，同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。目前ChIP-chip技术研究主要集中于两个领域：及转录因子的结合和条件特异性；组蛋白的修饰，组蛋白修饰蛋白和染色体重建。 ChIP-chip在描述转录结合因子动力学中的研究、染色体结构组分的分布、在组蛋白的修饰、组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用也十分广泛。ChIP-chip 技术的优点是，可以在体内进行反应；在给定的检验细胞环境的模式下得到DNA相互关系的简单影像；使用
ChIP Assay Kit 产品简介： ChIP Assay Kit即Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assay Kit，也称染色质免疫沉淀检测试剂盒或ChIP检测试剂盒，用于通过免疫沉淀来沉淀和目标蛋白结合的染色质片段，最后通过PCR或Southern等方法来检测沉淀的染色质片段的试剂盒。通常用于检测特定的转录因子或组蛋白等基因组DNA结合蛋白是否和预期的特定基因组DNA序列在同一复合物中。 通过ChIP检测可以获得在体的(In Vivo)目标蛋白和预期基因组DNA片段是否在同一复合物中的结论。EMSA，也称gel shift获得的结果是体外的(In Vitro)目标蛋白和预期基因组DNA片段的结合结果，可以推断细胞内也发生类似的结合，但并不代表该情况在细胞内也真实发生。而ChIP的检测结果则可明确说明这种结合在细胞内是真实发生的。 本ChIP Assay Kit采用了Protein A+G Agarose，比Protein A Agarose或Protein G Agarose适合于免疫沉淀更多种类的抗体，包括mouse IgG1，IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, rat IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, rabbit IgG, rabbit and goat polyclonal Abs，以及human IgG1, IgG2, IgG3和IgG4。 本试剂盒中经过Salmon Sperm DNA预饱和的Protein A+G Agarose和目的基因组DNA的非特异性结合大大下降。 提供了预混合的对照引物(Control Primers)。可用于扩增human GAPDH的部分相应序列，引物序列为：5’-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3’；5’-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3’。 本ChIP Assay Kit如果用于常规的染色质免疫沉淀，共可以免疫沉淀22个样品。 保存条件： 4℃保存，一年有效。 注意事项： 请勿冷冻保存P2078-1 Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA。除P2078-1外，其它溶液可以-20℃冷冻以保存更长时间。 需自备用于ChIP的一抗，37%甲醛，PBS，PMSF，Elutioin buffer (1% SDS, 0.1M NaHCO3)，蛋白酶K，Glycogen或tRNA，Tris平衡苯酚，氯仿，95%乙醇，70%乙醇，3M NaAc (pH5.2)以及细胞刮子或细胞铲子。PMSF(ST506) ，蛋白酶K(ST532/ST533) ， Glycogen(D0812)和3M NaAc pH5.2(ST351)等可以向碧云天订购。 需自备超声样品处理仪(sonicator)，也称超声粉碎机或超声细胞粉碎机。 使用甲醛时请在通风橱中进行操作。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1.样品超声处理条件的优化：