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人CD38抗原胞外段基因克隆及表达

人CD38抗原胞外段基因克隆及表达
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【高中生物】功能基因的克隆及生物信息学分析

(生物科技行业)功能基因的克隆及生物信息学分析

功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要:随着多种生物全基因组序列的获得,基因组研究正从结构基因组学(structuralgenomics)转向功能基因组学(functionalgenomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等),其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1],它代表了基因分析的新阶段,已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物,发展和应用新的实验手段,通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能,使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究,是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因,也成为我们面临的一个课题,本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词:功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆,它是根据目标基因在染色体上确切位置,寻找与其紧密连锁的分子标记,筛选BCA克隆,通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域,根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因,得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息,从突变体开始,逐步找到基因,最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多

控制质量性状的单基因得以克隆,最近也有报道某些控制数量性状的主效基因(控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2基因克隆[5]等)也通过图位克隆法获得。 1.2同源序列克隆目的基因 首先根据已知的基因序列设计PCR引物,在已知材料中扩增到该片段,并经克隆测序验证,利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针,与待研究材料的cDNA文库杂交,就可以获得该基因cDNA克隆,利用克隆进一步筛选基因组文库,挑选阳性克隆,亚克隆并测序,从中就可以筛选到该基因的完整序列。 1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法 结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6]。(Linkagedisequilibrium,LD)。与连锁分析不同,连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉,从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotypeblock)。这样经过很多世代的重组,只有相隔很近的基因,才能仍处在相同的原始单倍型片段上,基因间的连锁不平衡才能依然存在。所以基于连锁不平衡分析,可以实现目的基因的精细定位。林木大多为自由授粉的异交物种,所以连锁不平衡程度很低,林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域,这就为目的基因的精细定位提供了可能,结合SNP检测技术,科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来,进行数量性状寡核苷酸

基因克隆及转基因方法

基因克隆及转基因 一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物 软件是https://www.doczj.com/doc/39913315.html,sergene.v7.1,用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则:1、长度:18-25; 2、GC含量:40-60%,正反向引物相差不要大于5%; 3、Tm值:55以上(到65),实在不行50以上也可以,正反向引物相差不要大 于5; 4、3’端结尾最好是GC,其次是T,不要A; 5、正反向引物连续配对数小于4; 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何; (如果克隆的话不能满足条件也没办法。) 不是必须条件,但可以考虑:多个基因设计引物时,可尽量使Tm值相似,方便PCR。 步骤: 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’,在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基,如果你是要验证就随便选,如果你是要克隆就在最开始选,不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中,在File中选择Enter New Primer,复制,OK,然后可以看到引物的情况,看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准,不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’,选中序列,在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”,此时序列已反向互补,按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小,比如序列是1000bp,你想PCR出来800大小的目的带,那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补,在正向的序列中搜索R在的位置,就是在EditSeq中选择Search,点击第一个Find,开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆,所以引物要有酶切位点,酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体,在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点,注意加入时载体的表达的方向,前面的酶切位点在引物F上,后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度,找到后回收时就可以多PCR几管,一般我们用20ul的体系,PCR5管就可以回收,就是琼脂糖凝胶回收,将目的基因用刀片切下来,用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR: 20ul体系:灭菌水13.8ul,若模板为质粒灭菌水14.3ul; 2.5mMdNTP2.0ul;

绿色荧光蛋白GF基因的克隆表达和粗提取

绿色荧光蛋白G F基因 的克隆表达和粗提取 SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#

绿色荧光蛋白(G F P)基因的克隆、表达和粗提取 南方医科大学 2011预防医学(卫生检验检疫) 摘要 目的:研究绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达,以及对其进行粗提取。方法:从 DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳,确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切,并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳,用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞 BL-21中,用LB培养基对转化后的进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论:本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术,为进一步的实验奠定基础。 关键词:绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取 目录

1 前言 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时,GFP 发射绿

色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。1962 年,下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素,并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年,他们分离得到了这个蛋白,当时称绿色蛋白,以后称绿色荧光蛋白(GFP)[1] GFP 作为一种新的报告基因,其优点在于①荧光强度高,稳定性高;②GFP 分子量小,易于融合,适用于多种转化方式,对受体无毒害,安全可靠;③不需要反应底物与其他辅助因子,受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测; ④GFP 不具有种属依赖性,在多种原核和真核生物细胞中都表达;⑤通过替换一些特殊氨基酸,可以使之产生不同颜色的光,从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化,以及细胞的分离与纯化等研究领域[ 2~3]。采用GFP 作为标记基因,可直接收集转化细胞供实验,缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记,为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[ 4、5 ]。采用基因工程手段生产GFP标记的方法,可建立一种简便、快速的免疫诊断技术[6]。 质粒转化进入大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞是分子克隆的关键步骤[7],是基因克隆以及DNA文库构建等研究中一项重要的常规操作。目前,感受态 法,该方法操作简单、容易掌握、重复性好、转化率 细胞的制备主要采用CaCl 2 高,可广泛应用于一般的实验室。其原理是Ca2+ 破坏细胞膜上的脂质阵列,并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入[8]。 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌,它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产

4植物基因克隆的策略与方法

4植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1功能克隆(functional Cloning) 功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针 从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因 缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该

红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯

毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校

华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告

癌活性,对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素,高纯度紫杉醇价格昂贵,每公斤200万元人民币左右。因此,近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成,尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率,克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法,但是紫杉醇的合成途径非常复杂,涉及到多种酶以及很多分支途径,单纯依靠转化一、两种限速酶基因,只能保证转入的限速酶表达量提高,使之不再是限速因素,但其它阶段对于最终产量的限制依然存在,而且同时转入多种基因的可行性非常低,这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成,如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇,为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破,目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇,能够利用真菌生长速度快的优势,但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求,而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌,其紫杉醇含量极微,并且这些真菌的培养和大规模发酵困难,菌株衰退也是一个难题。 另外,红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一,是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段,如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前,在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因,它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域,是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因,之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。

整个基因克隆实验流程(完整)

一、组织总RNA的提取 相关试剂:T rizol;氯仿;苯酚;异丙醇;75%乙醇;RNase-free水 相关仪器:制冰机;液氮&研钵/生物样品研磨仪;高速离心机;移液器(1ml、200μl、100μl/50μl);涡旋振荡仪;恒温金属浴。 相关耗材:解剖工具,冰盒,离心管,离心管架,吸头(1ml,200μl/300μl),一次性手套,实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼,冰上放置一段时间,然后解剖,剪取肠道50~100mg,放入研钵中,加入液 氮迅速研磨,然后加入1ml 预冷TRIzol试剂,充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中,室温放置5min,使细胞充分裂解; 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿,盖上盖子,迅速充分摇匀15s,然后室温放置3min; 4.4℃,,12000g 离心15min; 此时混合物分为三层,下层红色的苯酚氯仿层,中间层和上层无色水相;RNA存在于无色水相中; 5.小心吸取上清液,千万不要吸取中间界面,否则有DNA污染;转移至一个新的离心管, 加入等体积的异丙醇,轻轻混匀; 6.室温放置10min;4℃,,12000g 离心10min; 7.弃上清,加入1ml 75%乙醇洗涤;涡旋,悬浮沉淀;4℃,,12000g 离心5min; 8.弃上清;可以再次用75%乙醇洗涤沉淀; 9.弃上清;用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇,注意不要吸取沉淀;室温放置5min 晾干沉淀;(RNA样品不要过于干燥,否则极难溶解) 10.沉淀中加入30μl RNase-free水,轻弹管壁,使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂:溴酚蓝, TEB/TAE电泳缓冲液,溴乙锭(EB) 相关仪器:(超微量分光光度计,移液器(2.5μl 或2μl 规格,10μl规格),电子天平,电泳仪,电泳槽,凝胶成像仪,微波炉,制冰机) 相关耗材:(无菌无绒纸,吸头,离心管架,PCR管,PCR管架,锥形瓶,烧杯,一次性手套,实验手套,冰盒) (1)RNA纯度的检测:测定其OD260和OD280的值,根据其OD260/ OD280的比值,当其比值在1.9~2.1之间,说明提取的总RNA纯度比较高,没有蛋白质和基因组的污染。 (2)RNA完整性的检测:取2μlRNA,与2μl溴酚蓝混匀,用1%的琼脂糖进行凝胶电泳,20min后,在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰,且亮度比大约是2:1时,5S条带若隐若现,而且没有其它条带时,说明完整性不错,可以用于下游逆转录实验。

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术,与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白,以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展,研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前,这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签,可以满足客户的不同需求,包括各种最新型的标签,如:SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签,如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍,更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签,可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用,一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力,可用于固定化金属螯合层析(IMAC),对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点: 标签的量小,只有~0.84KD,而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD,一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化,前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用,后者在纯化包涵体蛋白时特别有用,用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白,使复性不受其它蛋白的干扰,或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低,可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统,纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK),同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白,其融合表达目的蛋白后具有以下优点: FLAG作为融合表达标签,其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质,这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白,可以直接通过FLAG进行亲和层析,此层析为非变性纯化,可以纯化有活性的融合蛋白,并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白,其可以被抗FLAG的抗体识别,这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

拟南芥基因克隆的策略与途径

拟南芥基因克隆的策略与途径 拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种模式植物,具有基因组小(125 Mbp)、生长周期短等特点,而且基因组测序 已经完成(The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000)。同时,拟南芥属十字花科(Cruciferae),具有高等植物 的一般特点,拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究,产生重大的经济效益,特别是十字 花科中还有许多重要的经济作物,与人类的生产生活密切相关,因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各 国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功 能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的 几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms. 图位克隆(map-based clonig)又称定位克隆(positoinal cloning),1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座,在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上,通过构建高密度的分子连锁图,找到与目的基因紧密连锁的分子标记,不断缩小候选区域进而克隆该基因,并阐明其功能和生化机制。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的,无需预先知道基因的DNA序列,也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成,各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善,在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了(图1)。

功能基因的克隆及生物信息学分析

功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要:随着多种生物全基因组序列的获得,基因组研究正从结构基因组学(structural genomics)转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等),其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1],它代表了基因分析的新阶段,已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物,发展和应用新的实验手段,通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能,使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究,是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因,也成为我们面临的一个课题,本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词:功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1 图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆,它是根据目标基因在染色体上确切位置,寻找与其紧密连锁的分子标记,筛选BCA克隆,通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域,根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因,得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息,从突变体开始,逐步找到基因,最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆,最近也有报道某些控制数量性状的主效基因(控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等)也通过图位克隆法获得。

绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析

3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后,进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果,如图一所示,3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带,说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果,如图二所示,电泳会得到两条带,说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带,证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞,用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒

受态细胞。转化重组质粒后涂平板,进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因,所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落,说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长,说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落,证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后,由于倒平板速度太慢,导致 培养基凝固,影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中,离心后,弃 上清的过程中,将沉淀和上清混在了一起,影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后,进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功,得到电泳结果如图 四所示,结果表明,1、2泳道的条带约为700bp,说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果

生化绿色荧光蛋白的基因克隆及表达开题报告

题目:绿色荧光蛋白(GFP)基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达 李宏远 2014236053 立题依据: 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合,将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。 1.选材:大肠杆菌 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌,它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %,因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 2.基因标记技术 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注,现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白,分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。

3.绿色荧光蛋白 从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。分子质量为 26kDa,由238个氨基酸构成,第65~67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团,是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性,发出荧光稳定,且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定,对多数宿主的生理无影响,是常用的报道基因。 【实验目的】 研究绿色荧光蛋白(Greed Fluorescent Protein,GFP)基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 【研究意义】 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP,将重组质粒导入大肠杆菌体内,通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论,重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。 GFP的应用特点 检测方便:不需要外加底物和辅助因子,用内眼就可以观察到,在长紫外光照射下特别漂亮,以此作为标记,观察表达产物。

基因克隆的几种常见方法

基因克隆得几种常见方法 基因(gene)就是遗传物质得最基本单位,也就是所有生命活动得基础。不论要揭示某个基因得功能,还就是要改变某个基因得功能,都必须首先将所要研究得基因克隆出来。特定基因得克隆就是整个基因工程或分子生物学得起点。本文就基因克隆得几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列得基因克隆就是基因克隆方法中最为简便得一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道得基因序列直接作为自己克隆得依据。现在国际上公开发行得杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及得基因序列在基因库中注册,拟发表得文章中仅提供该基因在基因库中得注册号(accession number),以便别人参考与查询。目前,世界上主要得基因库有1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室得基因库,其网上地址为; (2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)得基因库,其网上地址为;(3)Swissport与TREMBL,Swissport就是一蛋白质序列库,其所含序列得准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来得序列。目前,以Genbank得应用最频繁。这些基因库就是相互联系得,在Genbank注册得基因序列,也可能在Swissport注册。要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因就是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都就是免费得,因而极易将所感兴趣得基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异得引物,通过PCR从基因组中克隆该基因,也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意得就是,由于物种与分离株之间得差异,为了保证PCR扩增得准确性,有必要采用两步扩增法,即nested PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质得基因扩增出来。在基因文库中注册得蛋白质序列都可以找到相应得DNA或cDNA序列。如蛋白质序列就是自己测定得,那么需要设计至少1对简并引物(degenerated primer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆得基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物得特异性。 另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用得PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其她有自我检测(reading proof)功能得酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现得点突变或终止密码子而导致整个研究结论得错误。 2根据已知探针克隆基因 这也就是基因克隆得一种较直接得方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理得基因组DNA杂交,最后将所识别得片段从胶中切下来,克隆到特定得载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中得拷贝数。

基因克隆的几种常见方法

基因克隆的几种常见方法 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession number),以便别人参考和查询。目前,世界上主要的基因库有1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为 https://www.doczj.com/doc/39913315.html,/ebi-home.html;(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为 https://www.doczj.com/doc/39913315.html,/web/search/index.html;(3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因,也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物种和分离株之间的差异,为了保证PCR 扩增的准确性,有必要采用两步扩增法,即nested PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引物(degenerated primer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。 另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。 2 根据已知探针克隆基因 这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来,克隆到特定的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。但在探

基因克隆和表达

Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.doczj.com/doc/39913315.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006

第五章基因克隆技术

第五章基因克隆技术 基因克隆技术是分子生物学的核心技术,其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝,用于深入分析基因的结构与功能,并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。基因克隆的一项关键技术是DNA重组技术,它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割,重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增,形成大量的子代分子,此过程称基因克隆。有目的地通过基因克隆技术,人为操作改造基因,改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。 基因克隆的一般程序为: 一、获取目的基因 目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。获取目的基因的主要方法: 1、用限制性内切酶酶解染色体DNA,构建基因组文库,再从基因组文库中筛选目的基因。该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同,在结构基因中也含有内含子序列,但是也正因为这一点构成了该法最大缺点,即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子),因而也不能表达出正确的基因产物。 2、分离纯化细胞中的mRNA,以mRNA为模板,在反转录酶作用下生成cDNA第一链,再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库,从中筛选所需的目的基因。此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列,具有完整的阅读框架,可在原核细胞中正确表达。 3、人工体外合成基因:由于当前人工体外合成DNA的长度有限,此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。在基因较大情况下,常需先合成多个DNA片段,然后拼接成完整的基因,此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。 4、PCR法扩增基因:PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展,为目的基因的寻找提供了有力技术工具。用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段,或用反向PCR技术,先将特定mRNA反转录为cDNA第一链,然后再进行扩增。用PCR法筛选基因,需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。 二、选择适当的载体 按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助,很难进入受体细胞,即使能进入,往往也不能进行复制和表达,因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆,必须将它们与适当的载体连接。理想的载体应该是:(1)分子量较小,能在细胞内自主复制的环状或线状DNA分子;(2)具有特异的限制性酶切位点,便于外源DNA片段的插入,且有明显的遗传筛选标志,如抗药性或插入失活等,以利于阳性克隆的筛选;(4)具有生物安全性。常用的克隆载体可分为三类,即质粒、噬菌体及病毒。由于天然载体用于基因克隆存在许多缺点,现用载体实际上是在天然载体基础上进行改造而成。 1、质粒载体质粒是细菌染色体外小型环状DNA复制子,质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。质粒载体具有如下特点:分子相对较小(3~10kb);含松弛型复制子因而在

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