·综述·
【作者单位】天津医科大学总医院,天津300052【作者简介】胡春艳(1980～),女,在读研究生,主要从事皮
肤病与性病学工作。
单克隆抗体制备技术及应用的研究进展
胡春艳,刘全忠
【文献标识码】B 【中图分类号】R 511
【文章编号】1007-1040(2008)02-0116-03【关键词】单克隆抗体; 制备; 应用
1975年,K o h l e r 和M i l s t e i n 创立了杂交瘤技术制备单克隆抗体[1]
,近年来随着分子生物学和细胞生
物学的发展,单克隆抗体技术的应用已日益普及,单抗的方法论几乎已经应用到生物学研究的每一个区域。单克隆抗体制备技术的发展也就显得尤为重要。
1 单克隆抗体的种类及制备
1.1 鼠源性单抗 自单克隆抗体技术问世以来,制备单抗的一般程序是,从超免疫的供体中即抗原免疫的小鼠,获取脾细胞,再与骨髓瘤细胞融合,最后对单个细胞进行克隆,培养出能分泌单抗的克隆细胞。目前所生产的单抗大多数是鼠源性的,但其在临床应用方面还存在着很大的弊端,主要是鼠源单抗与N K 等免疫细胞表面F c 段受体亲和力弱,产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(A D C C )作用较弱,而且它与人补体成分结合能力低,对肿瘤细胞的杀伤能力较弱,并且鼠源性抗体在人血循环中的半衰期短,它发挥A D C C 作用的时间较短
[2]
;其次鼠
单克隆抗体还具有免疫原性,使宿主易引起过敏反应。这样一方面降低了单抗的效价,另一方面又会给病人带来严重的后果。因此鼠源性单克隆抗体还应进一步改善才能广泛应用于临床。
1.2 鼠抗体人源化的构建 鼠抗体的人源化改造主要方法包括嵌合抗体、表面重塑抗体和重构抗体。1.
2.1 嵌合抗体 从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因,与人I g 恒定区的基因连接,再插入适当表达载体,转染宿主细胞,表达人-鼠嵌合抗体。也就是
将鼠源性单抗在保留其抗原结合活性的基础上,尽可能的去除鼠源化部分或代之以人源化片断,减少了鼠源性抗体的免疫原性,从而尽可能的减少单抗的异源性,同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的
能力。但是这种抗体仍保留了30%的鼠源性,可诱发人抗小鼠反应(H A M A )[3]
。
1.2.2 表面重塑抗体 对鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造,在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换。所替换的片段不应过多,对于影响侧链大小、电荷、疏水性,或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区构像的残基尽量保留。1.2.3 重构抗体 由异源抗体中与抗原结合相关的残基与人抗体重新拼接构建。
1.3 人源性单抗1.3.1 抗体库筛选技术 抗体库筛选技术主要包括噬菌体抗体库技术和核糖体展示技术。
1.3.1.1 噬菌体抗体库技术 噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术[4]
。1985年.S m i t h 将外源基因插入丝状噬菌体f l 的外壳蛋白质基因Ⅲ区。使目的基因编码的多肽在噬菌体表面表达.从而建立了噬菌体表面表达技术
[5]
.其基本原
理是将蛋白分子或肽段的基因克隆到丝状噬菌体的
基因组D N A 中,与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白,从而使该异源分子呈现于噬菌体表面。该技术构建方法是从免疫或未被免疫的B 细胞中分离抗体可变区基因;P C R 扩增抗体全套基因片段(如V H 、V L ),将体外扩增的V H 、V L 基因片段随机克隆入相应载体,形成组合文库;将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因Ⅲ(g 3)或基因Ⅷ(g 8)的序列,使外源基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在外壳蛋白g pⅢ或g p Ⅷ的N 端。通过噬菌体展示技术能将蛋白质的基因型和表型连接起来。用固相化抗原经“亲和结合—洗脱—扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库
[2,6]
。噬菌体抗体库技术是目前不经过免疫
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获取特异性人源抗体的新途径,为制备对人类和动物疾病有诊断和治疗价值的单克隆抗体奠定了基础。
噬菌体展示技术简单易行,筛选容量大,可在短期内筛选出100万～1亿个克隆,可获得高亲和力的人源化抗体。它直接从未经免疫的小鼠或人的淋巴细胞中得到抗体基因,可以获得完全人源化的抗体,克服了杂交瘤细胞的不稳定性的缺点。但该技术也存在一定的局限性,如库容量的有限性,密码子的偏爱性,氨基酸的修饰受宿主限制等,而且该技术依赖于细胞内基因的表达,所以一些对细胞有毒性的分子很难得到有效的表达。
1.3.1.2 核糖体展示技术 最初称为多聚核糖体展示,是一种完全在体外合成蛋白质分子并进行选择与进化的新技术。1994年,M a t t h e a k i s等建立了一种体外核糖体展示随机肽系统,利用“多肽-核糖体-m R N A”复合物将肽库构建在多核糖体上,借助多核糖体在体外将基因型和表型联系起来。1997年, H a n e s和P l u k t h u n等在此基础上加以发展和完善,建立了核糖体展示技术[7]。它的基本原理是通过P C R 扩增目的基因的D N A文库,同时加入启动子、核糖体结合位点及茎环,并置于具有耦联转录/翻译的无细胞翻译系统中孵育,是目的基因的翻译产物呈现在核糖体表面,并形成“m R N A-蛋白质-核糖体”三元复合体,最后通过常规的免疫学检测方法,通过固相化的靶分子直接从三元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体,再利用R T-P C R扩增,经过多次循环过程,最终筛选出高亲和力的目标分子。
该技术克服了其他一些蛋白质筛选技术(如噬菌体展示)的局限性,如:需转化细菌或真核细胞,因效率不高而降低库容,减少抗体多样性等,并避免了宿主随细胞基因组复制过程中可能丢失而产生的库容下降,同时亦解决了因抗体筛选条件不利于宿主细胞生存而导致抗体丢失这一难题。由于该技术是在体外翻译,体外筛选的特点,大大缩短了实验周期,省时省力,方便快速。
1.3.2 基因工程小鼠制备全人抗体 制备全人抗体的基因工程小鼠包括人外周血淋巴细胞-严重联合免疫缺陷小鼠(h u-P B L-S C I D小鼠)、转基因小鼠和转染色体小鼠制备人抗体技术。H u-P B L-S C I D 小鼠是将已产生一定免疫反应的供者或癌症患者的人的外周血淋巴细胞移植于严重联合免疫缺陷小鼠(S C I D),经抗原免疫后可获得人源抗体。转基因小鼠:转基因小鼠技术就是将外源D N A导入到小鼠基因组中,建立小鼠基因组中带有外源基因的遗传性小鼠突变模型的方法和技术。转基因小鼠制备人抗体的优点是,其功效优于其它生产抗人体蛋白单抗技术。不足之处:(1)由于抗体是在小鼠体内装配,因而产生的单抗具有鼠糖基化模式,所以这些单抗最终并不是全人的;(2)转基因通常有体细胞突变和其它独特的序列,导致不十分完全的人序列;(3)转基因小鼠表达的人I g多样性较少,而且在同一小鼠中不能够产生I g G各亚类;(4)由于转基因小鼠片断较小,仅有30K b,使抗体应答不足以满足抗原具有多样性。转染色体小鼠:通过微细胞介导法(M M C T方法)将人14号染色体上产生I g H的胚系片段和2号染色体上5～50M b的κ轻链片段转染到E S细胞,获得小鼠经人血清白蛋白免疫之后,可产生抗人血清白蛋白的人I g,再次免疫后产生I g M。由转染色体技术得到的小鼠,表达的人I g G各亚类的量与人血清中表达的I g G各亚类相同,且可同时在一个转基因小鼠内表达;但是,转染色体小鼠导入的人I g片断虽然比较大,但其表达的人I g量却比较低。
2 单克隆抗体在临床上的应用
2.1 用于疾病诊断方面 利用单抗进行疾病的诊断现已被广泛应用。(1)可用以检测淋巴细胞表面分子,以区分不同分化阶段的淋巴细胞,用于鉴别淋巴细胞。(2)可用于鉴定病原体,准确诊断感染性疾病[8]。将病原体的抗原分离,再同骨髓瘤细胞杂交建立相应的杂交瘤细胞株,分泌单克隆抗体,可以同病原体发生特异性的抗原-抗体反应,通过免疫荧光试验或E L I S A试验对疾病进行诊断。(3)可以用于肿瘤的诊断和分型。某些单抗具有在肿瘤部位蓄积的特性,可用于肿瘤的诊断。目前已批准使用的诊断剂有:用于结肠癌的v o t o m a b和a r c i l u m o n a b,用于探测感染部位的s u l e m a b,用于卵巢癌的i g o v o m a b,用于黑色素瘤的t e c n e m a bK-1。(4)激素类单抗可用于测定体内激素含量,判断内分泌的功能状态[9]。
2.2 用于疾病的治疗 目前利用单抗对疾病进行治疗已取得了很大的成果,主要是将单抗同药物耦联,再与病原体或肿瘤的特异抗原结合后发挥作用。
2.2.1 抗细胞表面分子单抗,可抑制同种免疫反应,主要用于移植排斥反应的防治。莫罗单抗(m u-r o m o n a b-C D3,O r t h o c l o n e O K T3)是F D A批准用于肾移植病人防止异体排斥反应的第一只鼠源型单克隆
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抗体[10]。
2.2.2 抗细胞因子单抗,可抑制自身免疫反应,主要用于自身免疫性疾病的治疗。单克隆抗体通过清除激活的细胞、阻滞其功能、或将升高的促炎细胞因子水平降至正常而抑制过度的免疫病理学反应。如T N F阻滞剂,用于治疗类风湿性关节炎[11][12]和节段性回肠炎取得了较好的效果。阿达木单抗(A d a l i-m u m a b)是继伊那西普(e t a n e r c e p t)和英夫利昔单抗(i n f l i x i m a b)之后第三代T N F-α拮抗剂,法国生产的,是最新研制的用于治疗类风湿性关节炎的单克隆抗体[13]。
2.2.3 抗肿瘤单抗,可用于肿瘤的导向治疗。第一个获准用于癌症治疗的嵌合型I g G-1单克隆抗体是r i t u x i m a b(M a b t h e r a),其作用标靶为C D20(即在前B 淋巴细胞和成熟B淋巴细胞上的跨膜蛋白)。多中心临床研究显示,本品能有效治疗复发的低度滤泡型非何杰金淋巴瘤[14]。
2.2.4 抗血小板治疗。糖蛋白I I b/Ⅲa受体拈抗剂能阻滞血小板活化和聚集的最后共同途径,作为急性治疗药物有明显疗效。这类拮抗剂中阿昔单抗(a b c i x i m a b,R e o P r o)是第一个通过临床评价的,E P I C 临床研究证实,本品能显著降低血管成形术高危病人缺血性并发症的发生率[15]。
2.2.5 单克隆抗体在用于免疫治疗时的局限性。2.2.5.1 单克隆抗体的特异性:由于肿瘤特异性抗原较少,缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗,而且有些对正常组织也有交叉反应。
2.2.5.2 异种抗体反应:鼠源性单抗用于人体,仍然是一种异体物质,可导致机体产生异源性超敏反应。
2.3 用作研究工具 单克隆抗体及制备技术在抗原的分析纯化、抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离和人工抗体和疫苗的制备、诊断技术、酶抑制剂的研究开发、多肽药物的研制等生物技术研究的不同领域得到了应用,并对这些领域产生了深远的影响。
3 展望
单克隆抗体的这些特征使它成为未来治疗学上研究的热点。在过去的三十年里,从鼠源性单抗到全人源性抗体,单抗在制备技术上取得了较大的进展。鼠源性单抗的免疫源性导致机体产生一系列的急性反应,使药物的功效降低。全人单克隆抗体是制备单克隆抗体的一种新技术。它减少了鼠基因序列,减少了抗抗体反应,提高了单克隆抗体的功效和安全性。而且,当前全人源性单克隆抗体技术的灵活性,可以选择发挥单抗最优的药动学和药效学特性。在未来的几年里,全人源性单抗将作为一种新的产物更多地用于疾病的诊断、治疗及研究。
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收稿日期:2007-11-27
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单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针
对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
小球藻的开发应用进展 王敬 (南通大学，海洋技术) 摘要：小球藻（Chlorella）为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是一种高效的光合植物，以光合自养生长繁殖，分布极广。细胞内含有丰富的蛋白质、维生素、矿物质、食物纤维、核酸及叶绿素等，是维持和促进人体健康所不可缺少的营养素，随着生物技术的迅速发展，小球藻也得到了广泛的应用。本文通过介绍小球藻在食品、饵料、医药、环保及工业应用等方面的应用，说明小球藻是一种重要的微藻资源，有广阔的应用前景。 关键词：小球藻；食品；医药；环保；工业应用 The application and development of Chlorella Wang Jing (Nantong university, Marine technology) Abstract: Chlorella gate of green alga chlorella is naturally unicellular green algae, is a kind of efficient photosynthesis of plants, grow in photosynthetic, widespread. Cells are rich in protein, vitamins, minerals, dietary fiber, nucleic acid and chlorophyll etc., are necessary to maintain and promote human health nutrients, with the rapid development of biotechnology, chlorella has been widely used. In this paper, by introducing the chlorella in food, bait, medicine, environmental protection, and the application of industrial applications, shows that chlorella is a kind of important micro algae resources, has broad application prospects. Keywords:Chlorella ; food ; medicine ; environmental protection ; industrial applications 小球藻(Chlorella)为绿藻门普生性单细胞藻类，是第一种人工培养的微藻。
单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫
小球藻在水产养殖上的应用 小球藻（Chlorella vulgaris）为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是一种球形单细胞藻类，直径3-8微米，是地球上最早的生命之一，出现在20多亿年前，是一种高效的光合植物，以光合自养生长繁殖，分布极广。 小球藻为单细胞藻，常单生，也有多细胞聚集。细胞球形、椭圆形，内有一个周生、杯状或片状的色素体。无性繁殖，每个细胞可以产生2、4、8或16个似亲孢子，成熟时母细胞破裂，孢子逸出，长大后即为新个体。细胞内的蛋白质、脂肪和碳水化合物含量都很高，又有多种维生素，可食用和作为饵料。 目前世界上已知的小球藻约10种，加上其变种可达数百种之多。小球藻广泛分布于自然界，以淡水水域种类最多；易于培养，不仅能利用光能自养，还能在异养条件下利用有机碳源进行生长、繁殖；并且生长繁殖速度快，是地球上动植物中唯一能在20小时增长4倍的生物，所以其应用价值很高。我国常见的种类有蛋白核小球藻、椭圆小球藻、普通小球藻等。 小球藻在水产养殖的功效 1、在养殖初期，将小球藻和肥料同时使用，起到快速肥水的作用。高温期可单独使用小球藻，也可与枯草芽孢杆菌或者EM菌同时泼洒使用，调节水质，降低氨氮、亚硝酸盐，抑制蓝藻，改善水体环境。 2、提供单胞小球藻源，进入养殖水体后可迅速繁殖，形成以单细胞小球藻为优势种群的水体，为鱼、虾、蟹、贝等各类水生动物构筑良好的生活环境。
3、小球藻能够提供丰富、均衡的天然营养素，含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质、叶绿素、藻多糖、核酸等。这些营养成分有助于提高防病能力和抵抗力。 4、小球藻具有较高的营养价值，可作为虾蟹贝幼苗的开口饵料，滤食性鱼类的的直接饲料，促进生长、降低成本，提高水产动物的成活率。 5、可以更好的进行光合作用，增加水体溶氧，大大减少缺氧浮头的可能。 小球藻在水质处理方面的应用案例 应用前：水质清瘦，透明度50cm以上（图1），晴天上午9点指标检测为：溶氧3.31mg/L，水温23.5℃，pH值7.8，氨氮0.4，亚硝0.15，藻相镜检（图2）：基本上没有藻类，无浮游动物。 解决方案：晴天上午9点使用小球藻1kg/亩，第二天使用硅藻旺1kg/亩+EM菌1kg/亩，在中午11点至下午13点开增氧机2小时。 处理后：第三天水体透明度至40cm以内，水色呈现淡绿色，第三天，水体透明度至30cm 以内，水色呈现绿色，第四天，水体透明度在20cm左右，水色呈现绿色（图3）。第四天上午10点指标检测：溶氧6.05mg/L，水温24.6℃，pH值8.3，氨氮0，亚硝0。藻相镜检：以小球藻为主，部分硅藻（图4）。
单克隆抗体药物研究新进展 单克隆抗体药物，俗称“生物导弹”，是一种具备疾病治疗靶向性治疗的药物，该种药物针对一些对应疾病的治疗具备极强的治疗针对性，往往可以取得较为有效的治疗效果，其整体所占市场份额也比较大。该领域的药品已经慢慢成为一种治疗疾病的主流药物，随着相关研究人员的不断研究推进，其整体呈现一种不断拓宽化的发展。本文从单克隆抗体药物整体的市场情况、靶点及技术三个方面进行全面的研究探索。 标签：治疗性抗体；上市抗体药物；靶点；技术综述 抗体药物的第一次应用是于十九世纪，采用血清疗法针对患者进行相关治疗，在这个阶段人们对抗体药物的认知停留在使用有效的阶段；随着医疗实力的不断发展，直到1975年杂交瘤技术之后，才逐步实现了抗体的更为全面的认知及大规模量产的过程。现阶段随着社会的不断发展，疾病种类也越来越多，治疗起来也越来越麻烦，在这样一种大的背景下，单克隆抗体药物的全面研究和使用，有效的帮助患者进行疾病的靶向治疗和恢复。 一、抗体药物的市场情况 抗体药无是一种具备靶向性，能实现与靶抗原特异性结合来实现对疾病针对性治疗的药物，该种药物在进行使用的过程中，对患者的病症能做到针对性的治疗，具备治疗过程中的安全性治疗及快速准确性治疗。该种药物常常作用与一些恶性肿瘤及免疫性疾病的治疗。因为这些疾病都具备一定的治疗难度，故此药物的出现，可以有效的实现对症治疗，帮助患者进行相关疾病的缓解，因为这样的一种原因，导致在进行相关应用的过程中，该种药物得到了巨大的发展[1]。现阶段，单克隆抗体药物已经成为一种在市场上占据巨大份额的药物，其具备巨大的经济效益，同时帮助患者进行各种疾病的治疗和恢复，其整体已经成为针对疾病进行治疗的有效思路及理论。针对该种药物的扩展，主要是针对一些靶向性进行全面的研究，研究出新的靶点，制造出更多针对更多病症的单克隆抗体药物。 二、靶点研究进展 单克隆抗体药物具备一对一的治疗针对性，其靶点的把控是针对疾病治疗的重要点。世界范围之内，针对新靶点的研究如火如荼。针对热点靶点的研究，主要通过分析世界范围内患者的病症及发病几率进行全面的分类研究，研究出一些有效且具备普遍性的靶点，全面促进单克隆抗体药物的研究和发展。其现阶段世界主要研究靶点分以下几类。 （一）PD-1、PD-L1 PD-1是一种存在于T细胞表面的免疫抑制跨膜蛋白，主要针对癌症进行相关治疗，其主要作用有两点：1.针对慢性感染炎症进行相关限制；2.针对癌症中
第四章单克隆抗体与基因工程抗体制备技术 本章考点 1.概念 2.杂交瘤技术基本原理 3.杂交瘤抗体的制备技术 4.基因工程抗体 由杂交瘤细胞产生的针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。其理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、且来源容易。 传统的方法是将抗原注入动物，由动物体内B细胞产生的抗体。由于多数天然的抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞产生针对某一抗原决定簇的抗体。因此，将抗原注入机体后，刺激多个B细胞克隆所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称为多克隆抗体（PoAb）。 第一节杂交瘤技术基本原理 单克隆是指利用在细胞融合基础上的B细胞杂交瘤技术。 杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。 一、B细胞杂交瘤技术 1.细胞的选择和融合：杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异性的单克隆抗体，所以融合一方必须是经过抗原免疫的B细胞，通常选用被免疫动物的脾细胞，脾淋巴细胞的主要特征是抗体分泌功能。融合细胞另一方则要求在培养条件下的永生性，只有肿瘤细胞才是具备这一条件，所以选择同一体系的骨髓瘤细胞，因多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，其特点是稳定易培养、自身不分泌免疫球蛋白及细胞因子、融合率高、是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株，是理想的脾细胞融合对象。 2.选择培养基的应用：细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以取三者的字头称为HAT培养基。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷是细胞DNA合成的途径；氨甲蝶呤（A）是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合作用的瘤细胞是经毒性培养基选取出的缺乏HGPRT细胞株，不能在该培养基上生长，只有融合细胞具有亲代双方遗传性能，才能在HAT 培养基上长期存活与繁殖。 3.有限稀释与抗原特异性的选择：细胞融合是一个随机的过程，需在融合细胞抗体筛选的基础上进行特异性筛选。将融合细胞进行充分稀释，进行克隆化处理，再将阳性细胞进行再次克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株进行增殖，再进行冰冻，体外培养或动物腹腔接种。
单克隆抗体制备方法 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。 主要仪器设备： 超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。 方法 动物的选择与免疫 1. 动物的选择 BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2. 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。
应用科技 小球藻的应用研究进展 单俊秀张平刘丽丽 (天津师范大学化学与生命科学学院，天津市300374) {}|。。’。。’…’1。jl|2 11，。。r? ¨……’。。。。。?。…?j’。“。4”j。’j j。j”j””?“j j…???。j’”?2、 ：?嘲要]小球藻是单细胞真核藻，细胞内含有多种营养物质。随着生物技术的迅速发展，有大量关于小球藻的研究工作被报道。本文通过，?，介绍小球藻在食品、饲料、饵料、医药、环保等方面的应用，说明小球藻是一种重要的微藻资源，有广阔的应用前景。 i呋键词]小球藻；保健食品；饵料；医药；环保， 小球藻为绿藻门【Chl or ophyt a)、绿藻纲、绿球藻目(C hl oro—cocCal es)、小球藻属(Chl or el l a)球形、普生性～般为聚集成群的单细绿藻，是第一种进行人工培养的微藻。小球藻比表面积大光合效率高，含有多糖、蛋白质、细胞色素、不饱和脂肪酸和生长因子等多种丰富的营养物质，是一种有重要意义的藻类具有广阔的开发利用前景，受到各国研究者的青昧。 1小球藻在食品、饲料、饵料方面的研究进展 L1小球藻应用。卜鑫品方面 小球藻包括海洋小球藻与淡水小球藻，其有高含量的维生泰如C、A、B，矿物元素钙、钾、碘、铁，小球藻特殊的细胞生长因子，还含有高达50％左右的粗蛋白。目前人们重视小球藻在保健食品方面的应用，开发出了如酶解小球藻保健饮料、小球藻豆腐、小球藻胶囊等。 12小球藻应用于饲料添加剂 小球藻具有耐酸性、耐抗生素和比一般微生物制剂热稳定性高的特点，因此小球藻可用于动物饲料添加剂一方面可以为动物提供多方面的营养物质，另一方面小球藻在动物体内可直接杀灭细菌，增强动物免疫性，长期使用，利于动物的生长发育j 13饵料方面的应用 小球藻可作为水产品的天然饵料，研究表明接种在养殖水体中可调节优化浮游生物的群落结构，降低水体中氨、磷的浓度，增加溶解氧，改善水体的化学环境条件，达到防病的目的。目前资料显示小球藻作为轮虫的首选饵料，能够增加轮虫体内的EPA和D H A的含量，而这两种物质对水产品如鱼、虾等的生长发育有重要的作用。 2小球藻药理作用 21凝集素 凝集素是一类能与糖类专一结合并具有细胞凝集活性的蛋白质与糖基结合时不需要糖分子的还原碳原子具有游离的羟基。郑恰，余萍等从蛋白核小球藻藻粉中分离纯化出了蛋白核小球藻凝集素(C PL)，经鉴定对兔、绵羊及鸽子红细胞有凝集作用掷怡等，2003)。 22抗肿瘤 小球藻，含有丰富的蛋白质，可以作为免疫激活剂具有抗肿瘤作用。汪炬等将小球藻提取物C E作用于动物肿瘤肉瘤细胞和肝癌H C A 腹水瘤，发现C E对这两种细胞有较强的杀伤力(汪炬等，2004)。 23生长因子 小球藻生长因子《Chl orel aG r ow t hFac t or，CG F)又称小球藻精，可以提高机体的免疫力和抗感染能力，还能防治胃溃疡、高血压和心血管等疾病。小球藻具有抑制脂肪吸收和刺激高脂食品排泄的作用，可用于防治包括高血脂症在内与脂肪过剩有关各种疾病。 24抗生素 近年来的研究表明，许多微藻中含有对其他微藻、细菌、真菌、病毒或原生动物有割生的抗生素物质。据报道小球藻细胞内也含有刘以抗生素。江红霞等从蛋白核小球藻中提取脂溶性化合物，进行了抗细菌和抗真菌活性实验，说明此脂溶性化合物的粗提物对真菌的抑制涮生明显大于对细菌的抑制活性(江红霞等，2003)。 25抗氧化 机体新陈代谢产生的自由基包括羟基自由基、超氧阴离子自由基等能对人体组织造成损伤，从而导致许多疾病的发生。小球藻中含有的叶黄素(L ut e i n)和蛋白质具有抗氧化作用。韩春然等研究7圆形海水小球藻异养培养的最佳生长条怖发酵生产叶黄素的条件为产生叶黄紊的最佳条件是B G—I I培养基中葡萄糖浓度1O g／L，尿素浓度O．59，L，培 养基初始Ph7．0'28℃下培养，叶黄索可以达到1．45m g／g，认为高细 胞浓度培养小球藻生产叶黄寨是=-J：f5的(韩春然，2007)。 3小球藻基因工程方面的研究进展 小球藻一方面培养简单、生馅幽枣、无毒无害、培养成本低廉，另 一方面能对蛋白质等肽类物质进行正确的加工修饰弥补了大厂杆菌原核 细胞生物反应器的特点，可以作为真核生物反应器应用于基因工程。王 义琴等以小球藻为载体成功表达了正常活性的兔防御素N P～，为实现 产业化奠定了基础【王义琴等，2001o 4小球藻在环保上的应用 重工业的飞速发展，人口数量过多带来的各方面环境污染，严重 影响到人1门的健康，威胁着人类的生存。随着科学技术的发展越来越多 的国家希望能够通过生物技术寻求一种成本低高效率的治污方式。小球藻在治理污染方面业发?省重要作用。 4．1清除重金属离子 藻类可以吸收富集水体中的金属，并加以回收和利用并具有原料 廉价易得、不产生二次污染、吸附容量大、应用范围广等优点。据文献 报道小球藻可以对以下金属离子有清除作用：固定化小球藻去除Cp的 研究、C u2+、C d2+、Z n2％小球在在治理水体污染方面有广阔的应用前景。 42降解原油 陶永华等通过实验证明普通小球藻和蛋白核小球藻具有降解原油 的能力，普通小球藻降解原油的能力最强，对于18．4m L含油污废水， 降解去除率高达94％一95％，实验还表明，单种藻株降解原油的能力 比混合藻株好。普通小球藻可作为净化含油污废水的材料深入进行应用 研究(陶永华等，2006)。 5小球藻的研究前景与展望 小球藻光和作用很强，细胞内含有多种营养物质，未来在开发小 球藻的健康食品、保健和药学功能，从实验转向产业化生产方面，小球 藻等藻类生物的开发利用有着广阔的前景，工厂化生产人类的优质天然 绿色食品即将成为现实。 [参考文献]7【1】郏怡．余薄，划艳如蛋白核小球藻凝粜素的分离纯化及部分性质研究Ⅱ】．i 水生生物学报3003． {21汪姬确含林，头岸等、蛋白核小球藻提取物的抑瘤作甩及对免疫功能的 影驹硎营养学报，2004．? 13】3i E-．红霞，郑怡．林雄平蛋白核，j球藻脂溶性化合物的抑菌活性及成分分7析【11植物资糖与环境学报．2003． 【4】陶永华，殷明．伍俊荣．高效原油降解小球藻株用于7由污废水净化的实验／研究U j海军医学袭吉，20067 233
浅谈单克隆抗体药物 摘要：单克隆抗体药物是生物医药领域中最耀眼的明珠。该类药物具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，代表了药品治疗领域的最新发展方向，在肿瘤、自身免疫性疾病的治疗手段不断升级过程中，单抗药物扮演着不可替代的角色，已经成为全球靶向治疗药物的主流。在刚刚兴起的细胞免疫治疗中，单抗药物同样是位列第一的品类，单抗产业是目前乃至未来医药行业中极具投资价值的细分行业。本文从单克隆抗体简介，常见的单克隆抗体药物、国内外单克隆抗体药物的研发现状，及对单抗药物的展望几个方面做一简介。 关键词：单克隆抗体单抗药物研发现状 1单克隆抗体 抗体是由B淋巴细胞转化而来的浆细胞分泌的，每个B淋巴细胞株只能产生一种它专有的、针对一种特异性抗原决定簇的抗体。这种从一株单一细胞系产生的抗体就叫单克隆抗体，简称单抗。这些抗体具有相同的结构和特性。抗体与特异性表达的肿瘤细胞表面蛋白质结合，从而阻碍蛋白质的表达，起到抗肿瘤作用。抗体还可使B淋巴细胞产生免疫反应，诱导癌细胞凋亡。早期单抗为鼠源性单抗,易被人体免疫系统识别，应用受到限制。后来采用基因工程的方法生产人源或人鼠嵌合型单抗，广泛应用于临床。 2常见的单克隆抗体药物 2.1利妥昔单抗（Rituximab）-美罗华-CD20单抗 第一个被美国食品药物管理局（FDA）批准用于临床治疗的单抗，是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，能特异性地与CD20结合，导致B淋巴细胞溶解的免疫反应，抑制其增殖，诱导成熟B淋巴细胞凋亡和提高肿瘤细胞对化疗的敏感性。90%以上的B淋巴细胞淋巴瘤细胞均有CD20表达，不表达于非定向干细胞或浆细胞。本药可使耐药淋巴瘤细胞对VP-16、顺铂重新敏感，用于CD20表达的复发或化疗耐药的惰性B淋巴细胞淋巴瘤，有效率46%。利妥昔单抗+CHOP 方案为治疗弥漫大B淋巴细胞淋巴瘤标准方案，可使全完缓冲（CR）率、生存时间明显延长[2-3]。 2.2曲妥珠单抗-赫赛汀-HER-2单抗 为重组DNA人源化的抗p185蛋白（癌基因）单克隆抗体-IgG抗体。进入人体后能选择性地与由细胞核内表皮生长因子2基因调控的p185糖蛋白结合。本
单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合
生物吸附剂的应用及研究进展 含重金属废水是对生态环境危害极大的一类污染源。重金属进入环境后不能够像有机物那样能够被生物降解，且大多参与食物链循环，并最终在生物体内积累，破坏生物体正常生理代谢活动，危害生物体健康[1,2]。另外，我国又是水资源相对匮乏的国家，我国每年缺水超过300亿吨[3]。因此，水污染防治及废水回用越来越受到人们重视。因此，如何有效地处理重金属废水，回收贵重金属已经成为当今环保领域中的一个突出问题。 虽然重金属离子对生物体有很强的毒害效应，超过一定的浓度后，就会对生物体产生不良的影响，抑制生物生长或使生物体死亡，但是有的微生物，如某些藻类、细菌、真菌等等本身或是经过驯化以后对重金属有一定的耐受性，甚至失活的微生物体，也能够除去水中的重金属离子。利用微生物体作为吸附剂进行废水处理或回收金属的来源十分广泛，具有良好的经济效益。 1 生物吸附剂的来源 1.1藻类生物吸附剂 全球已知的藻类约4万种。多数情况下，藻类的细胞壁是由微纤丝形成的网状结构，含有丰富的多糖，如果胶、木糖、甘露糖、藻酸或地衣酸，这些多糖一般带负电荷，可以通过静电引力与许多金属离子相结合，因而，藻类对大多数重金属都有很强的吸附能力[6]。海草arrassum能够积累去除水中的Cd和Cu，Zn 等重金属[7,8]；而Scenedesmus obliquus对UO22+最大吸附容量可达75mg/g干物质，能够使水中的铀浓度从5.0降至0.05mg/L，与Cu2+、Ni2+、Zn2+、Cd2+之间的竞争也很小[9]；绿微藻(Tetraselmis chui)在悬浮状态下能够吸附Cr[10]；一些大型海藻的吸附容量比其它种类生物体高得多，甚至比活性炭、天然沸石的吸附容量还高，与离子交换树脂的相当[11,12]。 1.2真菌生物吸附剂 真菌在自然界中分布很广。现已记载真菌约有12万种，其中大多数都应用于工业生产。它们的细胞壁含大量几丁质和葡聚糖，对重金属具有吸附能力[13,14]，利用其来吸附去除污水中的重金属，不仅可以节约处理费用，还可以达到以废治废的目的。 酿酒厂的废菌体啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，可吸附多种重金属离子和放射性核素，水中的一些常见的离子K+、Na+、Ca2+、Mg2+及盐度对吸附的影响很小或不影响[15-20]；曲霉属的一些真菌菌株多种重金属和放射性核素的吸附效果也好，如酱油曲霉(Aspergillus sojae)对Pb2+和Cd2+的吸附率为69.76%和72.28%，米曲霉(Aspergillus oryzae)为60.64%.，81.34%[21]；烟曲霉(Aspergillus fumigatus)能够很快地从水溶液中去除U(Ⅳ)，Fe2+、Fe3+、Ca2+、Zn2+的存在对它的吸附去除无影响[22]，在脂肪酶生产产生的废弃菌丝体Aspergillus terreus显示了良好的铜吸附容量并且不受竞争离子的影响[23]；无花果曲霉(Aspergillus ficuum)对铅的吸附率可达92.44%[24]；黑曲霉(Aspergillus niger)对241Am有很好的吸附选择性，其吸附率均高达96%，即使溶液中的金、银浓度较241Am高2000多倍，对其吸附也无明显影响，当它生长在含金属氮化物的金矿废水中时，它可通过细胞表面的吸附作用而积累金、银、铜、铁、锌[25]；根霉属(Rhizopus)的菌株对大多数的金属也有良好的吸附效果。根霉(Rhizopus oligosporus)进行固定化后，对Cd的最大吸附量为34.5mg/g，为非固定化的一倍[26]；少根根霉(Rhizopus arrhizus)铅有高吸附容量，而且是一种很有前途的处理核工业放射性废水的吸附剂[27~29]。黑根霉(Rhizopus nigricans)能快速地吸附多种金属离子，最大吸附容量为140到160mg/g干重[30]。 1.3 细菌生物吸附剂 细菌是地球上最丰富的微生物，其总生物量占地球总生物量的大部分，其细胞壁的化学组成为肽聚糖，含丰富的羧基和氨基。因此细菌与重金属表现出很强的吸附能力。 地衣芽孢杆菌((Bacillus licheniformis)R08对吸附Pd2+时，45min吸附量可达224.8mg/g[33]；Bacillus polymxa对铜有潜在的吸附能力[31,32]。一些芽孢杆菌，如Bacillus pumilus、Bacillus cereus等，对Ce2+，Co2+、Th4+、U4+等重金属离子具较高亲合性[34]。 假单孢杆菌菌属(Pseudomonas)的一些微生物能抵抗Cu2+的毒性，并对Cu2+有较好吸附能力[35]；Pseudomoas sp.GX4-1的发酵液经乙醇沉淀后得到的吸附剂WJ-I含多糖和蛋白质等成分，能吸附水溶液中的Cr6+，吸附率最大可达98%，最大吸附量达9.34mg/g[36]。
2009年第1期畜牧兽医科技信息国兽医科学,2007,37(1):29-32 [9]李余动,等.胶体金免疫层析法快速检测氯霉素残留[J].中国食品卫生杂志,2005,17(5):416-419 [10]张明,等.免疫胶体金法检测磺胺甲恶唑残留的研究[J].中国兽药 杂志,2006,40(4):17-24 [11]邓省亮,等.胶体金免疫层析法快速检测黄曲霉毒素B1的研究 [J].食品科学,2007,28(2):232-236 [12]Sun Xiulan,et al.Preparation of gold-labeled antibody probe and its use in immunochromatography assay for detection of aflatoxin B1[J].International Journal of Food Microbiology ，2005，99(2):185-194 [13]赖卫华,等.应用胶体金试纸条快速检测赭曲霉毒素A 的研究[J]. 食品科学,2005,26(5):204-207 [14]Timo Klewitz,et al.Immunochromatographic assay for determina tion of botulinum neurotoxin type D[J].Sensors and Actuators B:Chemical,2006,113(2):582-589 1975年德国学者Kohler 和英国学者M ilstein 发明了杂交瘤技术。他们成功地将骨髓瘤细胞和产生抗体的B 淋巴细胞融合为杂交瘤细胞，这种合成的杂交瘤细胞稳定、有致瘤性、能产生抗体，其分泌的抗体是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体，故称之为单克隆抗体(简称单抗)。自从鼠源单抗之后，单抗历经了鼠源性抗体、嵌合抗体、 人源化抗体、人源性抗体4个发展阶段。近年来随着分子生物学和细胞生物学的发展，单克隆抗体的应用已日益普及，单抗理论几乎应用到生物学研究的每一个区域。单克隆抗体制备技术的发展也就显得尤为重要。1 单克隆抗体的研究进展 1.1鼠源性单抗自单克隆抗体制备技术问世以来，制备单抗的一般程序基本相同，从超免疫的供体中即抗原免疫的小鼠，获取脾细胞，再与骨髓瘤细胞融合，最后对单个细胞进行克隆，培养出能分泌单抗的克隆细胞。目前生产的单抗大多是鼠源性的，但其在临床应用方面还存在着很大的弊端，主要是鼠源单抗与NK 等免疫细胞表面Fc 段受体亲和力弱,产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)作用较弱，而且它与人补体成分结合能力低,对肿瘤细胞的杀伤能力较弱，并且鼠源性抗体在人血循环中的半衰期短，它发挥AD-CC 作用的时间较短； 其次鼠单克隆抗体还具有免疫原性，使宿主易引起过敏反应。这样一方面降低了单抗的效价，另一方面又会给病人带来严重的后果。因此鼠源性单克隆抗体还应进一步改善才能广泛应用于临床。 1.2嵌合抗体抗体的恒定区是抗体分子结构中免疫原性 最强的部位，而决定抗体特异性的是抗体的可变区。从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig 恒定区的基因连 接,再插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。也就是将鼠源性单抗在保留其抗原结合活性的基础上，尽可能的去除鼠源化部分或代之以人源化片断，减少了鼠源性抗体的免疫原性，从而尽可能的减少单抗的异源性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。但是这种抗体仍保留了30%的鼠源性，可诱发人抗小鼠反应(HAM A)。 1.3人源化抗体由于嵌合抗体异源性仍然很大，因此需要对鼠源抗体进行人源化改造，进一步人源化的方法很多,主要是重构抗体和表面重塑技术。重构抗体就是互补决定区(complementarity determining region,CDR)移植，将鼠抗体的CDR 移植到人抗体的相应部位，这样人源化程度可达90%以上，目前该方法是人源化单抗最常用、最基本的方法。而表面重塑技术，即将鼠抗体框架区表面氨基酸的残基(surface amino acid residues,SAR)进行人源化改造。该方法是仅替换与人抗体SAR 差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换。 1.4人源性抗体虽然人源化抗体解决了鼠抗体的免疫原 性等问题，但生产人源化抗体仍有很大的困难；人源化过程需大量繁复、昂贵的电脑模拟，需取代不同的氨基酸以恢复选择性和亲和力，工作量非常大，并且它总还含有少量鼠源性成分。完全的人源性抗体才是用于治疗的理想抗体，目前它主要通过3种途径来研制：噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术和转基因小鼠制备人源性抗体。1.4.1 噬菌体抗体库技术 噬菌体抗体库技术是迄今发展 最成熟、 应用最广泛的抗体库技术。其基本原理是将蛋白分子或肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA 中,与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白,从而使该异源分子呈现于噬菌体表面。通过这种方式,形成了一个收藏上亿个以体外方式制得的不同抗体的基因数据库,使从任何真实的抗原中迅速分离高度相似的同族抗体成为可能。分离得到的抗体可用于 单克隆抗体及其应用的研究进展 孔 维1，杨文辉2 （1.东北农业大学动物医学院，哈尔滨150001；2.哈尔滨北方森林动物园，哈尔滨150300） 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000作者简介：孔维（1979～），湖南平江人，硕士研究生 专论与综述 9
修美乐阿达木单抗中文说明书
HUMIRA(阿达木单抗[adalimumab])注射剂，皮下用溶液使用说明书3月修订版美国初始批准：12月31日；公司：ABBOTT 译自：http://.org/pdf2html/view_online.php?url= 修改史03/14/ 补充；02/25/ 补充09/29/ 补充 07/29/ 补充04/08/ 修改说明书11/18/ 补充02/21/ 补充01/18/ 补充09/05/ 补充07/30/ 补充02/27/ 0089 补充02/16/ 补充 11/09/ 0071补充 11/09/ 补充08/28/ 补充10/03/ 补充10/03/ 补充 07/30/ 补充06/18/ 补充；12/31/ 批准 处方资料重点这些重点不包括安全有效使用HUMIRA所有资料。请查阅下文HUMIRA完整处方资料。
最近重要修改---以红色表示修改部分黑框警告3/ 剂量和给药方法，克罗恩氏病(2.3) 3/ 剂量和给药方法，监视评估安全性(2.5) 3/ 警告和注意事项，严重感染(5.1) 3/ 警告和注意事项，恶性病(5.2) 3/ 警告和注意事项，神经学反应(5.5) 7/ 警告和注意事项，与阿巴西普使用(5.11) 3/ 适应证和用途HUMIRA是一种肿瘤坏死因子(TNF)阻断剂适用于治疗： 类风湿样关节炎(RA) (1.1)在有中度至严重活动性RA成年患者中减轻征象和症状，诱导主要临床反应，抑制结构损伤进展，和改进机体功能。 幼年特发性关节炎(JIA) (1.2)
在4岁和以上儿童患者中减轻中度至严重活动性多关节JIA的征象和症状。 银屑病关节炎(PsA) (1.3)在活动性PsA成年患者中减轻征象和症状, 抑制结构损伤进展，和改进机体功能。 强直性脊柱炎(AS) (1.4)活动性AS成年患者中减轻征象和症状。 克罗恩氏病(CD) (1.5)在有中度至严重活动性克罗恩氏病对常规治疗反应不充分的成年患者中减轻征象和症状和诱导和维持临床缓解。如这些患者还对英夫利昔单抗[infliximab]丧失反应或不能耐受减轻征象和症状和诱导临床缓解。 斑块性银屑病(Ps) (1.6)中度至严重慢性斑块性银屑病成年患者的治疗，全身治疗或光疗，和其它全身治疗医学上不适宜的备选者。 剂量和给药方法HUMIRA是经过皮下注射给药。
单克隆抗体的制备、纯化及鉴定 一、实验目的： 单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。 二、实验原理： 骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。 三、试剂与器材： 细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。 四、操作方法： 1、抗原制备； 一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。 A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。
微藻利用现状综述 摘要：微藻是一类古老的原低等原核生物，其藻体内富含都中多糖、蛋白质、氨基酸维生素、类胡萝卜素、γ-亚麻酸、多种无机元素以及多种微量元素等，是一种纯天然的营养物质。其营养物质对许多疾病有防御作用，对动物、鱼虾生长和品质有促进作用，还可以净化水质等，具有广阔的前景，在医药食品、养殖饲料、化妆品、能源环境等行业都有所应用。本文从微藻营养物质的特点，在不同行业中的应用，及其在生产加工过程中存在的问题加以综述。关键词：微藻利用综述 1 微藻简介 藻类是最原始的生物之一，广泛存在于海洋、淡水湖泊等水域，通常呈单细胞、丝状体或片状体，结构简单，整个生物体都能进行光合作用，所以光合作用效率高，生长周期短、速度快。藻类按大小可分为大藻（如海带、紫菜等）和微藻[1]。微藻是一群小型藻类的总称，通常为单细胞或丝状体，直径小于1mm。微藻细胞微小，形态多样，适应性强，分布广泛，有原核藻类和真核藻类。原核藻类是指蓝藻，而蓝藻一般不产油。真核藻类包括绿藻、硅藻、裸藻、黄藻、金藻、褐藻、红藻和隐藻。 2 微藻的营养成分 多中微藻具有丰富的营养价值，其中最具代表性的是螺旋藻。螺旋藻被认为是目前常用微藻中蛋白质含量最高、营养最全面、消化吸收和适口性最好、无毒无副作用、安全性最高的藻种。既可作为蛋白质原料，又可作为食品及饲料的添加剂[2]。 微藻藻粉中含有多种成分，如蛋白质、氨基酸、多糖、维生素、类胡萝卜素、γ-亚麻酸、多种无机元素以及多种微量元素等。并且微藻细胞壁结构中纤维素极少，容易被人和动物消化吸收，越来越受到人们的关注。其营养价值特点如下： 2.1 蛋白质 微藻中蛋白质含量很高，约为40%-60%，可作为单细胞蛋白的一个重要来源，小球藻属中以蛋白核小球藻的蛋白质含量最高，一般不低于50%，明显高于常规植物蛋白源[3]。螺旋藻的蛋白质含量高达58.5%-83.4%，且蛋白质品质优良，易于消化吸收、不含任何阻碍消化吸收的因子。螺旋藻蛋白质中至少含有18种以上氨基酸，包括动物体所必需的8种必需氨基酸且含量丰富[4]。 2.2 多糖 糖类约占藻细胞干重的15%-20%，主要为多糖类。例如甘露糖、甲基糖、藻酸、鼠李糖等，尤其是藻酸、甘露醇是水产珍贵动物所必需，所含的多糖有调节和提高机体免疫力、以及抑癌和抗辐射作用[5]。