Calbiochem ?
FragEL? DNA Fragmentation Detection Kit,
Colorimetric -TdT Enzyme
目录货号QIA33
背景介绍背景介绍：：
细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在生物体进化、内环境的稳定以及系统发育中发挥着重要的作用。细胞凋亡发生在正常的细胞周期循环中，并发生形态学和生理生化的特征性改变，比如细胞皱缩，细胞间连接消失，线粒体膜电位消失，通透性改变，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA 降解成为约180bp-200bp 的片段；胞膜有小泡状突起，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍保持完整，最终凋亡细胞遗骸被分割包裹为几个凋亡小体，并迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。以上改变发生在不同的细胞凋亡阶段。
检测原理检测原理：：
在凋亡晚期细胞中，DNA 会被降解为不同大小的片段，正常的或正在增殖的细胞则几乎没有DNA 的断裂，该方法是将生物素（Biotin ）标记和未标记的dNTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT 酶）的作用下，连接到凋亡细胞中断裂DNA 片段的3’-OH 末端，然后再用亲和素（Streptavidin ）标记的HRP 与标记上的Biotin-dNTP 结合，并通过DAB 显色后用显微镜检测凋亡细胞。试剂盒对标试剂盒对标记反应进行了优化记反应进行了优化，，采用最佳比例的采用最佳比例的生物生物生物素标记和未标记的素标记和未标记的dNTP 进行3’-OH 末端的核苷酸掺入末端的核苷酸掺入，，使得同一个断裂的DNA 片段片段末端可以形成更长的末端可以形成更长的末端可以形成更长的““标记尾巴标记尾巴””，该“标记尾巴标记尾巴””减少了相邻掺入dNTP 上标记基团的空间位阻上标记基团的空间位阻，，增加每个断裂片段后的增加每个断裂片段后的标记标记标记基团数目基团数目基团数目；；同时生物素和亲和素的高亲和力也可以和力也可以提高检测灵敏度提高检测灵敏度提高检测灵敏度，，减少非特异性反应减少非特异性反应。。此外试剂盒中附有复染用甲基绿便于从形态学上分辨评估正常细胞和凋亡细胞。
检测次数检测次数：：50次
检测方法检测方法：：光学显微镜
样本类型样本类型：：石蜡包埋组织切片、组织冰冻切片、固定细胞片
种属反应种属反应：：一系列不同种属
储存与运输条件储存与运输条件：：试剂盒需用干冰运输并储存在-20℃非无霜冰箱中。第一次融化后，终止缓冲液和复染用甲基绿需放于室温储存，封闭缓冲液需放于4°C 储存。然而，再次冷冻后并不明显影响这些缓冲液的使用效果。
图1. 试剂盒检测原理图
试剂盒组分试剂盒组分：：
（1）蛋白酶K （PROTEINASE K ）：2mg/ml 的蛋白酶K 溶解在10mM Tris 溶液中（pH8.0）；用来消化细胞，增加样本的通透性。
（2）5×TdT 平衡缓冲液（5X TdT EQUILIBRATION BUFFER ）：1 M Sodium Cacodylate ，0.15 M Tris ，1.5 mg/ml BSA ，3.75 mM CoCl 2，pH 6.6；使用前需5倍稀释。
（3）生物素片段末端标记反应混合物（Biotin-FragEL TM LABELING REACTION MIX ）：3管；生物素标记和未标记的脱氧核糖核苷酸以最佳的比例混合，在末端脱氧核糖核苷酸转移酶（TdT 酶）的作用下标记DNA 片段末端。
（4）终止缓冲液（STOP BUFFER ）：0.5M EDTA ，pH8.0。
（5）封闭缓冲液（BLOCKING BUFFER ）：4% BSA 溶于PBS 溶液中。
（6）50×偶联物（50×CONJUGATE ）：50×链霉亲和素标记过氧化物酶偶联物。
（7）DAB 片：HRP 底物，0.7mg/片。
（8）双氧水/尿素片：1.6mg/片。
（9）甲基绿：0.3%复染用甲基绿。
（10）TdT 酶（TdT ENZYME ）：将标记和未标记的脱氧核糖核苷酸掺入断裂的DNA 3’-OH 末端。注意：TdT 酶在-20℃保存时不会凝固，因此不需要提前取出融化，只需在使用前迅速从-20℃冰箱中拿出取用后立即放回-20℃保存。
（11）HL-60细胞阳性/阴性对照片：提供两张相似的固定细胞甩片，都是用0.5μg/ml 放线菌素D 处理19小时的HL-60细胞，含有已诱导凋亡细胞和未凋亡细胞，可作为凋亡阳性和阴性对照。
注意：其他组分也在使用后尽快放回-20℃冰箱保存。为了避免试剂损失，使用前可以低速短暂离心融化后的试剂，然后小心开管取用。
实验准备实验准备：：
实验需用到的仪器耗材有：光学显微镜、小型染色缸、湿盒（塑料/玻璃容器与吸水纸）、冰盒、洗瓶、盖玻片、封口膜、各种规格的移液器及枪头等。
除试剂盒提供的组分外，需自备的实验试剂有：二甲苯、梯度稀释乙醇溶液（100%、90%、80%、70%）、30%过氧化氢溶液、10mM Tris 溶液（pH8.0）、TBS 缓冲液（1X TBS ，20 mM Tris pH 7.6， 140 mM NaCl ）、DNA 酶Ⅰ、1mM MgSO 4 PBS 缓冲液（选用，用于制备样本阳性对照片）、DNA 酶Ⅰ（选用，用于制备样本阳性对照片）、封片剂（如Permount ）等。
注意事项注意事项：：
为了获得最佳的实验结果，请在操作前认真阅读以下注意事项。
（1） TdT 酶在-20℃保存时不会凝固，因此不需要提前取出融化，只需在使用前迅速从-20℃冰箱
中拿出取用后立即放回保存；其他组分除封片剂外，在使用时也需放置在冰上，并在使用后尽快放回-20℃冰箱保存。为了避免试剂损失，使用前可以低速短暂离心融化后的试剂，然
后小心开管取用。避免不必要的反复冻融。
（2） DAB 溶液有潜在致癌性，在操作前必须穿戴好手套、实验服和护目镜。不要吞咽。
（3） 5×TdT 平衡缓冲液中含有的二甲砷酸盐有毒且潜在致癌，在操作前必须穿戴好手套、实验
服和护目镜。不要吞咽。
（4） 针对不同的样本类型，比如石蜡包埋组织切片，组织冰冻切片、固定细胞片等，各有不同的
操作流程，请根据实验的样本类型参考相应的操作流程。对照的HL-60细胞片需按照固定细胞片的操作流程操作。
（5） 蛋白酶K 孵育时间，DNase I 处理时间及标记反应时间需根据细胞类型，样本制备步骤摸索摸索
最适条件
最适条件。以说明书中的条件为初始参考标准。 （6） 在标记反应中，推荐使用盖片或封口膜覆盖样本，保证反应液均匀分布，并避免孵育过程中
缓冲液蒸发损失。准备覆盖膜时，可剪下一片Parafilm ?封口膜，使其稍大于样本，并将一角折起便于在接下来实验步骤中取放。
（7） 用塑料或玻璃容器及纸巾自制湿盒，在样本处理过程中使用湿盒保持样本存放环境的湿润，
一定一定避免样本干燥避免样本干燥避免样本干燥。
（8） 悬浮细胞可用以下方法固定或贴附在玻片上：4°C 缓慢离心（1000rpm ）5分钟，去除细胞培
养上清，并将细胞重新悬浮在4%的甲醛溶液（溶于1×PBS 溶液）使其终密度为1×106/ml ，室温孵育10分钟。按照上述方法离心收集细胞，去除固定液并用80%乙醇溶液以相同细胞密度重悬。固定后的细胞可以保存在4°C 。固定后的细胞（100-300μl ）可直接固定在玻片上或用Cytospin ?辅助制备细胞片。使用聚L-赖氨酸包被的玻片可以提高细胞的黏附性。
操作流程操作流程：：
一 石蜡包埋组织切片处理流程
A. 样本的样本的脱蜡脱蜡脱蜡处理处理
1、室温将石蜡组织切片放入二甲苯中浸泡5分钟。更换新的二甲苯再浸泡5分钟以彻底脱掉石蜡。
2、室温下用100%乙醇浸泡切片5分钟，更换新的100%乙醇再浸泡5分钟。
3、室温下用梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗1次，每次3分钟，逐渐增加水分。
4、用1×TBS 轻轻润洗切片，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。这时可用石蜡笔或疏水笔（Cat. #402176）在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验的每个步骤中，切勿让样品过分干燥！（如果有必要，可用1×TBS 溶液覆盖或样本或将样本置于1×TBS 溶液中保持湿润）处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。
B. 增加样本的通透性
1、按1：100的比例，用10 mM Tris 溶液（pH8.0）作为稀释液来稀释2mg/ml 的蛋白酶K 溶液，使其终浓度为20μg/ml 。每个样本需要100μL 蛋白酶K 溶液（可以将1μL 的2mg/ml 蛋白酶K 溶液加至99μL 的10mM Tris 溶液中配制而成）。
2、每个样本上滴加100μL 浓度为20μg/ml 的蛋白酶K 溶液，使其被全部覆盖，室温孵育20分钟。注意严注意严格控制孵育时间格控制孵育时间格控制孵育时间，，孵育时间过长可对细胞造成一定的伤害孵育时间过长可对细胞造成一定的伤害，，过短则可能造成透性处理不充分，影响标记效率影响标记效率。。蛋白酶K 工作液的使用浓度、处理时间及温度因组织或细胞的类型或固定方法的不同而有所不同，使用者可参照试剂盒提供的标准使用说明摸索最合适的实验条件。
3、用1×TBS 溶液润洗样本。
4、轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。
C. 样本阳性/阴性阴性对照处理对照处理
样本阳性对照实验为选做，可根据自身情况分析选做。但试剂盒提供的HL-60细胞的阳性/阴性对照片建议操作。
1、取经过预处理（已完成通透性处理）的组织包埋切片，用含有1μg/μl 的DNA 酶Ⅰ（Cat. #69164）溶液（含有1mM MgSO 4的1×TBS 溶液）完全覆盖样本，室温孵育20分钟。
2、用1×TBS 溶液漂洗。
3、轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持其湿润。
4、样本阴性对照和试剂盒提供的HL-60对照细胞片对照为建议必做实验，其处理方法与样本的处理方法相同，但在平衡和标记反应加入TdT 酶步骤时用蒸馏水替代TdT 酶。阴性对照可以使实验者参考样本中内源过氧化物酶的活性和非特异标记反应造成的显色。未诱导凋亡的阴性对照样本也非常必要，因为组织或细胞样本从制备步骤开始就一直发生着凋亡，如果固定操作过迟或是常规的机械操作都可能造成非正常的DNA 断裂，而被误测为细胞凋亡。
D. 灭活内源过氧化物酶活性
1、1：10稀释30% H 2O 2溶液（将10ul 30% H 2O 2与90ul 甲醇混合，每个样本需100ul 这样的混合物）。
2、以上述制备的100ul 3% H 2O 2溶液完全覆盖样品，室温孵育5分钟。处理时间不可过长。
3、用1×TBS 缓冲液漂洗。
4、轻轻去掉多余液体，小心干燥样品周围的玻片部分。
E. 平衡和标记反应
1、按1：5的比例用蒸馏水稀释5×TdT 平衡缓冲液（每个样本需用20μl 5×缓冲液和80μl 蒸馏水混合稀释成100μl 缓冲液）。
2、滴加100μl 1×TdT 平衡缓冲液使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育10-30分钟。或者将载玻片放入一个含有1×TdT 平衡缓冲液的缸中，保证缓冲液没过样本。在等待孵育的同时准备标记反应混合物。
3、把TdT 酶从冰箱中取出，为了减少试剂损耗，在打开管盖前需短暂离心试管。将置于冰上的洁净离心管一一做好标记，用移液器准确加入57μl 生物素片段末端标记反应混合物（Biotin-FragEL TM LABELING REACTION MIX ）和3μl TdT 酶（TdT ENZYME ），轻轻吹打混匀备用。阴性对照的标记反应混合物中不加TdT 酶，而用蒸馏水替代。
4、轻轻吸干样本周围的1×TdT 平衡缓冲液，注意不要触碰到样本。
5、在每个样本上立即滴加60μl 上述准备的TdT 标记反应混合物。
6、用预先裁剪好的比样本稍大的Parafilm?封口膜覆盖样本。注意：可将封口膜折起一角以便于取放。封口膜的使用不仅可以确保反应混合物的均匀分布，也能减少孵育过程中的液体蒸发。
7、将切片置于湿盒中于37℃孵育90分钟。
F. 终止终止标记反应标记反应
1、如果终止缓冲液中有沉淀，在使用前将其置于37℃预热5分钟。
2、移走Parafilm?封口膜，并用1×TBS 溶液中漂洗。
3、每个样本上滴加100μl 终止缓冲液，室温孵育5分钟。
4、用1×TBS 缓冲液漂洗。
5、轻轻去掉多余液体，小心干燥样品周围的玻片部分。
G ．显色与检测
1、每个样本上滴加100μl 封闭缓冲液，室温孵育10分钟。
2、用封闭缓冲液1：50稀释50×偶联物（每个样本需用2μl 50×偶联物和98μl 封闭缓冲液混合稀释成100μl 缓冲液）。
3、小心吸去样品上的封闭缓冲液，注意不要接触到样品。并立即加入100ul 稀释过的1×偶联物。
4、将切片置于湿盒中于室温孵育30分钟。
5、孵育结束前5分钟，制备DAB 显色物溶液：将一片DAB 片和一片双氧水/尿素片溶于1ml 自来水（足够处理10个样品）。注意：自来水中可能含有金属离子，造成DAB 显色增强。
6、用1×TBS 缓冲液漂洗。
7、轻轻去掉多余液体，小心干燥样品周围的玻片部分。
8、每个样本上滴加100μl DAB 显色物溶液，室温孵育10-15分钟。
9、用dH 2O 漂洗样本。
H ．复染复染（（选做选做））
1、立即以100ul 甲基绿复染剂完全覆盖样品。
2、室温孵育3分钟。
3、将玻片一边置于吸水纸上吸去绝大部分复染剂，并放置于科普林缸。
4、将玻片浸于100%乙醇中2-4次。
5、用吸水纸吸去玻片上液体。
6、重复第四步，换用新鲜乙醇。
7、用吸水纸吸去玻片上液体。
8、将玻片浸于二甲苯中2-4次。
9、擦干玻片背部及样本周围部分的二甲苯。
10、盖上盖玻片，以封片剂如Permount 封片。
二 组织冰冻切片组织冰冻切片处理流程处理流程
该操作流程与石蜡包埋组织切片相似，除了将脱蜡步骤替换为短暂的水化步骤，并将蛋白酶K 的处理时间缩短到10分钟。在进行该实验检测前需固定冰冻组织。为了避免在清洗步骤中的样本在玻片上损失，建议不用洗瓶清洗建议不用洗瓶清洗建议不用洗瓶清洗，而是将玻片浸在1×TBS 溶液中2-3次进行清洗。注意注意注意：：在操作中避免样本免样本过分过分过分干燥干燥干燥！！！！
A. 组织固定与水化
1、将玻片浸没在4%甲醛溶液（溶于1×PBS ）中，室温孵育15分钟。
2、轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。
3、将玻片浸没在1×TBS 溶液中，室温孵育15分钟。
4、轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。这时可用石蜡笔或疏水笔（Cat. #402176）在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。
B. 增加样本通透性
1、按1：100的比例，用10 mM Tris溶液（pH8.0）作为稀释液来稀释2mg/ml的蛋白酶K溶液，使其终浓度为20μg/ml。每个样本需要100μL蛋白酶K溶液（可以将1μL的2mg/ml蛋白酶K溶液加至99μL的10mM Tris溶液中配制而成）。
2、每个样本上滴加50-100μL浓度为20μg/ml的蛋白酶K溶液，使其被全部覆盖，室温孵育10分钟。注意严格控制孵育时间，孵育时间过长可对细胞造成一定的伤害，过短则可能造成透性处理不充分，影响标记效率。蛋白酶K工作液的使用浓度、处理时间及温度因组织或细胞的类型或固定方法的不同而有所不同，使用者可参照试剂盒提供的标准使用说明摸索最合适的实验条件。
3、在盛有1×TBS溶液的敞口烧杯中浸没清洗样本2-3次。
4、轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。
对照处理
C. 样本阳性/阴性
阴性对照处理
样本阳性对照实验为选做，可根据自身情况分析选做。但试剂盒提供的HL-60细胞的阳性/阴性对照片建议操作。
1、取经过预处理（已完成通透性处理）的组织冰冻切片，用含有1μg/μl的DNA酶Ⅰ（Cat. #69164）溶液（含有1mM MgSO4的1×TBS溶液）完全覆盖样本，室温孵育20分钟。
2、用1×TBS溶液漂洗。
3、轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持其湿润。
4、样本阴性对照和试剂盒提供的HL-60对照细胞片对照为建议必做实验，其处理方法与样本的处理方法相同，但在平衡和标记反应加入TdT酶步骤时用蒸馏水替代TdT酶。阴性对照可以使实验者参考样本中内源过氧化物酶的活性和非特异标记反应造成的显色。未诱导凋亡的阴性对照样本也非常必要，因为组织或细胞样本从制备步骤开始就一直发生着凋亡，如果固定操作过迟或是常规的机械操作都可能造成非正常的DNA断裂，而被误测为细胞凋亡。
D. 灭活内源过氧化物酶活性
1、1：10稀释30% H2O2溶液（将10ul 30% H2O2与90ul甲醇混合，每个样本需100ul这样的混合物）。
2、以上述制备的100ul 3% H2O2溶液完全覆盖样品，室温孵育5分钟。处理时间不可过长。
3、用1×TBS缓冲液漂洗。
4、轻轻去掉多余液体，小心干燥样品周围的玻片部分。
E. 平衡和标记反应
1、按1：5的比例用蒸馏水稀释5×TdT平衡缓冲液（每个样本需用20μl 5×缓冲液和80μl蒸馏水混合稀释成100μl缓冲液）。
2、滴加100μl 1×TdT平衡缓冲液使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育10-30分钟。或者将载玻片放入一个含有1×TdT平衡缓冲液的缸中，保证缓冲液没过样本。在等待孵育的同时准备标记反应混合物。
3、把TdT酶从冰箱中取出，为了减少试剂损耗，在打开管盖前需短暂离心试管。将置于冰上的洁净离心管一一做好标记，用移液器准确加入57μl生物素片段末端标记反应混合物（Biotin-FragEL TM LABELING REACTION MIX）和3μl TdT酶（TdT ENZYME），轻轻吹打混匀备用。阴性对照的标记反应混合物中不加TdT酶，而用蒸馏水替代。
4、轻轻吸干样本周围的1×TdT平衡缓冲液，注意不要触碰到样本。
5、在每个样本上立即滴加60μl上述准备的TdT标记反应混合物。
6、用预先裁剪好的比样本稍大的Parafilm?封口膜覆盖样本。注意：可将封口膜折起一角以便于取放。封口膜的使用不仅可以确保反应混合物的均匀分布，也能减少孵育过程中的液体蒸发。
7、将切片置于湿盒中于37℃孵育90分钟。
F. 终止标记反应
1、如果终止缓冲液中有沉淀，在使用前将其置于37℃预热5分钟。
2、移走Parafilm?封口膜，并用1×TBS 溶液中漂洗。
3、每个样本上滴加100μl 终止缓冲液，室温孵育5分钟。
4、用1×TBS 缓冲液漂洗。
5、轻轻去掉多余液体，小心干燥样品周围的玻片部分。
G ．显色与检测
1、每个样本上滴加100μl 封闭缓冲液，室温孵育10分钟。
2、用封闭缓冲液1：50稀释50×偶联物（每个样本需用2μl 50×偶联物和98μl 封闭缓冲液混合稀释成100μl 缓冲液）。
3、小心吸去样品上的封闭缓冲液，注意不要接触到样品。并立即加入100ul 稀释过的1×偶联物。
4、将切片置于湿盒中于室温孵育30分钟。
5、孵育结束前5分钟，制备DAB 显色物溶液：将一片DAB 片和一片双氧水/尿素片溶于1ml 自来水（足够处理10个样品）。注意：自来水中可能含有金属离子，造成DAB 显色增强。
6、用1×TBS 缓冲液漂洗。
7、轻轻去掉多余液体，小心干燥样品周围的玻片部分。
8、每个样本上滴加100μl DAB 显色物溶液，室温孵育10-15分钟。
9、用dH 2O 漂洗样本。
H ．复染复染（（选做选做））
1、立即以100ul 甲基绿复染剂完全覆盖样品。
2、室温孵育3分钟。
3、将玻片一边置于吸水纸上吸去绝大部分复染剂，并放置于科普林缸。
4、将玻片浸于100%乙醇中2-4次。
5、用吸水纸吸去玻片上液体。
6、重复第四步，换用新鲜乙醇。
7、用吸水纸吸去玻片上液体。
8、将玻片浸于二甲苯中2-4次。
9、擦干玻片背部及样本周围部分的二甲苯。
10、盖上盖玻片，以封片剂如Permount 封片。
三 固定细胞片处理流程
该操作流程与冰冻组织切片相似，除了将蛋白酶K 的处理时间缩短到5分钟。将悬浮细胞固定到玻片上的操作请参考“注意事项注意事项注意事项”章节。为了避免在清洗步骤中的样本在玻片上损失，建议不用洗瓶建议不用洗瓶清洗清洗，而是将玻片浸在1×TBS 溶液中2-3次进行清洗。注意注意注意：：在操作中避免样本干燥在操作中避免样本干燥！！！！
A. 水化
1、将玻片浸没在1×TBS 溶液中，室温孵育15分钟。
2、轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。这时可用石蜡笔或疏水笔（Cat. #402176）在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。
B. 增加样本通透性
1、按1：100的比例，用10 mM Tris 溶液（pH8.0）作为稀释液来稀释2mg/ml 的蛋白酶K 溶液，使其终浓度为20μg/ml 。每个样本需要100μL 蛋白酶K 溶液（可以将1μL 的2mg/ml 蛋白酶K 溶液加至99μL 的10mM Tris 溶液中配制而成）。
2、每个样本上滴加50-100μL 浓度为20μg/ml 的蛋白酶K 溶液，使其被全部覆盖，室温孵育5分钟。注意严格控制孵育时间，孵育时间过长可对细胞造成一定的伤害，过短则可能造成透性处理不充分，
影响标记效率。蛋白酶K工作液的使用浓度、处理时间及温度因组织或细胞的类型或固定方法的不同而有所不同，使用者可参照试剂盒提供的标准使用说明摸索最合适的实验条件。
3、在盛有1×TBS溶液的敞口烧杯中浸没清洗样本2-3次。
4、轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。
对照处理
C. 样本阳
阴性对照处理
样本阳性性/阴性
样本阳性对照实验为选做，可根据自身情况分析选做。但试剂盒提供的HL-60细胞的阳性/阴性对照片建议操作。
1、取经过预处理（已完成通透性处理）的固定细胞片，用含有1μg/μl的DNA酶Ⅰ（Cat. #69164）溶液（含有1mM MgSO4的1×TBS溶液）完全覆盖样本，室温孵育20分钟。
2、用1×TBS溶液漂洗。
3、轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持其湿润。
4、样本阴性对照和试剂盒提供的HL-60对照细胞片对照为建议必做实验，其处理方法与样本的处理方法相同，但在平衡和标记反应加入TdT酶步骤时用蒸馏水替代TdT酶。阴性对照可以使实验者参考样本中内源过氧化物酶的活性和非特异标记反应造成的显色。未诱导凋亡的阴性对照样本也非常必要，因为组织或细胞样本从制备步骤开始就一直发生着凋亡，如果固定操作过迟或是常规的机械操作都可能造成非正常的DNA断裂，而被误测为细胞凋亡。
D. 灭活内源过氧化物酶活性
1、1：10稀释30% H2O2溶液（将10ul 30% H2O2与90ul甲醇混合，每个样本需100ul这样的混合物）。
2、以上述制备的100ul 3% H2O2溶液完全覆盖样品，室温孵育5分钟。处理时间不可过长。
3、用1×TBS缓冲液漂洗。
4、轻轻去掉多余液体，小心干燥样品周围的玻片部分。
E. 平衡和标记反应
1、按1：5的比例用蒸馏水稀释5×TdT平衡缓冲液（每个样本需用20μl 5×缓冲液和80μl蒸馏水混合稀释成100μl缓冲液）。
2、滴加100μl 1×TdT平衡缓冲液使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育10-30分钟。或者将载玻片放入一个含有1×TdT平衡缓冲液的缸中，保证缓冲液没过样本。在等待孵育的同时准备标记反应混合物。
3、把TdT酶从冰箱中取出，为了减少试剂损耗，在打开管盖前需短暂离心试管。将置于冰上的洁净离心管一一做好标记，用移液器准确加入57μl生物素片段末端标记反应混合物（Biotin-FragEL TM LABELING REACTION MIX）和3μl TdT酶（TdT ENZYME），轻轻吹打混匀备用。阴性对照的标记反应混合物中不加TdT酶，而用蒸馏水替代。
4、轻轻吸干样本周围的1×TdT平衡缓冲液，注意不要触碰到样本。
5、在每个样本上立即滴加60μl上述准备的TdT标记反应混合物。
6、用预先裁剪好的比样本稍大的Parafilm?封口膜覆盖样本。注意：可将封口膜折起一角以便于取放。封口膜的使用不仅可以确保反应混合物的均匀分布，也能减少孵育过程中的液体蒸发。
7、将切片置于湿盒中于37℃孵育90分钟。
F. 终止标记反应
1、如果终止缓冲液中有沉淀，在使用前将其置于37℃预热5分钟。
2、移走Parafilm?封口膜，并用1×TBS溶液中漂洗。
3、每个样本上滴加100μl终止缓冲液，室温孵育5分钟。
4、用1×TBS缓冲液漂洗。
5、轻轻去掉多余液体，小心干燥样品周围的玻片部分。
G ．显色与检测
1、每个样本上滴加100μl 封闭缓冲液，室温孵育10分钟。
2、用封闭缓冲液1：50稀释50×偶联物（每个样本需用2μl 50×偶联物和98μl 封闭缓冲液混合稀释成100μl 缓冲液）。
3、小心吸去样品上的封闭缓冲液，注意不要接触到样品。并立即加入100ul 稀释过的1×偶联物。
4、将切片置于湿盒中于室温孵育30分钟。
5、孵育结束前5分钟，制备DAB 显色物溶液：将一片DAB 片和一片双氧水/尿素片溶于1ml 自来水（足够处理10个样品）。注意：自来水中可能含有金属离子，造成DAB 显色增强。
6、用1×TBS 缓冲液漂洗。
7、轻轻去掉多余液体，小心干燥样品周围的玻片部分。
8、每个样本上滴加100μl DAB 显色物溶液，室温孵育10-15分钟。
9、用dH 2O 漂洗样本。
H ．复染复染（（选做选做））
1、立即以100ul 甲基绿复染剂完全覆盖样品。
2、室温孵育3分钟。
3、将玻片一边置于吸水纸上吸去绝大部分复染剂，并放置于科普林缸。
4、将玻片浸于100%乙醇中2-4次。
5、用吸水纸吸去玻片上液体。
6、重复第四步，换用新鲜乙醇。
7、用吸水纸吸去玻片上液体。
8、将玻片浸于二甲苯中2-4次。
9、擦干玻片背部及样本周围部分的二甲苯。
10、盖上盖玻片，以封片剂如Permount 封片。
结果与判断结果与判断：：
呈现深棕色染色的细胞为凋亡细胞，如果进行了甲基绿复染操作，非凋亡细胞会呈现青绿色至淡绿色染色。由于凋亡细胞中含有3’-OH 末端的DNA 片段主要集中在细胞核及凋亡小体中，因此也可以利用形态学观察结合显色结果来解释FragEL TM 的凋亡检测结果。凋亡过程中典型的形态学改变已经被明确确定和广泛接受（参见图3中放线菌素D 诱导凋亡/Lane 2和未诱导凋亡/Lane 1的HL-60细胞DNA Ladder 实验结果），可以用来作为细胞程序化死亡的检测指标，并辅助说明TUNEL 检测的实验结果。非凋亡细胞由于缺乏大量的3’-OH 末端，因此不会被显著掺入和标记生物素基团从而显色。标记反应后，用光学显微镜仔细观察试剂盒中提供的HL-60细胞对照片，会得到如下结果（参加图2）：对照片中由于放线菌素D 的诱导，既含有凋亡细胞（深棕色），也有正常细胞（青绿色）。而未诱导凋亡的样本阴性对照中，由于细胞或组织在培养中会发生正常的细胞死亡，处理过程中的机械破坏也可能造成细胞死亡，1-5%的正常细胞或组织也会呈现阳性染色。在组织切片样本中，很难观察到胞膜的突起或起泡，许多凋亡细胞的胞核呈现圆形或椭圆形，保存完好的凋亡小体有时可以观察到。由于凋亡是一个非同步发生的过程，组织中的凋亡细胞可能呈散在分布而非像坏死细胞一样呈连续或成群地分布。
已经用此试剂盒检测了几种不同方式诱导的凋亡细胞，包括Taxol 、Camptothecin 、UV 照射、Actinomycin D 诱导的HeLa 、Daudi 和HL-60细胞。阳性染色结果显示与诱导剂的剂量明显相关。多种组织也被成功用于验证本试剂盒：人结肠癌、乳腺癌组织、前列腺瘤、神经胶质瘤、正常人皮肤、淋巴、扁桃腺、结肠、肺、心、卵巢、子宫、睾丸及肾脏等。
图2. HL-60细胞阳性/阴性对照片 图3. HL-60细胞DNA Ladder 结果
引用引用文献文献文献：：
Aaja S Muhlfeld, Min W Spencer, Kelly L Hudkins, Elizabeth Kirk, Renee C Leboeuf and Charles E Alpers(2004) Hyperlipidemia aggravates renal disease in B6.ROP Os/+ mice. Kidney International 66:1393–1402
Christopher N. Mayhew, Emily E. Bosco, Sejal R. Fox, Tomohisa Okaya, Pheruza Tarapore, Sandy J. Schwemberger, George F. Babcock, Alex B. Lentsch, Kenji Fukasawa, and Erik S. Knudsen(2005) Liver-Specific pRB Loss Results in Ectopic Cell Cycle Entry and Aberrant Ploidy. Cancer Res 65(11):4568-4577
Kewei Wang, John J. Brems, Richard L. Gamelli, and Jinwen Ding(2005) Reversibility of Caspase Activation and Its Role during Glycochenodeoxycholate-induced Hepatocyte Apoptosis. Journal of Biological Chemistry 280:23490-23495
Eugenia Colo′n, Farasat Zaman, Magnus Axelson, Olle Larsson, Christine Carlsson-Skwirut, Konstantin V. Svechnikov, and Olle So¨der(2007) Insulin-Like Growth Factor-I Is an Important Antiapoptotic Factor for Rat Leydig Cells during Postnatal Development.
Endocrinology 148(1):128–139
Buer Song, Courtney J Haycraft, Hwa-seon Seo, Bradley K Yoder, and Rosa Serra(2007)
Development of the post-natal growth plate requires intraflagellar transport proteins. Dev Biol 305(1): 202–216
Shi-He Liu, Alan Davis, Zhijun Li, Nikiforos Ballian, Elizabeth Davis, Xiao-Ping Wang, William Fisher and F. Charles Brunicardi(2007) Effective Ablation of Pancreatic Cancer
Cells in SCID Mice Using Systemic Adenoviral RIP-TK/GCV Gene Therapy. Journal of Surgical Research 141(1):45-52
Liu, Shihe, Ballian, Nikiforos, Belaguli, Narasimhaswamy S., Patel, Sanjeet, Li, Min, Templeton, Nancy Smyth, Gingras, Marie-Claude, Gibbs, Richard, Fisher, William, Brunicardi, F. Charles(2008) PDX-1 Acts as a Potential Molecular Target for Treatment of Human Pancreatic Cancer. Pancreas 37(2):210-220
Debashree Mukherjea, Sarvesh Jajoo, Craig Whitworth, Jennifer R. Bunch, Jeremy G. Turner, Leonard P. Rybak, and Vickram Ramkumar(2008) Short Interfering RNA against Transient Receptor Potential Vanilloid 1 Attenuates Cisplatin-Induced Hearing Loss in the Rat. The Journal of Neuroscience 28(49):13056-13065
Stephan Woditschka,Jill D Haag,Bob Mau,Ronald A Lubet,and Michael N Gould(2008) Chemopreventive effects of celecoxib are limited to hormonally responsive mammary carcinomas in the neuinduced retroviral rat model. Breast Cancer Res 10(1): R18
Silvia Lorrio, Pilar Negredo, José M. Roda, Antonio G. García, Manuela G. López(2009) Effects of memantine and galantamine given separately or in association, on memory and hippocampal neuronal loss after transient global cerebral ischemia in gerbils. Brain Research 1254:128-137
Lei Zhang, Yan Liu, Xiao Ting Lu, Xin Sheng Xu, Yu Xia Zhao, Xiao Ping Ji, Peng Fei Zhang, Chun Xi Liu, Meng Xiong Tang, Wen Qiang Chen, Yun Zhang(2009) Intraplaque injection of Ad5-CMV p53 aggravates local inflammation and leads to plaque instability in rabbits. J. Cell. Mol. Med 13:2713-2723
Joe Quadrilatero, Eric Bombardier, Sarah M. Norris, Jason L. Talanian, Matthew S. Palmer, Heather M. Logan, A. Russell Tupling, George J. F. Heigenhauser, and Lawrence L. Spriet (2010) Prolonged moderate-intensity aerobic exercise does not alter apoptotic signaling and DNA fragmentation in human skeletal muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab 298:
E534-E547
细胞凋亡试验常用的方法（MTT法、荧光法、DNA琼脂糖凝胶电泳法与流式细胞仪检测法） （一）药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法： 用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L，在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。 次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组，设加完全培养基不加药物的阴性对照，并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照，每组均设4-6个复孔（平行孔）、37℃、5% CO2继续培养。 培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT（5g/L），培养4-6h后，阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应，于37℃存放过夜。 用酶标仪在A570波长下测吸光度值，按下式计算抑制率 抑制率（%）=（1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值）x 100%。 （二）荧光法： 选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞，培养细胞48h后，收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。 弃去固定液，并用PBS洗2次后，用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI 荧光染色60min，用PBS冲洗3次，取10ul滴片，干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。 （三）DNA琼脂糖凝胶电泳法： 1、DNA提取： 用大方瓶培养肿瘤细胞，每瓶10ml，细胞浓度为3 x 108个/ml，每隔药物浓度、作用时间均设2瓶，共分3个时间段，4个药物浓度。共培养26瓶细胞。 分别于细胞中加入不同浓度的药物，于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h，收货细胞，用PBS洗2-3次。 于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中，加1ml细胞裂解液，再加蛋白酶K，轻轻振摇使悬液混匀，成黏糊状，50℃过夜。 冷却后加入等体积的饱和酚溶液，混合后10000r/min离心10min，吸出上层水相，移至另一离心管中，再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次，直到无蛋白为止。 吸上清加入氯仿/异戊醇（24：1）按上述方法再抽提一次。 吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液，混匀。 再加入2.5倍体积冷无水乙醇，混合置-20℃处理30min后，10000r/min离心10min，沉淀部分为提供的DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干乙醇。 加入200ulTE缓冲液融解DNA，再加入25ul的RNA酶，置37℃作用30min，置4℃冰箱保存。 2、琼脂糖凝胶电泳： TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖融解，待冷却至60℃时，加入溴化乙锭，使其终浓度为0.5mg/ml，混匀后灌胶。 待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内，使TBE电泳液盖过凝胶。 取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4：1比例混匀后点样。 60V电泳1h，用紫外透射仪观察梯形条带。
常用细胞凋亡检测方法（图） 转载请注明来自丁香园 发布日期：2012-02-16 13:41 文章来源：丁香通 关键词：丁香园生物专题义翘神州细胞培养点击次数：951 一、细胞凋亡的形态学检测 1、光学显微镜和倒置显微镜 ①未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 ②染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA 特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释，终浓度为10 ug/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为10 ug/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3、透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细核红染。因此将Annexin-V 与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 方法
细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞与坏死 细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡与坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体与生存中起着非常重要的作用。它就是细胞在一 定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,就是细胞遵循一定规律自己结束生命 的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学与生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网与细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。 在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。 相比之下,坏死就是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期 即丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎症反应,坏死过程中细胞核DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的DNA片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。 一些温与的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度与细胞本身对刺激的敏感 程度。 三尖杉酯碱(HT)就是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0、02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342与碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。 细胞膜就是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着
细胞凋亡检测方法 一、细胞凋亡的形态学检测 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，全面皱缩，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体，凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2）染色细胞： 姬姆萨（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常细胞核色泽均一；凋亡细胞染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态；坏死细胞染色浅或没染上颜色。 苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：Hoechst 33342，Hoechst 33258，DAPI。三种染料与DNA 的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。 PI和Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但PI不能通过正常细胞膜，Hoechst则为膜通透性荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调
亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3 透射电子显微镜观察 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴露在细胞外环境中。磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段，先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。体内的吞噬细胞可通过识别
1.5.8 孟塞尔表色系统 孟塞尔表色系统是目前世界上广泛应用的颜色系统，这一系统包括表色方法和标准色度卡。 孟塞尔表色系统是孟塞尔立体图，见图1.5－10。该立体图是一非对称旋转体，其内部有一根中央轴、有10个剖面、还有一个底面。 图1.5－10中的中央轴代表照度，它在底盘位置的明度为0，代表黑色；而在中央轴的顶端的照度为102，代表白色；在此二位置的中间则均分为10等分。由此，照度轴上共有11个刻度，各代表的明度值如下表所示。 表1.5－2 孟塞尔立体的剖面还用横竖线分成很多小格,每个小格离底盘的高度仍用与中央轴上等高的明度V表示，而离中央轴的水平距离则用彩度C表示，此彩度的数值有： 2 4 6 8 10 12 14 由此，剖面上每个小格可用V／C表记，如8／6则代表该小格的明度为8，而彩度则为6。
孟塞尔立体的每个剖面在圆周上的角度用色调角H 表示，并可在此立体图的底盘上给予标记，见图1.5－11。 图1.5－11中共有五个主要色调：红（R ）、黄（Y ）、绿（G ）、蓝（B ）、紫（P ）和五个中间色调：黄红（YR ）、绿黄（GY ）、蓝绿（BG ）、紫蓝（PB ）、红紫（RP ）。 因此，孟塞尔表色系统是用孟塞尔立体表示颜色的，而立体内的任一位置，即任一剖面上的任一方格的坐标，则是用明度V 、彩度C 、色调角H 的颜色三属性描述的，而且标注顺序为：对于有彩色的记为色调明度／彩度，即HV/C ；对于无彩色的记为NV ／，N 代表无彩色。孟塞尔表色系统与CIE 之间的参数转换有表可查。 根据孟塞尔表色系统已经制出了标准色度卡，为定标创造了条件。这些标准色度卡有两类：有光泽标准色度卡和无光泽标准色度卡；此外，还有带颜色的和中性色的，不过前者的数量多得多，如下： 表1.5－3 同时，每块卡上均注明有HV ／C 值。
细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 （1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 （2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 （4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发
生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物，测光吸收制。 用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，
实验14 细胞凋亡的诱导和检测 20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。 细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。 1．细胞凋亡的检测方法 凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。
形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征： （1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。 （2）Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。 （3）吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （4）吖啶橙(A())／溴化乙啶(EB)复染可以更可靠地确定凋亡细胞的变化，AO只进入活细胞，正常细胞及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；EB只进入死细胞，将死细胞及凋亡晚期的细胞的核染成橙红色。 （5）台盼蓝染色对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助，如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。使用透射电镜观察，可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 （6）木精-伊红（HE）染色是经典的显示细胞核、细胞质的染色方法，染色结果清晰。发生凋亡的细胞经HE染色后，其细胞大小的变化及特征性细胞核的变化：染色质凝集、呈新月形或块状靠近核膜边缘，晚期核裂解、细胞膜包裹着核碎片“出芽”凸出于细胞表面形成凋亡小体等均可明显显示出来。 DNA凝胶电泳：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞小分子 质量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180～200 bp DNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
孟塞尔色立体 自然界的颜色是十分丰富的，长期以来，人们对颜色的表述习惯常用日常生活中所见到的自然界物体作参照物来表示或加以描述的，如玖瑰红、柠檬黄、草绿、湖蓝等。这种表示方法虽然比较简单、直观、生动形象，但由于对颜色确切命名有困难，而且每个人的选择的参照物也不相同，所以经常会出现不同的人对同一物体给予不同颜色判断的现象，只能粗略定性地表示颜色。 30多年来，人们对彩色学科作了大量的研究。因而颜色的表示也日趋精确和定量。目前根据有色物体的光学基础，已经可以从物理学的角度，较准确地研究颜色的表示方法，从而定量地描述及测量颜色。 孟塞尔色立体是一种用颜色三属性，即色相、明度和彩度来描述颜色的立体空间。1920年由Albert H. Munsell(孟塞尔)所研发出来的。孟塞尔色立体是最著名的色立体，它是由色相、明度、彩度组成的圆柱坐标体系，每个颜色都对应着体系中的点，并且体系中的色相、明度、彩度在视觉上都是等间隔的，色卡间的色差与这个颜色空间中两个色点之间的直线距离成比例。如图6-7所示为孟塞尔色立体，图6-8为孟塞尔颜色空间排列示意图。 图6-7 孟塞尔色立体L *
图6-8 孟塞尔颜色空间排列示意图 在孟塞尔色立体中，中心轴表示颜色的明度，即孟塞尔明度，用V （Value）表示，理想白色在纵轴的上端，明度值V为10，绝对黑色在纵轴的下端，其明度值V为0，其间共分成0—10，即11个等间隔的等级，因为0和10实际都是不存在的，所以实际图册中只有1—9共9个明度级别。明度的间隔通常为1。 孟塞尔色相是以围绕纵轴的环形结构来表示的，用H（Hue）表示，环形结构常称为孟塞尔色相环。色相环中的各个方向代表10种孟塞尔色相，包括5种主要色相，即红（R）、黄（Y）、绿（G）、蓝（B）、紫（P），5种中间色相，即黄红（YR）、绿黄（GY）、蓝绿（BG）、紫蓝（PB）、红紫（RP），每一种色相又分成10个等级，即从1到10 。每种主要色相和中间色相的等级都定为5，如黄色则表示为5Y，绿黄色则表示为5GY。色相是以红（R）、黄（Y）、绿（G）、蓝（B）、紫（P）的顺序以顺时针方向排列的。前一色相的10 刚好为后一色相的0 ，10 Y即为0 GY。图6-9为孟塞尔色立体的色相环，图6-10为孟塞尔色立体的等明度面。
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。基因组DNA 断裂时，暴露的3'-0H 可以在末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal Deox yn ucleotidyl Tran sferase,TdT）的催化下加上荧光素（FITC）标记的dUTP（fluorescein-dUTP），从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL 法检测细胞凋亡的原理。 TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂（和细胞凋亡时的断裂方式不同）。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把 射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。 针对问题2（TUNEL法的实验原理是什么？）： 基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dUTP进入细 胞内，在rTDT的辅助下dUTP与核断裂的DNA 3 -0H结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dUTP 上的biot in 结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biot in 分子），最后用DAB 过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情 况。■ 1. TUNEL工作原理：简单说就是一一TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况。 其原理是；生物素（biot in ）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT En zyme）的 作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3' - 0H末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的 链霉亲和素（Streptavidin-HRP ）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通 显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-0H形成，很少能够被染色。 针对问题3 （TUNEL实验中几个关键步骤是什么？）： 1. 充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20min，再用二甲苯两次5~10min ;而水化用梯度乙 醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀； 2. 把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10~30min, 几um切片用短时间；几十um切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和 抗体进入胞内。 3. 适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37度1h,你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h,但要结合你最终的背景着色。 4. DAB显色条件的选择。一般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过 30min;我不喜欢用promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色。 5. PBS的充分清洗。我个人认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加 次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。 6. 此外，内源性POD的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经 验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的 特异性染色。 针对问题5.细胞通透的原理、通透剂的浓度、孵育时间及其配制方法？ 1. 蛋白酶K是消化膜蛋白，从而起打孔作用，增加
细胞凋亡的检测 细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。
孟塞尔表色系统 孟塞尔表色系统是目前世界上广泛应用的颜色系统，这一系统包括表色方法和标准色度卡。 孟塞尔表色系统是孟塞尔立体图，见图1.5－10。该立体图是一非对称旋转体，其内部有一根中央轴、有10个剖面、还有一个底面。 图1.5－10中的中央轴代表照度，它在底盘位置的明度为0，代表黑色；而在中央轴的顶端的照度为102，代表白色；在此二位置的中间则均分为10等分。由此，照度轴上共有11个刻度，各代表的明度值如下表所示。
表1.5－2 刻度值v 01234567 8910 明度值y 010.220.430.640.851.061.271.4 81.691.8102 孟塞尔立体的剖面还用横竖线分成很多小格,每个小格离底盘的高度仍用与中央轴上等高的明度V表示，而离中央轴的水平距离则用彩度C表示，此彩度的数值有：2468101214 由此，剖面上每个小格可用V／C表记，如8／6则代表该小
格的明度为8，而彩度则为6。 孟塞尔立体的每个剖面在圆周上的角度用色调角H表示，并可在此立体图的底盘上给予标记，见图1.5－11。 图1.5－11中共有五个主要色调：红（R）、黄（Y）、绿（G）、蓝（B）、紫（P）和五个中间色调：黄红（YR）、绿黄（GY）、蓝绿（BG）、紫蓝（PB）、红紫（RP）。 因此，孟塞尔表色系统是用孟塞尔立体表示颜色的，而立体内的任一位置，即任一剖面上的任一方格的坐标，则是用明度V、彩度C、色调角H的颜色三属性描述的，而且标注顺序为：对于有彩色的记为色调明度／彩度，即HV/C；对于无彩色的记为NV／，N代表无彩色。孟塞尔表色系统与CIE 之间的参数转换有表可查。 根据孟塞尔表色系统已经制出了标准色度卡，为定标创
(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项 编辑整理： 尊敬的读者朋友们： 这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项）的内容能够给您的工作和学习带来便利。同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。 本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项的全部内容。
常见细胞凋亡检测的方法与注意事项 大家常把细胞凋亡和细胞坏死混淆,其实两者是不同的细胞死亡形式，大家可以在死亡细胞的形态、生化和分子指标上将二者区分开来，细胞凋亡检测的方法不少，这里就总结下几种常用的检测方法. 细胞凋亡检测更多详情，点击查看不可不知的细胞检测方法——MTT 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1) 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落. (2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等.凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342），HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ～1mg/ml。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1）。 3 透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro—apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations)的空泡结构(图2）；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。 图2
细胞凋亡检测，细胞凋亡实验步骤，检测方法 一、定性和定量研究 只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜） 进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA 定量琼脂糖凝胶电泳。 二、区分凋亡和坏死 可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，AnnexinV/PI双染色法流式细胞仪检测等。 不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等。 三、样品来源不同选择 组织：主要用形态学方法(HE染色，透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记，ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳)。 四、细胞凋亡检测 1、早期检测: 1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测 2)细胞内氧化还原状态改变的检测 3)细胞色素C的定位检测 4) 线粒体膜电位变化的检测 2、晚期检测： 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在 180-200 bp 的DNA片段。 对于晚期检测通常有以下方法： 1) TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记) 2) LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 3) T elemerase Detection (端粒酶检测) 3、生化检测： 1）典型的生化特征：DNA 片段化 2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等 3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记） 4）通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为dUTP）间接或直接接到DNA 片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。 4、LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，
细胞凋亡的几种检测方 法 Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】
细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 （1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 （2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 （4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、 DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规
律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。 正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物，测光吸收制。 用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，
细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3 透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V 进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
细胞凋亡的检测方法 一、细胞凋亡概念： 细胞凋亡是指为维持内环境的稳定，有基因控制的细胞自主的程序性死亡。 细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。 细胞凋亡与胚胎发育、自身免疫耐受、肿瘤发生、病毒感染等生理、病理过程密切相关,近年来一直是生物医学领域各专业的研究热点。选择合适的凋亡检测方法是研究细胞凋亡研究的关键。 二、细胞凋亡的检测方法： 1. 磷酯酰丝氨酸(PS)外翻法(Annexin V 法) 在凋亡细胞中，磷酯酰丝氨酸 (PS) 从质膜内侧转移到外侧，暴露在细胞外环境中。 荧光基团或荧光蛋白标记的膜联蛋白V 可与暴露在质膜外侧的PS 结合，用于识别凋亡细胞。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V 与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 应用实例：以FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit 为例子 2. Caspase-3活性的检测: 半胱氨酸蛋白酶caspase 家族蛋白的激活是凋亡进程中的一个必要的决定性事件。其中caspase-3的激活在凋亡信号传导的许多途径中发挥着关键的作用。Caspase-3正常以酶原（32KDa ）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KDa ）和两个小亚基（12KDa ）组成， 图1. 使用10 μM 喜树碱处理Jurkat 细胞4 小时作为阳性实验组（右图），同时设置未处理组做阴性对照（左图）。使用FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit 对以上两组细胞进行相应的实验处理，流式细胞仪进行观察。
第三部分 其它表色系统
前言： 表色系统即是一种颜 色描述方法。 CIE色度系统是一个 重要的表色系统， 但不是唯一的系 统。早在它出现 前，人们就采用样 卡的方法传输颜色 信息。这类系统使 用方便，故为许多 行业采用。 国际 上一些表色系统： 3.1 孟塞尔系统(Munsell Color System) 3.2 奥斯特瓦尔得系统(Ostwald) 3.3 瑞士自然色系(NCS) (Nature Color System) 3.4 美国OSA色标(OSA:美国光学学会) 3.5 中国颜色体系 3.6 日本CC5000色彩图(还有cosmos） 3.7 四色印刷色谱 3.8 德国的 DIN
1
The Artist Point of View：颜色三个属性
Hue - The color we see (red, green, purple紫色) Saturation - How far is the color from gray (pink粉红的is less saturated than red, sky blue is less saturated than royal blue品蓝) Brightness/Lightness (Luminance) - How bright is the color
white
2
3.1 孟塞尔系统(Munsell Color System)
3
由孟塞尔所创立的色相(HHue)、明度(V-Value)和彩度(Cchroma)表示颜色的方法，以颜色 的视觉特性来制定颜色分类和标定 系统，是从心理学的角度把汇集到 的实际色样，按目视色彩感觉等間 隔的排列方式，用HVC 把各种表 面的特性表示出来,给以颜色标号, 并按此精心制作成许多标准颜色样 品，汇编成颜色图冊。 本属性色相、明度、彩度全部表示出来。
图3-1孟塞尔颜色立体示意图
它是一个三维类似球体的空间模型，把物体各种表面色的三种基
目前国际上已广泛采用孟塞尔颜色系统作为分类和标定表面色。
4
流式检测细胞凋亡 Annexin V 检测细胞凋亡 (2) 实验原理 (2) 实验用品 (2) 操作步骤 (3) Annexin V Blocking (5) 凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7) 实验原理 (7) 实验用品 (8) 操作步骤 (9) BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12) 实验原理 (12) BrdU Flow Kits 试剂盒 (12) 结果分析 (17) 流式仪器设置指南 (18) 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22) 实验原理 (22) 实验用品 (22) 样本制备 (23) 结果分析 (24) 注意事项 (24) Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26) 实验原理 (26) 实验步骤 (27) 结果分析 (28)
Annexin V 检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12×75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C保存。 3 3. 微量加样器和加样头。