中国农业科学 2011,44(20):4199-4206
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2011.20.008
双重PCR技术检测马铃薯环腐病菌
和黑胫病菌方法的建立
韩广涛1，杨志辉1，朱杰华1，赵冬梅1，韩彦卿2
（1河北农业大学植物保护学院/河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心，河北保定071001；
2中国农业大学农学与生物技术学院，北京100193）
摘要：【目的】利用双重PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌（Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus）和黑胫病菌（Pectobacterium atroseptica）。【方法】根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列，对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列，设计并合成了1对特异性引物CMS1/CMS2，将设计的引物与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r结合，经过条件优化后，建立了双重PCR 体系。【结果】利用引物CMS1/CMS2扩增出了1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达100 fg·μL-1，在细菌数上达105 CFU·mL-1。利用双重PCR体系对马铃薯环腐病菌和黑胫病菌进行扩增，可获得913和690 bp的2条特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达600 fg·μL-1，在细菌数上达5×105 CFU·mL-1。【结论】成功建立了双重PCR检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌技术体系，该技术能够同时快速可靠地检测出马铃薯环腐病菌和黑胫病菌。
关键词：马铃薯；环腐病菌；黑胫病菌；双重PCR；分子检测
Development of Duplex PCR Assay for Detection of
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and
Pectobacterium atroseptica from Potato
HAN Guang-tao1, Y ANG Zhi-hui1, ZHU Jie-hua1, ZHAO Dong-mei1, HAN Yan-qing2
(1College of Plant Protection, Agricultural University of Hebei/Control Centre of Plant Pathogens and Plant Pests of Hebei Province, Baoding 071001, Hebei; 2College of Agriculture and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193)
Abstract:【Objective】The objective of this study is to develop a duplex PCR system to simultaneously and reliably detect Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and Pectobacterium atroseptica. 【Method】Choosing the cellulose A gene sequence encoded by the native plasmid pCS1 of C. michiganensis subsp. sepedonicus which was published on the GenBank and comparing it with the nucleotide sequence of closely-related species and some pathogens of potato, a specific pair of primers, CMS1/CMS2, was designed and synthesized. A duplex PCR system had been established under the optimized PCR parameters using the combining primers CMS1/CMS2 and ECA1f/ECA2r which was a specific pair of PCR primers to detect P. atroseptica. 【Result】Using CMS1/CMS2 primers, a single unique PCR band of 913bp was amplified from C. michiganensis subsp. sepedonicus. The detection sensitivity was 100 fg·μL-1 of DNA and 105CFU·mL-1 of bacteria. Under the duplex PCR system, the 913 and 690 bp PCR bands from P. atroseptica could be specifically amplified. The detection sensitivity was 600 fg·μL-1 of DNA and 5×105 CFU·mL-1 of bacteria.【Conclusion】The duplex PCR system could simultaneously and rapidly detect the two pathogens.
Key words:potato; Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus;Pectobacterium atroseptica; duplex PCR; molecular detection
收稿日期：2011-02-14；接受日期：2011-05-03
基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-10-P12）
联系方式：韩广涛，Tel：0312-*******；E-mail：hgt832@https://www.doczj.com/doc/3513954179.html,。通信作者朱杰华，Tel：0312-*******；E-mail：zhujiehua356@https://www.doczj.com/doc/3513954179.html,
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0 引言
【研究意义】马铃薯环腐病（Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus）和黑胫病（Pectobacterium atroseptica）是影响马铃薯生产的2个重要的种薯传播细菌病害，种薯中存在肉眼无法诊察的潜伏侵染，带菌种薯种植后，常造成马铃薯烂种、死苗、死株，储藏期间病情发展可造成烂窖，引起相当大的产量损失和经济损失[1-2]。【前人研究进展】目前，对这2种病原菌的分子检测技术已有一些报道。Mills等[3]开发的环腐病菌特异性引物是马铃薯环腐病菌PCR检测技术中最常用的，检测限度为102 CFU·mL-1；胡林双等[4]根据环腐病菌16S rDNA 基因片段核苷酸序列开发了环腐病菌特异性引物，检测限度为105 CFU·mL-1；De Boer等[5]开发的黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r是马铃薯黑胫病菌PCR检测技术中最常用的，它的特异性好、灵敏度高，达5×102 CFU·mL-1。双重PCR技术检测植物病原菌已用于水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌[6]、小麦条纹花叶病毒和小麦花叶病毒[7]、洋葱黄矮病毒和葱潜隐病毒[8]、西瓜枯萎病菌和西瓜蔓枯病菌[9]、马铃薯晚疫病菌和青枯病菌[10]及胡萝卜软腐果胶杆菌马铃薯黑胫病亚种和胡萝卜软腐果胶杆菌菊亚种[11]，均能快速地同时检测2种病原菌的存在。【本研究切入点】在自然界中马铃薯环腐病菌和黑胫病菌经常是复合侵染的，但针对马铃薯环腐病菌或黑胫病菌的检测技术都是单一的，双重PCR检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌的方法到目前还没有报道。【拟解决的关键问题】本研究拟根据存在于马铃薯环腐病菌pCS1质粒上的纤维素酶A基因序列设计马铃薯环腐病菌特异性引物，与马铃薯黑胫病菌特异性引物组合建立双重PCR体系，为马铃薯各级种薯、商品薯及其相关产品检测和控制这2种病害的传播提供技术保障。
1 材料与方法
本试验于2009年9月至2010年12月在河北农业大学植物保护学院马铃薯病害研究室完成。
1.1 供试菌株及来源
本研究供试菌株马铃薯环腐病菌由山西省农业科学院高寒区作物研究所提供；胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种由河北省生物研究所提供；番茄溃疡病菌和苜蓿细菌性萎蔫病菌购自中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）；马铃薯黑胫病菌于2008年在河南商丘采集，菊果胶杆菌于2010年在河北保定采集，晚疫病菌于2007年在河北围场采集，早疫病菌于2009年在河北崇礼采集，干腐病菌、黑痣病菌于2010年在内蒙古采集，马铃薯田间土壤中的细菌于2010年在河北农业大学标本园采集，以上采集的菌株均由河北农业大学马铃薯病害实验室分离和保存（表1）。
1.2 供试菌株培养
马铃薯环腐病菌用BPA培养基23℃培养96 h后，将菌苔用接菌环接入装有150 mL BPA液体培养基的250 mL容量三角瓶中，23℃置摇床振荡（180r/min）培养96 h。马铃薯黑胫病菌[12]、马铃薯晚疫病菌[13]、其它对照细菌[14]、真菌[15]的培养参见相应文献。
1.3 DNA的提取
1.3.1 供试菌株DNA提取用碱裂解法提取马铃薯环腐病菌质粒DNA[16]；用CTAB/NaCl 法提取其它细菌基因组DNA[17]；用改良的CTAB法提取真菌的基因组DNA[18]。
1.3.2 发病组织的DNA提取取一块发病的植物组织，每1 mg加入10 μL 0.5 mol·L-1 NaOH，充分研磨后，12 000 r/min离心3 min，取5 μL上清液加入495 μL 0.1 mol·L-1 Tris pH8.0，混匀后取2 μL用于PCR反应。
1.4 引物CMS1/CMS2的设计
根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌Cellulase A基因序列（GenBank登录号AY007311.1），通过Primer5.0软件设计1对引物CMS1/CMS2，扩增片段长度为913 bp，由上海生工合成。
1.5 引物CMS1/CMS2的PCR扩增
反应总体系为15 μL：含2×Taq PCR Master Mix 7.5 μL，10 μmol·L-1的引物各0.4 μL，模板DNA15 ng，不足部分由ddH2O补足。反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，62℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸10 min。反应结束后，取5 μL PCR产物经1%（0.5×TBE）琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统上观察并拍照。
1.6 引物CMS1/CMS2特异性检测
用引物CMS1/CMS2对供试菌株DNA进行PCR 扩增，检验其特异性。PCR反应体系、反应程序同上。
1.7 引物CMS1/CMS2灵敏性检测
1.7.1 对马铃薯环腐病菌悬浮液的灵敏性检测采用10倍梯度稀释法，将马铃薯环腐病菌悬浮液稀释成109、108、107、106、105、104和103 CFU·mL-1共7种不同浓度梯度，利用1.5中的PCR反应体系、反应程
20期韩广涛等：双重PCR技术检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌方法的建立4201
表1 用于双重PCR特异性测试的细菌和真菌
Table 1 The bacterial and fungal strains used to test specificity of duplex PCR assay
编号Number 菌株
Species
来源
Origin
引物Primer
CMS1/CMS2 CMS1/CMS2,
ECA1f/ECA2r
1 马铃薯环腐病菌Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus山西Shanxi + +
2 番茄溃疡病菌Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis 日本Japan - -
3 苜蓿细菌性萎蔫病菌Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus 日本Japan - -
4 马铃薯黑胫病菌Pectobacterium atroseptica 河南商丘Shangqiu, Henan - +
5 胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum
河北Hebei - -
6 菊果胶杆菌Pectobacterium chrysanthemi 河北保定Baoding, Hebei - -
7 德氏食酸菌Acidovorax delafieldii河北保定Baoding, Hebei - -
8 恶臭假单胞菌Pseudomonas putida河北保定Baoding, Hebei - -
9 滋养节杆菌Arthrobacter pascens河北保定Baoding, Hebei - -
10 球形节杆菌Arthrobacter globiformis河北保定Baoding, Hebei - -
11 约氏黄杆菌Flavobacterium johnsoniae河北保定Baoding, Hebei - -
12 马塞芽孢杆菌Bacillus massiliensis河北保定Baoding, Hebei - -
13 产酶溶杆菌Lysobacter enzymogenes河北保定Baoding, Hebei - -
14 马铃薯晚疫病菌Phytophthora infestans河北围场Weichang, Hebei - -
15 马铃薯早疫病菌Alternaria solani 河北崇礼Chongli, Hebei - -
16 马铃薯干腐病菌Fusarium spp. 内蒙古Inner Mongolia - -
17 马铃薯黑痣病菌Rhizoctonia solani内蒙古Inner Mongolia - - “+”：单一PCR条带；“-”：无PCR条带；7—13：从马铃薯田土壤中分离
“+”: A single PCR band; “-”: No PCR band; Number 7-13: Separated from the soil of potato fields
序，对引物灵敏度进行测定。
1.7.2 对马铃薯环腐病菌质粒DNA的灵敏性检测采用10倍梯度稀释法，将马铃薯环腐病菌质粒DNA从0.5 μg·μL-1依次稀释至50 fg·μL-1，利用1.5中的PCR 反应体系、反应程序，确定反应灵敏度。
1.8 双重PCR检测方法的建立
1.8.1 双重PCR引物的筛选对文献报道的马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r[5]、ERWFOR/ ATROREV[19]、Y45/Y46[20]进行筛选，筛选出引物ECA1f/ECA2r，与引物CMS1/CMS2组合进行双重PCR（表2）。
1.8.2 双重PCR反应体系的建立PCR反应条件：设计10个不同退火温度，分别为57、58、59、60、61、62、63、64、65和66℃。5种不同循环次数，分别为25、30、35、40和45次。
引物量：设定10 μmol·L-1引物CMS1/CMS2的量的3个梯度为0.5、0.75和1 μL，设定10 μmol·L-1引物ECA1f/ECA2r的量的3个梯度为0.5、0.75和1 μL。
1.8.3 双重PCR特异性检测以供试菌株的DNA为模板，利用
2.3中的PCR反应体系、反应程序，检测
表2 本研究中双重PCR所用的引物
Table 2 The primers used for duplex PCR in the study
菌株Species 引物
Primer
PCR 片段长度
PCR fragment size (bp)
来源
Source
马铃薯环腐病菌
Clavibacter michiganense subsp. sepedonicus CMS1: 5′-CCCTGGGTGGGTCATACATTTC-3′
CMS2: 5′-TGCGGCTCGTTGTGGAGA-3′
913 本研究In this study
马铃薯黑胫病菌Pectobacterium atroseptica ECA1f: 5′-CGGCATCATAAAAACACG-3′
ECA2r: 5′-GCACACTTCATCCAGCGA-3′
690 文献[5] Reference [5]
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双重PCR的特异性。
1.8.4 双重PCR灵敏性检测采用10倍梯度稀释法，将马铃薯环腐病菌和马铃薯黑胫病菌的DNA从0.5 μg·μL-1依次稀释至50 fg·μL-1，利用
2.3中的PCR 反应体系、反应程序，确定双重PCR灵敏度。
采用10倍梯度稀释法，将马铃薯环腐病菌和黑胫病菌悬浮液稀释成5×109、5×108、5×107、5×106、5×105、5×104、5×103和5×102 CFU·mL-1共8种不同浓度梯度，利用2.3中的PCR反应体系、反应程序，对引物灵敏度进行测定。
1.9 双重PCR对病薯中病原菌的检测
在温室育苗，当马铃薯叶片长出6—8复叶时，距主茎1—2 cm处用刀垂直向下切割，从而对其根造成伤口，在伤根部位分别灌注20 mL 108 CFU·mL-1的环腐菌悬液、黑胫菌悬液、环腐和黑胫混合菌悬液，对照灌注等量无菌水。自发病植株上收获薯块，取其维管束组织，利用1.3.2中的DNA提取方法提取DNA，利用2.3中的PCR反应体系、反应程序，进行双重PCR 检测。
2 结果
2.1 引物CMS1/CMS2特异性检测
利用设计的马铃薯环腐病菌特异性引物CMS1/CMS2对供试的马铃薯环腐病菌DNA和其它菌株DNA进行PCR扩增，结果表明，只有在马铃薯环腐病菌中产生1条913 bp的产物（图1，泳道1），其它供试菌株和空白对照均无扩增条带（图1，泳道2—18），表明该引物具有很高的特异性。
1：马铃薯环腐病菌；2：番茄溃疡病菌；3：苜蓿细菌性萎蔫病菌；4：马铃薯黑胫病菌；5：胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种；6：菊果胶杆菌；7：德氏食酸菌；8：恶臭假单胞菌；9：滋养节杆菌；10：球形节杆菌；11：约氏黄杆菌；12：马塞芽孢杆菌；13：产酶溶杆菌；14：马铃薯晚疫病菌；15：马铃薯早疫病菌；16：马铃薯干腐病菌；17：马铃薯黑痣病菌；18：阴性对照；M：DL2000分子量标记
1: C. michiganensis subsp. sepedonicus; 2: C. michiganensis subsp. michiganensis; 3: C. michiganensis subsp. insidiosus; 4: P. atroseptica; 5: P. carotovorum subsp. carotovorum; 6: P. chrysanthemi; 7: A. delafieldii; 8: P. putida; 9:A. pascens; 10:A. globiformis; 11:F. johnsoniae; 12:B. massiliensis; 13:L. enzymogenes; 14: P. infestans; 15: A. solani; 16: F. spp.; 17: R. solani; 18: Negative control; M: DL2000 marker
图1 引物CMS1/CMS2特异性的分子检测
Fig. 1 The specificity of primers CMS1/CMS2 in molecular detection
2.2 引物CMS1/CMS2灵敏性检测
2.2.1 对马铃薯环腐病菌悬浮液的灵敏性检测将马铃薯环腐病菌悬浮液浓度从109 CFU·mL-1依次稀释10倍至103 CFU·mL-1，利用1.5中的PCR反应体系、反应程序，对引物灵敏度进行测定。结果（图2）表明，该PCR反应的最小检测浓度为105 CFU·mL-1（泳道5）。
2.2.2 对马铃薯环腐病菌质粒DNA的灵敏性检测将马铃薯环腐病菌质粒DNA浓度从0.5 μg·μL-1依次稀释10倍至50 fg·μL-1，每个点样孔加3 μL模板，利用1.5中的PCR反应体系、反应程序，对引物灵敏度进行测定。结果（图3）表明，该PCR反应的最小检测
1—7：环腐病菌悬浮液浓度分别为109、108、107、106、105、104和103 CFU·mL-1；8：阴性对照；M：DL2000分子量标记
1-7: Amplified products with bacterial suspension at concentration of 109, 108, 107, 106, 105, 104 and 103 CFU·mL-1; 8: Negative control; M: DL2000 marker
图2 引物CMS1/CMS2病菌悬浮液灵敏性检测
Fig. 2 The sensitivity of bacterial suspension for primers CMS1/CMS2 in molecular detection
20期韩广涛等：双重PCR技术检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌方法的建立
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1—8：在15 μL体系中模板DNA分别为1.5 μg、150 ng、15 ng、1.5 ng、150 pg、15 pg、1.5 pg和150 fg的扩增产物；9：阴性对照；M：DL2000分子量标记
1-8: Amplified products with template DNA at the concentrations of 1.5 μg, 150 ng, 15 ng, 1.5 ng, 150 pg, 15 pg, 1.5 pg and 150 fg in a 15 μL PCR reaction, respectively; 9: Negative control; M: DL2000 marker
图3 引物CMS1/CMS2病菌DNA灵敏性检测
Fig. 3 The sensitivity of pathogens DNA for primers CMS1/CMS2 in molecular detection
浓度为100 fg·μL-1（泳道7）。
2.3 双重PCR反应体系的建立
对双重PCR退火温度、循环次数和引物量进行优化，结果表明，退火温度62℃，循环次数35次，引物CMS1/CMS2各0.5 μL，引物ECA1f/ECA2r各1 μL 时为最佳。
最终优化出双重PCR体系25 μL：含2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol·L-1的引物CMS1/CMS2各0.5 μL，10 μmol·L-1的引物ECA1f/ECA2r各1 μL，模板DNA15 ng，不足部分由ddH2O补足。反应程序为，95℃预变性5 min；94℃变性30 s，62℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸10 min。反应结束后，取5 μL PCR产物经1%（0.5×TBE）琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统上观察并拍照。
2.4 双重PCR特异性检测
利用2.3中的PCR反应体系、反应程序，同时扩增马铃薯环腐病菌DNA和黑胫病菌DNA时，能同时观察到913和690 bp的2条条带（图4，泳道1）；但以供试的其它菌株DNA为模板进行扩增时，不能出现任何条带（图4，泳道2—16）。
2.5 双重PCR灵敏性检测
2.5.1 对马铃薯环腐病菌和黑胫病菌DNA的灵敏性检测采用10倍梯度稀释法，将马铃薯环腐病菌和马铃薯黑胫病菌的DNA浓度从0.5 μg·μL-1依次稀释至50 fg·μL-1，每个点样孔加3 μL模板，利用2.3中的PCR反应体系、反应程序进行PCR扩增，结果（图5）表明该双重PCR最低检出量为600 fg·μL-1。
2.5.2 对马铃薯环腐病菌和黑胫病菌悬浮液的灵敏性检测采用10倍梯度稀释法，将马铃薯环腐病菌和黑胫病病菌悬浮液稀释成5×109、5×108、5×107、5×106、5×105、5×104、5×103和5×102 CFU·mL-1共8种不同浓度梯度，利用2.3中的PCR反应体系、反应程序进行PCR扩增，结果（图6）表明该双重PCR，环腐病菌最低检出量为5×105 CFU·mL-1，黑胫病菌最低检出量为5×104 CFU·mL-1。
2.6 双重PCR检测环腐病菌和黑胫病菌侵染的薯块
人工接种产生病薯的双重PCR检测结果（图7），自环腐病菌和黑胫病菌混合接种产生的薯块上，可以同时检测到2种病原菌的存在，可以同时产生2种病
1：马铃薯环腐病菌和黑胫病菌；2：番茄溃疡病菌；3：苜蓿细菌性萎蔫病菌；4：胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种；5：菊果胶杆菌；6：德氏食酸菌；7：恶臭假单胞菌；8：滋养节杆菌；9：球形节杆菌；10：约氏黄杆菌；11：马塞芽孢杆菌；12：产酶溶杆菌；13：马铃薯晚疫病菌；14：马铃薯早疫病菌；15：马铃薯干腐病菌；16：马铃薯黑痣病菌；17：阴性对照；M：DL2000分子量标记
1: C. michiganensis subsp. sepedonicus, P. atroseptica; 2: C. michiganensis subsp. michiganensis; 3: C. michiganensis subsp. insidiosus;4: P. carotovorum subsp. carotovorum; 5:P. chrysanthemi; 6: A. delafieldii; 7:P. putida; 8:A. pascens; 9:A. globiformis; 10:F. johnsoniae; 11:B. massiliensis; 12:L. enzymogenes; 13: P. infestans; 14: A. solani; 15: F. spp.; 16: R. solani; 17: Negative control; M: DL2000marker
图4 双重PCR特异性检测
Fig. 4 Specificity test of duplex PCR
4204 中国农业科学44卷
1—8：在25 μL体系中模板DNA分别为1.5 μg、150 ng、15 ng、1.5 ng、150 pg、15 pg、1.5 pg和150 fg的扩增产物；9：阴性对照；M：DL2000分子量标记
Lanes 1-8: Amplified products with template DNA at the concentrations of 1.5 μg, 150 ng, 15 ng, 1.5 ng, 150 pg, 15 pg, 1.5 pg and 150 fg in a 25 μL PCR reaction, respectively; 9: Negative control; M: DL2000 marker
图5 双重PCR病菌DNA灵敏性检测
Fig. 5 The sensitivity test of duplex PCR in molecular detection
1—8：病菌悬浮液浓度分别为5×109、5×108、5×107、5×106、5×105、5×104、5×103和5×102 CFU·mL-1；9：阴性对照；M：DL2000分子量标记
1-8: Amplified products with bacterial suspension at concentrations of 5×109, 5×108, 5×107, 5×106, 5×105, 5×104, 5×103 and 5×102 CFU·mL-1; 9: Negative control; M: DL2000 marker
图6 双重PCR病菌悬浮液灵敏性检测
Fig. 6 The sensitivity test of duplex PCR in bacterial suspension detection
原菌特异的条带（泳道1—3）；同时，在分别接种环腐病菌和黑胫病菌植株产生的薯块上，也可以分别检测出环腐病菌预期产生的单一特异性条带（泳道4—5）和黑胫病菌预期产生的单一特异性条带（泳道6—7）；而健康薯块提取液和无菌水组成的2个阴性对照均未产生任何扩增产物（泳道8—9）。
3 讨论
纤维素酶A基因序列是在马铃薯环腐病菌pCS1质粒上的毒力基因序列[21]，由它编码的纤维素酶A是马铃薯环腐病菌的一个主要致病因素[22]。本研究根据纤维素酶A基因序列，对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列，设计了1对特异性引物
CMS1/ 1—3：接种环腐病菌和黑胫病菌；4—5：接种环腐病菌；6—7：接种黑胫病菌；8：未接种病菌；9：阴性对照；M：DL2000分子量标记
1-3: Inoculated both C. michiganensis subsp. sepedonicus and P. atroseptica; 4-5: Inoculated C. michiganensis subsp. sepedonicus; 6-7: Inoculated P. atroseptica; 8: Pathogen-free potato; 9: Negative control; M: DL2000 marker
图7 接种环腐病菌和黑胫病菌患病薯块上病原菌的双重PCR检测
Fig. 7 Duplex PCR detection of C. michiganensis subsp.
sepedonicus and P. atroseptica from artificially
inoculated tuber by using CMS1/CMS2 and ECA1f/
ECA2R
CMS2，能够扩增出1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带，该引物的检测灵敏度在DNA水平上可达100 fg·μL-1。由于该引物是在考虑到黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r的退火温度和引物之间以及引物与模板序列之间的相互干扰等问题的基础上开发的，因此灵敏性比国外单纯检测环腐病菌的引物稍差。该引物能够特异性的扩增出马铃薯环腐病菌特异性条带，而对照菌株均不能扩增出条带，表明本研究开发的特异性引物能够快速而准确地检测马铃薯环腐病菌，可以在马铃薯环腐病潜伏期和发病初期对其进行诊断和监测, 以便及时采取有效地防治方法, 控制病害的发生和发展, 减少经济损失，因此在生产上具有重要的指导作用。据报道，并不是所有的马铃薯环腐病菌都存在pCS1质粒，菌株P45和CS14是不存在pCS1质粒的[23]。因此，引物CMS1/CMS2不能检测P45和CS14，但它们已被报道是无毒力的[23]，不会造成马铃薯环腐病。
马铃薯环腐病和黑胫病是严重危害马铃薯的细菌性病害，主要靠种薯传播，种薯中存在肉眼无法诊察的潜伏侵染，并且在田间它们是可以复合侵染的，单一PCR分别对2种病原菌进行检测，工作量大、费时费力，已经满足不了病害检测中的快速、准确、灵敏、可靠的要求，因此建立能够同时检测这2种病原菌的方法就显得十分必要。在本研究中，根据马铃薯环腐
20期韩广涛等：双重PCR技术检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌方法的建立4205
病菌纤维素酶A基因序列设计了马铃薯环腐病菌特异性引物CMS1/CMS2，与De Boer等[5]开发的马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r组合，建立了双重PCR体系，并对该体系进行了优化，使该体系具有很好的特异性和较高灵敏性。应用该双重PCR体系能够在短时间内一次检测出马铃薯环腐病和黑胫病，大大节省了检测时间和费用，可满足病害检测中快速、准确、灵敏、可靠的要求。该体系可以对种薯、商品薯和发病初期的植株进行快速而准确地检测，对保证马铃薯各级种薯、商品薯的质量和及时采取有效的防治方法，控制这2种病害的传播、流行和减少经济损失具有重要意义，同时也为其它植物病害双重PCR检测方法的建立提供了理论基础。
4 结论
本研究建立了一种利用双重PCR技术同时检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌的新方法，该方法具有快速、准确、灵敏、可靠以及费用低等优点，适合于对上述2种病原菌进行快速、大规模分子检测。
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