30(6)839-844 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2014年12月
内生解淀粉芽孢杆菌CC09在小麦根部定殖
的电镜观察及防病效果
杨洪凤1，余向阳2，薛雅蓉1，刘常宏1*
（1. 南京大学生命科学学院/医药生物技术国家重点实验室，南京 210093；2. 江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所，南京210014）
摘要：采用抗利福平标记菌株的平板菌落计数法，检测了内生解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens CC09在小麦根部的定殖能力及消长动态，发现菌株CC09在小麦根内、根表和根际均能定殖，接种后5 d 定殖量分别稳定维持在2.7×105、2.0×105和5.5×105 cfu/g。透射电镜观察发现，菌株CC09能够在小麦根组织的皮层细胞、细胞间隙、中柱鞘及髓腔中定殖，且不影响根组织细胞结构。室内盆栽试验表明，用菌株CC09发酵液灌根处理小麦，对由禾谷镰刀菌Fusarium graminearum侵染引起的麦苗赤霉病的防效高达90.7%，表明菌株CC09是潜在的防治小麦赤霉病的生防菌，具有良好的开发和应用价值。
关 键 词：内生菌；解淀粉芽孢杆菌；定殖；透射电镜
中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2014)06-0839-06
Colonization of Endophytic Bacillus amyloliquefaciens CC09 in Wheat Roots Observed under Transmission Electron Microscopy and Its Biocontrol Efficiency against Diseases
YANG Hongfeng1, YU Xiangyang2, XUE Yarong1, LIU Changhong1*
(1. State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology/School of Life Sciences, Nanjing University, Nanjing 210093, China;
2. Institute of Food Safety and Monitoring Technology, Jiangsu Academy of Agriculture Sciences, Nanjing 210014, China)
Abstract: Bacillus amyloliquefaciens can colonize many plant roots, promote plant growth and suppress pathogenic fungi. However, its colonization process and potential disease control efficacy on wheat roots and rhizosphere are rarely studied. By applying the rifampicin resistant mutant and plate diluting method, we have investigated the colonization capacity and population dynamics of endophytic B. amyloliquefaciens CC09 within wheat root tissues, surface and rhizosphere. Results showed that CC09 strain colonized well within root tissues, surfaces and rhizosphere with a density of 2.7×105, 2.0×105 and 5.5×105 cfu/g, respectively, at 5 d after inoculation, and maintained at these population levels thereafter. Moreover, the strain could colonize in the cortical cells, intercellular spaces, pericycle cells and canal tissues in wheat root tissues and did not show clear adverse impacts on the cell ultra-structures based on the transmission electron microscopy (TEM) observation. In addition, the cultural broth of the strain exhibited 90.7% control efficiency against wheat seedling blight caused by Fusarium graminearum using root-drenching pot assay under the greenhouse conditions. These results suggested that the endophytic B. amyloliquefaciens CC09 has the potential to be developed as biocontrol agent to control wheat disease caused by the pathogenic F. graminearum.
Key words: endophytes; Bacillus amyloliquefaciens; colonization; TEM
小麦赤霉病（Fusarium head blight，FHB）是严重危害小麦产量的世界性流行病害之一，主要是由禾谷镰刀菌Fusarium graminearum侵染所致，可引起小麦减产40%～60%[1]。由于该菌分布广，适应力强，
收稿日期：2014-01-14
基金项目：国家自然科学基金（31272081）；江苏省科技支撑项目（BE2011355，BE2012372）
作者简介：杨洪凤（1990-），女，硕士研究生，E-mail：hongfengxiyuan@https://www.doczj.com/doc/3416917941.html,；*通信作者，男，教授，E-mail：chliu@https://www.doczj.com/doc/3416917941.html,。
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且能够种子带菌，侵染和危害时间长，因此，化学农药防治一般效果有限，生物防治被认为是比较理想的防治措施[2]。目前，用于防治小麦赤霉病的生防菌株主要有假单胞菌Pseudomonas spp.、放线菌Actinomycetes和芽孢杆菌Bacillus spp.[3]。其中，芽孢杆菌因其能够形成环境适应性极强的芽孢而备受关注。特别是内生芽孢杆菌（如枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌等），不仅具有促进植物生长和产生多种抗菌物质（如Iturin，Fengycin等）的能力，而且能够在植物体内稳定定殖[4]，行使长效防病功能，克服传统生物防治田间应用时效果不稳定等问题，生防潜力巨大。
解淀粉芽孢杆菌具有较强的定殖能力。Weng等[5]采用浸根法研究了解淀粉芽孢杆菌SQR9在黄瓜根部的定殖能力；Tan等[6]比较了不同接种方法对解淀粉芽孢杆菌CM-2和T-5在番茄根部定殖的影响；Yaryura等[7]比较了大豆浸出物与根系分泌物对解淀粉芽孢杆菌BNM339定殖的影响。然而，目前尚无内生解淀粉芽孢杆菌在小麦根内定殖的研究，而体内大量定殖是内生细菌发挥生防效果的前提。
解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens CC09是本实验室从樟树健康叶片中分离获得的内生细菌，该菌能够产生抗菌环脂肽物质Iturin A而对禾谷镰刀菌等多种病原真菌的生长有抑制作用[8]。本文通过研究该菌在小麦根部的定殖能力、消长规律及其对由禾谷镰刀菌引起的麦苗赤霉病的防效，评价其防治小麦赤霉病的潜力及可能作用机制。
1材料与方法
1.1 供试材料
内生解淀粉芽孢杆菌（CGMCC No.4669）由本实验室保藏；供试小麦品种为“豫麦49号”，购于江苏省农业科学院农业生物技术研究所；供试病原菌为禾谷镰刀菌,由南京农业大学提供。
1.2菌株CC09的抗性标记
将菌株CC09接入含利福平0.5 μg/mL的LB培养基中，摇床培养12 h，涂布于含相同浓度利福平的LB固体培养基上，培养24 h，挑取菌落形态与原始菌株相同的单菌落，转入含利福平浓度更高的培养基中，直至筛选出能在含300 μg/mL利福平的LB培养基上稳定生长且生理特性与原始菌株一致的抗性标记菌株CC09rif [9]。
1.3 菌株发酵液和禾谷镰刀菌的制备
菌株CC09及其抗性标记菌株（CC09rif）于37 ℃、120 r/min过夜培养，制备种子液。按3%接种量转接到含250 mL LB培养基的1 L三角瓶中，同样条件培养60 h，所得菌株发酵液稀释到2×108 cfu/mL备用。
禾谷镰刀菌先在PDA平板上活化，挑取少许接种至含有玻璃珠的PD培养基中，于30 ℃、120 r/min 摇床培养7 d备用。
1.4标记菌株CC09rif在小麦根内定殖能力的测定
选取饱满一致的小麦种子，依次在75%酒精中浸泡2 min和1%次氯酸钠溶液中浸泡5 min，再用无菌水清洗4次，然后置于铺有双层湿润无菌滤纸的平皿中，于25 ℃恒温培养箱（新苗GZX-400BS-Ⅲ）中催芽，待其露白后浸泡于菌株CC09rif发酵液（2×108 cfu/mL）4 h，无菌水为对照；然后播种于直径14 cm的盛有灭菌土的花盆中，待其出苗后，定期取样检测菌株CC09rif在小麦根内的定殖情况。
将小麦苗从花盆中拔出并抖落根部土壤，用自来水冲洗干净，灭菌纸吸干根表的水后，剪下根系并称重，之后依次用75%酒精表面消毒1 min和1%次氯酸钠漂洗4 min，无菌水清洗4次，取最后1次无菌水冲洗液100 μL涂布于抗性平板，37 ℃培养24 h后，检验消毒效果。然后吸干表面水后用1 mL无菌水在无菌研钵中研磨至浆糊状，静置15 min使组织内细菌充分释放出来，取100 μL组织悬浮液梯度稀释后涂布于含利福平300 μg/mL的LB平板上，过夜培养后统计平板上菌落数。
1.5标记菌株CC09rif在小麦根际与根表的消长规律
小麦种子的处理和播种参见1.4，待其出苗后定期取样检测菌株CC09rif在小麦根际与根表的消长规律，取样方法参照文献[10,11]并略做修改。
第6期杨洪凤等：内生解淀粉芽孢杆菌CC09在小麦根部定殖的电镜观察及防病效果 841
1.5.1 根际土 拔出小麦后，抖落大部分土壤，留取少量根际土，剪下根系称重（m1），置于装有20 mL
无菌水的三角瓶中，用手轻摇30 s后取出根系，将土壤悬液于200 r/min摇床振荡30 min，然后超声波（40 Hz）
处理4 min，静置2 h后取上清2 mL，进行梯度稀释后涂布于含300 μg/mL利福平的LB抗性平板上检测
根际土的含菌量，重复3次。将采过根际土的根系取出后，用滤纸吸尽根周围的水分并称重（m2），根际
土壤质量为m1－m2。
1.5.2 根表将取过根际土并用滤纸吸干水分的根系置于另一装有20 mL无菌水的三角瓶中，分别于
200 r/min摇床振荡30 min，超声（40 Hz）处理4 min后，取100 μL进行梯度稀释，检测小麦根系所能定
殖的标记菌株CC09rif数量。
1.6 电镜样品制备及观察
取1.4中浸种处理后7 d的小麦根系，自来水轻轻冲洗掉根表土壤后，用双面刀片切成3 mm长的根段，
用2.5%的戊二醛4 ℃固定过夜，然后用磷酸缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.0）冲洗3次，每次10 min（下同），
再用1%锇酸室温固定2.5 h，磷酸缓冲液冲洗3次，此后依次用50%、70%、80%、90%乙醇脱水各15 min，
再用100%乙醇脱水3次，每次30 min，最后用100%丙酮脱水3次，每次30 min。脱水后材料在室温下于丙
酮:包埋剂＝3:1的渗透液中放置2 h，转1:1渗透液中2 h，再转入装有1:3渗透液的离心管中，于30 ℃
烘箱中开盖过夜，之后用纯包埋剂包埋，分别于35 ℃聚合12 h、40 ℃聚合12 h、60 ℃聚合24 h，制备
超薄切片，经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后用于透射电镜（日立HT7700）观察，分析菌株CC09在小麦
根内的定殖部位以及对根细胞超微结构的影响。
包埋剂配方：812树脂5.4 g，NMA硬化剂（甲基内次甲基四氢邻苯二甲酸酐）2.8 g，DDSA硬化剂
（十二烷基琥珀酸酐）1.8 g，DMP?30催化剂2,4,6?三（二甲胺基甲基）苯酚0.15 g。
1.7 菌株CC09发酵液对禾谷镰刀菌引起的麦苗赤霉病的防治作用
选取饱满一致的小麦种子按照1.4方法表面消毒并催芽后，直接播种于装有灭菌土的花盆中，灭菌土
与禾谷镰刀菌按照30:1（w/v）比例混合，每盆播种6粒种子。在接种病原菌的同时用菌株CC09发酵液
及其5与10倍稀释液处理土壤，各处理的使用量均为20 mL/盆，以无菌水为空白对照，以同体积的三唑
酮（10 mg/mL）为化学农药对照，每处理播种3盆，试验重复3次。置于25 ℃光照培养箱中培养14 d后
调查小麦幼苗发病情况，并计算病情指数和相对防治效果[12]。
1.8数据统计与分析
采用Excel作图和GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析（unpaired Student’s t test和One-way ANOVE），
采用Digital Micrograph软件对电镜图片进行处理。
2结果与分析
2.1菌株CC09的抗性标记
通过对菌株CC09进行抗利福平筛选，得到抗利福平（300 μg/mL）的标记菌株CC09rif，该菌株的菌
落形态、颜色等均与原始菌株相同。在无抗生素的
LB培养液中连续培养5代，该菌仍能在抗性平板
上生长，在含利福平和不含利福平的平板上生长无
显著差异。
2.2菌株CC09rif在小麦根内的定殖能力
浸种处理结果（图1）显示，菌株CC09rif能够
在小麦根内定殖并且维持较高数量（1.3×105～
2.7×105 cfu/g）。虽然处理后5 d根内定殖量达到最
大值2.7×105 cfu/g，10 d稍有下降（1.3×105 cfu/g），
但不同调查时间根内定殖量无显著差异（P＞0.05），
表明接种5 d后菌株CC09rif即在小麦根内稳定
定殖。
C
C
9
r
i
f
数
量
P
o
p
u
l
a
t
i
o
n
o
f
C
C
9
r
i
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(
l
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c
f
u
·
g
1
)
图1菌株CC09rif在小麦根内的定殖及消长规律Fig. 1 Colonization and dynamic of strain CC09rif inside the
wheat roots
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2.3 标记菌株CC09rif 在小麦根细胞内定殖的电镜观察
浸种处理后7 d 的小麦根组织的透射电镜观察显示，菌株CC09rif 能在小麦根皮层细胞内（图2B ）、
细胞间隙（图2C ）、中柱鞘（图2B ）和髓腔中广泛定殖，而在未接种对照根组织中未发现该菌存在
（图2A ）。此外，菌株CC09rif 的定殖对小麦根组织和细胞结构无显著影响（图2E ，对照为图2D ），
线粒体、细胞膜和细胞壁、细胞核、内质网以及高尔基体均正常，说明菌株CC09rif 与小麦根组织能够
形成和谐的共生关系。
GB
GB
M ：线粒体Mitochondria ；N ：细胞核Nuclear ；CM ：细胞质膜Cytoplastic membrance ；CW ：细胞壁Cell wall ；ER ：内质网Endoplasmic reticulum ；
GB ：高尔基体Golgi apparatus ；P ：中柱鞘细胞Pericycle cells ；C ：皮层细胞Cortical cells ；CC09：生防菌Strain
图2 菌株CC09rif 在小麦根细胞内的定殖部位及其对细胞超微结构的影响
Fig. 2 TEM photograph of strain CC09rif colonized within wheat root tissues and its impacts on the host cell ultrastructures
2.4 菌株CC09rif 在小麦根际与根表的消长规律
图3显示菌株CC09rif 在小麦根际与根表的消
长规律相似，均以较高数量稳定存在，两者均在
处理后 5 d 时达到最大定殖量（5.5×105和
2.0×105 cfu/g ），之后稍有下降，30 d
时定殖量分别为3.4×105和1.0×105 cfu/g ，与5 d
时无显
著差异（P
＞0.05）。在同一调查时间，根际的定殖量显著大于根表（P ＜0.05）。
2.5 菌株CC09
发酵液对禾谷镰刀菌引起的麦苗赤霉病的防治作用 浇灌处理结果（表1）显示，不同稀释倍数的菌株CC09发酵液对麦苗赤霉病的防治效果存在显著差异，其中发酵液原液的防效高达
90.7%，
显著高于化学农药三唑酮（62.4%）的防治效果 C C 09r i f 数量P o p u l a t i o n o f C C 09r i f (l g c f u ·g 1) 注：*表示同一调查时间根际与根表定殖量在P ＜0.05水平有显著差异。 Note: *indicated the population of CC09rif within rhizoshpere was significant difference from that on root surface at 0.05 level and given investigation days. 图3 菌株CC09rif 在小麦根际与根表的消长规律 Fig. 3 Dynamic of strain CC09rif population within wheat root
surface and rhizosphere
第6期杨洪凤等：内生解淀粉芽孢杆菌CC09在小麦根部定殖的电镜观察及防病效果 843
表1菌株CC09发酵液不同稀释倍数对禾谷镰刀菌引起的麦苗赤霉病的防治效果
Table 1 Control efficiency of F. graminearum caused disease of wheat seedling blight by CC09 strain at various dilutions of the fermentation
broths
处理 Treatments 病情指数 Disease index 防治效果Control efficiency (%)
对照 CK 58.3±1.8 ?
三唑酮 Triadimefon 21.9±0.6 62.4±1.9 b
菌株CC09发酵液Fermentation broths of CC09 strain 5.4±0.4 90.7±1.2 a
5倍稀释液5-fold dilution 22.5±1.2 61.3±3.5 b
10倍稀释液 10-fold dilution 32.2±1.4 44.8±4.2 c
注：数据为平均值±标准差，不同小字母表示0.05水平上差异显著。
Note：Data were presented as mean±SD, data with different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level.
（P＜0.01）。5倍稀释液的防效与三唑酮无显著差异（P＞0.05），而10倍稀释液的防效则显著低于三
唑酮，但仍然高达44.8%。
3讨论
解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的生防芽孢杆菌[13]，广泛定殖于杨树、樟树、水稻
和小麦等植物及其根际。大部分解淀粉芽孢杆菌菌株能够产生广谱抗菌活性物质、诱导植物产生系统抗性
等生防[8,14]和促植物生长作用[15]，部分菌株已商业化生产（德国的Rhizo Vital?42，美国的Double Nickle），
用于马铃薯黑痣病Rhizoctonia solani和疮痂病Streptomyces scabies、黄瓜白粉病Sphaerotheca fuliginea、水
稻稻瘟病Magnaporthe oryzae和莴苣土传病害R. solani的防治[16~18]。然而，不同菌株在植物上的定殖与防
病能力存在较大差异[19]。
目前研究生防菌在植物体内定殖的方法主要有抗生素标记、荧光标记法、电镜观察、抗血清法及免疫
胶体金染色法[20]，其中抗利福平标记法为普遍接受和采用的方法，其优点是可以定量分析生防菌在植物组
织和器官中的定殖量。电镜观察法也是常用的方法之一，不仅可以获得生防菌在植物组织和器官中定殖的
直接证据，更重要的是能够直接观察到生防菌与植物细胞之间的相互作用，因此，该方法常用于生防菌与
植物互作机理以及生防机制的研究。本文利用上述两种方法研究了菌株CC09在小麦根际、根表以及根内
定殖及种群消长的特性，发现该菌在小麦根部以较高数量稳定定殖（约105 cfu/g），且根际定殖量大于根
表，这与常慧萍等[11]采用根盒试验研究固氮菌N2106-L在小麦根际的定殖结果相反，表明不同生防菌在
植物根部的定殖能力存在较大差异[15]。
内生菌在植物体内定殖是其行使生防作用的重要机制之一，但内生细菌在植物组织的定殖能力因
菌种和植物品种而异。大多数内生细菌进入根表皮细胞，然后在皮层细胞及细胞间隙扩展，甚至穿透
内皮层障碍进入木质部导管，扩展至茎、叶等器官[21~23]。但有的内生细菌则只在局部定殖而不系统扩
展。如Melnick等[24]接种内生芽孢杆菌于可可叶片不同时间后，用平板计数法只检测到该菌在叶内局
部的定殖，而未在维管束组织以及新生叶片中检测到活菌。根据透射电子显微镜观察结果，本研究证
实解淀粉芽孢杆菌菌株CC09能够在小麦根组织细胞中广泛定殖，皮层细胞、皮层细胞间隙、中柱鞘
以及髓腔组织中均有定殖，而且菌株CC09的定殖对小麦根组织细胞的超微结构无明显影响。因此，
菌株CC09为一株很有潜力的生防菌株，能够与小麦根组织细胞建立和谐的共生关系，实现稳定、长
期定殖，发挥生防效果。
管章玲等[1]曾采用平板对峙法筛选到4株芽孢杆菌NS-GWCG-X、N-WM-G、N-BoCY26和N-LJG2，
但室内盆栽试验表明这些菌株对由禾谷镰刀菌引起的麦苗赤霉病均无明显的生防效果，只有一株链霉菌
NS-QCT显示出一定的防治效果。而本研究结果显示菌株CC09发酵液对麦苗赤霉病有很高的防治效果，
使用后14 d的防效高达90.7%，显著高于链霉菌NS-QCT的防治效果。说明该菌株是潜在的高效抗禾谷镰
刀菌的生防菌，而有关该菌株防治小麦穗部赤霉病的效果有待探讨。
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