第18卷第1期2004年2月
水土保持学报
Journal of So il and W ater Conservati on
V o l.18N o.1
Feb.,2004
氮磷肥对黑土玉米农田生态系统土壤微生物量碳、氮的影响Ξ
王继红1,2,刘景双1,于君宝1,王金达1
(1.中国科学院东北地理与农业生态研究所,长春130021;2.吉林农业大学,长春130118)
摘要:通过田间氮磷肥配施试验研究了氮磷配施对黑土玉米农田生态系统玉米不同生育时期微生物量碳、氮的
影响。微生物量随玉米不同生育期的动态变化表明,氮磷肥对微生物量碳和微生物量氮的动态影响并不同步,微
生物量碳和微生物量氮变化最显著的时期均是授粉期,但此时微生物量碳是最低的谷值,而微生物量氮是最高的
峰值。不同氮磷配比对微生物量碳影响的回归分析表明,氮肥是影响微生物量碳的主导因素,无论是适量施用还
是过量施用都是氮肥对微生物量碳的影响较大。不同氮磷配比对微生物量氮影响的回归分析表明,过量氮肥的施
用减少了土壤微生物量氮的含量。磷肥无论高量和低量均能增加微生物量氮的含量,但随着施用量的增加对微生
物量氮的正效应减小。氮磷配合施用可增加土壤的微生物量氮,由此可见无论单施氮肥还是单施磷肥,过量施用
对微生物量氮的增加都是不利的,只有氮磷配合施用才是增加土壤微生物量氮的有效途径。
关键词:玉米; 黑土; 农田生态系统; 氮磷肥; 土壤微生物量
中图分类号:S154.3;S143.1;S143.2 文献标识码:A 文章编号:100922242(2004)0120035204
Effect of Fertil iz i ng N and P on So il M icrob i a l B ioma ss Carbon and N itrogen
of Black So il Corn Agroecosystem
W AN G J i2hong1,2,L I U J ing2shuang1,YU Jun2bao1,W AN G J in2da1
(1.Institu te of N ortheast Geog rap hy and A g ricu ltu re E cology,Ch inese A cad e m y of S ciences,Chang chun130021;
2.J ilin A g ricu ltu ral U niversity,Chang chun130118)
Abstract:A field experi m en t w as conducted to study the effects by m atch fertilizer N and P on m icrob ial b i om ass C and N of b lack so il agroeco system.T he resu lt of the variati on of m icrob ial b i om ass in differen t grow th p eri ods show s that the effects of fertilizer N and P on m icrob ial b i om ass C is no t sam e as on m icrob ial b i om ass N,incubati on peri od is the m o st obvi ou sly varied peri od of m icrob ial b i om ass C and N,the m icrob ial b i om ass C is at its low est bu t m icrob ial b i om ass N is at its h ighest.T he regressi on analysis indicated that fer2 tilizer N is the m ain facto r in affecting the m icrob ial b i om ass C,It show ed that the excessive u se of fertilizer N decrease the con ten t of m icrob ial b i om ass N,and fertilizer P can increase the con ten t of m icrob ial b i om ass N though it w as app lied p rop erty o r excessive,the effect decrease fo llow the increase of u se the fertilizer P. T he m atch of fertilize N and P can increase the m icrob ial b i om ass N,so w e can say that it is no t a effective w ay in increase the quan tity of m icrob ial b i om ass N by app lying fertilizer N o r fertilizer P singly,the effec2 tive w ay to increase so il m icrob ial b i om ass N is by m atch app lying of N and P
Key words:co rn; b lack so il; agroeco system; fertilizer N and P; so il m icrob ial b i om ass 土壤施入化学肥料后,土壤微生物与植物之间存在既相互依存又相互制约的关系。微生物不但能把有机养分矿化为植物可利用的无机养分,还可通过同化作用保存一部分养分。与此同时微生物不仅在矿化同化过程中造成养分的损失,有时还存在着与植物争夺有效的无机养分。土壤微生物是土壤有机质和土壤养分转化循环的动力,而土壤微生物量C、N是土壤碳素和氮素养分转化和循环研究中的重要参数,它们较为直观地反映了土壤微生物和土壤肥力状况。因此土壤微生物量对了解土壤养分转化、循环具有重要的意义[1]。同时由于微生物生长繁殖所需的最适温度、湿度及养分条件与植物相似,故可以综合反映土壤的肥力和环境质量状况[2]。因此土壤微生物量的研究近年来已经成为养分循环和生态环境保护方面研究的热点[3～6]。
本文研究了不同氮磷配比条件下玉米不同生育期、微生物量C、N的变化,了解氮磷肥向农田生态系统的输入对碳、氮循环以及环境后果的作用,为寻求适合的氮磷肥配比和用量,使作物既有较高的产量又能保持较好的土壤环境质量。
Ξ收稿日期:2003211220
基金项目:国家重大基础规划项目(1999011804-05)和吉林省科技厅资助项目(20020666)
作者简介:王继红,女,生于1966年,副教授,在读博士。主要从事土壤环境生态方面的研究工作。
表1 氮、磷2次D -饱合最优设计方案
处理号
N P 2O 5码值用量(kg hm 2) 码值用量(kg hm 2) 1
-10-102
1225-103
-101103.54
-0.131597.710.131544.945
12250.394572.1660.3945156.881103.51 材料和方法(1)供试土壤及肥料。田间试验在吉林农业大学教学试验场进行,供试土壤为黑土,其全氮含量1560m g kg ,全磷560m g kg ,pH 值7.08,有机质含量为22.3g kg 。氮素肥料采用尿素,磷肥采用三料过磷酸钙为供试肥料。(2)试验方案。试验采用二因素四水平D 饱合最优设计方案,试验设计的编码值与施肥量见表1,共设6组氮、磷不同配比
的处理。5月8日播种,磷肥作基肥,尿素作追肥于7月2日施入。分别在玉米不同生育时期用土钻采集0～20c m 土壤样品。
(3)分析方法。取新鲜土样20g (相当于干土)于100m l 烧杯,并放入能抽气的真空干燥器内,再放入一只盛有无醇氯仿的小烧杯,灭菌24h [7],然后加入0.5m o l L 的K 2SO 4(土∶水为1∶4)于灭菌后的土样中,振荡0.5h ,过滤。不灭菌土样做同样处理。微生物C 的测定采用V ance 的FE 法[7],微生物量氮的测定参见文献
[4]。
图1 玉米不同生育期微生物量C 动态变化2 结果与分析
2.1 氮磷配合施用对土壤微生物量C 的影响
2.1.1 玉米不同生育时期微生物量C 的动态变化 土壤微生
物量C 的消长反映微生物利用土壤C 源进行自身细胞建成并
大量繁殖和微生物细胞解体使有机碳矿化的过程[8]。由图1可
知,玉米整个生育期微生物量C 的变化表现出拔节期较高,拔
节、授粉期逐渐降低,成熟期又逐渐上升的趋势。这是由于玉米
拔节授粉期处于夏季气温较高时期,微生物生命活动旺盛,消
耗土壤中大量的C 源,同时作物生长正处旺盛季节对C 源需求
较多,使构成微生物体的C 源减少。玉米成熟期随着气温逐渐降低微生物活动减弱,作物也过了旺盛生长季节,土壤中多余的C 源又重新被固定在微生物体内,使微生物量增加。从不同施肥处理来看,玉米从拔节期到开花期由于只施了P 肥,因此拔节期到开花期的生物量C 变化,表现出施用不同量磷肥对土壤生物量C 的影响,拔节期不同施肥量微生物量C 没有明显变化,开花期不同施肥量间微生物量碳大小顺序为5>3(6)>1(2)>4,即其生物量C 的大小与施肥量大小并不呈现线性相关性,而是中等施P 量微生物量C 最高,其次是最高施P 量,而较低施P 量甚至低于对照微生物量C 。说明在玉米生育初期适量加入P 肥能够增加微生物量C ,而这一加入量需超过某一临界值,低于这一值反而会降低微生物量C ,施入较高量的P 肥虽然也能增加微生物量C ,但其增加幅度不如中等施P 量,这又进一步说明维持较高量的微生物量C 水平,P 肥的施用量有一个最适值,这一值即是微生物生命活动最适的环境P 量。其原因尚不清楚有待于进一步研究。
由于从开花期开始加入了不同量的N 肥,各处理随施N 量不同表现出不同的微生物量C 变化,从开花期到授粉期不同施肥处理间微生物量碳出现分异,到成熟期不同施肥处理间微生物量C 出现明显分异,表现出单施高量氮肥、磷肥的处理2、3生物量C 低于未施肥对照,而氮磷配合施用的处理4、5、6均高于未施肥对照,处理4、5、6间的比较则表现出4>6>5的顺序。这说明过量单施氮肥和磷肥都使土壤微生物量C 降低,而低量氮肥和低量磷肥配合(氮磷比为2∶1)施用微生物量碳最高。
2.1.2 微生物量C 变化的回归分析 根据D 饱合最优设计方案的编码值和施肥量以及所测得玉米授粉期和成熟期的土壤微生物量碳含量,建立二元二次回归方程分别为:
y 末受粉期=248.9+11.6N +6.6P -
73.9N 2-58.5P 2+22.1N P y 成塾期=516.8+26.7N +6.7P -171.8N 2-98.2P 2+97.6N P
所建立的回归方程理论计算微生物量碳与实际测得的微生物量碳十分接近(如表2),偏差很小,经x 2检验后(x 2值为0.046)x 2 .3)表明配置的回归方程拟合精度较高,有应用价值。分析这一回归方程的系数可以看到,施用氮肥和磷肥均可增加土壤微生物量碳,氮肥和磷肥相比,施用氮肥增加微生物量碳的效果更好。但过量施用氮肥和磷肥均可减少土壤微生物量碳含量,氮肥和磷肥相比,过量施用氮肥降低微生物量碳的作用更明显。 63水土保持学报第18卷 2.2 氮磷配合施用对土壤微生物量N 的影响 2.2.1 玉米不同生育期土壤微生物量N 的变化 微生物量氮在整个玉米生育期表现出拔节期较低,开花期表2 氮磷配施对土壤微生物量碳的变化处 理CK N 0P 0N 225P 0N 0P 103N 225P 45N 157P 103授粉期成熟期 实测值 计算值 实测值 计算值310310.85120.1120.37170168.999.899.4130129.090.189.4510509.3245.0244.0400397.5190.1188.8450447.5199.8198.8生物量氮持平或略有升高,授粉期出现高 峰到成熟期又逐渐下降的趋势。这与已有 的研究结果相类似[3～4],其原因一方面与微生物的生命活动有关,另一方面也与作物对养分的吸收、气候变化等因素有关。 图2 玉米不同生育期微生物量氮动态变化不同施肥量对生物量N 在玉米生育期的动态变化无明显影 响。但不同施肥量生物量氮含量从玉米开花期出现分异,到 授粉期和成熟期不同施肥量的微生物量氮含量差异进一步 加大。由于开花期之前未施入氮肥,因此开花期不同处理间 的微生物量氮差异反映了P 肥在玉米生长初期对微生物量 氮的影响,开花期微生物量氮的大小表现为随施磷量的增 加微生物量氮增加。这说明在玉米生育初期磷肥促进了氮 从土壤向微生物体的转化,但磷肥影响氮素同化和矿化的 机理有待于进一步研究。授粉期和成熟期不同施肥量微生 物量氮含量大小表现出一致的规律性,即处理6>3>5=4>1>2。即单施高量氮肥的处理2微生物量氮小于未施肥处理,其余氮磷配施和单施磷肥处理的微生物量氮都大于未施肥对照,其中处理6(氮磷比为1.5∶1)微生物量氮最大,即配比最小的其生物量氮最大。 2.2.2 微生物量氮变化的回归分析 根据D 饱合最优设计方案的编码值和施肥量以及所测得的玉米授粉期和成熟期土壤微生物量氮含量,建立二元二次回归方程,分别为 y 授粉期148-6.39N +70.1P -47N 2+22P 2-10N P (x 2值为0.027)x 2 2.64N +37P -16N 2+13P 2-19N P (x 2值为0.017)x 2 表3 氮磷配施对土壤微生物量氮的影响处 理CK N 0P 0N 225P 0N 0P 103N 225P 45N 157P 103授粉期成熟期实测值计算值实测值计算值70.170.252.052.236.435.88.17.7190.0189.588.187.7139.9139.666.065.8131.1129.975.975.4237.0235.9126.0125.43 讨 论 土壤微生物量的承载容量为土壤的 一个特性,是土壤可稳定保护土壤微生物 体量的能力,其大小与土壤物质的输入与 循环有关[9]。农田的养分循环决定着系统的生产力和持续性及环境后果[10],而氮磷肥向农田生态系统的输入,必然改变农田生态系统原有的物质循环和生态平衡。施用化肥对土壤微生物量影响的研究,不同研究者的结果不尽一致,加拿大的研究者认为施用化肥与不施肥相比微生物量氮无显著差异[11],英国洛桑进行的肥料定位试验也发现,长期施用无机氮肥并未增加土壤微生物碳、氮的含量[12],但也有研究者认为施用氮肥增加了土壤微生物量氮的含量[13～14]。本研究的结果则说明,黑土中氮磷肥对微生物量的影响与氮磷肥的施用量及不同配比有关。因此,我们认为,产生以上这些结果的原因,一方面与实验地区土壤碳氮供应状况有关,另一方面与化肥的施用量和不同肥料的配比有关。 本研究中微生物量随玉米不同生育期的动态变化表明,氮磷肥对微生物量碳和微生物量氮的动态影响并不同步,微生物量碳和微生物量氮变化最显著的时期均是授粉期,但此时微生物量碳是最低的谷值,而微生物量氮是最高的峰值。产生这一结果的原因是由于在玉米生长的旺季加入了氮肥,在供给玉米充足氮肥的同时,作为C 4作物的玉米必然从土壤中吸收大量的C 源来组成生物体,致使微生物处于矿化阶段,释放C 素,从而使微生物量C 降低。微生物量氮则不同,由于向土壤中加入了氮源,多余的氮源反而被微生物固定到微生物体内,使微生物量氮增加。氮素的固持无疑会增加土壤微生物氮含量,而矿化作用将使土壤微生物量氮含量降低。这一时期微生物量氮的增加对增加肥料利用率和减少环境污染尤为重要。这一时期正处于黑土区降雨旺季,氮素被固定到微生物体内,势必减少氮素养分的淋失,在作物需要氮素时微生物氮又可重新矿化而释放出来。 7 3第1期王继红等:氮磷肥对黑土玉米农田生态系统土壤微生物量碳、氮的影响 83水土保持学报第18卷 不同氮磷配比对微生物量碳影响的回归分析表明,氮肥是影响微生物量碳的主导因素,无论是适量施用还是过量施用都是氮肥对微生物量碳的影响较大。微生物量碳是组成土壤腐殖质的重要碳源,微生物量碳的增加势必促进土壤形成活性较高的新生腐殖质,对改善土壤环境质量有重要意义。因此控制氮肥用量一方面可以减少氮肥的损失和污染,另一方面还会改善碳素在土壤环境中的作用。 不同氮磷配比对微生物量氮影响的回归分析表明,氮肥的施用减少了土壤微生物量氮的含量。比较氮肥的一次项和二次项的系数可知,低量氮肥对微生物量氮的负效应低于高量氮肥,即随着施氮量的增加,氮肥对微生物量氮的负效应增加。这一结果一方面可能与氮素掩盖了微生物氮的测定,另一方面可能与氮肥的“激发效应”有关。磷肥的一次项和二次项系数说明施用磷肥无论高量和低量均能增加微生物量氮的含量,但随着施用量的增加对微生物量氮的正效应减小。而回归方程的交互项为正值则表明,氮磷配合施用可增加土壤的微生物量氮。由此可见,无论单施氮肥还是单施磷肥,增加用量对微生物量氮的增加都是不利的,只有氮磷配合施用才是增加土壤微生物量氮的有效途径。氮素的固持无疑会增加土壤微生物量氮含量,而矿化作用将使土壤微生物量氮含量降低。微生物对肥料氮的固持一方面可以减少肥料氮因挥发淋溶和反硝化而造成的环境污染,另一方面这部分氮在作物生长期间还可以释放出来,成为作物的有效氮源[15]。不同施肥量对土壤微生物量氮含量的影响,是其对土壤氮素矿化固持作用以及对土壤环境状况影响的综合反应。 参考文献: [1] 俞慎,李振高.薰蒸提取法测定土壤微生物量研究进展[J].土壤学进展,1994,22(6):42-50. 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[26] 徐香兰,张科利,徐宪立,等.黄土高原地区土壤有机碳估算及其分布规律分析[J].水土保持学报,2003,17(3)∶13-15. 土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法） 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生 物生物量碳，用一定体积的LK 2SO 4 溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微 生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。 实验试剂 1）无乙醇氯仿（CHCL 3 ）； 2）L硫酸钾溶液：称取87g K 2SO 4 溶于1L蒸馏水中 3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下， 仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 操作步骤 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 熏蒸 称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO 2 ，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 抽真空处理 熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完 全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※ 浸提过滤 从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个的滤头，一个才1元）。 TOC仪器测定 吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（Shimadzu Model TOC---500,JAPAN）为例。 计算 SMBC=(E C CHCL3—E C CK)*TOC仪器的稀释倍数*原来的水土比/ 2 土壤微生物生物量氮（茚三酮比色法） 土壤微生物生物氮一般占土壤全氮的2%—7%，是土壤中有机—无机态氮转化的一个重要环节，关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测定法，另一个是茚三酮比色法，如下 基本原理（茚三酮比色法） 玉米蛋白粉的质量及其在畜禽饲料中的应用概况 玉米蛋白粉是玉米经脱胚、粉碎、去渣、提取淀粉后的黄浆水，再经脱水制成的富含蛋白质的产品，粗蛋白质含量不低于50%（以干基计）。玉米籽粒经湿磨法工艺制得的粗淀粉乳，再经淀粉分离机分出的蛋白水，然后用浓缩离心机或沉淀池浓缩，经脱水、干燥即制得玉米蛋白粉。也有玉米蛋白粉为提取赖氨酸之后的加工副产品。我国年产玉米蛋白粉在220万吨以上。玉米蛋白粉粗蛋白在50%以上，有的高达70%，色泽金黄，是常用的蛋白质饲料原料，常用于各种动物日粮。 １玉米蛋白粉的化学组成 玉米蛋白粉粗蛋白含量在50～60%左右，含有的蛋白质主要为：玉米醇溶蛋白（Zein，68%）、谷蛋白（Glutelin，22%）、球蛋白（GIobulin，1.2%）和少量白蛋白（Albumin）。玉米蛋白粉氨基酸组成不佳，Ile、Leu、Val、Ala、Pro、G1u等含量高，而Lys、Trp严重不足。虽然玉米蛋白粉的氨基酸组成不佳，但这种独特的氨基酸组成通过生物工程来控制其水解度，可以获得具有多种生理功能的活性肽。需要注意的是：玉米蛋白粉的氨基酸总和高于豆粕和鱼粉，并且含硫氨基酸和亮氨酸含量也比豆粕和鱼粉更高，因此玉米蛋白粉可以与豆粕和鱼粉蛋白源相互补充。此外，玉米蛋白粉粗纤维含量低；代谢能与玉米相当或高于玉米；铁含量较多；维生素中胡萝卜素含量较高；富含色素。 表1玉米蛋白粉的化学组成和氨基酸组成 蛋白/% 淀粉/% 脂肪/% 水分/% 纤维/% 灰分/% 类胡萝卜素mg/kg 55～65 15～20 5～7 9～12 0.5～2.5 0.5～3.7 100～300 氨基酸 Ile Leu Val Ala Pro Glu Lys Trp 摩尔百分比 /% 2.05 8.24 3.00 4.81 3.00 12.26 0.96 0.20 2玉米蛋白粉用作饲料蛋白源 玉米蛋白粉用作鸡饲料可以节省蛋氨酸，并且着色效果明显，特别适宜作家禽饲料原料。但由于玉米蛋白粉很细，因此它在鸡配合饲料中的用量不宜过大（一般在5%以下），否则会影响鸡的采食量。玉米蛋白粉对猪的适口性较好，它与豆粕合用还可以起到平衡氨基酸的作用，其在猪配合饲料中的用量一般在15%左右。玉米蛋白粉还可用作奶牛、肉牛的蛋白质饲料原料，但因其密度大，需要配合密度小的饲料原料使用，其在精料中的添加量以30%为宜。另外，在使用玉米蛋白粉的过程中，还应该注意对霉菌（尤其是黄曲霉毒素）含量的检测。 土壤微生物量碳测定方法及应用 土壤微生物量碳（Soil microbial biomass）不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。近40年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc)来表示土壤微生物生物量的大小。测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigation-incubation, FI）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE）。 熏蒸提取法（FE法） 由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加 入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。Voroney (1983)发现熏蒸土壤用·L-1K 2SO 4 提取液提取 的碳量与生物微生物量有很好的相关性。Vance等(1987)建立了熏蒸提取法测定土壤微生物 碳的基本方法：该方法用·L-1K 2SO 4 提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取 液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换 系数K EC (取值来计算土壤微生物碳。 Wu等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。 林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。 对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数K EC 的取值，有很多研究进行了大量的 研究。测定K EC 值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用14C底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较）。提取液中有机碳的 测定方法不同（如氧化法和仪器法），那么转换系数K EC 取值也不同，如采用氧化法和一起法 K EC 值分别为（Vance等，1987）和（Wu等，1990）。不同类型土壤（表层）的K EC 值有较大不 同，其值变化为（Sparling等，1988，1990；Bremer等，1990）。Dictor等（1998）研究表 明同一土壤剖面中不同浓度土层土壤的转换系数K EC 有较大的差异，从表层0-20cm土壤的K EC 为，逐步降低到180-220cm土壤的K EC 为。 一、基本原理 熏蒸提取法测定微生物碳的基本原理是：氯仿熏蒸土壤时由于微生物的细胞膜被氯仿破 坏而杀死，微生物中部分组分成分特别是细胞质在酶的作用下自溶和转化为K 2SO 4 溶液可提取 成分（Joergensen,1996）。采用重铬酸钾氧化法或碳-自动分析仪器法测定提取液中的碳含量，以熏蒸与不熏蒸土壤中提取碳增量除以转换系数K EC 来估计土壤微生物碳。 二、试剂配制 （1）硫酸钾提取剂（·L-1）：取分析纯硫酸钾溶解于蒸馏水中，定溶至10L。由于硫酸钾较难溶解，配制时可用20L塑料桶密闭后置于苗床上（60-100rev·min-1）12小时即可完全溶解。 （2） mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：称取130℃烘2-3小时的K 2 Cr 2 O 7 （分析纯）9.806g 于1L大烧杯中，加去离子水使其溶解，定溶至1L。K 2Cr 2 O 7 较难溶解，可加热加快其溶 解。 （3） mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：取经130℃烘2-3小时的分析纯重铬酸钾4.903g， 用蒸馏水溶解并定溶至1L。 常见的微生物检测 方法 摘要：微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 概述： 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同 时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，能够从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法： 土壤微生物量氮的测定方法 1.试剂配制： (1)混合催化剂：按照硫酸钾：五水硫酸铜：硒粉=100：10：1，称取硫酸钾100g、 五水硫酸铜10g、硒粉1g。均匀混合后研细,贮于瓶中。 (2)密度为1.84浓硫酸。 (3)40%氢氧化钠：称400g氢氧化钠于烧杯中，加蒸馏水600ml，搅拌使之全部溶 解定容至1L。 (4)2%硼酸溶液：称20g硼酸溶于1000ml水中，再加入20ml混合指示剂。（按体 积比100:2加入混合指示剂） (5)混合指示剂：称取溴甲酚绿0.5g和甲基红0.1克,溶解在100ml95%的乙醇中, 用稀氢氧化钠或盐酸调节使之呈淡紫色，此溶液pH应为4.5。 (6)0.01mol的盐酸标准溶液：取比重1.19的浓盐酸0.84ml，用蒸馏水稀释至 1000ml，用基准物质标定之。 (7)0.5M K2SO4溶液：称取K2SO4 87.165g溶解于蒸馏水中，搅拌溶解，（可加 热）定容至1L。 (8)去乙醇氯仿的配制：在通风柜中，量取100毫升氯仿至500毫升的分液漏斗 中，加入200毫升的蒸馏水，加塞，上下振荡10下，打开塞子放气，而后加塞再振荡10下，反复3次，将分液漏斗置于铁架台上，静止溶液分层，打开分液漏斗下端的阀，将下层溶液（氯仿）放入200毫升的烧杯中，将剩余的溶液倒入水槽，用自来水冲洗。再将烧杯中的氯仿倒入分液漏斗中，反复3次。将精制后的氯仿倒入棕色瓶中，加入无水分析纯的CaCl2 10g，置于暗处保存。 2.试验步骤：。 （1）制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%水在25℃下培养7~15d。取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，静置5分钟，再抽滤5分钟，同样操作三次。干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。按照土：0.5M K2SO4=1:4(烘干土算，一般就是湿土：0.5M K2SO4=1：2)，加入0.5M K2SO4溶液（空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。 （2）测定：滤液要是不及时测定，需立即在-15℃以下保存，此滤液可用于微生物碳氮的测定。微生物碳测定只吸取2ml，采用重铬酸钾-硫酸亚铁滴定法测定。微生物氮吸取滤液10ml于消化管中，加入2g催化剂，在再加5ml浓硫酸，管口放一弯颈小漏斗，将消化管置于通风橱内远红外消煮炉的加热孔中。打开消煮炉上的所有加热开关进行消化，加热至微沸，关闭高档开关，继续加热。消煮至 土壤微生物测定 土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。 测定指标： 1、土壤微生物量(MierobialBiomass，MB) 能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。 目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。 因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。 此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施 用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。 熏蒸提取-容量分析法 操作步骤： （1）土壤前处理和熏蒸 （2）提取 -1K2SO 4（图将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol·L 水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min -1），用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol·L -1K2SO4提取；另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。 （3）测定 吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018 mol·L -1K2Cr2O7—12mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃ 磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。冷却后无损地转移至150mL三角瓶中，用去离子水洗涤消化管3~5次使溶液体积约为80mL， 加入一滴邻菲罗啉指示剂，用0.05mol·L -1硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色 变 为蓝色，再变为红棕色，即为滴定终点。 （4）结果计算 土壤微生物生物量碳及其影响因子研究进展3 黄辉(1陈光水(1谢锦升(1黄朝法(2 (1.福建师范大学福州350007;2.福建省林业调查规划院福州350003 摘要:笔者较为全面地综述了国内外土壤微生物生物量碳的研究成果。笔者针对土壤微生物生物量碳主要受到碳氮限制、树种类型、土地利用方式、管理措施、土壤湿度和温度、土壤质地等因素的影响,提出了今后的研究应集中在以下几个方面:(1加强不同尺度土壤微生物生物量碳的影响因子及调控机理研究;(2进一步加强不同土壤类型下土壤微生物生物量碳动态及调控机理研究;(3对影响土壤微生物生物量碳高低不确定性的因子进行深入研究;(4加强其他因子对土壤微生物生物量碳影响的研究;(5探讨全球气候变化对土壤微生物生物量碳的影响。 关键词:微生物生物量碳;土壤;影响因子;全球变化 Adva nces on Soil Microbial Biomass Ca rbon a nd Its Effect Factor Huang Hui(1Che n Gua ngshui(1Xie J ingsheng(1Huang Chaof a(1 (1.Fujia n N or mal U niversity Fuzhou350007;2.Fujian Provincial Forest ry Survey a nd Planning Institute Fuzhou350003 Abstract:The aut hors review current knowledge of t he p roperty and deter mination of soil microbial biomass carbon a nd several f act ors cont rolling its dynamics bot h at home a nd abroad.By now,t here are several f ac2 t ors influe ncing soil microbial biomass carbon w hich include inhere nt p roperties of t he soil like texture,mois2 ture and temp erature a nd etc.Besides t hese,external f act ors(C a nd N limitation,sp ecies typ e,ma nageme nt measures and diff ere nces in la nd usealso cont rol on soil microbial biomass carbon.Despite intensive resear2 ches in recent years,t he uncertainties of soil microbial biomass still re main f or f urt her studies:(1St re ngt he2 ning eff ect f act ors of soil microbial biomass carbon a nd its cont rol mecha nism at diff erent scale;(2Paying 土壤水解性氮的测定(碱解扩散法) 土壤水解性氮，包括矿质态氮和有机态氮中比较易于分解的部分。其测定结果与作物氮素吸收有较好的相关性。测定土壤中水解性氮的变化动态，能及时了解土壤肥力，指导施肥。测定原理 在密封的扩散皿中，用1.8mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液水解土壤样品，在恒温条件下使有效氮碱解转化为氨气状态，并不断地扩散逸出，由硼酸(H3BO3)吸收，再用标准盐酸滴定，计算出土壤水解性氮的含量。旱地土壤硝态氮含量较高，需加硫酸亚铁使之还原成铵态氮。由于硫酸亚铁本身会中和部分氢氧化钠，故需提高碱的浓度(1.8mol/L，使碱保持 1.2mol/L 的浓度)。水稻土壤中硝态氮含量极微，可以省去加硫酸亚铁，直接用1.2mol/L氢氧化钠水解。 操作步骤 1.称取通过18号筛(孔径1mm)风干样品2g(精确到0.001g)和1g硫酸亚铁粉剂，均匀铺在扩散皿外室内，水平地轻轻旋转扩散皿，使样品铺平。(水稻土样品则不必加硫酸亚铁。) 2.用吸管吸取2%硼酸溶液2ml，加入扩散皿内室，并滴加1滴定氮混合指示剂，然后在皿的外室边缘涂上特制胶水，盖上毛玻璃，并旋转数次，以便毛玻璃与皿边完全粘合，再慢慢转开毛玻璃的一边，使扩散皿露出一条狭缝，迅速用移液管加入10ml1.8mol/L氢氧化钠于皿的外室(水稻土样品则加入10ml1.2mol/L氢氧化钠)，立即用毛玻璃盖严。 3.水平轻轻旋转扩散皿，使碱溶液与土壤充分混合均匀，用橡皮筋固定，贴上标签，随后放入40℃恒温箱中。24小时后取出，再以0.01mol/LHCl标准溶液用微量滴定管滴定内室所吸收的氮量，溶液由蓝色滴至微红色为终点，记下盐酸用量毫升数V。同时要做空白试验，滴定所用盐酸量为V0。 结果计算 水解性氮(mg/100g土)= N×(V-V0)×14／样品重×100 式中： N—标准盐酸的摩尔浓度； V—滴定样品时所用去的盐酸的毫升数； V0—空白试验所消耗的标准盐酸的毫升数；14—一个氮原子的摩尔质量mg/mol； 100—换算成每百克样品中氮的毫克数。注意事项(1)滴定前首先要检查滴定管的下端是否充有气泡。若有，首先要把气泡排出。 (2)滴定时，标准酸要逐滴加入，在接近终点时，用玻璃棒从滴定管尖端沾取少量标准酸滴入扩散皿内。 (3)特制胶水一定不能沾污到内室，否则测定结果将会偏高。 (4)扩散皿在抹有特制胶水后必须盖严，以防漏气。主要仪器 扩散皿、微量滴定管、1/1000分析天平、恒温箱、玻璃棒毛玻璃、皮筋、吸管(2ml和10ml)，腊光纸、角匙、瓷盘。 试剂 (1)1.8mol/L氢氧化钠溶液。称取化学纯氢氧化钠72g，用蒸馏水溶解后冷却定容到1000ml。 (2)1.2mol/L氢氧化钠溶液。称取化学纯氢氧化钠48g,用蒸馏水溶解定容到1000ml。 (3)2%硼酸溶液。称取20g硼酸，用热蒸馏水(约60℃)溶解，冷却后稀释至1000ml，用稀盐酸或稀氢氧化钠调节pH至4.5(定氮混合指示剂显葡萄酒红色)。 (4)0.01mol/L盐酸标准溶液。先配制1.0mol/L盐酸溶液，然后稀释100倍，用标准碱标定。 (5)定氮混合指示剂。与土壤全氮的测定配法相同。 (6)特制胶水。阿拉伯胶(称取10g粉状阿拉伯胶，溶于15ml蒸馏水中)10份、甘油10份，饱和碳酸钾5份混合即成(最好放置在盛有浓硫酸的干燥器中以除去氨)。 (7)硫酸亚铁(粉状)。将分析纯硫酸亚铁磨细保存于阴凉干燥处。 土壤可溶性有机氮、硝态氮、铵态氮、微生物量氮最方便最简单的测定方法 1.母液制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%水在25℃下培养7~15d。取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，静置5分钟，再抽滤5分钟，同样操作三次。干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。按照土：0.5M K2SO4=1:4(烘干土算，一般就是湿土：0.5M K2SO4=1：2)，加入0.5M K2SO4溶液（未熏蒸为空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。其中熏蒸后的土壤过滤液为A母液，未熏蒸的土壤过滤液为B母液。母液要是不及时测定，需立即在-15℃以下保存 2.测定 可溶性有机氮=可溶性全氮-（铵态氮+硝态氮） 要是有流动分析仪器还有TOC的话可以利用A母液测得碳氮减去B母液的碳氮含量根据公式计算得出微生物碳氮，可以用B母液测的铵态氮、硝态氮和可溶性全氮，是很方便的。 以下的是用传统的方法测定以上指标，经过852个土壤样品试验结果还是很好的。 土壤可溶性全氮测定 氧化剂:将6g NaOH 和30g K2S2O8溶于蒸馏水中并定容至1 L(K2S2O8 比较难溶，在低于60℃得瑟水浴中溶解，高于60℃配置的溶液至其氧化性失效，NaOH制成溶液，致其温度达到常温后与K2S2O8 溶液混合定容至1L) 测定：移取A母液10ml至消化试管，加入10ml氧化剂，水浴中加热，温度升高到120℃后保持90min，使用紫外分光光度计测定A220和A275，空白需加入1ml氧化剂并同时作水浴处理。（Tips：农化上母液与氧化剂各取25ml，此处取其比例为1:1。） 标准曲线：0.7218g硝酸钾溶于水中，转入1000ml容量瓶中定容摇匀，制得浓度为100mg/L的氮标准贮存液。稀释10倍即为10mg/L 的氮标准溶液。吸取氮标准溶液（梯度为0ml，1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml；对应浓度分别为0 mg/L，0.02 mg/L，0.04 mg/L，0.06 mg/L，0.08 mg/L，0.10 mg/L，0.12mg/L）于50ml容量瓶中，各加入1ml 氧化剂并定容，得氮的标准系列，与样品同样消煮测定A220和A275。以A（A= A220-A275）为纵标，氮浓度为横标绘制标准曲线。 硝态氮测定1 注：硝态氮测定1仅适合于农田土壤，腐殖质含量比较低的土壤，森林土壤和腐殖质含量比较高的土壤不适用，因为森林土壤和腐殖质高的土壤有腐植酸的颜色，干扰比色可采用硝态氮测定2进行测定 1. 土壤微生物生物量的测定 (滴定法 一、实验目的和内容 土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5~10μm 3活的微生物总量, 是土壤有机质中最活跃的和最易变化的部分。耕地表层土壤中,土壤微生物量碳(Bc 一般占土壤有机碳总量的 3%左右,其变化可直接或间接地反映土壤耕作制度和微生物肥力的变化,并可以反映土壤污染的程度。近 30年来,国外许多学者对土壤微生物生物量的测定方法进行了比较系统的研究,但由于土壤微生物的多样性和复杂性,还没有发现一种简单、快速、准确、适应性广的方法。目前广泛应用的方法包括:氯仿熏蒸培养法(FI 、氯仿熏蒸浸提法(FE 、基质诱导呼吸法(SIR 、精氨酸诱导氨化法和三磷酸腺苷(A TP 法。 氯仿熏蒸浸提法(FE 的原理是:土壤经氯仿熏蒸处理,微生物被杀死,细胞破裂后, 细胞内容物释放到土壤中,导致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物生物量碳。 二、实验材料和用具 仪器:培养箱;真空干燥器;真空泵;往复式振荡机(速率 200次每 min ; 1L 广口玻璃瓶;定量滤纸;紫外分光光度计; LNK-872型消煮炉(江苏省宜兴市科教仪器研究所试剂: 1. 无乙醇氯仿:市售的氯仿都含有乙醇(作为稳定剂 ,使用前必须除去乙醇。方法为:量取 500ml 氯仿于 1000ml 分液漏斗中,加入 50ml 硫酸溶液[ρ(H2SO 4=5%], 充分摇匀, 弃除下层硫酸溶液, 如此进行 3次。再加入 50ml 去离子水, 同上摇匀, 弃去上部的水分,如此进行 5次。将下层的氯仿转移存放在棕色瓶中,并加入约 20g 无水 K 2CO 3,在冰箱的冷藏室中保存备用。 2. 硫酸钾溶液 [c(K2SO4=0.5mol·L -1]称取硫酸钾(K 2SO 4,化学纯 87.10g ,先溶于 土壤微生物生物量的测定方法 1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。 1.2 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。 1.3 实验试剂 1）无乙醇氯仿（CHCL3）； 2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中 3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 1.4 操作步骤 1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 1.4.2 熏蒸 称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子， 用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 1.4.2 抽真空处理 熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。（注意：熏蒸后不 可久放，应该快速浸提）※ 1.4.4 浸提过滤 从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡 30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1元）。 1.4.5 TOC仪器测定 吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（Shimadzu Model TOC---500,JAPAN）为例。 1.5 计算 膨化玉米及在饲料工业中的应用 引言 “科技是第一生产力，科技就是财富”，膨化技术已让更多的饲料生产商感受到这一切。大豆、玉米、饼粕脱毒、血粉、羽毛粉、肉骨粉、米糠、豌豆、糊化玉米尿素、屠宰下脚料、宠物食品、组织蛋白、全价料……，1. 膨化玉米简介 国内很早就有用挤压膨化生产膨化玉米，但自2003年来，高效养殖业对膨化玉米的需求急剧增加，由于膨化玉米目前尚未有相关的标准，因此整个膨化玉米市场比较混乱，有些关于膨化玉米的介绍也仅限于试验机型。本文是膨化技术及应用系列讲座之一，主要根据众多膨化机用户反馈回来的信息归纳整理而成，很多数据资料均来自第一生产现场，基本上反映了目前国内膨化玉米生产现状，希望对现有膨化机用户及欲从事膨化玉米生产的客户提供一些参考。 首先让我们来了解一下为什么要膨化玉米。 玉米作为饲料中最重要的能量源，其籽粒成分含70～75%的淀粉，由于生玉米内其淀粉分子聚集成致密的淀粉粒结构，淀粉粒内存在相当比例抗酸抗酶的晶体结构而不利于动物的消化利用，必须让晶体结构解体（即糊化）才能被酶充分水解而提高消化率。幼龄动物特别是早期断奶仔猪消化器官尚未发育成熟，消化酶活性很低，研究表明仔猪在出生后42天内都存在淀粉酶分泌不足的问题，并且由于断奶应激使消化酶活性增长出现倒退，常常因淀粉消化不良导致腹泻，影响生产性能。当玉米膨化后，淀粉糊化，使淀粉晶体结构不可逆地被破坏，在动物小肠内迅速吸水膨胀，大大增加了淀粉酶的作用面积和穿透能力，使淀粉的水解速度和消化程度均提高，同时，糊化淀粉大幅度提高了ɑ-淀粉酶的敏感度，使其作用更迅速。此外，糊化淀粉还会刺激幼畜胃内产生乳酸，可防止病原微生物的产生，从而减轻和消除仔猪下痢。 对于水产动物，糊化淀粉的影响也甚为显著，虹鳟对生淀粉的利用率仅为20～24％，而熟淀粉为52～70％；鲤鱼对熟淀粉的消化率高达96％，而生淀粉为38％。水产饲料中的糊化淀粉还增强了饲料的粘结性能，提高其在水中的稳定性。 正是由于以上原因，糊化淀粉在幼畜料、特种饲料、水产饲料中大量应用，挤压膨化也成为一种重要的淀粉糊化手段。实际上，在这些饲料中不仅玉米需要膨化，其它用作能量饲料的谷物都需要膨化。 2. 挤压膨化玉米工艺 我们再看看典型的挤压膨化玉米工艺过程。 玉米膨化是在水分、热、机械剪切及压力差的综合作用下的淀粉糊化过程。当物料与蒸汽和水混合时，淀粉的非结晶区开始吸水膨胀，通过膨化腔时，迅速升高的温度及螺旋叶片的揉捏使淀粉加速吸水，晶体结构开始解体，氢键断裂，膨胀的淀粉粒开始破裂，变成一种粘稠的熔融体，在出口处由于瞬间的压力降，水分闪蒸使大量的膨胀淀粉粒崩解，淀粉糊化。高温、高压及机械剪切使挤压膨化比其他加工方式产生的淀粉糊化更彻底，一般糊化度可达80～100％，与常规的煮熟工艺相比，能使植物细胞壁破裂，淀粉链更短从而更有 一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法） 1、试剂配制 去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。 硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。 六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。 过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。 磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。 邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。 2、仪器设备 土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。 1–真空干燥器，2–装土壤烧杯，3–装氯仿烧杯4–磨口三通活塞5–真空表 6–缓冲瓶7–抽真空管8–增压泵9–控制开关10–进水口11–出水口 （图6–1 土壤熏蒸抽真空装置） 3、操作步骤 （1）土样前处理 新鲜土样应立即进行前处理或保存于4℃冰箱中。测定前先仔细除去土样中可见的植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径< 2mm）并混匀。如土样过湿，应在室内适当风干至土样含水量约为田间持水量（Water-holding capacity，WHC）的40%（以手感湿润疏松但不 二、土壤微生物量碳、氮的测定方法—熏蒸提取法 1．主题内容与适用范围 本方法采用氯仿熏蒸—提取测定土壤微生物量碳、氮，适用范围广，既适用于中性和微碱性土壤，也适用于强酸性土壤，并且适用于滞水土壤（如水稻土）和新施有机肥土壤。 2．方法提要 土样经氯仿熏蒸和未熏蒸两种不同处理后，用K 2SO 4 溶液浸提，提取液一部分用K 2 CrO 7 （重络酸钾）氧化法测定微生物量碳，另一部分用浓H 2SO 4 消煮、碱化蒸馏法测定微生 物量氮。 3．提取液的制备 3.1仪器、设备：抽气皿（真空干燥器）、无醇氯仿、抽气机、大铝盒、分析天平（感量： 0.01g）、小烧杯（50ml）、大塑料瓶（250ml）、大三角瓶（150ml）、40C的 冰箱、定量滤纸（15cm）、漏斗、保鲜膜 3.2试剂的制备：0.5 M K 2SO 4 溶液（化学纯）、 无醇氯仿（提纯方法：用1N H 2SO 4 溶液与氯仿(CHCl 3 三氯甲烷)按体积比2:1 于分液漏斗中振荡混匀，净置分离，共做3次；再用水代替硫酸与氯仿2:1 混匀，振荡分离，共5次，将提纯的氯仿放入到棕色试剂瓶中，加一勺无 水硫酸钠，保存） 3.3分析步骤： 3.3.1 称取12.50g鲜土(取土要准确、均匀，不要夹入有机残体)于大铝盒中。在抽气皿中放入盛有25ml无醇氯仿的小烧杯，小烧杯中放几张小纸片以便于观察沸腾。放入装土的大铝盒，连上抽气机，抽真空使氯仿沸腾5分钟，关紧活塞，关闭抽气机。包上黑布，置于阴暗处（250C）熏蒸24小时。到时间后，取出小烧杯后反复抽真空2~3次（每次5分钟），排除氯仿。 另称取一批同等重量的土放入大塑料瓶中，不做熏蒸处理，同样包上黑布，置于阴暗处24小时。 3.3.2 将步骤(3.1.1)中的两批土样转移到离心管中（红壤适宜离心管）。用注射器注入每 瓶50ml 0.5M K 2SO 4 溶液，盖紧瓶塞，振荡30分钟，离心5分钟后取出，用15ml定量滤纸 过滤到150ml大三角瓶中，应立即测定。如不立即测定，用保鲜膜封口（防止污染和挥发），保存在40C的冰箱中。 4．生物量碳的测定—K 2CrO 7 氧化法 4.1仪器、设备：DOC测定仪(冷凝装置4套、配套沸瓶装16个)、玻璃沸珠、1500W电炉两 个、变压器两个、滴定管（25ml） 4.2试剂的制备：蒸馏水、混合酸(浓硫酸:浓磷酸=2:1,分析纯) 、0.1000N K 2CrO 7 标准溶 液 邻菲罗啉指示剂、66.7mM（0.4 N）K 2CrO 7 溶液（19.6125g/L，分析纯） 0.02M (NH 4) 2 Fe(SO 4 ) 2 溶液：取15.69g/L溶于蒸馏水，用20ml浓硫酸（98%， 分析纯）酸化，而后定容至1L、4.3分析步骤： 4.3.1吸取2ml 0.4 N K 2CrO 7 溶液放入沸瓶，再吸15ml 混酸放入沸瓶，混合，加入等量的 玻璃球（约一小药匙，10个）。吸取步骤（3.2.2）中的过滤液8~10ml（根据含碳量多少而 1.23.1 土壤微生物碳的测定——TOC-V CPH有机碳分析仪 一、方法原理 土壤有机碳的测量方法主要有两种，即氯仿熏蒸培养法和氯仿熏蒸—直接浸提法。 1．氯仿熏蒸培养法[1]：土壤经氯仿熏蒸后再进行培养，测定培养时间内熏蒸与未熏蒸处理所释放CO2之差来计算土壤生物量碳。 2．氯仿熏蒸直接浸提法[2]：土壤经氯仿熏蒸后直接浸提进行，测定浸提液中的碳含量，以熏蒸和不熏蒸土壤中总碳的差值为基础计算土壤微生物含碳量。 直接提取法与氯仿熏蒸培养法相比，直接提取法具有简单、快速、测定结果的重复性较好等优点。直接提取法测定土壤微生物量的碳的方法日趋成熟。现在氯仿熏蒸—K2SO4提取法已成为国内外最常用的测定土壤微生物碳的方法。本实验以氯仿熏蒸直接浸提法为例介绍土壤微生物量碳氮的浸提与测定。 二、主要仪器 振荡机、真空干燥器、真空泵、TOC-V CPH有机碳分析仪。 二、试剂 1．氯仿（去乙醇）：普通氯仿一般含有乙醇作为稳定剂，使用前要去除乙醇。将氯仿按照1︰2（v/v）的比例与蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分振动，慢慢放出底部氯仿，重复3次。得到的无乙醇氯仿加入无水CaCl2，以除去氯仿中的水分。 2．0.5 mol·L-1 K2SO4浸提液：43.57g分析纯K2SO4定溶至1L。 四、操作步骤 称取过2mm筛的新鲜土样12.5g六份，置于小烧杯中。将其中三份小烧杯放入真空干燥器中，干燥器底部放3个烧杯，其中一个放氯仿，烧杯内放少许玻璃珠（防爆），另一个放水（保持湿度），再放一杯稀NaOH。抽真空时，使氯仿剧烈沸腾3-5 min，关掉真空干燥器阀门，在暗室放置24 h。熏蒸结束后，打开干燥器阀门，取出氯仿，在通风厨中使氯仿全部散尽。另三份土壤放入另一干燥器中，但不放氯仿。 将熏蒸的土样全部转移至150 mL三角瓶中，加入50mL 0.5 mol·L-1 K2SO4 (土水比为1:4)，振荡30min，过滤。未熏蒸土样操作相同，同时做空白。 五、结果计算 土壤微生物量碳 =（熏蒸土壤有机碳-未熏蒸土壤有机碳）/0.45 式中：0.45——将熏蒸提取法提取液的有机碳增量换算成土壤微生物生物量碳所采用的转换系数（kEc)。 一般量容法采用的kEc值为0.38，仪器分析法kEc 取值0.45。 六、注意事项 1．氯仿致癌，操作时应在通风厨中进行。 2．打开真空干燥器时，要听声音，如没空气进去的声音，试验需重做。 3．应注意试剂的厂家，有些厂家的K2SO4试剂不宜浸提土壤微生物量碳。 4．浸提液应立即用TOC-V CPH有机碳分析仪测定或在-18℃下保存。 1.23.2土壤微生物量氮的测定 一、方法原理 土壤微生物态氮是土样在CHCl3熏蒸后直接浸提氮含量，并进行测定，以熏蒸和不熏蒸土壤微生物生物量的测定方法
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