网络出版时间：2012-10-16 17:38
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高效液相色谱法测定酸奶中四种有机酸
Determination of 4 organic acids in yogurt by high-performance
liquid chromatography
田辉1,2孙懿琳1,2周元良1,2霍贵成1,2
TIAN Hui1,2SUN Yi-lin1,2ZHOU Y uan-liang1,2HUO Gui-cheng1,2
（1.乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150030；2.东北农业大学，黑
龙江哈尔滨150030）
(1.Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Harbin, Heilongjiang 150030, China;
2.Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang 150030, China)
摘要：测定酸奶中风味有机酸，精确评价酸奶风味，并对比3种发酵剂的发酵性能。使用3种直投式发酵
剂以半工业化方式生产酸奶，测定3种酸奶在发酵及冷藏过程中的酸度变化，感官评定酸奶成品，并通过
高效液相色谱法（HPLC）分析酸奶中的4种有机酸成分（乳酸、柠檬酸、丙酮酸及甲酸）。结果表明：3
种发酵剂产酸迅速，所产酸奶品质优良，M与自制发酵剂后酸化弱。冷藏期间3种酸奶中有机酸含量的变
化存在细微差异。利用高效液相色谱法有效测定了酸奶中4种有机酸（乳酸、柠檬酸、丙酮酸及甲酸），成
功评定了3种发酵剂的的发酵性能。
关键词：高效液相色谱；有机酸；酸奶；感官评定
Abstract: The research is to determine the organic acids in yogurt by high-performance liquid chromatography
(HPLC), evaluate the flavor of yogurt by sensory evaluation, and compare the performances of 3 cultures. Three
kinds of direct-vat-set cultures were used to produce yogurt respectively in a semi-industrialized way, and then the
acidities of yogurt during fermentation were determined. Sensory evaluation was made to assess the quality of
yogurt, and 4 kinds of organic acids (lactic, citric, pyruvic and formic acids) in yogurts were determined by HPLC.
Results: It showed that all 3 cultures had quick acidity production, and all yogurt was proved to hold high qualities.
The culture M and the self-made culture showed a weak post acidification while N culture showed strong. Some
differences of the organic acids contents among 3 kinds of yogurt were observed. 4 organic acids (lactic, citric,
pyruvic and formic acids) in yogurt were determined effectively by HPLC, and the performances of 3 cultures
基金项目：教育部长江学者和创新团队发展计划项目（编号：IRT0959）
作者简介：田辉(1984—)，男，东北农业大学在读博士研究生。E-mail：tdairy09@https://www.doczj.com/doc/3518239028.html,
通讯作者：霍贵成
were evaluated successfully in this experiment.
Key words: high-performance liquid chromatography;organic acid; yogurt; sensory evaluation 酸奶作为一种时尚的健康食品被越来越多的人所喜爱[1]，而优良的风味是其被消费者接受的前题，其中有机酸是酸奶风味物质中的重要成分。乳制品中天然有机酸的来源主要有：乳脂肪的水解（自由脂肪酸如乙酸、丁酸），牛的生理代谢（柠檬酸、乳清酸、尿酸），以及细菌代谢（乳酸、乙酸、丙酮酸、丙酸、甲酸）。乳酸菌的分解代谢也会产生这些产物，同型乳酸发酵将几乎全部的碳源经丙酮酸代谢转化为乳酸，也可以产生其它有机酸及风味代谢产物[2]。有机酸的产生，抑制了有害菌的繁殖，提高了食品的安全性，同时还是发酵乳风味的重要来源[3]。对酸奶中有机酸成分进行定性和定量分析，有助于人们更好地对生产过程与产品品质进行控制，同时，随着酸奶发酵剂研究的逐渐兴起[4]，准确分析乳酸菌的有机酸代谢将有利于优良发酵剂的筛选与选育。
本试验以硝酸法处理酸奶样品，采用高效液相色谱法（HPLC）对酸奶中4种有机酸进行定性和定量的检测，对比3种酸奶中有机酸成分的差异，为酸奶的风味分析及酸奶发酵剂的性能评价提供了理论根据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
商业直投式发酵剂M：工业生产用，市售；
商业直投式发酵剂N：家庭用，市售；
自制发酵剂：本实验室研制；
鲜牛奶：阿城牧场；
蔗糖：市售食品级；
乳酸、甲酸、丙酮酸：色谱纯纯（99.5%），美国Sigma公司；
氢氧化钠、硝酸、冰乙酸：分析纯，天津化学试剂一厂。
生化培养箱，GL-20G-Ⅱ，上海佳胜实验设备有限公司；
冰箱，HVE-50，海尔集团；
pH计，DELTA320，美国Mettler Toledo公司；
高效液相色谱仪，2695，美国Waters公司；
色谱柱，HPX-87H，美国Bio-RAD公司；
离心机，GL-21M，上海市离心机械研究所。
1.2 试验方法
1.2.1 半工业化生产酸奶鲜牛奶在乳品车间生产线进行前处理、冷却与投菌，分别经过滤、加蔗糖（6%）、标准化、均质、灭菌，最后冷却至43 ℃，分别将M、N及自制发酵剂接入灭菌乳中并搅拌均匀，迅速分装至30个100 mL无菌小烧杯中，置于43 ℃恒温箱中发酵。每隔1 h分别取出3种酸奶中3个平行小烧杯，测定pH值。待pH 4.3～4.4时，将该组样品迅速转移至4 ℃冰箱冷藏。冷藏1 d时取样品进行感官评定。冷藏1，5，9，13 d取样测定pH，同时进行风味有机酸分析，每种酸奶3个平行。
1.2.2 酸度测定取小烧杯样品，将酸奶轻轻搅拌均匀，分别取出约15 mL进行酸度测定。其中pH值采用DELTA320精密pH计直接测定；滴定酸度采用GB 5413.34——2010，每个样品测定3次，计算平均值。
1.2.3 感官评定参照美国农业部（USDA）评定瑞士酸奶扣分卡系统[5]，并作相应修改,见表1，对冷藏1 d的3种酸奶分别进行感官评定。评定系统分为风味、组织结构和表观三部分，针对每项采取扣分制原则，扣分越多表明产品缺陷就越多。选择有感官评定基础知识和经验者10人，在酸奶搅拌前进行表观评定，再将酸奶轻轻搅拌均匀进行组织结构评定，最后进行风味评定，计算平均值，并利用SPSS 16.0软件通过单因素方差分析，分别对风味、组织结构和表观评分进行差异显著性分析。
表1 感官评定扣分详细表
Table 1 Punishment of the Organoleptic Evaluation
评定项目扣分指标
（风味每项扣1～10分，组织结构与表观每项扣1～5分）
风味 1.苦味；2.蒸煮味；3.外来异味；4.涩味；5.过酸；6.甜度过高；7.风味不正；8.酸度不足；
9.甜度过低；10.原料陈旧味；11.有酵母味；12.氧化味；13.酸败味；14.不洁净味；15.
不自然风味
组织结构 1.有颗粒；2. 过软
表观 1.析出乳清；2.表面不平整；3.皱缩
1.2.4 有机酸的测定采用高效液相色谱法[6]。
(1) 样品处理：3 mL酸奶与50 μL的68%硝酸混合，再用1 mL的5 mM的流动相硫酸稀释。14 000×g 离心30 min。用1 mL注射器吸取中间层清液，经0.22 μm滤膜过滤到进样瓶中约1.5 mL。每个样品3个平行处理。
(2) 机器参数：5 mM H2SO4的流动相，0.5 mL/min流速，10 μL进样量，检测温度35℃，树脂基柱，最大柱压1 500 Pa，每个样品检测时间25 min，紫外吸收检测器，检测波长210 nm。
(3) 操作要点：开启机器并运行至基线平稳后开始进样。用1 mg/mL标准样品确定保
留时间，再根据样品中相应峰的面积，每个标样配制5个梯度浓度，使在样品中浓度范围附近。每个浓度标样测定平行测定3次，并计算平均值。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，利用Excel 软件绘制标准曲线。待测样品每个样品平行测定3次，计算平均值，通过回归方程计算浓度。
2 结果与分析
2.1 发酵过程中的酸度变化
发酵期间的酸度变化是发酵剂活力的体现，直投式发酵剂由于经过冷冻干燥处理，活菌数和菌活力降低。初始活菌数（即接种量）低、菌活力恢复慢，会导致延迟期增加，进而会增加生产成本，甚至影响酸奶品质。因此，乳酸菌活力的迅速恢复是直投式发酵剂的首要性能。
0 h （未发酵）奶的pH 为6.58，滴定酸度为15.63 °T ，如图1所示，发酵剂在1 h 左右就进入对数期，可见发酵剂活力恢复较快。4 h 后酸度平缓增加，而这种趋势非常利于控制发酵的终止。5 h 时自制发酵剂与商业发酵剂H 发酵pH 值分别达到4.32，4.34，滴定酸度分别为91.9，86 °T 。而家庭式发酵剂产酸较慢，至5.5h 时pH 值达到4.39滴定酸度91.7 °T 。一般来说，酸奶pH 范围为4.2～4.5，乳酸最大量在0.9%（即100 °T ）左右[7]，均符合酸度要求。
44.555.566.5
70
1
2
345
6
20406080100时间 Time/hour
p H
滴定酸度 T i t ration
A c i d /°T
N-pH M-pH 自制-pH N M 自制
图1发酵过程中酸奶的酸度变化 Fig. 1 Acidity of Yogurt during Fermentation
2.2 冷藏期间的酸度变化
由图2可知，两种商业发酵剂和自制发酵剂生产酸奶，其pH 值在前9 d 为下降趋势，第9天至13天保持稳定。工业用直投式发酵剂M 与自制发酵剂在冷藏过程中，后酸化现象较弱，前9 d pH 分别由4.34和4.39下降至4.16和4.15。而家庭用直投式发酵剂N 的后酸化较强，到第9天，pH 已降至3.98，说明发酵剂N 作为家庭用发酵剂，虽然在产品风味与质构方面达到较高水平，但只能在短时间内食用。
3.9
44.14.2
4.3
4.44.50
1
5
9
1360
708090
100
110120130时间 Time/day
p H
滴定酸度 T i t r a t i o n A c i d /°T
M pH N pH 自制 pH M 滴定N 滴定自制 滴定
图2冷藏期间酸奶的酸度变化
Fig. 2 Acid changes of Yogurt during Cold-storage
酸奶后酸化的原因，主要由保加利亚乳杆菌在冷藏期间继续产酸导致，低温和低pH 环境使嗜热链球菌的代谢被抑制，但保加利亚乳杆菌由于具有较强的耐酸力，虽然低温一定程度降低了乳酸菌产酸关键酶活力，但代谢活动并未完全停止。产酸关键酶活力与后酸化之间存在紧密联系，如果保加利亚乳杆菌中酸代谢中的酶在低温下失去活力或很弱，那其所产酸奶的后酸化就会很弱。通过试验结果可知，自制发酵剂中的保加利亚乳杆菌为一株弱后酸化菌株，弱后酸化能力与商业发酵剂不相上下。 2.3 感官评定
由表2可知，3种酸奶在风味、组织结构和表观方面虽然有差异，但差异不显著（P>0.05），其中，组织结构和表观相差不大，都达到了较高水平。在风味方面，发酵剂N 与自制发酵剂所产酸奶扣分略高于发酵剂M 所产酸奶，而扣分主要集中在酸味方面。感官评定时间为
冷藏1 d，此时3种酸奶酸度都在适宜范围内，但发酵剂N所产酸奶酸度略高于发酵剂M与自制发酵剂所产酸奶，而自制发酵剂的酸味稍偏于柔和，可能与有机酸中不同成分的比例所致。
表2感官评定扣分表?
Table 2 Results of Organoleptic Evaluation
酸奶风味组织结构表观
M 18.10± 0.458 a 2.22± 0.147 a 3.70± 0.260 a
N 19.10± 0.379 a 2.50± 0.167 a 3.80± 0.249 a
自制19.20± 0.327 a 2.40± 0.163 a 3.80± 0.249 a
?a表示组间差异不显著性（P>0.05）。
2.4 风味有机酸分析
有机酸在210 nm处有强吸收峰，Fernandez-Garcia E等[8]利用高效液相色谱法，通过紫外吸收检测器（210 nm），测定并分析了酸奶中的乳酸、柠檬酸、乙酸、丙酮酸、乳清酸、尿酸、甲酸及马尿酸。
表3 标准样品的相关信息
Table 3 Relative Information of Nominal Samples
峰号名称保留时间/min 回归方程线性系数R2RSD/%
1 柠檬酸9.326
2 y = 1 182 706.8676 x -8 985.400 0 0.999 9 2.73
3 丙酮酸10.71
4 6 y = 9 993 535.7354 x– 6 548.400 0 0.999 9 2.42
7 乳酸14.604 8 y = 858 582.8571 x– 8 822.200 0 0.999 9 1.30
8 甲酸16.122 1 y = 743 914.6954 x + 855.800 0 0.991 1 1.52 2.4.1标准曲线的绘制及精密度和回收率标准样品的标准曲线如表3所示，其中x表示样品浓度（mg/mL），y表示峰面积。由线性相关性系数R2可知，回归方程有很好线性，并且由RSD的范围表明具有较高精密度。
采用加标回收率方法评定方法准确度，向样品酸奶中分别加入标准样品，测定加入前后样品浓度，计算回收率。由结果可知，回收率在96%～103%，具有较好准确度。
表4 回收率试验结果
Table 4 Results of the Recovery Experiment
名称样品酸奶中测得量
/(mg·mL-1)
添加量
/(mg·mL-1)
添加后测得量
/(mg·mL-1)
RSD/% 回收率/%
柠檬酸 1.62 2.00 3.54 2.60 96 丙酮酸 0.03 0.07 0.10 2.47 98 乳酸 6.94 10.00 17.24 1.33 103 甲酸
0.04
0.10
0.14
1.50
96
2.4.2有机酸成分分析 通过高效液相色谱试验图3发现，冷藏期间3种酸奶样品在210 nm 波长处的吸收峰主要有10种（0号峰为溶剂峰）。
图3 酸奶中有机酸成分的高效液相色谱图 Fig.3 HPLC Figure of Organic Acids in Yogurt
乳酸是乳酸菌发酵代谢的主要产物，是酸奶中最主要的有机酸。由图4可知，3种酸奶在冷藏前5 d 乳酸浓度增加较快，至第9天，乳酸浓度趋于稳定，其中M 与自制发酵剂产酸奶中乳酸含量在6.5～7.0 mg/mL ，而N 发酵剂产酸奶中乳酸含量却高达8.25 mg/mL ，第9天至13天，乳酸浓度基本保持相同水平。乳酸含量的变化趋势基本与表4中酸奶滴定酸度的趋势一致，说明乳酸是影响酸奶后酸化的主要因素。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
时间 Time/min
吸光度a b s o r p t i o n /A U
0123456789
1
5
913
时间 Time/day
浓度 C o n c e n t r a t i o n /m g /m L
M N 自制
图4 冷藏期间酸奶中乳酸含量变化
Fig. 4 Content Changes of Lactic Acid during Cold-store
乳酸与有机酸的比例会对发酵乳制品的风味产生影响，Gonzalez de LD 等[9] 测得贮存3d 的奶酪中乳酸占总酸含量75%，而由表5可知，3种酸奶乳酸含量在总酸中比例为60%～80%，即与文献[9]结果一致。
表5 几种有机酸成分的分析?
Table 5 Analysis of Several Organic Acids
指标
冷藏时间/d
1
5 9 13 M
N 自制 M N 自制 M N 自制 M N 自制 滴定总酸 8.1 8.28 7.92 8.325 9.9 8.37 9.045 10.89 9.09 9.09 11.07 9.18 乳酸 5.108 6.068 5.226 6.577 7.578 6.409 6.584 8.25 6.987 6.58 8.312 7.245 乳酸/总酸
0.631
0.733
0.66
0.79
0.765
0.766
0.728
0.758
0.769
0.724
0.751
0.789
? 滴定总酸（mg/mL ）以乳酸计量表示，即滴定吉尔涅尔度（°T ）×0.009；乳酸含量（mg/mL ）为高效液相色谱试验所得。
原乳中即含有较高量的柠檬酸，乳中大部分柠檬酸与Ca 2+及Mg 2+结合形成相溶性络合物，少量柠檬酸与酪蛋白微团结合形成胶体微粒[8]。柠檬酸是重要的风味前体物质[9]，能分
解生成羰基化合物，如丙酮和2,3-丁二酮等。由图5可知，冷藏期间，3种酸奶中柠檬酸未呈现规律性变化，含量在1.3～1.9 mg/mL 波动，相比于文献[8]报道的酸奶中2.3 mg/g ，自制发酵剂发酵酸奶中柠檬酸含量偏低。
00.5
1
1.5
2
1
5
913
时间 Time/day
浓度 C o n c e n t r a t i o n /m g /m L
M
N
自制
图5 冷藏期间酸奶中柠檬酸含量变化
Fig. 5 Content Changes of Citric Acid during Cold-store
丙酮酸是乳酸菌糖酵解（EMP ）产生的重要产物，糖类物质首先转化为丙酮酸，同型乳酸发酵中几乎全部丙酮酸都会生成乳酸，但也会产生其他代谢产物，包括双乙酸和乙醛等风味物质[10]。由图6可知，冷藏期间，3种酸奶中丙酮酸含量差异很大，其中，M 酸奶中丙酮酸随冷藏时间延长呈现先增加后稳定的变化，而N 与自制发酵剂发酵的酸奶却相反，即先降低后稳定，这一现象或许可以从弱后酸化的角度进行解释，M 发酵剂发酵的酸奶在冷藏期间显示了非常弱的后酸化能力，推测M 中乳酸菌糖酵解产生丙酮酸后，由于低温抑制了乳酸脱氢酶的活力，而使丙酮酸停止转化，导致丙酮酸的堆积；而N 发酵剂后酸化力强，冷藏期间继续代谢丙酮酸而产生更多乳酸。自制发酵剂产酸奶中丙酮酸含量也呈降低趋势，但其后酸化现象并不明显，可能是由于丙酮酸转化生成乳酸的途径中断后，丙酮酸向其它代谢途径进行转化。
00.010.020.030.04
0.050.06
1
5
913
时间 Time/day
浓度 C o n c e n t r a t i o n /m g /m L
M
N 自制
图6 冷藏期间酸奶中丙酮酸含量变化
Fig. 6 Content Changes of Pyruvic Acid during Cold-store
酸奶发酵过程中，嗜热链球菌会产生甲酸，能促进保加利亚乳杆菌的生长[10]。由图7可知，3种酸奶中甲酸含量没有明显差异，在0.04～0.06 mg/mL 。
00.010.020.030.040.050.06
1
5
913
时间 Time/day
浓度 C o n c e n t r a t i o n /m g /m L
M N 自制
图7 冷藏期间酸奶中甲酸含量变化
Fig. 7 Content Changes of Formic Acid during Cold-store
3 结论
（1）本试验以半工业化方式生产酸奶，3种发酵剂产酸奶感官品质优良，评定差异不显著（P>0.05）。
（2）高效液相色谱法可有效测定酸奶中4种有机酸，3种酸奶中有机酸存在细微差异，这是由于相应发酵剂因使用方向不同（工业和家庭）而具有不同产酸特性。
（3）尽管酸奶成品在感官评分上无显著性差异，但其中有机酸生成种类和含量上的细微差异，可以作为今后发酵剂制作时优选菌株和调整发酵参数时的重要依据。自制直投式发酵剂在商业开发领域中存在的巨大潜力，将推动此项研究继续进展。
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注：供《食品与机械》杂志专用，未另投其他刊物
高效液相色谱方法的验证 ?方法验证的目的 ?方法验证的内容 ?方法验证的项目及测定方法
方法验证的目的 目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。 方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。
方法验证的内容 ?准确度 ?精密度 ?专属性 ?检测限 ?定量限 ?线性和范围 ?耐用性
准确度 定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率%表示。 1. 主成分含量测定 原料药：对照品或方法比对 2. 制剂、中药：标准加样回收 杂质定量 测定：加样回收（n 3 9） 杂质对照品 方法比对 回收率 C-A %=′ B 100% 杂质与主成分的相对含量 A:试验供试品中被测成分的量 （通常为含量测定量的50%） B: 试验供试品中加入的对照品的量 （通常为±20%） C:试验测定值
精密度 定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差 1. 重复性（n 9） 3 2. 中间精密度 3. 重复性 测定：HPLC方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计3个浓度， 分别平行制备3份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制备6份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。 同一份供试品连续进样6次，计算得到的相对标准偏差只能表征进样精密度，不能作为方法精密度。
专属性 定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。 1. 鉴别反应 2. 含量测定 杂质测定 测定： 限量检查 空白制剂，模拟复方 加速破坏试样测试 DAD峰纯度检查
高效液相色谱法在水质检测中的应用 摘要：液相色谱仪已广泛应用于水环境监测中，逐步成为常规检测方法，其适用于分子量大、挥发性低、热稳定性差的有机污染物的分离和分析，具有准确、快速等特点。 关键词：液相色谱仪；水环境监测；有机污染物 1、引言 高效液相色谱法 ( high performance liquid chro-matography，简称 HPLC)，具有下列主要优点：固定相颗粒细且规则均匀，传质阻抗小，组分间分离效率高；利用高压泵输送流动相，大大缩短分析时间；使用高灵敏检测器，提高了检测灵敏度，在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化方面，达到了和气相色谱法相媲美的程度，气相色谱法仅适于分析蒸汽压低、挥发性高、沸点低、热稳定性好的样品。在全部已知的有机化合物中仅有20%的样品符合这些条件，近80%的有机化合物属于挥发性低、易受热分解或者大分子化合物，适合于高效液相色谱分析，因此，HPLC 应用前景更为广阔。 在环境监测中，高翔液相色谱法已逐步上升为常用的监测方法，如检测多环芳烃类、酚类、多氯联苯、苯胺类、阴离子和非离子表面活性剂、有机农药除草剂等。随着经济的快速发展，人们在获取大量化学物质以满足经济、生产和生活需要的同时，也将一些典型的有毒有害的有机污染物带入环境，其中部分有机污染物已经直接或间接被证明具有致癌、致畸和致突变的作用，给人类健康和自然生态环境带来了严重、持久、潜在的危害。根据发达国家的经验和我国经济发展
伴随的污染现状，有毒有机污染物也必将成为我国环境监测的重要目标。 2、实验部分 2.1主要仪器 岛津公司生产的高效液相色谱仪（LC-20A），包括： (1)CBM-20A—系统控制器； (2)CTO-20A—色谱柱柱温箱； (3)LC-20A—溶液传输单元； (4)SPD-20A—紫外可见光检测器； (5)RF-20A—荧光检测器； (6)SIL-20A—自动进样器； (7)DGU-20A3R—在线脱气机 (8)数据处理：LC-LabSolutions工作站软件。 (9)色谱柱：Shim-pack column size serial NO.VP-ODS。 2.2液相色谱原理简介 液相色谱法是在高压条件下溶质在固定相和流动相之间进行的 一种连续多次交换的过程，它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同引起排阻作用的差别使不同溶质得以分离。 2.3建立实验方法 研究液相色谱测定苯系物的实验方法，结合查找的资料及实验验证，确定检测苯系物的实验方法如下： (1) 进样量：10微升；色谱柱：Shim-pack column size serial NO.VP-ODS 柱。
实验二高效液相色谱法测定甲硝唑的含 量 一、实验目的 1.熟悉高效液相色谱仪主要结构组成及功能。 2.了解反相色谱法的原理、优点和应用。 3.了解流动相的选择依据及配制方法。 4.掌握高效液相色谱法进行定性和定量分析的基本方法。 二、实验原理 高效液相色谱法是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由数据处理系统记录色谱信号。本实验以甲硝唑为测定对象，以反相HPLC来分离检测未知样中甲硝唑的含量。以甲硝唑标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度进行线性回归，再根据样品中甲硝唑的峰面积，由线性方程计算其浓度。 三、实验内容 （一）实验仪器与材料 1.实验仪器：高效液相色谱仪、精密天平、50mL烧杯、玻璃棒、称量纸、10mL容量瓶、50mL 容量瓶、注射器、洗瓶。 2.实验材料：甲硝唑原料、蒸馏水、HCl（0.1mol/L）、乙腈、三氟乙酸、超纯水。 （二）实验内容 1、色谱操作条件的制定： 色谱柱：C18柱（250×4.6mm,5μm）； 流动相：乙腈：0.02%三氟乙酸水溶液（20：80） 流速：1mL/min 检测波长：277nm 柱温：35℃ 进样量：20μL 2、标准溶液配制 精密称取在105℃条件下干燥至恒重的甲硝唑对照品10mg，置于50mL容量瓶中，用0.1mol/L的HCl溶液溶解并定容至刻度，即得浓度为0.2mg/mL的甲硝唑标准储备液，备用。 3、标准曲线的建立 （1）精密量取甲硝唑标准储备液分别为0.3mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL、1.1 mL置于10 mL的容量瓶中，然后用0.1mol/L的HCl溶液定容至刻度，得到浓度梯度为6μg/mL、10μg/mL、14μg/mL、18μg/mL和22μg/mL的标准溶液，分别过0.22μm的微孔滤膜过滤，滤
实验四高效液相色谱法测定有机化合物的含量 [目的要求] 1、了解仪器各部分的构造及功能。 2、掌握样品、流动相的处理，仪器维护等基本知识。 3、学会简单样品的分析操作过程。 [基本原理] 高效液相色谱仪液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的主色谱分离技术，在基本理论方面与气相色谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比，高效液相色谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相色谱法的不足。 液相色谱根据固定向的性质可分为吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱和大小排阻色谱。其中反相键合相色谱应用最广，键合相色谱法是将类似于气相色谱中固定液的液体通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相，极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。 反相键合相色谱采用醇-水或腈-水体系作为流动相，纯水廉价易得，紫外吸收小，在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37―）键合到硅胶表面，这也就是我们通常所说的碳十八柱。 [仪器试剂] 高效液相色谱仪（包括储液器、高压泵、自动进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、工作站）、过滤装置 待测样品（浓度约100 ppm）、甲醇、二次水 [实验步骤] 1、仪器使用前的准备工作 （1）样品与流动相的处理 配好的溶液需要用0.45 μm的一次性过滤膜过滤。纯有机相或含一定比便例有机相的就要用有机系的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系滤膜。 水、甲醇等过滤后即可使用；水放置一天以上需重新过滤或换新鲜的水。含稳定剂的流动相需经过特殊处理，或使用色谱纯的流动相。 （2）更换泵头里清洗瓶中的清洗液 流动相不同，清洗液也不同，如果流动相为甲醇-水体系，可以用50%的甲醇；如果流动相含有电解质，通常用95%去离子水甚至高纯水。 如果仪器经常使用建议每周更换两次，如果仪器很少使用则每次使用前必须更换。（3）更换托盘里洗针瓶中的洗液 洗液一般为：50%的甲醇。
高效液相色谱法的标准操作规程 1 定义及概述： 1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。 1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 1.3 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理组成。检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外—可见检测器。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求： 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无渗漏连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
脑蛋白水解物溶液氨基酸含量分析方法研究方案 1、仪器与试药 1.1 仪器 1525型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters1525型泵，Waters2487型检测器，Waters5CH 型柱温箱，WatersBREEZE数据处理软件，水浴恒温器（精度±0.1℃），旋涡器，微量移液器，衍生专用管；CP225D型分析天平（德国）；4umNora-Pak TM C18（3.9mm×150mm，5μm）色谱柱（美国） 1.2 药品与试剂 16种氨基酸（门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）由中国药品生物制品检定所提供。 脑蛋白水解物注射液，云南盟生药业有限公司生产，规格10ml/支。批号：2013、2013、2013. 乙腈（HPLC级）；EDTA（分析纯）；磷酸（分析纯）；二乙胺（分析纯）；三水合乙酸钠（分析纯）。2、方法与结果 2.1色谱条件流动相A为AccQTag醋酸—磷酸盐缓冲液；由AccQTagEluent A浓缩制备AccQTag洗脱液,用前稀释10倍（或按以下方法配制：称19.04g三水合乙酸钠，加1000ml纯化水，搅拌，溶解，用50%H3PO4将pH调至5.2，加入1ml 1mg/ml的EDTA溶液，加入2.37ml二乙胺，用50%H3PO4滴定至pH4.95，用水溶性过滤器过滤，超声，脱气，备用。）；流动相B为60% HPLC级乙腈，按梯度表梯度洗脱；流速1.0ml/min；检测波长为254nm；进样量5μl；柱温38℃。
时间 (min) 流速 (ml/min) % A % B 曲线 起始 1.0 100 0 * 0.5 1.0 98 2 6 15.0 1.0 93 7 6 19.0 1.0 90 10 6 32.0 1.0 65 35 6 33.0 1.0 65 35 6 34.0 1.0 0 100 6 37.0 1.0 0 100 6 38.0 1.0 100 0 6 42.0 1.0 100 0 6 2.2对照品溶液、供试品溶液的制备分别精密称取16种氨基酸标准品，用纯化水配制成浓度如下表 所示的混合溶液。 名称浓度（mg/ml）名称浓度（mg/ml）名称浓度（mg/ml）门冬氨酸 4.80 苏氨酸 1.20 异亮氨酸 1.10 丝氨酸 2.60 丙氨酸 2.50 亮氨酸 2.70 谷氨酸 6.20 脯氨酸 2.00 苯丙氨酸 1.20 甘氨酸 2.40 缬氨酸 1.60 色氨酸0.40 组氨酸0.90 甲硫氨酸 1.00 精氨酸 1.20 赖氨酸 3.45 取上述溶液0.1ml，加纯化水0.9ml，旋涡器混匀，作为对照品溶液；取脑蛋白水解物注射液，加水稀释成含总氮为1mg/ml的溶液，取0.1ml，加纯化水0.9ml,旋涡器混匀，作为供试品溶液。 衍生剂配制将水浴锅设置55℃，加热，待温度稳定, 取AccQFluor衍生剂2A，轻轻弹击,确保AccQFluor 衍生剂2A粉末全落在瓶底，吸取AccQFluor衍生稀释剂2B 1ml并放掉，清洗移液器管，再吸取AccQFluor 衍生稀释剂2B 1ml，加入AccQFluor衍生剂2A的瓶中，振荡10秒钟，在恒温水浴锅中溶解，保持10分钟。于干燥器中室温保存一周,于干燥器中4℃保存二周。 2.3测定方法分别取20ul对照品溶液和供试品溶液加入衍生专用管底部，加入60uLAccQFluor硼酸
实验二有机酸含量的测定 重点：①碱式滴定管的调零、体积读数，容量瓶、移液管的正确使用；②邻苯二甲酸氢钾及有机酸样品的正确称取（差减法）；③有效数字的取舍及确定。 难点：滴定终点的判断及掌握。 一、实验目的 1.学习强碱滴定弱酸的基本原理及指示剂的选择 2.掌握NaOH的配制和标定方法以及基准物质的选择 二、实验原理 1.大多数有机酸是弱酸，如果某有机酸易溶于水，解离常数Ka>>10-7，用标准碱溶液可直接测其含量，反应产物为强碱弱酸盐。滴定突跃范围在弱碱性内，可选用酚酞指示剂，滴定溶液由无色变为微红色即为终点。根据NaOH标准溶液的浓度c和消耗的体积V计算该有机酸的含量： 2. NaOH标准溶液是采用间接配制法配制的，因此必须用基准物质标定其准确浓度。邻苯二甲酸氢钾（KHC8H4O4），它易制得纯品，在空气中不吸水，容易保存，摩尔质量较大，是一种较好的基准物质，标定反应如下： 反应产物为二元弱碱，在水溶液中显微碱性，可选用酚酞作指示剂。 邻苯二甲酸氢钾通常在105-110℃下干燥2h后备用，干燥温度过高，则脱水成为邻苯二甲酸酐。 三、仪器和试剂 邻苯二甲酸氢钾（KHP）分析纯；酚酞2g·L-1乙醇溶液；NaOH分析纯；有机酸试样。 电子天平；细口试剂瓶；容量瓶（100mL）；移液管（25mL）；碱式滴定管；锥形瓶（250mL）。 四、实验内容 1. 0.1mol/L NaOH溶液的配制 在台秤上取约2g固体NaOH(用小烧杯称取),另用大量筒量取500mL去离子水，倒少量水入装有NaOH固体的小烧杯中，搅拌使NaOH溶解后将其倒入试剂瓶中；再将大量筒中剩余的水倒入试剂瓶中，混匀。 2. 0.1mol/L NaOH溶液的标定： 准确称取三份0.5-0.6g邻苯二甲酸氢钾分别于250mL的锥形瓶中，加20-30mL水溶解，加2滴酚酞指示剂，用NaOH溶液滴定至淡粉色即为终点。平行滴定3次，计算NaOH溶液的浓度。 3.有机酸试样的测定： 准确称取有机酸样品3.0-4.0g，置于小烧杯中，加入适量水溶解。然后定量地转入100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。 用移液管取有机酸溶液25.00mL, 加酚酞指示剂1-2滴，用NaOH标准溶液滴定至溶液呈微红色，30秒不褪色，即为终点。记下NaOH用量，平行测定三份，计算有机酸试样的含量。 五、数据记录及处理
实验二 高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因 一、目的要求 1、学习高效液相色谱仪的操作。 2、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理。 3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。 二、基本原理 咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍生物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤。咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中含咖啡因约为1.2~1.8%，茶叶中约含2.0~4.7%。可乐饮料、APC 药片等中均含咖啡因。其分子式为C 8H 10O 2N 4，结构式为： N N CH 3 H 3C O O N N CH 3 定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间t R 和峰面积A 后，可直接用t R 定性，用峰面积A 作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。 三、仪器和试剂 1、Agilent 1100高效液相色谱仪。 2、色谱柱：Kromasil C18，5μ 150×4.6mm 。 3、流动相：30%甲醇（色谱纯）+70%高纯水；流动相进入色谱系统前，用超声波发生器脱气10min 。 4、 咖啡因标准贮备溶液：将咖啡因在110℃下烘干1h 。准确称取0.1000g 咖啡因，用二次蒸馏水溶解，定量转移至100mL 容量瓶中，并稀释至刻度。标样浓度1000μg·mL -1。 5、测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。
高效液相色谱（HPLC ）法测定邻苯二甲酸酯 一、实验目的： 1. 了解高效液相色谱仪原理； 2. 学习高效液相色谱仪的基本操作方法； 3. 利用高效液相色谱仪测定邻苯二甲酸酯、邻苯二乙酸酯、邻苯二丁酸酯的峰图和含量。 二、实验原理： ① 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC ）是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高效液相色谱法有“四高一广”的特点：高压、高速、高效、高灵敏度和应用范围广。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。 在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R ）的计算公式为： R ＝ 2[t (R2)-t (R1)] /1.7*(W 1＋W 2) //式中 t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间；t (R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W 1 及W 2为此相邻两峰的半峰宽。 除另外有规定外，分离度应大于1.5。 ② 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE ，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。 但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。同时也有一定的致癌作用。 如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC 分离检测。 三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul 微量注射器。 2、试剂 甲醇（色谱专用） ，高纯水，样品。 出峰次序 样品组成 1 邻苯二甲酸二甲酯（DMP ） 2 邻苯二甲酸二乙酯(DEP) 3 邻苯二甲酸二丁酯(DBP)
高效液相色谱法测定手册 一目的：制定高效液相色谱法，规范高效液相色谱法的测定操作。 二适用范围：适用于高效液相色谱法的测定。 三责任者：品控部。 四正文 1 简述 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 高效液相色谱仪基本由泵，进样器，色谱柱，检测器和色谱数据处理系统组成。检测器最常用的为可变波长紫外可见光检测器，其他检测器有如示差折光检测器和蒸发光散射检测器等。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705—90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
高效液相色谱法： 系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。 注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测， 由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。 色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。 超高液相色谱仪：是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、 高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 （1）色谱柱 反相色谱柱： 以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱： 用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶 和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。 （2）检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器， 其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器， 其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；
甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、酒石酸、草酸、苯乙酸、阿魏酸 甲酸、乙酸、丙酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、酒石酸、草酸、 仪器与设备 waters2695 Alliance SeparationsModule高效液相色谱仪;waters2996 PhatadiodeArray二极管阵列检测器;Heraeus离心机;HORIBApH计。 色谱分析 (1)混标配置。分别准确称取适量上述10种有机酸并用超纯水溶解或稀释,以孔径0. 45μm 的微孔滤膜过滤,转移至50mL容量瓶中,定容,配制浓度为100mg/L的储备液,保存于4℃冰箱中。 (2)标准曲线绘制。有机酸标准液的配置:根据紫外吸收灵敏度,将草酸、酒石酸、苹果酸、甲酸、丙二酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、丙酸按照0. 2∶2. 5∶5∶5∶5∶2. 5∶5∶5∶5∶5的比例配制混标,逐级稀释,配制成A、B、C、D、E五个浓度级别的标准溶液,以绘制标准曲线。其中A级别标准溶液浓度为0. 2; 2. 5, 5, 5, 5, 2. 5, 5, 5, 5, 5(μg/mL);B、C、D分别为上一个级别浓度的5倍稀释,E级为D级的2倍稀释。并将这10中有机酸编号为:OA01-OA10。 (3)色谱条件。反相C18柱CAPCellPAK C18MG 4. 6mm×250mm, 5um, pH范围: 2~10,流动相: 0. 1%H3PO4的去离子水和乙腈(V/V)98∶2;检测器波长: 210nm;流速: 1mL/min;进样量: 20u;l柱温: 35℃; (4)流动相配置。取1mLH3PO4用超纯水稀释至1000mL,经孔径为0. 45μm的微孔滤膜过滤,超声脱气后备用。乙腈(色谱纯)超声脱气备用。
标准操作规程 STANDARD OPERATION PROCEDURE 1 目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。 2 适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3 责任：QC人员对本SOP实施负责。 4容 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1. 对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据 处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μ m。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1. 色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合 物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分 离物质的性质来选择合适的色谱柱。温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2? 8 之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2 或大于8 的流动相。
标准操作规程 1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。 2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3责任：QC人员对本SOP实施负责。 4容 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1.色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分
离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2?8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。 4.1.2.检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应。结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定围呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 4.1.3.流动相 反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5％，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。 正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。 品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变围为0.7X?1.3X；当X大于33%时，允许改变围为X—10%?X+10% 。
高效液相色谱法测定维生素C的含量 【摘要】高效液相色谱法已经成为解决生命科学、医药学发展中各种难题的重要手段，在实验室中也广泛应用于物质的定性定量分析。本实验中利用高效液相色谱法对维生素C进行定量分析，所采用的定量分析方法为外标法，通过做出标准溶液浓度与峰面积的标准曲线进而对样品中的维生素C进行定量检测。 【关键词】高效液相色谱法、维生素C、含量 1、引言 维生素 C（Vitamin C, Vc）又叫抗坏血酸，是一种水溶性维生素。Vc 在体内参与多种反应，如氧化还原过程，在生物氧化和还原作用以及细胞呼吸中起重要作用。人体内缺乏 Vc 时容易导致坏血病。同时，由于 Vc 是一种水溶性的强有力抗氧化剂并参与胶原蛋白的合成，它同时还具有防癌、预防动脉硬化、治疗贫血、抗氧化和提高人体免疫力等功效。Vc 在蔬果中普遍存在，尤其是柑桔类水果中含量较高。樱桃、番石榴、辣椒、猕猴桃等水果中 Vc 含量在 50-300 mg/100 g。 溶于流动相（mobile phase）中的各组分经过固定相时，由于与固定相（stationary phase）发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。高效液相色谱法（High performance Liquid Chromatography，HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，于 60 年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法（High Pressure Liquid Chromatography，HPLC）。HPLC 系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代 HPLC 仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型 HPLC 仪还备有自动馏分收集装置。 2、HPLC测定维生素C的含量 2.1、仪器试剂 2.1.1、仪器 高效液相色谱仪（Agilent1260），色谱柱：C18 柱 (250 mm×4.6 mm, I.D.5 μm)；平头进样器。 2.1.2、试剂 乙腈（色谱纯），冰乙酸，维生素 C，磷酸二氢钾等均为分析纯，实验用水为超纯水。
实验水果、蔬菜中总酸的测定 （学号：030212011031，030212011026 李欣钰和郎琳） 【实验目的】 1、利用标准液滴定水果蔬菜，测定不同水果蔬菜中总酸度 2、练习利用滴定管滴定溶液 3、练习移液管的使用 4、练习pH计的使用 【实验原理】 1、水果和蔬菜中含有各种不同的有机酸，主要为苹果酸，柠檬酸，酒石酸，草酸等。果树的种类不同，含有机酸的种类和数量也不同。果汁或菜汁的酸性取决于游离态的酸或酸式盐的存在数量。这些算都是有机弱酸，所以在测定时，有氢氧化钠标准溶液滴定就能测出酸度。这样测得的数据是总酸度，包含了未离解酸和已离解酸的浓度。用下式计算： 总酸度（%）=（V 样/W 样 ）x（V NaOH xc NaOH x折算系数/V取样）x100 式子中V样为样品稀释总体积；V取样为滴定时取样体积；W样为样品的质量。折算系数为不同有机酸的毫摩尔质量 2、食品中的总算度往往根据算韩算的不同，而取其中某种主要有机酸计量。食品中常见的有机酸及其毫摩尔质量折算系数如下 苹果酸——0.067（苹果，梨，西红柿） 酒石酸——0.075(葡萄) 柠檬酸——0.090(柑橘类) 【仪器试剂】 烧杯（100ml）(3-5只)，洗耳球，移液管（25ml）,容量瓶（250ml）（3只），滤纸，铁架台，滴定管夹，碱式滴定管，玻璃棒，胶头滴管，电子天平，研钵，酚酞指示剂，NaOH标准溶液（约为0.2mol/l），西红柿，葡萄，橘子（自备），塑料袋若干（自备），小刀（自备） 【实验内容】 1．准确称取混合均匀磨碎的样品10g 2.转移到250ml容量瓶中，加纯水至刻度线，摇匀 3.吸取50ml溶液于锥形瓶中，加入两滴酚酞试剂 4.用NaOH标准溶液滴定溶液至淡红色，并且在30s内不退色，即到达终点。 5.记下所用的NaOH体积。重复测定三次取平均值。 6.利用同样的方法测定剩余的两种水果或蔬菜。并记录实验数据 7.用pH计测出样品稀释液的pH 8.处理实验数据，比较所测的西红柿，葡萄，橘子的总酸度的不同 实验数据处理表
此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC 主要内容包括： 1.高效液相色谱法（HPLC）的概述 2. 高效液相色谱基础知识介绍（1——13楼） 3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类 4. 液相色谱的适用性 5.应用 高效液相色谱法（HPLC）的概述 以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。 由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有5 0种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。 高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。 目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。C18（ODS）为最常使用的化学键合相。 根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相
的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。 在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。 系统组成： （一）高压输液系统 由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。 1.贮液罐 由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。2.流动相 流动相常用甲醇-水或乙腈－水为底剂的溶剂系统。 流动相在使用前必须脱气，否则很易在系统的低压部分逸出气泡，气泡的出现不仅影响柱分离效率，还会影响检测器的灵敏度甚至不能正常工作。脱气的方法有加热回流法、抽真空脱气法、超声脱气法和在线真空脱气法等。 3.高压输液泵 是高效液相色谱仪的关键部件之一，用以完成流动相的输送任务。对泵的要求是：耐腐蚀、耐高压、无脉冲、输出流量范围宽、流速恒定，且泵体易于清洗和维修。高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵（其压力随系统阻力改变而流量不变）。 （二）进样系统 常用六通阀进样器进样，进样量由定量环确定。操作时先将进样器手柄置于采样位置（L OAD），此时进样口只与定量环接通，处于常压状态，用微量注射器（体积应大于定量环体积）注入样品溶液，样品停留在定量环中。然后转动手柄至进样位置（INJECT），使定量环接入输液管路，样品由高压流动相带入色谱柱中。 （三）色谱柱 由柱管和填充剂组成。柱管多用不锈钢制成。柱内填充剂有硅胶和化学键合固定相。在化学键合固定相中有十八烷基硅烷键合硅胶（又称ODS柱或C18柱）、辛烷基硅烷键合硅
实验六高效液相色谱(HPLC)柱效测定 093858 张亚辉 一. 实验目的 1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。 2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。 3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。 二. 实验原理 高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。 在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为： R＝ 2[t(R2)-t(R1)] /1.7*(W1＋W2) 式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的半峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。待测物性质见表1。 表1色谱柱测试条件
如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。 三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。 2、试剂 甲醇（色谱专用），高纯水 四. 实验步骤 1、色谱条件 色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8） 柱温：室温 流动相：初始为高纯水：20％，甲醇：80％ 检测器：DAD检测器; 检测波长：220nm； 进样体积：20μl定量环，实际注射每次可控制在40μl。 2、待测溶液的配制 首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。 3、色谱测定 (1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。流量为1.000ml/min。 (2) 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液40ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。 (3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。 (4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。 五.实验结果