本技术介绍了一种使用胚胎干细胞构建的药物筛选模型，进行药物药效初步筛选与评价。胚胎干细胞在药物诱导下定向分化成特定类型细胞，构建高效率药物筛选模型，利用该模型进行药物药效初步筛选和评估。只要药物可在分化的某一个或某几个阶段起作用，就可对药物的药效进行初步评估。本模型具有高效药物筛选的特性，评估指标直接、明确，可对许多天然药物的药理作用进行快速评估。另外，本药效筛选模型所需试剂、时间和经费相对较少，富含细胞分化信息，具备高效率与高仿真以及兼顾药效与机制研究的优势。
技术要求
1.一种胚胎干细胞体外定向分化药物筛选模型的构建及应用，其特征是：在药物
诱导下，使胚胎干细胞(ES)定向分化成单一类型细胞，构建高效率药效筛选模型，并
利用该模型进行中药活性成分药效筛选和评估，本技术主要分以下几个步骤：
(1)利用已有的ES细胞的支持培养；
(2)药物诱导ES细胞定向分化为单一类型细胞的培养；
(3)利用该模型进行药效筛选与评估。
2.如权利要求1所述的利用已有的ES细胞的支持培养，其特征是：选用小鼠胚
胎干细胞D3细胞株(ES-D3细胞株)，接种于滋养层细胞上，按常规方法进行传代培养。3.如权利要求1所述的药物诱导ES细胞定向分化为单一类型细胞的培养，其特
征是：当诱导定向分化为单一类型细胞时，这类细胞包含心肌细胞，用培养基将ES-D3
细胞制成单细胞悬液，再悬滴培养成拟胚体，拟胚体进行贴壁培养，加入供试药物共
同培养，以拟胚体细胞团出现特定标志，作为定向分化成功的指标。
4.如权利要求3所述的药物诱导ES细胞定向分化为单一类型细胞的培养，其特
征是：当诱导定向分化为心肌细胞时，拟胚体细胞团出现的特定标志是有节律地搏动。
5.如权利要求3所述的药物诱导ES细胞定向分化为单一类型细胞的培养，其特
征是：测试药物可以是银杏黄酮、黄芪、淫羊藿苷、葛根素、丹参等中药活性物质。
6.如权利要求1所述的胚胎干细胞体外定向分化药物筛选模型的构建及应用，其
特征是：利用该方法，可构建心肌细胞定向分化模型、神经元定向分化模型、血管发生定向分化模型及其他多种单一类型细胞模型，用于药效初步筛选与评估。
说明书
胚胎干细胞体外分化中药活性物质药效筛选模型的建立及应用
技术领域
本技术属于再生医学领域，涉及一种药效筛选模型的建立及应用，主要是关于药
物诱导胚胎干细胞体外分化中药活性成分药效筛选模型的建立及应用，可高效率地对中药药效进行快速筛选与评估。
背景技术
经典的药效筛选模型包括(1)整体动物水平的药效筛选模型：其优点是可以从
整体水平，直观反映药物的治疗作用；缺点是需要大量动物，实验周期长，需要大量供试品，不适用于药效的初步大规模筛选；(2)组织器官(如离体心脏)水平的药效
筛选模型：主要缺点是不能反映神经和体液对器官药理效应的调节作用，且其筛选规模小、效率低、样品需求量较大。(3)细胞水平的药效筛选模型：有较好的代表性，供试品用量少，可实现大规模筛选。其局限性在于不能反映药物对某一类型细胞在持续发育过程中的作用信息，可供药效评价的指标较少。(4)基因水平的药效筛选模型，可以大规模、高通量、快速筛选药物活性成分，评价药效。但此模型尚不能体现药物对生命体活动的影响过程及药物与大分子作用时重要生命过程变化的性质(如基因调控、蛋白质翻译后修饰，信号传导级联等)。
研究胚胎干细胞(ES细胞)体外定向分化成单一类型细胞(心肌细胞、神经细胞、
内皮细胞等)起始于90年代，主要用于(1)转化医学研究；(2)再生医学研究；(3)
发育生物学研究。ES细胞具有体外不分化的永久增殖能力，当处于合适的培养条件下，可定向分化形成某些单一类型细胞。国外在本世纪初即开始研究ES细胞的体外定向分化，已有ES细胞定向分化成心肌细胞、神经细胞、内皮细胞等的报道，但ES细胞的
分化成功率远低于药物诱导的分化成功率。干细胞用于药物筛选的工作在国外刚刚开始，国内尚在起步阶段。
技术内容
本技术的目的是利用ES细胞在特定条件下，可分化成单一类型细胞的性质，在
药物诱导下，使ES细胞在体外分化成特定细胞，构建高效率药效筛选模型，并利用该模型进行药物药效初步筛选与评价。本技术主要分以下几个步骤：
1.利用已有的ES细胞的支持培养；
2.药物诱导ES细胞定向分化为单一类型细胞的培养；
3.利用该模型进行药效筛选与评估。
本技术利用已有的ES细胞的支持培养，其特征是：选用小鼠胚胎干细胞D3细胞
株(ES-D3细胞株)，接种于滋养层细胞上，按常规方法进行传代培养。
本技术进行的药物诱导ES细胞定向分化为单一类型细胞的培养，其特征是：当
诱导定向分化为单一类型细胞时，这类细胞包含心肌细胞，用培养基将ES-D3细胞制
成单细胞悬液，再悬滴培养成拟胚体，拟胚体进行贴壁培养，加入供试药物共同培养，当拟胚体细胞团出现特定标志，则以此作为定向分化成功的指标。对诱导ES细胞定向分化为心肌细胞时，拟胚体细胞团出现的特定标志是有节律地搏动。根据药物诱导拟
胚体细胞团出现的特定指标，及药物诱导分化的时效关系和量效关系进行统计学分析，以此作为药效评价标准。测试药物可以是黄芪、淫羊藿苷、葛根素、银杏黄酮、丹参
等中药活性物质。
本技术所用的培养基是DMEM培养基、胎牛血清。
用本技术方法可构建心肌细胞定向分化模型、神经元定向分化模型、血管发生定
向分化模型等多种单一类型细胞模型，用于相关药物的药效初步筛选与评价。
利用本技术方法诱导ES细胞定向分化为心肌细胞，还可进行心肌发育依赖性特
殊基因表达的研究、心肌结构蛋白表达研究和离子通道形成研究。本技术具有以下优点：
1.应用面非常广：ES细胞具有体外不分化的无限增殖能力，构建药物诱导ES细
胞体外定向分化形成单一类型细胞(如心肌细胞、神经细胞、内皮细胞等)的药效筛
选模型，可初步评价以心脏、神经、血管等为作用靶点的多种新型药物的药效。药物在诱导过程中，可能通过干预多个环节使ES细胞定向分化为某种单一类型细胞，因此在该模型的应用中，只要药物具有干预其中某个或几个关键环节的作用，就可初步评价药物的药效。
2.生物信息量大、特异性强：ES细胞体外定向分化体系由于能够基本模拟乃至
重现体内复杂的发育及组织器官生成过程，具备能人工控制、干预的特点；并且可专一性地通过ES细胞在定向分化过程中，在细胞信号转导、基因表达调控等方面高度模拟药物在整体动物中的作用，重现药物对生物大分子调控的生命现象本质，为新药研制提供了简单有效的体外药效评价模型。
3.对有诱导ES细胞定向分化为某种单一类型细胞的创新药物，该筛选模型由于
可呈现分化的全过程，亦可提供药物作用特异性靶点研究，并有可能发现一些有治疗功能的基因。
4.观察与评价指标直观、明了，能直观地反映药物的时效关系和量效关系，用于
客观评价药效。如ES细胞与具有治疗心脏疾病药效的创新药物共培养后，以ES细胞形成的拟胚体是否具有自发的节律性搏动为评价终点，如获得的时效关系及量效关系资料与对照组有显著性差异，即可明确其对ES细胞定向分化有诱导作用。
5.该药效筛选模型仍保持常规的细胞层面筛选药物活性的一般特点，如所需供试
品用量少、节时省钱、效率高等，但由于在定向分化过程中富含发育依赖性生物信息，能提供更多的靶点供药效评价用，因此是一个高效率、高仿真兼顾，药效与机制研究并存的药效筛选模型，在新型药物研制、中药活性物质药效评价领域应用前景十分广阔。
附图说明
图1为中药单体银杏黄酮诱导ES-D3细胞定向分化为心肌细胞的时效关系曲线和
量效关系曲线图。
具体实施方式
实施例一：中药单体银杏黄酮诱导ES细胞定向分化为心肌细胞的研究
1.ES细胞的支持培养：
ES-D3细胞在条件培养基(含DMEM培养基、胎牛血清)中，按2x107～5x107
个/ml的密度接种于滋养层细胞(小鼠成纤维细胞或STO细胞株)上，按常规方法
进行传代培养。
2.药物诱导ES细胞定向分化为心肌细胞的培养：
①ES-D3细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，按20～30uL接种于培养皿的盖子内
表面上，培养皿内加入10mL ES-Hanks溶液，将盖子翻转形成悬滴，置培养箱中悬
滴培养2天。此后将悬滴转入盛有10mL ES细胞分化培养基(DMEM培养基、胎牛血
清)的培养皿中，进行ES细胞集落悬浮培养3天，形成ES细胞拟胚体。②附着ES
细胞的分化培养：在显微镜下用吸管将拟胚体转移到24孔板内，孵育4～5小时，使
其吸附后，每孔中缓慢加入1ml ES分化培养基，加入中药单体银杏黄酮与ES细胞
拟胚体共孵育。此时开始用倒置显微镜每天观察细胞，以捕捉心肌细胞开始跳动的最初时间。
2.用该模型进行药效评价：
若拟胚体细胞团能有节律性地搏动，则以此作为定向分化成心肌细胞的指标，作
出药物银杏黄酮对ES-D3细胞诱导分化的时效关系曲线和量效关系曲线，结果见附图1，以此作为药效评价的指标。附图1中，银杏黄酮终浓度分别为：系列1：0，系
列2：10-8mol/L，系列3：10-7mol/L，每个浓度n＝400拟胚体，相同实验重复做了6次。
分别对5种心脏疾病疗效明确的药物(如银杏黄酮、丹参、黄芪、淫羊藿苷、葛
根素等)进行诱导分化试验。结果其中有3种药物分别在与ES-D3细胞共培养5～7天
时，就有90％以上的细胞克隆出现节律性搏动，并有心脏胚芽纤维蛋白表达上调。另有2种药物与ES-D3细胞共培养9～11天时，均有80％以上的细胞克隆出现节律性
搏动，同时可见心肌发育依赖性基因上调。其中以中药单体银杏黄酮的诱导作用最明显，且具有很好的量效关系。
实施例二：心肌发育依赖性特殊基因表达的研究
若药物能诱导ES细胞定向分化为心肌细胞，则分别在药物共培养前，药物共培
养后拟胚体形成时及拟胚体搏动时，进行如下研究：
(1)DNA文库克隆→培养后提取噬菌体DNA作模板，PCR反应扩增→扩增产物测
序；
(2)半定量逆转录聚合酶链反应鉴定→对一些基因进行功能推测研究；
(3)对差异表达基因进行RT→PCR半定量鉴定→对某些基因进行功能推测研究。
实施例三：心肌结构蛋白表达研究
(1)电镜显示心肌结构蛋白特征性图谱，并以出现与否及其成熟程度来显示药物作
用。
(2)蛋白电泳，western blot，评价是否有表达差异，及表达后修饰等。必要时进
行搏动拟胚体电信号采集与分析。
用本技术的药效筛选模型能高效快速地初步评价具有改善心肌功能、抗心律失常、
改善心肌供血、抗老年性痴呆、抗帕金森病、抗肿瘤及肿瘤转移，治疗心脑血管疾病、治疗糖尿病、抗肝病等药效的创新药物。
中药炮制学（重点） 第一章绪论 1.中药炮制是根据中药理论，依照辩证施治用药的需要和药物的自身性质，以及调剂、制 剂的不同要求，所采取的一项制药技术。 2.《雷公炮炙论》刘宋南北朝以“炮炙”作书名，而在正文中多用“修事”。 《本草纲目》李时珍明朝正文中设有“修制”专项。 《修事指南》张仲岩清朝以“修事”作书名，而正文中用“炮制”。 3. 三类分类法：明代陈嘉谟《本草蒙筌》（此种分类方法基本能反映出炮制的特点， 但对饮片切制及切制前的洁净和软化处理等未包括其中。） 火制：煅、炮、炙、炒 水制：渍、泡、洗 水火共制：蒸、煮 第二章中药炮制基本理论 4. 制则（定义、举例） 1）相反为制：指用药性相对立的辅料（含药物）或某种炮制方法来制约中药的偏性或改变药性。【酒制大黄】 2）相资为制：指用药性相似的辅料（含药物）或某种炮制方法来增强药效。资，有资助之意。【盐制知母】 3）相畏为制：指用某种辅料（含药物）来炮制某药物，以制约该药物的毒副作用。【生姜制半夏】 4）相恶为制：指炮制时可以利用某种辅料或某种方法来减弱药物的烈性。（即某种作用减弱，使之趋于平和，以免损伤正气。）【麸炒枳壳、煨木香】 5）相喜为制 5. 醋制入肝经，蜜制入脾经，盐制入肾经 6. 炮制对重要毒性的影响：炮制对中药的影响是通过炮制消除或降低药物治疗剂量下对人 体的伤害，其主要途径： 1）使毒性成分发生改变。如：川乌、草乌等。 2）使毒性成分含量减少。如：巴豆、干漆等。 3）加入具解毒作用的辅料。如：白矾制天南星、半夏等。（可降低毒性的辅料：甘草、生姜、醋、明矾、石灰、黑豆等。） 7. 改变药物作用的部位或增强对某部位的作用 炮制可以改变药物的作用部位，如生诃子偏入肺经，长于清金敛肺利咽，用于治疗咽痛失音，肺虚久嗽。煨诃子炮制后使涩敛之性增强，专入大肠经，增强了涩肠止泻的功效，用于老人久泻久痢及脱肛症。 炮制可以调整某些药物的一药多经，使其作用专一。如柴胡、香附等经醋制后有助于引药入肝经，更好地治疗肝经疾病。小茴香、益智仁、橘核等经过盐制后，有助于引药入肾经，能更好地发挥治疗肾经疾病的作用。 第三章中药炮制对药物的影响
关于药物筛选模型征集的通知 依据广东省新药筛选重点实验室的要求，为药学院的药物筛选和新药发现提供保证，现计划从药学院现有药物筛选模型和相关资源中发掘和开发特色药物筛选模型。 1、药学院药理学相关课题组向广东省新药筛选重点实验室提供本领域的特色筛选模型，按照1000元/种的标准给予资助。 每种筛选模型需提供两个版本，一个详细操作的PROTOCOL版本（筛选中心在获得全部细胞和试剂后，按此规程操作，能重复实验结果），一个是挂网宣传的版本。 2、提供的筛选模型必须保证其稳定性和有效性，广东省新药筛选重点实验室全套备份筛选模型，并在网上挂出。 3、成立新药筛选模型评估委员会，负责审核课题组提交的新药筛选模型，并及时将审核结果反馈给课题组。 4、筛选平台可提供实体和虚拟两种筛选平台，虚拟筛选平台的资助标准为实体筛选平台的1/5。 5、广东省新药筛选重点实验室在未获得药物筛选模型提交课题组PI或者实验室负责人知情时，不得向任何人提供筛选平台的详细流程和相关使用材料信息。
注意： 1、本表一式两份，双面打印。一份课题组保存，一份广东省新药筛选重点实验室保存，供年终评估使用。 2、电子版发广东省新药筛选重点实验室，可添加纸双面打印。
化合物征集办法 为了响应广东省新药筛选重点实验室的要求，为药学院的药物筛选和新药发现提供保证，现计划从药学院现有合成的药物资源中征集新的小分子实体。 1、以课题组为单位向广东省新药筛选重点实验室提交小分子化合物每种10-100 mg，并提供相应完整谱图，按照100元/个（合成化合物），200元/个（天然产物）的基准向提供课题组提供资助。若与购买的商品化合物库中化合物重复，资助标准减半；若证明为全新化合物，资助标准翻倍。 2、同一化合物入库遵从先到先入原则，每个化合物入库需要跟库里已有的化合物查重。 3、采用ISIS25软件进行登记，化合物提供纯度和检测说明。 4、由广东省新药筛选重点实验室负责，审核课题组提交的小分子实体，并及时将审核结果反馈给课题组。 5、广东省新药筛选重点实验室在未获得小分子实体提交课题组PI或者实验室负责人知情时不能提供任何结构信息。 6、合乎筛选要求的化合物（国家新药筛选中心标准） 普遍要求：分子量介于175和800之间的固体有机化合物。 杂环和稠（杂）环 饱和非芳香性杂环：需带有两个或以上取代基团 桥连双环化合物：二环可全部由碳原子组成，或含有氧、硫、氮
选修课程- 中药炮制与临床疗效的关系 考试信息提示： 试卷考题：10道，考试时长：120分钟。 您可以点“交卷”按钮提交答题结果，如果考试时间到未交卷的系统会自动交卷，注意把握时间！ 其他注意事项，请查看页面最下方的考试说明。 1、寒凉之药可治（单项选择）A A.热证 B.寒证 C.虚证 D.实证 E湿证 2、炮制有毒药物时，去毒常用的炮制方法有（多项选择）ABCDE A.水泡漂 B.水飞 C.加热 D.加辅料处理 E.去油制霜等 3、生地炮制成熟地后的功效是（单项选择）C A.清热凉血 B.活血祛瘀 C.补血滋阴 D.和胃止呕 E.涩肠止 泻 4、中药的四气是指（多项选择）ABCD A.寒 B.热 C.温 D.凉 E.平 5、麻黄的功效是（多项选择）BCD A.补气 B.发汗 C.平喘 D.利尿 E.固涩 6、使药物能适合病情需要，在炮制的具体方法上可概括为（多项选择）ABCD A.或制其形 B.或制其性 C.或制其质 D.或制其味 E.或制成 霜 7、川乌、草乌、附子的主要成分为生物碱，其中毒性最强成分是（单项选择）D A.乌头胺 B.中乌头胺 C.次乌头胺 D.双酯型乌头碱 E.苯甲 酰乌头胺 8、黄连味苦泻火，炒后缓和了苦味且微有辛味，长于和胃止呕,其辅料是（单项选择）A
A.姜汁 B.盐水 C.醋 D.黄酒 E.黑豆汁 9、延胡索的炮制方法是（单项选择）B A.盐水炒 B.醋制 C.酒制 D.蜜炙 E.姜汁制 10、川乌、草乌、附子经炮制后毒性仅为最强成分的1/2000—1/4000是（多项选择） A.苯甲酰乌头胺 B.苯甲酰中乌头胺 C.乌头胺 D.中乌头 胺 E.次乌头胺答案：CDE
胚胎干细胞的体外诱导分化模型马宗源 李祺福(厦门大学生命科学学院福建厦门361005) 胚胎干细胞是具有全能性及无限制的自我更新与分化能力的一类特殊的细胞群体,它能通过祖细胞为中介,分化为各种类型的体细胞,可重演体内干细胞的分化过程。自80年代从小鼠囊胚的内细胞团分离到胚胎干细胞并建系到现在已建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞、造血细胞等体外分化体系。将胚胎干细胞体外分化成为可利用的分化模型,无论从组织结构、细胞及分子水平都体现了体内分化过程的体外重演,再加上胚胎干细胞系具有体系简单,影响因子少,可控制,便于研究等特点,因此可用于研究早期胚胎发育和细胞分化调控;可成为器官移植和修复器官的细胞来源;还可用于新型药物筛选。 1 胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞具有与早期胚胎相似的结构特征,具有较高的核质比和整倍体核型。体外培养的细胞紧密堆积,呈克隆状生长,具有发育分化的多潜能性和无限制的自我更新能力,碱性磷酸酶染色呈阳性,具有高的端粒酶活性,早期胚胎细胞均表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、T RA-1-81、T R A-1-60等;表达种系转录因子OCT-4,并且可将O CT-4基因作为细胞多能性的一个标志;白介素6型细胞因子家族参与维持调节胚胎干细胞未分化状态。 胚胎干细胞建系的过程中要解决的问题在于体外不断增殖的过程中保持未分化的状态,但是细胞如何维持其未分化状态的机理并不清楚。研究发现主要是通过膜上的特异受体蛋白gp130来发挥作用,细胞因子受体蛋白g p130可激活JA N U S、酪氨酸激酶,JA K-ST A T、M EK/M A P K等信号途径,而JAK/ST A T3和M EK/ ERK信号途径则处于相对平衡的状态。另外,一些未知的膜结合分子也参与胚胎干细胞的增殖与分化。分离纯化及鉴定调节细胞的自我更新及分化的未知分子已成为研究的热点。 2 胚胎干细胞为基础的分化模型 胚胎干细胞要维持其未分化的状态,需要在胚胎饲养层中加入分化抑制因子。一旦改变了维持胚胎干细胞未分化状态的条件,胚胎干细胞首先形成胚胎小体,胚胎小体有外中内三胚层,继续分化可形成多种类型的细胞。在体外分化培养时,可自发形成有节律性跳动的心肌细胞,同时还形成骨骼肌、神经细胞、上皮细胞等。由于体外胚胎细胞可重演体内胚胎细胞的发育过程,并且基因的表达时相与体内的胚胎发育过程是相似的,在这一过程中加入外源的诱导分化因子并与相关的调控基因结合,可使胚胎干细胞分化为各种类型的细胞。现在已初步建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞和造血细胞等体外分化模型。 2.1 神经细胞 体外培养胚胎干细胞可模拟从未定型细胞向功能性神经元转化的过程,并且其基因的表达时相与体内的胚胎发育过程相似。在分化的早期表达N FL、N F M基因,后期则表达N eur ocan基因。维甲酸及神经生长因子可诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞,是常用的诱导分化物,它能上调神经元特异基因的表达,同时下调中胚层基因的表达。将神经元特异的SOX2基因转进胚胎干细胞,再经维甲酸诱导,可表达90%以上的具有神经元标志的神经细胞。可能是外源基因和维甲酸同时拮抗分化抑制因子的作用,阻碍细胞向其他的方向分化,迫使其向神经元的方向分化。维甲酸能诱导胚胎干细胞分化为C-氨基丁酸能和多巴胺能神经元,而维甲酸分别结合无血清培养基和含胎牛血清的培养基培养胚胎干细胞后发现,采用无血清培养时,几乎检测不到分化的多巴胺能神经元的存在;但在有血清培养时,却能检测到大量的多巴胺神经元。这暗示血清中的某些未知的因子和维甲酸共同起到定向诱导分化 化为特定组织细胞,将这些细胞回输体内,从而达到长期治疗的目的。干细胞的医学应用还包括体外克隆人体器官,然而这比体内移植干细胞要复杂的多。相信随着研究的不断深入,来自人体干细胞的器官应用于临床治疗已为期不远。干细胞研究与应用不仅在疾病治疗方面有着极其诱人的前景,而且将对克隆动物,转基因动物生产,发育生物学,新药物的开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响。 参考文献 1 Th omson J A,Itsk ovitz-Eldor J os eph,Shapiro S S,et al. Em bryonic s tem cell lin es d erived from human b las tocysts.S cience,1998,282:1145—1147. 2 Sh amb lott M J,Axelman J,W ang S,et al.Derivation of Plurip otent stem cells from cultured human primordial germ cell.Proc Natl Acad S ci U SA,1998,95:13726—13731. 3 Jack son K A,M i T,Goodell M A.Hematopoietic potential of s tem cells isolated from murie s keletal mus cle.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:14482— 14486. 4 裴雪涛.干细胞研究现状与展望.高技术通讯,2001, (6):93—95. (BH)
胚胎干细胞的归类 干细胞按分化潜能可分为全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞三类，对于胚胎干细胞和造血干细胞各属于哪一类，不同的教材和资料说法不同。新课标人教版必修1教师教学用书P31“胚胎干细胞分裂速度快，并且有产生多种分化细胞类型的潜力，因此，它们也被称为多能干细胞。”选修3教师教学用书P73“全能干细胞是可以发育成一个完整个体的未分化细胞，如受精卵。多能干细胞是指能分化成除胎盘之外所有其它组织细胞的未分化细胞，如ES细胞（胚胎干细胞），他的分化能力仅次于受精卵。专能干细胞是指与特定器官和特定功能相关的一类干细胞，如神经干细胞、造血干细胞等。”从中不难看出，胚胎干细胞和造血干细胞分别属于多能干细胞和专能干细胞。 而苏教版教材上是这样解释的：“专能干细胞只能分化成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌干细胞；多能干细胞具有分化成多种细胞或组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，如造血干细胞等；全能干细胞可以分化为全身200多种细胞，如神经细胞，并进一步形成机体的所有组织、器官，如胚胎干细胞。” 再看中图版教材上的描述：“全能干细胞具有形成机体的任何组织或器官，直至形成完整个体的潜能。受精卵便是一个最初的全能干细胞，它可以分化出许多全能干细胞，如胚胎干细胞。提取这些细胞中的任意一个置于子宫内，就可以发育出一个完整的个体。多能干细胞具有分化出多种组织的潜能，但不能发育成完整的个体，如骨髓造血干细胞可以分化出至少12种血细胞。专能干细胞只能分化成某一类型的，如神经干细胞只可分化出各类神经细胞。” 从苏教版和中图版教材的内容中可以看出，胚胎干细胞是全能干细胞，造血干细胞是多能干细胞，这和人教版教师教学用书上的叙述相矛盾，和人
胚胎干细胞体外诱导分化综述 摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。 关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用 干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以 分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离 自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的 分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团 内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培 养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞
药物筛选细胞模型的种类 目前用于药物筛选的细胞模型可分为三大类：基于靶点的细胞模型、基于表型的细胞模型和抗病毒药物筛选的细胞模型等。 1. 基于靶点的细胞模型建立基于靶点的细胞模型，要明确药物可能作用的靶点，进而建立靶点过表达的细胞，筛选对靶点有明确作用的药物。基于靶点的细胞模型是目前用于药物筛选的细胞模型的主要类型，可以分为四类。 (1)以受体为靶点的细胞模型：如以维甲酸受体为靶点的药物筛选细胞模型。 (2)以通道为靶点的细胞模型：如囊性纤维化相关的氯离子通道CFTR激活剂／抑制剂筛选细胞模型。 (3)以信号通路为靶点的细胞模型：如NF2κB信号通路的抗阿尔茨海默病药物筛选细胞模型。 (4)以报告基因和其他类型联用为靶点的细胞模型：事实上前三种药物筛选细胞模型通常是和报告基因联用来建立的，这样能够比较快速直观地观察到药物作用后细胞的变化。目前常用的报告基因有绿色荧光蛋白(GFP)和分泌型碱性磷酸酶(SEAP)等。 由人胎盘基因编码的分泌型碱性磷酸酶，能分泌至细胞外，无须裂解细胞就能进行检测，有较强的耐热性，通过热处理就可以排除细胞内源性碱性磷酸酶的干扰。在用碱性磷酸酶做报告基因时，通常是将其与要检测的靶点通过基因重组构建共表达的载体，然后稳定转染到细胞内，在筛选药物时，通过检测SEAP，就可以达到检测药物靶点检测水平的目的。 绿色荧光蛋白的发现，特别是在其基础上通过改造形成的，如黄色荧光蛋白(YFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及其他突变体的产生，极大促进了药物筛选细胞模型的发展。绿色荧光蛋白是一类对离子变化敏感的荧光蛋白分子。将绿色荧光蛋白与目的药靶稳定共转染于细胞模型中，药物作用于药靶后，会引起细胞内环境的变化，从而使荧光强度发生改变。通过荧光测定装置来捕捉用药前后的荧光强度变化，可以快速直观地观察到药物与药靶的作用情况。 2．基于表型的细胞模型基于表型的药物筛选模型通过筛选那些能造成细胞产生期望的生理变化的化合物，将有助于新蛋白、新靶点的发现。如目前在2 型糖尿病药物筛选中应用较多的有胰岛素抵抗细胞模型和葡萄糖消耗运转细胞模型、用于抗 I 型超敏反应药物筛选的肥大细胞模型等。
细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养
胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs
1简述莲子去心的方法及心和肉分别人药的原因。 去心的方法：莲子在产地趁鲜用竹签插出莲子心，晒或烘干，莲子肉仍保持整粒出售。莲子心能清心热，而莲子肉能补脾涩精，作用不一样，故须分别人药。 2为什么说“逢子必炒”、“逢子必破” ? 果实种子类药物经炒黄处理后，种皮或果皮爆裂，质地酥脆易碎，易于煎出有效成分，故有“逢子必炒”、“逢子必破”之说。“逢子必破”：意思是把所有的果实种子都捣碎更有利于有效成分的煎出。 3试述液体辅料中醋的炮制作用、分类及其异同。 4试述液体辅料中酒的炮制作用、分类及其异同。 5简述山楂的炮制方法和炮制作用 【炮制方法】 ①山楂：秋季果实成熟时采收，切片，干燥，除去杂质及脱落的核。 ②炒山楂：取净山楂，置预热适度的炒制容器内，用中火加热，炒至色变深，取出晾凉。筛去碎屑。 ③焦山楂：取净山楂，置预热适度的炒制容器内，用中火加热，炒至表面焦褐色，内部黄褐色，取出晾凉。筛去碎屑。 ④山楂炭：取净山楂，置预热适度的炒制容器内，用武火加热，炒至表面焦黑色，内部焦褐色，取出晾凉。筛去碎屑。 【炮制作用】山楂生品长于活血化瘀。 炒山楂酸味减弱，可缓和对胃的刺激性，善于消食化积。 焦山楂不仅酸味减弱，且增加苦味，长于消食止痢。 山楂炭性收涩，具有止血，止泻的功效。 6槐米炒炭后为什么能增强止血作用 ? (1)鞣质增加而止血。鞣质本身就有收敛止血的作用，槐米炒炭后鞣质含量可以增加，一般在?190?℃?时可使鞣质增加达到高峰，外观褐色，只有炒焦的程度。 (2)槲皮素增加而止血。槐米炒炭后槲皮素增加，槲皮素具有一定止血作用。? (3)异鼠李素降低而止血。槐米的抗止血成分异鼠李素经炒炭后含量几乎减少一半。由此看来槐米炒炭，使止血作用增强具有双重意义：即止血成分增加，抗止血成分降低。 7试述荆芥的炮制方法及炮制作用。 【炮制方法】 ①荆芥：取原药材，去除杂质，抢水洗净，稍润，切段，干燥，筛去灰屑。 ②炒荆芥：取荆芥段，置预热适度的炒制容器内，用文火加热，炒至微黄色，取出，放凉。 ③荆芥炭：取荆芥段，置预热适度的炒制容器内，用武火加热，炒至表面焦黑色，喷淋清水少许，熄灭火星，取出晾干。 【炮制方法】荆芥生品辛散力较强，具有祛风解表的功效。 炒荆芥去游祛风理血的作用。 荆芥炭辛散作用极弱，具有止血的功效。 8简述苍术的炮制方法及炮制作用。 【炮制方法】 1.生苍术：除杂、用水浸泡，润透、切厚片，干燥。
中药炮制与临床疗效 张学兰, 李慧芬 中药炮制是根据中医药理论，依照辨证施治用药需要和药物自身性质，以及调剂、制剂的不同要求，所采取的一项制药技术。炮制是制备中药饮片的一门传统制药技术，也是中医药学特定的专用制药术语，历史上又称“炮炙”、“修治”、“修事”。中药材不能直接入药，必须炮制成饮片之后才能入药。所谓中药饮片是指中药材经过炮制后可直接供中医临床调配汤剂和中成药生产使用的所有药物。中药依法炮制和复方配伍是中医临床用药的特色所在，也是中医药有别于其它传统医药的重要标志。 中医治病主要借鉴中国古代哲学思想，重视人体本身的统一性、完整性、个体差异及其与自然界的相互关系，以“天人合一”为基本精神，以“辨证施治”为治疗疾病的基本法则。在临床工作中，中医从诊断到治疗的整个过程，都要考虑人体的阴阳盛衰、气血变化以及脏腑的寒热虚实、气候、环境以及生活起居等对人体的影响。治疗原则、遣方用药必须根据这些情况做出正确决定。但中药的性能和作用无有不偏，偏则利害相随，不能完全满足临床治疗的要求，这就需要通过炮制对药物原有的性能予以取舍，权衡损益，力求符合疾病治疗的实际要求。通过炮制可改善中药的偏性和毒性，以保证临床用药的安全有效；并可根据不同的病因、病机、症候及患者的体质情况，有的放矢地选用炮制品，以增强方剂的准确性、可靠性和实用疗效。 第一部分中药炮制是中医临床用药的特点中药炮制作为一门传统制药技术，是中医药特色和优势的具体体现，已经成为中医药不可缺少的组成部分。在某种意义上说，中药炮制的理论、方法工艺以及临床应用是由我国劳动人民以生命为代价，历经几千年的临床实践和反复验证的经验总结，保证了中医临床用药安全有效。 一、中药来源于自然界，经炮制后方能达到临床用药要求 中药绝大多数来源于自然界的原植物、原动物和原矿物，原药材中常常含有泥沙杂质、霉败品和非药用部位，因此，多数不能直接入药，经加工炮制后，可去除杂质，选出规定的药用部位。对于体积、质地不同的原药材，尤其是具有毒
净制与临床疗效 由于药材在采收过程中难免混有杂质和非药用部位。有的药材各个部位的作用不同，如果不加以净制，一并入药，势必影响疗效，甚至造成医疗事故。如麻黄茎具有发汗作用，而麻黄根却有止汗作用，在炮制中必须根茎分开，区别入药，否则就会影响疗效。还有些药材必须剔除非药用部分，如巴戟天、远志、牡丹皮等必须抽取净木芯，如果不加以净制，会造成疗效降低或完全没有疗效。 切制对疗效的影响 一部分中药材体积较大，无法直接调剂，更不能保证煎出效果，必须按药材的质地不同，采取“质坚宜薄”、“质松宜厚”的原则进行切制，以利于煎出药物的有效成分，并避免药材细粉在煎煮过程中出现糊化、粘锅等现象，显示出饮片“细而不粉”的特色。饮片切制是提高煎药质量，保证中医临床疗效的关键措施之一。 中药饮片切制是为了提高煎药的质量，在炮制前要进行润泡软化操作，使软硬适度，便于切制，但软润方法和控制处理的时间以及吸水量是至关重要的。有些药材不易在水中浸泡，需采取其它方法软润；有的药材浸泡的时间不宜过长，吸水量不宜过大，否则药材中的有效成份大量流失，降低或失去疗效，并给饮片干燥带来不利影响。另外药材在切制过程中厚度应均匀，厚薄相差太大在煎煮过程中就会出现易溶和难溶，以及先溶和后溶等问题，浸出物将会取气失味或取味失气，达不到气味相得的要求。如黄芩在切制饮片前宜蒸气软化，或者沸10分钟，而不宜冷水浸泡软化。又如槟榔经水浸煎后切片，醚溶性物碱损失很大，以减压蒸汽焖润法或蒸气法软化切片可大幅度降低槟榔碱损失。 饮片干燥亦很重要，切制后的饮片因含水量较高，若不及时干燥很容易霉烂变质。干燥方法和干燥温度不当，也会造成有效成分损失，特别是挥发性成分或对日光敏感的部分，若采用高温干燥或曝晒，疗效会明显降低。 加热炮制对疗效的影响
第二章中药炮制与临床疗效 习题 一、填空题 1.中医用药得一大特色就是。 2.传统制药得原则就是、、——、——;具体方法为——、、、。 3.炮制对药性得影响包括对、——、——、——得影响等。 4.所谓“毒”主要指得就是。 5、——就是汤剂与中成药得基本原料药。 二、选择题 (一)A型题 1.“或制其形,或制其性,或制其味,或制其质”得论述载于( ) A.《汤液本草》 B.《炮炙大法》 C.《修事指南》 D.《雷公炮炙论》 E.《医学源流论》 J.用药性相对立得辅料或药物来制约中药得偏性或改变药性称为( ) A.相反为制 B.相资为制 C.相畏为制 D.相恶为制 E.相杀为制 3.张仲景在《伤寒论》白虎汤中得甘草就是( ) A.炙甘草B、生甘草 C.粉甘草 D.甘草梢 E.甘草皮 4.“升者引以咸寒,则沉而直达下焦;沉者引以酒,则浮而上至巅顶”得论述源自( ) A.缪希雍 B.李时珍 C.张仲岩 D.雷小 E.陶弘景 5.叙述栀子“用仁去心胸热,用皮去肌表热,寻常生用”就是下列哪个书籍记载: A.《医学入门》 B.《本草便读》 C.《雷公炮炙论》 D.《炮炙大法》 E.《神农本草经》 6.叙述香附“人血分补虚童便浸炒;调气盐水浸炒;行经络酒浸炒;消积聚醋浸炒……走表药中,则生用之”就是下列哪个书籍记载( ) A.《本经逢原》 B.《修事指南》 C.《本草纲目》 D.《新修本草》 E.《太平圣惠方》 7.“炮制失其体性,筛罗粗恶,分剂差殊,虽有疗疾之名,永无必愈之效”就是下列哪个书籍记载( ) A.《新修本草》 B.《黄帝内经》 C.《太平圣惠方》 D.《炮炙大法》 E.《修事指南》 8.“凡药制造,贵在适中,不及则功效难求,太过则气味反失……”就是下列哪个书籍记载( ) A.《新修本草》 B.《伤寒论》 C.《汤液本草》 D.《本草蒙筌》 E.《医学流源》 9.“炮制不明,药性不确,则汤方不准,而病症不验也”就是下列哪个书籍记载( ) A.《本草述》 B.《修事指南》 C.《本草述钩元》 D.《本经逢原》 E.《神农本草经》 10.百合蜜炙后适用于( ) A.肺虚咳嗽 B.肺热咳喘 C.阴虚燥咳 D.咳嗽痰多 E.肺寒咳嗽 11,三子养亲汤中莱菔子应首选( ) A.生莱菔子 B.炒莱菔子 C.捣烂得莱菔子 D.焦莱菔子 E.莱菔子炭 12.“痛泻要方”中得白术应选择( ) A.生白术 B.麸炒白术 C.土炒白术 D.焦白术 E.炒白术
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/4e192710.html, 胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景 作者：王士珍李雪甫陈培 来源：《科技视界》2012年第23期 【摘要】胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES细胞)主要来自于胚胎发育早期囊胚中内细胞群(inner cell mass, ICM), 具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性。理论上可以诱导分化为机体中200多种细胞，可作为细胞移植、组织替代, 甚至器官克隆的细胞供体，为将来治疗人类诸多难治性疾病提供细胞来源。本文简述了胚胎干细胞的诱导分化方法、定向分化的一些细胞种类以及应用前景。 【关键词】胚胎干细胞；诱导；分化 ES细胞是由囊胚的内细胞群或胎儿的原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)经体外抑制分化培养而获得的一种具有多向分化潜能的细胞。英国剑桥大学的Evans等[1]于1981年首次建立了小鼠胚胎干细胞系。Thomson等[2]于1998年利用临床上体外受精的胚胎，采用免疫法分离出内细胞群，首次成功分离出人胚胎干细胞系。同年，Sham blott等[2]以STO作为饲养层首次建立了人胚胎生殖细胞(hEGC)系。一般情况下，可将胚胎干细胞和胚胎生殖细胞统称 为胚胎干细胞。饲养层或白血病抑制因子（LIF）是ES细胞体外培养过程中保持未分化状态的必要条件。当培养条件有轻微改变时，例如在培养液中添加某些诱导分化因子（维甲酸RA、DMSO等），ES细胞就会发生分化；另外，如果把脱离饲养层的ES细胞进行悬浮培养，会发育成大小不一的拟胚体（embryoid boby, EB）,然后可诱导EB向不同类型细胞分化。至今，已从ES细胞诱导分化出心肌细胞、骨细胞、软骨细胞、肝细胞、造血细胞、脂肪细胞、胰岛素细胞、神经细胞、内皮细胞等。这些诱导后的细胞有望为器官移植、损伤器官的修复提供原材料，具有十分广阔的临床应用前景。所以，近年来有关胚胎干细胞的定向分化研究已成为全世界研究的热点。 1诱导ES细胞定向分化的方法 目前，通常针对人们设想要得到的终末靶细胞，而采用不同的诱导分化方法，使ES细胞最终定向分化为目的细胞。最常用的诱导方法一般包括以下四种：化学试剂诱导法、细胞因子诱导法、共培养诱导法以及转基因诱导法等。 1.1化学试剂诱导法 维甲酸（retinoic acid，RA）是体内维生素A的代谢中间产物，主要影响骨的生长和促进上皮细胞增生、分化、角质溶解等代谢作用。Schuldiner等[3]用一定浓度的RA（10-6M）诱导人ES细胞向神经细胞分化。实验证实：产生的神经细胞比未用RA处理的对照组增加了22%。目前，RA诱导ES细胞分化为神经细胞的机制还没有完全弄清楚。一般认为RA进入细胞后，最先与细胞质中维甲酸结合蛋白 (cellular RA binding protein，CRABP)形成复合物，然
中药炮制对药效的影响 【摘要】目的:探讨中药炮制对药方的影响。方法:通过对中药采用不同的方法和辅料炮制，对药效进行比较。结果:通过炮制，消除方中某些药物的不良反应，利于治疗，提高药方疗效，调整方剂部分适应证，扩大应用范围，满足药方的剂型要求，保证临床安全有效。 【关键词】中药;炮制;方剂 中药是中医治病的物质基础，而中医运用中药又常常是组成复方应用，药物的炮制方法通常根据组方的需求而定。饮片质量的好坏对方剂的疗效有直接的影响。由于药方对方中药物的炮制要求常用脚注方式标明（亦有直接冠以炮制品名的）或在用法中予以说明，这样就把炮制与药方的疗效紧密结合起来了。本文主要从4个方面来阐述中药炮制对药方的影响，以供参考。 1 消减方中某些药物的不良反应 由于方中有的药物某一作用不利于治疗，往往影响全方疗效的发挥，就需要通过炮制调整药性，使其更好地适应病情的需要。 1.1 消除药物本身不利于治疗的因素有的药物在治病的同时，也会因药物某一作用与证不符，给治疗带来不利影响。因此，需要通过炮制调整药效，趋利避害，扬长避短。如干姜，其性辛热而燥，长于温中回阳，温肺化饮。在四逆汤中用干姜生品，取其能守能走，力猛而速，功专温脾阳而散里寒，助附子破阴回阳，以迅速挽救衰微的肾阳。在小青龙汤中，用干姜生品，是取其温肺化饮之功，且能温中燥湿，使脾能散精，以杜饮邪之源。在生化汤中则需用炮姜，这是因
为生化汤主要用于产后受寒，恶露不行，小腹冷痛等。因产后失血，血气大虚，炮姜微辛而苦温，既无辛散耗气、燥湿伤阴之弊，又善于温中止痛，且能入营血助当归、炙甘草通脉生新，佐川芎、桃仁化瘀除旧;若用生品，则因辛燥，耗气伤阴，于病不利。 1.2 调整辅助药物的药性，制约方中主药对机体的不利影响某些药方中的主药在发挥治疗作用的同时也会产生不良反应，为了趋利避害，可在方中加入某种辅助药物，但它并不直接起治疗作用，而是制约主药的不良反应。如调胃承气汤为治热结阳明的缓下剂。方中芒硝、大黄均系大寒之品，易伤脾阳，又因二物下行甚速，足以泄热，方中用甘草不是泻火解毒，而是为了缓和大黄、芒硝速下之性，兼顾脾胃，所以甘草原方要求炙用，取其甘温，善于缓急益脾之功。 2 提高药方疗效 在成方中各药究竟选用什么炮制品是由药方的功效而定的，临床应用时，遣方用药和炮制品的选用又是根据病人的具体情况而定。为了确保临床疗效，通常可以从以下几个方面来考虑对中药的炮制。 2.1 增强方中药物的作用要达到此目的，就须将方中药物进行炮制，使有效物质易于溶出或利于保存，并调整其药性，发挥各自的擅长。如三子养亲汤中的紫苏子、白芥子、莱菔子均需炒爆。中医认为治痰以顺气治标，健脾燥湿治本;但气实而喘者，应以顺气降逆治本，治痰为标。三子养亲汤的适应证恰好是气实而喘，痰盛懒食，故本方的功效是降气平喘，化痰消食。紫苏子炒后辛散之性减弱，而温肺降气作用增强，其降气化痰，温肺平喘之功明显;白芥子炒后辛散耗
高通量药物筛选模型* 姚佳杨建波杨洁* （南京大学生命科学院生物化学系，医药生物技术国家实验室，南京210093） 摘要：本文介绍了可用于药物筛选的三种新的快速高通量筛选方法，包括基于反酵母双杂交的筛选系统；细胞平台伤的高通量筛选系统以及动物水平的筛选系统。并对其应用原理，应用情况和有缺点进行了阐述。 关键词：高通量筛选（HTS），酵母双杂交，靶点，受体 Abstract: This article mainly deals with three new dominant plat forms of HTS(High-Throughput Screen) which are fairly useful in drug screen——the reverse yeast two hybrid system, the cell-based screen and the animal platform, including their principles, their appliance and their advantages together with disadvantages. Key Words: High-Throughput Screen, yeast two-hybrid system, target, receptor 学科分类号：Q7 药物筛选模型研究经历了三个不同的发展阶段：最初意义上的筛选方法、分子生物学筛选方法和高通量筛选方法，而每一个阶段都源于一种新技术的诞生。最初的药物筛选是直接利用动物组织或天然产物进行的，并不涉及到疾病发生的分子机制。在这样粗略的筛选系统中只有有限的样品得到筛选，而且大多数样品只是基于疾病表征而非靶点的筛选。因此，药物的发现会带有偶然性。1980年以来，随着有机化学和分子生物学的发展，更加系统化的筛选方法应用到药物研究与开发中。一方面，有机化学的飞速发展为筛选提供了庞大的人工合成小分子库；另一方面，分子生物学为筛选提供了靶蛋白。通过比较正常人群与疾病患者间在机体组织细胞分子上的差异以及阐明模型组织中相应蛋白质的功能，从而正确地选择、描述并确认某些靶蛋白，有助于更加理性地进行药物筛选，不足的是上述过程往往费时耗财。而基因组学的发展对这个问题提供了很好的解决方法，基因组学能够更加有效地验证潜在的靶蛋白,并通过功能基因组研究能够快速有效地确认与特定疾病有关的靶蛋白[ 1 ]。 *本课题为国家自然科学基金资助项目（项目编号30171094和30271497）。联系人：杨洁，南京大学生命科学学院，医药生物技术国家重点实验室，南京210093，中国；电话：86-25-3594060，传真：86-25-3324605；Email：luckyjyj@https://www.doczj.com/doc/4e192710.html,。
中药炮制与临床疗效的发挥 炮制可以改变中药的作用机制，缓和药性及降低毒副作用；其中加工时间、炮制方法及气味炮制与疗效关系很大。中药的炮制工艺影响着中药的药效和临床疗效，为此我们要加强炮制工艺，提高中药的临床疗效。 标签：炮制；中药；疗效 中药炮制是根据中药理论，依照辨证施治用药的需要和中药自身性质，以及制剂的不同要求，所采用的一项制药技术。众所周知，我国中药加工炮制已有4 000多年的历史，其与临床疗效的关系早已被证明。不过在实际工作中，很多医院或者中药企业往往忽视了中药炮制的作用，其作用往往达不到临床需要。为此本文探讨了中药加工炮制中影响临床疗效的几个问题。 1中药炮制与对临床疗效的影响 1.1改变中药的作用机制 疾病有表里之别，药有升降、敛散之殊。临床上，治疗表里病位不同的病症时，常常需要通过强化复方的作用机制趋势，来满足治表治本的需要。强化复方作用机制趋势，除了配伍时对中药的选择外，还常常通过对中药进行炮制来实现这一目的。例如干姜，原本以温中散冷，兼而发汗见长，但通过煨制后，则消除了解表作用，而专于温中止呕，炒炭后，不仅发汗解表作用荡然无存，就连温中作用也明显降低，而专于温中止血。还有柴胡，原本是典型的发汗解表药，作用趋向于表。经过醋炒后，其发汗解表作用，明显削弱，而作为肝经的引经作用则明显增强，作用趋向于里。 1.2降低中药的毒性反应 长期以来，我国人民普遍认为中药安全无毒，很多中药制剂成为西药降低副反应的备选药物。中药在国外销售时，也主要以保健品和食品添加剂形式出现在市场上，其毒性也未被充分重视。为此我们需要通过炮制降低其毒性或不良反应。例如半夏辛温有毒，生用有毒刺激咽喉，炮制后则减低毒性并缓和药性；例如草乌有用浸、漂、蒸、煮、加辅料等炮制方法，可以降低毒性。如酒炙大黄，取大黄片。大黄味苦，性寒，归脾、胃、大肠、肝、心经。生大黄苦寒沉降，气味重浊，走而不守，直达下焦，泻下作用较烈，具有攻积导滞，泻火解毒的功能。再比如姜炙厚朴，取厚朴丝，加姜汁拌匀，闷润，待姜汁吸净后，置铁锅内炒干，取出放凉，厚朴味苦、辛，性温。归脾、胃、肺、大肠经，具有燥湿消痰，下气除满的功能。 1.3缓和药性 中药采用冷、热、温、凉来表达中药的性能。炮制可改变中药冷热之性，例