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HE染色与免疫组织化学染色实验报告
1实验目的及意义
1.1了解石蜡切片的制作过程
1.2 掌握HE染色与免疫组织化学染色的基本原理以及染色方法
1.3 熟悉HE染色与免疫组织化学染色后的读片知识
2 实验方法及步骤
2.1 石蜡切片制作及HE染色步骤
2.1.1取材与固定：
从人或动物新鲜尸体上取下组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。
2.1.2脱水透明：
一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。
2.1.3浸蜡包埋：
将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。
2.1.4切片前的准备工作：
先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，四周留约2mm的石蜡块，块两边必须切成平行的直线。将玻片擦洗干净后均匀涂抹薄薄的一层蛋白甘油，放置冰箱备用。
2.1.5切片与贴片：
将预冷的蜡块固定于切片机上，调节切片厚度为6微米，切成薄片。切下的薄片往往皱折，放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。2.1.6 脱蜡至水
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二甲苯Ⅰ20分钟，二甲苯Ⅱ20分钟，无水乙醇3分钟，95％酒精3分钟，80％酒精3分钟，70％酒精3分钟，自来水洗5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。
2.1.7染色：
苏木素液7分钟，自来水洗5分钟，1％盐酸溶液分化30秒，自来水洗5分钟，1％氨水返蓝10秒，自来水洗20分钟，95％酒精3分钟，1％伊红酒精溶液2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。
2.1.8脱水和透明：
95％酒精2分钟，无水酒精Ⅰ2分钟，无水酒精Ⅱ2分钟，二甲苯Ⅰ5分钟，二甲苯Ⅱ5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。
2.1.9封固：
将已透明的切片滴上中性树胶，盖上盖玻片封固，放入37℃烘箱。
2.2 SABC 染色步骤
2.2.1脱蜡至水：
二甲苯Ⅰ20分钟，二甲苯Ⅱ15分钟，100％酒精2分钟，95％酒精2分钟，80％酒精2分钟，70％酒精2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。
2.2.2流水冲洗5分钟（水流要小）
2.2.3用蒸馏水配置新鲜的3%双氧水（30%双氧水1：9配制，配100ml），室温封闭15分钟，注意避光。
2.2.4蒸馏水洗5分钟，重复2次。
2.2.5热抗原修复，将切片浸入0.01M枸盐酸盐缓冲液中，置微波炉内高火5分钟，低火20分钟，完后自然冷却。
2.2.6取出切片放入染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。
2.2.7取出切片放入湿盒中，滴加5%BSA封闭液（覆盖满组织为宜），室温20分钟。
2.2.8甩去多余液体（擦去周围的流痕），滴加一抗（覆盖满组织为宜）注:阴性对照滴加PBS,放入4℃冰箱过夜。
2.2.9放入染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。
2.2.10取出放入湿盒中滴加二抗（覆盖满组织为宜），室温30分钟。
2.2.11取出置染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。放回湿盒中加SABC（覆盖满组织为宜），室温30分钟。
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2.2.12取出置染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。
2.2.13 DAB显色，取一试管加1ml单蒸水，B、C、A试剂按顺序各一滴加入试管中混匀，滴加于切片上，观察是否终止显色。
2.2.14终止显色用单蒸水洗5分钟，重复2次。
2.2.15苏木素衬染1分钟，流水冲洗5分钟。
2.2.16脱水透明，70％酒精3分钟，80％酒精2分钟，90％酒精2分钟，95％酒精2分钟，95％酒精Ⅱ2分钟，100％酒精Ⅰ2分钟，100％酒精Ⅱ2分钟，100％酒精Ⅲ2分钟二甲苯Ⅰ8分钟，二甲苯Ⅱ5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。
2.2.17中性树胶封片，放入37℃烘箱。
3 实验结果
3.1 HE 染色结果
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A
IB
B
IB
IB：狂犬病毒包涵体（内基氏（Negri）小体）
图1 狂犬病毒感染后脑组织病变 HE染色
A: 小脑浦肯野细胞内包涵体x400; B: 脑神经元内多处包涵体x400
狂犬病的病理变化在显微镜下主要表现为神经元退变,淋巴细胞和单核细胞浸润，胶质细胞增殖以及特征包涵体形成。狂犬病毒包涵体又称为内基体，直径
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约3～10nm，边缘整齐，内有1～2个状似细胞核的小点,主要出现在大脑海马区及小脑，其他部位也可见，在病变神经元胞浆内成圆形或卵圆形，苏木素一伊红染色脑组织切片中呈嗜酸性反应，病变神经元可含包涵体。大脑海马区神经元和小脑浦肯野细胞胞浆内检出狂犬病病毒包涵体，伴脑组织淤血、水肿。神经元变性．
A B
CP
C D
CP：豆状囊尾蚴虫卵的壳
图2 肝脏与肾脏的病变 HE染色
A: 豆状囊尾蚴在肝脏形成包囊x200; B: 脑神经元内多处包涵体x400 C：肾小管结构模糊，破坏x200; D: 肾小管上皮从基底膜脱落x400
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囊尾蚴感染后肝脏的病理变化可分为一般性变化和特征性变化两种。一般性病理变化主要表现为肝细胞变性与间质性肝炎。颗粒变性：表现为肝细胞肿大，肝细胞中有蛋白性颗粒，肝窦隙变小。水泡变性：肝脏细胞肿大，细胞质有些溶解，较为透亮，但细胞核的位置多无改变，肝窦隙变小。脂肪变性：有程度不等的脂肪滴。脂肪变性和颗粒变性常见于同一肝脏。间质病变：表现为程度不等的间质性肝炎，在汇管区或小叶间有结缔组织增生和灶状淋巴细胞浸润，小叶间静脉扩张。小叶间胆管都有程度不等的增生，其数量增加。胆管上皮增生，单层变成两层甚至复层，胆管黏膜上皮变厚，胆管周围结缔组织明显增生，呈慢性胆管炎与胆管周围炎。特征性病理变化是肝组织形成肉芽肿。可能是幼虫移行对肝细胞造成损伤后在局部发生的慢性炎症反应。幼虫移行造成肝细胞坏死和少量出血，接着局部上皮样细胞增生，其间有异物巨细胞以及多少不等的中性粒细胞浸润。这些中性粒细胞大多在结节外侧分布，在肉芽肿外围是结缔组织构成的包囊，包囊内分布着许多空壳样结构以及均质红染的椭圆形的虫卵。
肾脏的病变主要集中在大量的肾小管上皮从基底膜上脱落，肾小球囊腔变大，肾小球萎缩变小，血管球数目减少，肾小囊囊壁增厚。由于没有见到明显的炎性细胞的浸润，主要变现肾小管的病变，所以推断可能是肾病。而引起的原因也可能是多方面的，如临床的升汞急性中毒便会引起相应的病变。
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A
B
C
图3 肺脏形成的霉菌结节 HE染色
A: 肺泡结构大面积的消失x80; B: 霉菌结节的炎性反应带x200
C：肺脏的霉菌结节x400
肺脏的病理变化：肺细支气管及其周围小叶内都可看到很多肉芽肿。肉芽肿的中心含有细胞崩解物一嗜酸性坏死块占据，其周围为淋巴球、组织球等单核细胞。再往外，还可看到多核巨细胞及其上皮细胞。结节则可波及两个或两个以上的肺
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小叶，使其固有结构完全遭到破坏。较小的结节是由上皮样细胞、巨细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、数量不等的假性嗜伊红细胞和排列疏松的网状结构构成，巨细胞的位置不定，有的在结节中心，有的偏向边沿，数量和核的多少也不等。大的结节内细胞成分与小结节相同，但在排列上有一定的层次性，中心多为干酪样坏死区，外围是核巨细胞构成的细胞带，最外层是淋巴样细胞、成纤维细胞所形成的包膜。同样结节中也有数量不等的假性嗜伊红细胞和不规则排列的纤维素。结界中有时可见不同程度的出血。但没有发现很明显的淡染的菌丝体，可能是由于组织过厚，细胞成分过多，颜色过深，将菌丝体遮盖了，故难于发现。
3.2 SABC 染色结果
C A B D
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图4 Ki67蛋白在乳腺上皮的表达（SABC染色）
A: 乳腺组织Ki67阴性（核内）x400;B: 乳腺组织Ki67阴性（核内）x100
C: 乳腺组织Ki67阳性（核内）x400; D: 乳腺组织Ki67阴性（核内）x200
Ki67抗原是1983年由Gerdes等发现在增殖细胞中表达的一种核抗原，也是目前较为肯定的核增殖标志物。Ki67是一个标记细胞增殖状况的常用指标，尤其经常用于反映恶性肿瘤细胞的增殖状况。Ki67在正常乳腺组织有表达，但在从正常乳腺或是纤维腺瘤及增生上皮来的样本显示，ki67表达的水平极低。Ki67高表达与乳腺癌恶性程度成正相关，Ki67在细胞核内的定位形式复杂又有特异性，并随细胞周期改变。Ki67作为一种与细胞周期相关的增殖细胞核蛋白，只与增生细胞核反应，无组织特异性，是一个界定细胞凋亡和增殖的有价值的标记物。Ki67能准确地反映肿瘤细胞的增殖活性，并与多种肿瘤的发展、转移及预后有关，除细胞周期的G0期外，在每个有丝分裂期都可检测到Ki67，尤以M 期为最高，可直接、敏感地反映肿瘤细胞的增殖活性，并能较全面地反映增殖细胞的数量。其高阳性表达可反映肿瘤细胞的增殖和侵袭能力强，恶性程度高。在浸润性乳腺癌中发现Ki67与肿瘤细胞增殖及侵袭转移密切相关。部分学者认为Ki67表达与乳腺癌肿瘤临床分期有关，即分期越晚，Ki67阳性率越高。Ki67与肿瘤恶性程度呈正比与肿瘤的生长、侵袭及转移能力密切相关，是乳腺癌诊断和预后判断的一项重要指标。Ki67表达阳性的乳腺癌肿瘤细胞的恶性程度大，细胞增殖活跃,肿瘤生长速度快侵袭性大，转移的机会高，预后差。Ki67高表达是乳腺癌预后不良的指标。
4 小结
4.1石蜡切片制作的体会
石蜡切片是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。下面就按照实验步骤，谈一下我的一些体会。
4.1.1取材应根据要求选取材料来源及部位。
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4.1.2固定用适当的化学药液（固定液）浸渍切成小块组织材料，并选择合适固定液量以及固定时间。
4.1.3.脱水透明，固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。脱水时间长短应根据组织厚度，组织较薄或小，脱水时间不宜过长，否则组织会出现过硬或过脆的现象；组织厚度大时相对要求时间长些。透明时要注意：①要保证最后一级纯酒精的浓度，使组织彻底脱水，否则在二甲苯内就不能得到完全透明。②切片从纯酒精取出后进入二甲苯时，在空气中停留的时间不宜过长，特别是在阴天，空气湿度较大时，因纯酒精吸水性较强，致使切片进入二甲苯时其表面出现雾状而使切片透明不良。
4.1.4浸蜡要掌握时间，过短石蜡没有完全渗入组织中，会出现组织过软，切片困难。过长会造成组织硬脆，切片也难。组织包埋时要掌握好标本切面，选择较完整平坦面为切面，切面朝下。小标本包埋速度应快，否则易造成组织块与
周围石蜡的脱裂，包埋好的蜡块放置4℃冰箱中过夜，便于切片。
4.1.5切片包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形，切片刀要求锋利且无缺口，切片自行卷起多由切片刀不锋利所致。刀有缺口时，易造成断裂、破碎和不完整。切片时组织块固定不牢时，切片上常形成横纹及切片厚薄不均。因此刀放置的要有合适的夹角。为保证切片的完整性，对于组织结构致密的组织如淋巴结等应适当薄切以防细胞成分叠加，影响观察效果。遇到硬化过度的肝、脾、脑等组织时应轻轻切削，以防组织由于震动产生空洞现象。
4.1.6贴片与烤片，用蛋白甘油作为粘附剂，在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，防止蛋白甘油吸附过多，在染色时出现脱片现象。
4.2应用HE染色的体会
苏木精—伊红染色法简称HE染色法，它是最常用的普通染色方法。苏木精（hematoxylin）是阳离子染料，将细胞核内的嗜碱性物质染成蓝紫色。伊红（eosin）是阴离子染料，将细胞质和胶原纤维等染成粉红色。虽然HE染色是一种十分常见的染色方法，但对于不同的组织，其脱水，染色，透明等步骤的具体时间有所不同，很多环节还有待进一步摸索。下面就按照实验步骤，谈一下我的一些体会。
4.2.1染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液
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中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。
4.2.2苏木精染色后，分色是至关重要的，应该在显微镜下进行。一般以细胞核染色比较清晰，细胞质等基本无色为宜。如发现过染，可以延长分色时间，若染色太浅，则应重新进行染色后再分色，总之必需分色至细胞核清晰而背景基本无色才能往下进行。
4.2.3切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。
4.2.4在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。
4.2.5切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。
4.2.6最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。
4.3应用SABC法进行免疫组化染色的体会
SABC（Strept Actividin-Biotin Complex）法是一种显示组织和细胞中抗原分布的简便而敏感的免疫组化染色方法。由于该方法中的链霉亲和素的等电点接近中性（pH=6.0-6.5），对组织和细胞的吸附性特别低，因而具有较低的背景。它的步骤与其他免疫组化染色基本相似，有良好的可操作性。尽管SABC法操作简便，敏感性强，但是，在操作中仍然要遵循一定的原则，才能得到可信度高的结果。下面就按照实验步骤，谈一下我的一些体会。
4.3.1试验前要先做好标记，以防滴加试剂时出现混乱。
4.3.2切片常规脱蜡至水：二甲苯虽然可以反复使用，但次数不宜多。乙醇的浓度是从高到低，与脱水时相反。
4.3.3灭活内源性酶：使用30%双氧水和蒸馏水按1:9的溶剂比混合较为理想。4.3.4抗原修复：由于Ki67蛋白在细胞核内表达，可进行热修复抗原。
4.3.5正常犊牛血清封闭：封闭时应该注意室温与时间的相对关系。室温低，时间就要长一些，反之亦然。另外，保持反应池湿润是重要的一环，否则，前功尽弃。后面的步骤也是如此。
4.3.6一抗的浓度：这需要自行探索，虽然试剂公司给出了参考浓度，但仍然要探索出恰当的浓度，任何取巧的念头都是得不偿失的。孵育时间与温度：抗原抗体充分反应是得到可靠结果的关键。因此，控制温度与时间也是一个严肃的问题。由于室温控制较为困难，可放在4℃冰箱过夜（≥18h）
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4.3.7滴加BSA、一抗、二抗、SABC等要以覆盖满组织为宜。
4.3.8所有的反应均应在湿盒中进行，PBS洗切片时要将组织完全浸润在液体中。
4.3.9DAB显色镜下控时：DAB浓度应该比推荐的要低一些，这样可以便于控制反应时间以及在合适的时候中止反应。同时注意，使用后残余的DAB应妥善处理，而不是随便倒入下水道，因为它可能有致癌性。
4.3.10脱水透明：脱水乙醇的浓度由低到高，有一个较准确判断脱水成功与否的办法是：观察透明后盛二甲苯容器的壁，若发现白色雾状现象，则说明脱水不成功，应再次脱水。透明时间不要太长，1分钟左右就可以了。
4.3.11封片：封片时，中性树脂量宜少，同时注意不要产生气泡。
4.4在整个实验过程中，要注意的方面
4.4.1要设立对照，以及做好记录，以便于在问题产生时查找原因。
4.4.2注意时间与温度的相对关系，留心试验过程，优化试验结果。
4.4.3要提前准备：例如各种浓度的乙醇要提前准备好，孵育设备提前开机等，都要考虑周到，否则会影响实验的进程，甚至影响实验的结果。
4.4.4准备一份操作流程图，按部就班做实验，同时也有利于查找失败的原因.
免疫组织化学抗体试剂及检测试剂盒注册申报资料的基本要求 2013-01-04 01:48 免疫组织化学抗体试剂及检测试剂是指一类利用免疫学原理结合酶催化底物显色的化学方法，检测组织标本中抗原的检测试剂。此类试剂为待测抗原特异性单克隆或多克隆抗体，或抗体与显色系统、对照试剂、质控片及其它辅助试剂一同包装成试剂盒形式的检测试剂盒。该类产品检测项目繁多，应用广泛，检测过程为多步骤检测，影响因素多，在临床上主要用于检测细胞的特异性抗原以确定细胞的表型。该类产品的预期用途与诊断、鉴别诊断、预后判断、指导用药相关，按照三类体外诊断试剂管理。 基于该类产品临床应用的重要性及特殊性，根据目前注册申报工作的需要、依据《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》、《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》以及《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的相关规定，结合临床及病理检测中的应用实践、临床病理专家和生产企业的建议，现对免疫组织化学抗体试剂及检测试剂盒注册申报资料提出以下基本要求（对于本要求未提及的部分，申请人均应依据相关法规要求提交注册申报资料）。 本《要求》是在目前科学技术认识水平及现阶段免疫组化类产品技术审评基础上形成的，审评人员会密切关注相关技术的最新进展，随着认识的提高将适时调整。由于该类产品种类繁多，《基本要求》不能涵盖所有该类产品的特殊情况，如某些要求不适用，申请人也可采用其他方式证明产品的技术性能，建议申请人对此进行详细说明，并
提交相应的性能验证资料。 依据免疫组化不同标志物的临床应用情况，将其分为二个大类：A类：Her2/Neu、ER、PR、ALK、CD117、c-met、CD20、EGFR等与临床治疗、用药密切相关的标志物；其他全新标记物，具有新的临床意义。 B类：临床使用多个指标综合诊治的标志物之一，与辅助诊断、鉴别诊断、病情监测、预后相关标志物：如：Ki67、CK5/6等。 一、产品说明书 1. 【产品名称】：单独的第一抗体试剂通用名称建议采取以下命名方式：待测抗原特异性抗体+试剂（免疫组织化学法）。抗体与显色系统、对照试剂、质控片及其它辅助试剂一同包装成试剂盒形式的检测试剂盒通用名称建议采用以下命名方式：待测抗原+检测试剂盒（免疫组织化学法）。如：雌激素受体抗体试剂（免疫组织化学法）、孕酮受体检测试剂盒（免疫组织化学法）。 2. 【预期用途】：应明确检测的样本类型（冰冻和/或石蜡包埋等）；明确抗体的类型、克隆号、阳性着色特点；明确临床用途（诊断、鉴别诊断、预后判断、指导用药）；指明“对任何阳性或阴性结果的解读，应
免疫组织化学 傅琦博 引言 酶工程是生物工程的重要组成部分，近几十年来，随着研究手段的更新和技术水平的提高，产生了一门以研究酶在细胞内的存在及其动态，以阐明组织细胞的结构和功能为主要内容的科学——酶组织化学。酶组织化学是利用酶化学反应的产物可在光学显微镜或电子显微镜下被识别的特性，借以从形态学角度判定酶在组织细胞内的存在的部位的一门技术，其基础是组织化学。它具有将形态学、生物化学和生理学联系起来的特点，在生物学、生物化学、医学生物领域内日益发挥着重要的作用。研究组织细胞内特定酶分布的酶组织化学方法大致分为：（1）利用酶的活性反映的方法；（2）利用抗原抗体反应（免疫应答）证实酶的存在部位的方法。后者也被称之为免疫组织化学。 免疫组织化学概述 免疫组织化学简称免疫组化，是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分，进行原位的定性、定位或定量的研究。这种技术称为免疫组织化学技术。免疫组化是利用抗体与抗原的结合具有高度特异性的特点，采用一直的抗体检测组织或细胞的抗原物质，以期确定组织或细胞是否存在未知抗原，并进行定性、定位或定量的研究。抗原与抗体结合形成的免疫复合物是无色的，故必须借助组织化学方法，将抗体抗原反应部位显示出来。它的主要研究方法是免疫组织染色法（简称免疫染色法），食用该方法检测细胞内物质，必须具备两个条件：①作为检测对象的物质须具有抗原性，能制作出与之相应的特异、高效价的抗体；②在免疫反应发生之前，目标物质要保持抗原性，同时还要保持在组织细胞内的稳定状态。要检测抗原，就要用与之相应的抗体进行免疫反应，同时要用可视的标记标出抗原或抗体，采用这种方法的免疫染色法称为标识抗体法或标识抗原法，常用的表示抗体法有直接法、间接法、补体结合法以及多重染色法等。直接法是标识要检出的抗原的抗体，然后进行反应的方法，其特异性高，但检出的敏感度不如间接法，标识抗体的食用范围手局限。间接法是以未标识的第一抗体进行反应，接着标识以第一抗体为抗原所制作的抗体（即第二抗体）进行重叠反应，间接的证明抗原，这种方法的缺点是容易出现非特异性反应，但敏感度较高，标识抗体的用途也广；补体结合法是将间接法中的第二抗体作为标识抗补体抗体食用；多重染色法则是在同一标本上检出多种抗原物质的方法，可以用反复进行的重复标记的直接法，也可以用酶标记的重复进行的间接法。此外，还有后标识抗体的免疫染色法，此法先采用未标识的抗体进行反应，反应结束后，通过免疫化学反应或其他化学反应，用适当的标记物质来识别已与组织细胞内抗原发生结合的抗体。 免疫组织化学技术的发展 免疫组织化学技术是形态学研究领域一门新兴方法学。自它问世以来发展迅猛,用“日新月异”一词形容它毫不过分。酶标免疫组织化学技术是由Nakane 等人于60 年代末期创立的最早的免疫酶组织化学技术,之后Sternberger 等人于70 年代初期便在此基础上建立了非标记抗体酶法(又称间接法) 和PAP 法(过氧化酶抗过氧化酶法) 。80 年代初期美籍华人Hsu 又建立了卵白素生物素复合物法(ABC法) ,自此之后,免疫金银染色法、免疫电镜等技术相继问世。80 年代末期人们又发现链霉菌抗生物素蛋白(或译成链霉菌亲合素,St reptavidin) 与生物素结合力极强,遂用它标记过氧化酶建立起了SP 法,或称LSAB 法(链霉菌亲合素生物素过氧化酶法) 。由于链霉菌亲合素不与人组织中的内源性生物素起非特异性结合反应,故背景染色更加清晰,且敏感性比ABC 法高4～8 倍,比PAP 法高8～16 倍。进入90 年代,免疫组织化学又向基因水平深入发展,与分子生物学技术的结合日益紧密。如原位杂交后信 号的放大与显示便是采用了免疫组织化学显色技术,因而又可称之为原位杂交免疫组织化学技术。而图象分析、流式细胞仪的运用，是免疫细胞化学定量分析技术提高到更精确的水平。现就该技术的发展及其应用作一概述。 1利用免疫荧光标记技术可以分辨出标记抗原抗体所在的位置及其性质, 并可利用荧光定量技术计算抗原(或抗体) 的含量, 以达到对定性、定位、定量测定的目的[2 ]。如黄祥瑞等人(1999) 利用免疫荧光细胞化学技术研究西藏环状病毒细胞生物学特性和敏感细胞范围(CPE) , 成功地观察到该病毒的细胞病变效应特异荧光发生的部位、细胞数量和病毒的形态发生。辛德毕斯热是由辛德毕斯病毒Sindbis V irus (SiN ) 引起的人兽共患虫媒病毒病, 1974 年南非发生辛德毕斯热大流行。1991年梁国栋等通
免疫组织化学及其应用 浙江大学病理学与法医学研究所 周韧 1．免疫组织化学的历史、现状和发展 1．1．历史 ●人类的历史有多长，医学的历史也就有多长.医学的任何一个进步都是建立在当 时科学与技术发展的相应水平上的. ●医学的目的: 解除人体的病痛 ●核心: 诊断和治疗。 任何疾病的有效治疗均来源于正确的诊断。●疾病的诊断手段准确性，首推病理诊断准确性高，即病理组织学诊断。更准确、 更可信、更有权威性。 ●免疫组织化学（以下简称免疫组化）已成为病理诊断中的一种常用手段。 病理诊断发展过程的主要事件 年代作者事件 1632年 Severino 肿瘤切开后观察的书 1661年 Malpighi 放大镜观察后的报告 1761年 Morgagni 肿瘤与外科方面的书 1829年 Horner 首篇病理论文 1832年Hodgkin 报告7例尸检结果的论文 1858年Virchow 发表《细胞病理学》 1863年 Paget 发表《外科病理学》 1897年 Mallory和Wright 发表组织学技术的书 1914年 Mallory 发表《细胞组织学原则》 1919年 Ewing 发表《肿瘤病》 1924年 McFarland 发表《外科病理学》 1926年 Karsner 发表《人体病理学》 1928年 Papanicolaou 发表细胞学方面的书 1951年电镜应用于病理诊断 1974年免疫组化用于病理诊断 ●诊断病理学开始于19世纪 ●20世纪的第二个25年中达到光学显微镜诊断的辉煌。随之而起的电子显微镜 ●20世纪第三个25年中成为诊断病理的发展高峰。
●进入20世纪最后25年，取而代之的便是免疫组化了。 1．2．免疫组织化学的发展 1．2．1．免疫学的发展 1．2．2．单克隆技术的出现 ●病理诊断的确立：是找到“特征性”形态表现。 常规苏木素伊红（HE）染色 几百种的“特殊染色” ●免疫组织化学产生： 抗原抗体结合原理 ●从组织细胞水平进行抗原抗体反应，于是就了免疫组织化学技术。 主要的发展过程 年代研究者事件 1941年 Coons 实用免疫荧光技术 1948年 Fagraeus 进一步发展免疫荧光技术 1970年 Sternberger 抗体酶标记技术 1974年 Taylor 证实组织中的浆细胞免疫 1975年 Kohler和Milstein 单克隆抗体技术 1981年 Hsu ABC法 90年代以来 SP法，原位杂交及原位PCR免 疫组化法
免疫组化技术 免疫组化技术
业精于勤而荒于嬉 行成于思而毁于随
免疫组化技术
原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色 来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取 出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并 用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗 体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂 DAB 显示 为棕黄色颗粒） 。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产 物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨 基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）
1、免疫荧光方法
最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内 的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某 种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较 广。
2、免疫酶标方法
免疫酶标方法是继免疫荧光后， 60 年代发展起来的技术。 于 基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用， 然后加入酶的底物， 生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标 技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种 标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属 PAP 法（过氧化物酶-抗过氧化物酶） 、ABC 法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物） SP 、SP 、即用型二步法（聚合物链接）等。 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶） 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）
3、免疫胶体金技术
免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白 的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为 探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免 疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银 加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法
标本
1、组织标本：石蜡切片 石蜡切片（病理切片和组织芯片） 、冰冻切片 石蜡切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
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ICS65.020.30 B44 中国实验动物学会团体标准 T/CALAS x-201x 实验动物组织切片免疫组织化学染色 方法 Laboratory animals-Immunohistochemical procedures for paraffin embedded tissues （征求意见稿） 201x-xx-xx发布201x-xx-xx实施中国实验动物学会发布
前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则编写。 本标准由中国实验动物学会归口。 本标准由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。 本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本标准主要起草单位：浙江大学动物科学学院、浙江省医学科学院。 本标准主要起草人：吴旧生、刘月环。
实验动物组织切片免疫组织化学染色方法 1范围 本标准规定了实验动物组织切片的免疫组织化学染色方法。 本标准适用于实验动物组织切片的免疫组织化学检测。 2术语和定义 以下术语和定义适用于本标准。 2.1 免疫组织化学immunohistochemistry,IHC 用已知的抗原或者抗体去检测待检组织中的抗原或抗体，根据其结合后经一系列方法的处理，呈色反应，在光镜下确定组织的来源属性和部位，对靶抗原进行定性、定位和定量的方法。 2.2 抗原antigen,Ag 一类可以刺激机体的免疫系统并促进其发生免疫应答，与免疫应答产物即抗体和效应细胞，在体内或体外发生特异性结合的物质。 2.3 抗体antibody 机体的免疫系统受到抗原刺激后，通过机体一系列的化合作用：即体液免疫应答、B 淋巴细胞活化、增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白的物质称为抗体。 2.4 抗原修复antigen repair 利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程。 3主要试剂 3.10.01M 磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution.PBS） 先配成A 液和B 液，其中A：0.2M Na H 2PO 4贮存液（PH7.6）：15.60g 磷酸二氢钠 （NaH 2PO 4﹒2H 2O）溶解于少量水，加蒸馏水定容至500ml，放于4℃冰箱保存。B：0.2M Na 2HPO 4贮存液(HP7.6)：将35.82g 磷酸氢二钠（Na 2HPO 4﹒12H 2O）溶解并定容至500ml，贮存于4℃
免疫组化的相关知识！ 一、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC) 免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。 二、免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？ 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。 三、石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？ 石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。 四、免疫组化实验用抗体的选择 1、一抗选择要点 (1)选择单克隆还是多克隆抗体。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对较低；而多克隆抗体特异性稍弱，抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色(可以通过封闭等有所避免)。 (2)种属来源。一般家兔来源的抗体多是多克隆；而小鼠来源的抗体多是单克隆，但也有另外。这条主要要与后面的二抗来源相匹配。 (3)实验目的是检测什么种属的抗原，即species reactivity。这一点很重要，一般说明书
华中农业大学动物科技动物医学院 HE染色与免疫组织化学染色实验报告 1实验目的及意义 1.1了解石蜡切片的制作过程 1.2 掌握HE染色与免疫组织化学染色的基本原理以及染色方法 1.3 熟悉HE染色与免疫组织化学染色后的读片知识 2 实验方法及步骤 2.1 石蜡切片制作及HE染色步骤 2.1.1取材与固定： 从人或动物新鲜尸体上取下组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。 2.1.2脱水透明： 一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。 2.1.3浸蜡包埋： 将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。 2.1.4切片前的准备工作： 先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，四周留约2mm的石蜡块，块两边必须切成平行的直线。将玻片擦洗干净后均匀涂抹薄薄的一层蛋白甘油，放置冰箱备用。 2.1.5切片与贴片： 将预冷的蜡块固定于切片机上，调节切片厚度为6微米，切成薄片。切下的薄片往往皱折，放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。2.1.6 脱蜡至水
华中农业大学动物科技动物医学院 二甲苯Ⅰ20分钟，二甲苯Ⅱ20分钟，无水乙醇3分钟，95％酒精3分钟，80％酒精3分钟，70％酒精3分钟，自来水洗5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。 2.1.7染色： 苏木素液7分钟，自来水洗5分钟，1％盐酸溶液分化30秒，自来水洗5分钟，1％氨水返蓝10秒，自来水洗20分钟，95％酒精3分钟，1％伊红酒精溶液2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。 2.1.8脱水和透明： 95％酒精2分钟，无水酒精Ⅰ2分钟，无水酒精Ⅱ2分钟，二甲苯Ⅰ5分钟，二甲苯Ⅱ5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。 2.1.9封固： 将已透明的切片滴上中性树胶，盖上盖玻片封固，放入37℃烘箱。 2.2 SABC 染色步骤 2.2.1脱蜡至水： 二甲苯Ⅰ20分钟，二甲苯Ⅱ15分钟，100％酒精2分钟，95％酒精2分钟，80％酒精2分钟，70％酒精2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。 2.2.2流水冲洗5分钟（水流要小） 2.2.3用蒸馏水配置新鲜的3%双氧水（30%双氧水1：9配制，配100ml），室温封闭15分钟，注意避光。 2.2.4蒸馏水洗5分钟，重复2次。 2.2.5热抗原修复，将切片浸入0.01M枸盐酸盐缓冲液中，置微波炉内高火5分钟，低火20分钟，完后自然冷却。 2.2.6取出切片放入染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。 2.2.7取出切片放入湿盒中，滴加5%BSA封闭液（覆盖满组织为宜），室温20分钟。 2.2.8甩去多余液体（擦去周围的流痕），滴加一抗（覆盖满组织为宜）注:阴性对照滴加PBS,放入4℃冰箱过夜。 2.2.9放入染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。 2.2.10取出放入湿盒中滴加二抗（覆盖满组织为宜），室温30分钟。 2.2.11取出置染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。放回湿盒中加SABC（覆盖满组织为宜），室温30分钟。
免疫组织化学染色（IHC） 定义： 免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。 免疫组化原理 抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 免疫组化检测标本 1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片； 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片。 免疫组化操作步骤 ①石蜡切片制作 1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4% 多聚甲醛溶液内固定12 h。 2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，
编号：１－２ 主题：免疫组化技术 概述： 免疫组织化学（Immunohistochemistry）是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测的技术。凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。 免疫组织化学染色方法分类： 1、按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。 2、按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）；与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 3、按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等。 目的： 对所研究的大分子如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等进行
定位，进而深入研究其功能。 原理： 1、免疫荧光方法 免疫荧光方法是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。 2、免疫酶标方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。 3、免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至
目录： 1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素 (1) 2.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色 (2) 3.免疫荧光组织化学技术的荧光…………………………………….3,4 4.免疫组织化学染色结果评价 (4) 5.免疫组织化学对照实验 (5) 6.免疫组织化学技术应用的基本原则……………………………….5,6 7.SABC法与其他免疫组织化学染色方法比较…………………….6,7 8.免疫组织化学技术疑难问题剖析………………………………….7,8 9.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色…………………8,9 10.非特异性荧光染色的消除 (9) 11.荧光显微镜的基本操作及注意事项……………………………..9,10 12.补体法免疫荧光组织化学染色步骤……………………………11,12 13.双重染色法免疫荧光组织化学染色步骤 (11) 14.间接法免疫荧光组织化学染色步骤 (12) 15.双重免疫荧光标记法 (13) 16.免疫荧光组织化学直接法 (13) 17.免疫荧光组织化学间接法 (14)
1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素 常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素有：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothioeyanate，TRITC)、四乙基罗丹明(tetraethyl rhodamine B200，RB200)、得克萨斯红(Texas red)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、花青类(cyanine，如Cy3、Cy5)等。此外还有一些新型荧光染料，如量子点。 (1)异硫氰酸荧光素(FITC)：FITC性质稳定，易溶于水和乙醇，能与蛋白质结合，是检测组织细胞内蛋白质最常用的荧光探针。它还能标记抗体，可用于免疫组织化学单染或多重染色。缺点是在光照下易淬灭，易受自发荧光影响。最大激发光波长为490nm；最大发射光波长为525nm，呈现黄绿色荧光。 (2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)：该荧光素能与细胞内蛋白质结合，比FITC稳定性好，在生理条件下对pH值变化不敏感，荧光强度受自发荧光干扰小。最大激发光波长为550nm；最大发射光波长为 620nm，呈橙红色荧光，与FITC发出的黄绿色荧光对比鲜明，常用于免疫荧光组织化学双重染色。 (3)四乙基罗丹明(RB200)：能与细胞内蛋白质结合，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存，广泛应用于双标记示踪染色。最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为595-600nm，呈橙红色荧光。 (4)花青类染料：常用的有Cy3、Cy5等，能与细胞内蛋白质结合。这类染料的荧光特性与传统荧光素 类似，但水溶性和对光稳定性较强，荧光量子产率较高，对pH等环境不敏感。常用于多重染色。Cy3最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为650nm，呈绿色荧光。但是，在绿光光谱波长激发下，Cy3也可出现红色荧光。Cy5的最大激发光波长为649nm，最大发射光波长为680nm，呈红色荧光。由于Cy5的最大发射波长为680nm，很难用裸眼观察，而且不能使用高压汞灯作为理想的激发光源，因此，使用普通荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。通常观察Cy5时需使用激光扫描共聚焦显微镜。 (5)乙酸甲酯：其本身不发荧光，但透膜进入细胞质后，在酯酶的作用下转变为具有荧光特性的乙酸甲酯。其激发光谱有pH依赖性，是使用最多的细胞内pH荧光指示剂。最大激发光波长为505nm，最大发射光波长为530nm，呈绿色荧光。 (6)Indo-1：是典型的双发射荧光探针。无钙时在485nm左右有发射峰，结合钙后，则在405nm处有发射峰，两者的比值与细胞内游离钙离子浓度成线性关系，将此比值与标准曲线相比即可得出细胞内游离钙浓度，因此，可利用此探针定量检测细胞内游离钙离子浓度。最大激发光波长为330/346nm，最大发射光波长为405/485nm，呈紫色(405nm)或青色(485nm)荧光。 (7)量子点(quantum dot)：是近年来研制的一种新型荧光染料，又称半导体纳米晶体(semiconductor nanocrystal)，是由几百或几千个纳米级颗粒构成的半导体材料，性质稳定，溶于水，细胞本身不能合成和组装。量子点具有荧光时间长、产生多种颜色、检测方便和应用范围广等优点。当某一波长的激发光对多种大小不同的量子点进行照射时，可以同时观察到多种颜色，因而可同时进行多个目标的观察和检测。量子点可与抗体、链霉亲和素等多种分子进行耦联，检测靶分子的分布和功能。
免疫组织化学染色原理和操作步骤 一、免疫组织化学原理 免疫组织化学(IHC)又称免疫细胞化学,是根据抗原—抗体特异性结合的原理,应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法:直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分;间接法则先后加入一抗和二抗,形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的,该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶(PＡP)法、亲和素—生物素—过氧化物酶(ＡBC)法和链霉亲和素—过氧化物酶(ＳP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响,但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAＰ复合物（含３个酶分子和2个抗体分子),染色时依次加入一抗、二抗、ＰＡ Ｐ复合物孵育标本,最后用H ２Ｏ ２ 和二氨基联苯（DAB)为底物显示过氧 化物酶，即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合４分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似,一抗不标记,二抗用生物素标记,染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上,最后加入DAＢ进行显色。AＢＣ法的敏感性较ＰAＰ法更高。
图１. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》） SP法与ABC法相似，其不同于ＡBＣ法之处在于用生 物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。在 标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化 物酶使其结合到二抗的生物素上,最后加入ＤAＢ进行显 色。与亲和素相比,链酶亲和素的结合力与亲和素相似而 非特异性结合较亲和素低。SＰ法简化了操作步骤，同时 也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免疫绥 化染色技术。 图2. SP法原理示意图二、实验准备： 1．标本准备 ①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理 ②冰冻组织切片:由病理室常规处理 ③细胞爬片:将无菌盖玻片置于六孔板中,接种细胞，待细胞生长达到6 ０％以上后取出玻片,4%多聚甲醛固定2 h。 2.试剂准备 ①抗体选择 单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后 将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位，可避免单克隆抗体
免疫组织化学及H E 染色实验步骤
精品资料 免疫组织化学（ immunohistochemistry） 1组织脱水、包埋及切片 （1）将剥离出瘤组织切成合适大小的组织块放于4%多聚甲醛中固定2天，固定时间最长不能超过1个月； （2）将组织块从固定液中取出，PBS漂洗1h，然后开始进行组织脱水，程序如下：70%乙醇浸泡30min—80%乙醇浸泡30min—90%乙醇浸泡30min—95%乙醇I浸泡30min—95%乙醇II浸泡30min—无水乙醇I浸泡30min—无水乙醇II浸泡30min—无水乙醇III浸泡30min—二甲苯I浸泡30min—二甲苯II浸泡 30min； （3）将组织块完全浸泡在蜡液中60℃过夜； （4）打开包埋仪器，设置相应参数，2h后将蜡液中的组织块取出放入包埋机的蜡缸中，将包埋所用铁槽清理干净放入蜡缸，用镊子将组织块放于铁槽正中央，取出铁槽接取少量蜡液使凹槽填满，将包埋盒倒置卡在铁槽上，放于低温工作台上冷却凝固，待其完全凝固后，取下包埋好的蜡块； （5）在切片前，先将蜡块表面修平，切成连续的厚度为5μm的切片，放入冷水中展片，用刀片将连续蜡带分开，然后放入40℃水浴锅中，用防脱载玻片捞出目的蜡带，放入烤片机上过夜，组织切片4℃保存。 2免疫组化染色 （1）首先，用二甲苯脱蜡，然后用梯度酒精和水使切片充分复水，详细流程为：二甲苯I浸泡10min—二甲苯II浸泡10min—无水乙醇I浸泡5min—无水乙醇II浸泡5min—90%乙醇浸泡5min—80%乙醇浸泡5min—自来水冲洗5min； （2）抗原修复：微波炉中火预热配制好的枸橼酸缓冲液3min，将切片浸入修复液内，用微波炉中火加热3min，在此过程中注意不要让修复液溢出，以免切片变干，加热后室温冷却5min，加热冷却过程重复3次，修复完成后自然冷却至室温，用PBS清洗3次，每次5min； （3）滴加适量的3% H2O2覆盖组织，室温孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，摇床上PBS清洗3次，每次5min； （4）用PBS配制5%的山羊血清，滴加适量至组织上封闭1h； 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢2
全自动免疫组织化学染色快速诊断【免疫组织化学的现状和 应用】 【】R361 【】A 【】1672－3783(xx)08－0497－02 【摘要】：本文对免疫组化的优点作了简要介绍，同时介绍了其在病理诊断中的应用，有支持、鉴别诊断的作用，检测激素受体与生长因子，对预后及治疗产生重要意义。文中还叙说了免疫组化的结果对肿瘤细胞增生和分期具有评价作用，并对免疫组化应该注意的事项也逐一列举。 当免疫学的理论和技术进一步成熟发展后，就产生了免疫组织化学技术，将这一方法应用在病理诊断上就称为诊断免疫组织化学。在现代医学基础和临床研究中免疫组织化学对疾病尤其是对肿瘤的 诊断、鉴别诊断及发病机制的研究提供了强有力的手段。 （一）免疫组化的优点 （1）特异性强 免疫组化是利用抗原、抗体可以特异性结合，也就是“一对一”的结合的原理。 （2）敏感性高
现在免疫组化的ABC法、SP法的问世，抗体可以稀释成千上万倍甚至上亿倍，仍可发生抗原抗体的结合。 （3）定位精确 免疫组化的反应可在组织和细胞中进行，抗原实现了准确的定位观察，对于病理学的诊断和研究具有非常重要的意义。 （二）免疫组织化学的应用 （1）免疫组化对病理诊断具有支持和鉴别诊断的作用。 在病理诊断比较明确的情况下，应用组化标记可以起到支持诊断的作用。有时无法判断肿瘤时，组化的应用将起到极大的帮助，可以鉴别肿瘤的和性质。 （2）激素受体与生长因子的检测对预后及治疗具有十分重要的意义 激素受体的检测对于乳腺癌的研究已有了较明确的结论，雌激素受体阳性的乳腺癌患者预后优于阴性表达者，同时阳性表达者对内分泌治疗效果好，患者生存期延长。
免疫组化染色操作顺序文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）
免疫组织化学染色原理和操作步骤 一、免疫组织化学原理 免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子）， 染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H 2O 2 和二氨基联苯（DAB）为底 物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。 图1.免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）
常用免疫组织化学染色方法 ( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行) 1.切片经二甲苯Ⅰ5分钟。 2.切片经二甲苯Ⅱ5分钟。 3.无水酒精Ⅰ30秒。 4.无水酒精Ⅱ30秒。 5.95%酒精Ⅰ30秒。 6.95%酒精Ⅱ30秒。 7.90%酒精30秒。 8.80%酒精30秒。 9.70%酒精30秒。 10.自来水洗。(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10) 11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。 12.水洗。 13.抗原修复。 14.PBS洗3次，1分钟/次。 15.加入血清孵育20分钟。 16.摔干血清，加入一抗60分钟。 17.PBS洗3次，2分钟/次。 18加入二抗孵育30分钟。 19.PBS洗3次，2分钟/次。 20.加入ABC复合物，孵育30分钟。 21.PBS洗3次，2分钟/次。 22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。 23.PBS洗，水洗。 24.Harris苏木素染核5-10分钟。 25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。 (二)、LSAB法。(SP法)(Labelled streptavidim biotln) 1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。 3.水洗。 4.抗原修复。 5.PBS洗3次，1分钟/次。 6.加入血清孵育10分钟。 7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。 8.PBS洗3次，每次2分钟。加入二抗，孵育20分钟。 9.PBS洗3次，每次2分钟。 10.加入SP复合物孵育20-30分钟。 11.PBS洗3次，每次2分钟。 12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。 13.PBS洗，水洗。 14.Harris苏木素染核5-10分钟。 15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。 (三)真空负压LSAB法 1.切片脱蜡至水。 2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min. 3.水洗。 4.如果需要，可进行抗原修复。 5.PBS洗3次，每次1分钟。 6.加入正常血清真空负压处理5min。 7.摔干血清，加入第一抗体，真空负压处理5分钟。 8.PBS洗3次，每次2分钟。 9.加入二抗(即连接抗体)真空负压处理5分钟。 10.PBS洗3次，每次2分钟。 11.加入链卵蛋白复合物，真空负压处理5分钟。 12.PBS洗3次，每次2分钟。 13.DAB-H2O2孵育5-10分钟。 14.PBS洗，水洗。
免疫组化的流程 多聚赖氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution） Cat.No.: SGP8920 Size: 10ml Conc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26℃ Thimerosal, 0.01%, added as preservative 多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。 适用组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理，以防实验操作过程中组织掉片。也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。 [使用说明] 免疫学 操作步骤（可直接在玻片上涂布） 1．灭菌的ddH2O 1:10稀释该多聚赖氨酸溶液。 2．用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度到室温18-26℃ 3．将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟。注意增加时间不会提高包被效果。 4．在60℃烘箱1小时干燥，或室温18-26℃过夜干燥待用。 [注意] 1．每100mL已稀释的多聚赖氨酸溶液要包被的玻片40-90张，超过90张片子将影响其黏合力。 2．用之前的玻片必须保持清洁。必要时用含1% HCl的70%乙醇溶液来清洗。 4．释过的多聚赖氨酸溶液要放在2-8℃，至少在3个月内是稳定的。 5．用过的稀释液要过滤，若出现浑浊或长菌要丢弃。 [订货信息] ￥100 / 10ml 免疫组化操作规程 （一）、仪器设备 1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉； 2）水浴锅 （二）、试剂 1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。 2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。 3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。 4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。 5）酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。 6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 7）封裱剂： a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；