凝胶迁移实验（EMSA）实验方法
凝胶迁移实验有称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验（EMSA，electrophoretic mobility shift assay），是一种用于蛋白与核算相互作用的技术。最初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验，也可应用与蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。
一、实验原理
EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发送互作。
二、实验操作步骤
1、实验前准备
（1）合理的实验方案
根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等。
（2）样本制备
可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量，实验中等量加入蛋白。
（3）探针制备
根据实验要求设计不同的探针并添加标记，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。现在大多数实验室已经不再使用放射性标记，生物素使用相对较多。
2、形成蛋白-探针复合物
（1）在0.5ml
（2）冰浴5min
（3）PCR仪中室温（20-23℃）温育30min。
3、制备凝胶，电泳
（1）制备6.5%
（2
（3）加样前先在预冷的0.5X TBE buffer中120V预电泳10min，与电泳完毕后冲洗加样孔。
（4）混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。
（5）将电泳槽置于冰上或者4℃环境中，恒压100V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3cm为止。（大约50-60min，根据实际情况调整电泳时间及电压；电泳时间不宜过长）
4、转膜
（1）在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶，膜，滤纸和纤维垫。
（2）按如下顺序组装“三明治”：纤维垫，滤纸，凝胶，膜，滤纸，纤维垫。注意电极，确保凝胶位于阴极、膜位于阳极。
（3）在预冷的0.5XTBE中进行转膜。转膜装置应置于冰上或者低温室中，恒压60V转膜1h。（注意根据实际情况调整电压及时间）。
5、检测
（1）去除转好的膜，放入合适的盛有缓冲液的容器中，冲洗。（注意整个检测过程避免膜干燥）
（2）去掉冲洗缓冲液，加入封闭液后轻微震荡，室温封闭20min。
（3）加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP conjugate），室温震荡孵育45min。（勿将酶标记物直接加到膜上）
（4）去掉酶联物稀释液，用洗涤缓冲液洗膜三次，每次室温轻微震荡1 0min。（5）配置反应底物，均匀加至膜上，室温孵育5min。（可以在加完底物后，用薄膜轻轻覆盖在膜上，是底物均匀覆盖，注意不要产生气泡）
（6）化学发光成像系统曝光成像（曝光时间的长短可以根据检测方法不同而进行相应调整）。
三、实验结果展示（美国Signosis EMSA实验结果）
四、Super-Shift EMSA
非纯化的蛋白样本和一个特定的探针可形成一个或几个特异的蛋白复合物。确定复合物中蛋白的特征可能会困难，可以加入目的蛋白的抗体，进行超迁移实验，即Super-Shift EMSA。抗体和蛋白/探针复合物中的蛋白结合，使复合物的迁
移延迟，形成超迁移。
Super-Shift EMSA工作原理；在反应体系中，抗体与DNA/蛋白复合物中的蛋白产生反应形成复合物会引起复合物的体积变大，在非变性凝胶中的移动变慢而与DNA/蛋白复合物区别开。
进行Super-Shift EMSA需要考虑以下因素：
1）一般先做一般的EMSA测定，成功后才考虑做Super-Shift EMSA实验。
2）不是所有的抗体都可以用于Super-Shift EMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-Shift EMSA。
3）抗体的浓度要高。一般10-20ul的反应液需要使用0.5-1ul原倍的抗体。
3）为减少非特异性反应，尽量使用纯化的抗体。
4）单抗与多抗都可用于Super-Shift EMSA，但多抗可能与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到Super-Shift的带，但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。
五、常见问题
1、为什么看不到迁移带？
1）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。
2）样本中没有可以与探针结合的蛋白。
3）探针与蛋白无特异性的相互作用。
4）转膜效率低，蛋白或者探针未转移到膜上。
5）曝光或者成像时间过短。
在Super-Shift EMSA测定中看不到Super-Shift DNA/蛋白复合物带还可能有以下原因：
6）抗体没有工作。不是所有的抗体都可以用于Super-Shift EMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-Shift EMSA。
7）测定的活化的DNA/蛋白复合物中没有希望检测的构成成分存在。此时既看不到Super-Shift的带，也看不到DNA/蛋白复合物的量的减少。
8）使用的抗体过度稀释。一般10-20ul的反应液需要使用0.5-1ul原倍的抗体。
9）多抗与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到Super-Shift的带，但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。
2、为什么实验背景高？
1）曝光或者成像时间过长。
2）封闭时间不足或者效率不高。
3）洗涤效果不佳
4）实验过程中膜没有一直处于湿润状态。
3、EMSA测定需要多少量的蛋白与标记的探针？
对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白，部分纯化蛋白，粗制核抽提液需作优化：一般所用纯化蛋白的量在20-2000ng间，可将蛋白:DNA的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA的5倍；用粗制核抽提液，需要2-10ug蛋白形成特异的复合物。
部分纯化蛋白与粗制核抽提液应保存在-80℃、探针应保存在-20℃以防止降解。
无论探针或是结合蛋白都应避免多次冻融。
4、Poly(dI:dC)，非特异性竞争DNA，特异性竞争DNA在EMSA测定中的作用？
Poly(dI:dC)由肌苷和胞嘧啶组成。在EMSA反应中加入poly(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中转录调节因子与标记探针的非特异结合。结合溶液中的poly(dI:dC)的用量需在正式实验前进行优化，一般用量大约在0.05mg/ml左右。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)。
为确定所形成的复合物的特异性，在含或不含增量的特异竞争DNA或非特异的竞争DNA时，作结合反应的竞争实验。一般，特异竞争探针是非标记的DNA，其序列与标记探针相同，故能与标记探针竞争与结合蛋白的反应。非特异竞争探针的长度组成和DNA探针相同，但序列不同。如果结合蛋白与标记探针的结合被特异竞争探针抑制，而不受非特异探针的影响表明靶结合蛋白的存在。特异与非特异性竞争DNA的用量也需优化或滴定，但竞争DNA通常是标记的探针用量的30-100倍（w/w）。
5、用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开？
将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合，蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为6%，在特定条件下可用高或低的浓度。也可将TGE缓冲液（12.5mM Tris，pH8.3，95mM 甘氨酸，0.5mM EDTA）用于不稳定的蛋白/DNA复合物。在4℃进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。
当带型不紧密出现拖尾时，表明复合物存在解离。凝胶必需完全聚合，以避免带型拖尾。如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量，或盐的浓度过量不适用于这一反应。在含抽提液的带中不含游离探针或复合物，但只含探针的带中有探针表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。
第十一章动作技能的学习与学习的迁移 （一）什么是动作技能 领会： 对动作技能概念的分析：所谓动作技能是在练习基础上形成的按某种操作程序顺利完成某种身体协调任务的能力。如书写、游泳、驾车、打字等都是动作技能。第一，动作技能是习得的。第二，动作技能是有一定操作程序要求的。第三，动作技能是一种能力。 （二）动作技能的特征 领会： 动作技能的特征：第一，准确性。动作技能形成后，相应的动作越来越准确。第二，动作的速度加快。动作技能形成后，相应动作的速度越为越快。第三，多余动作的减少。所谓多余动作是指与完成某项任务无关但却在完成过程中参与其间的动作。如初学写字时，牙关紧咬；学打乒乓球时，非优势手拳头紧握等等。等到熟练后，这些多余的动作就减少了。第四，灵活性。一种动作技能形成后，其固定的动作程序不是单纯的动作与动作之间的固定衔接，而是具有灵活性。 （三）动作技能的分类 领会： 动作技能的分类：（一）从有没有器械来划分，一类是操纵器械的，如写字、绘画等；另一类是不操纵器械的，如唱歌、跳舞等。（二）从动作技能操作时调节方式的不同来划分，动作技能可分为连续的和不连续的两大类。连续的动作技能一般较多受外部情境所制约，如开汽车、滑冰等；不连续的动作技能一般由自我调节，较少受外部情境控制。 （四）动作技能形成的阶段 领会： 动作技能形成的三个阶段：（一）认知阶段，这一阶段也称为知觉学习。其学习重点是观察动作反应的线索，即观察操作程序。（二）联系形成阶段，在这一阶段，重点是使某一特定的刺激与某一特定的动作反应形成联系，即有意识地使操作程序支配动作反应。（三）自动化阶段，技能学习进入这一阶段时，一边串的动作系列能够自动地连续下来，即操作程序自动支配动作反应，无需特殊的注意和纠正。 （五）动作技能形成的一般趋势 1、识记： 练习曲线：是指在连续多次的练习期间所发生的动作效应变化的图解。 2、领会 动作技能练习曲线的趋势：1、练习成绩逐步提高。练习成绩逐步提高又有两种不同的表现形式：（1）练习的进步先快后慢。（2）练习的进步先慢后快。2、高原期现象。在技能形成中，练习中期往往出现进步暂时停顿的现象，这就是练习曲线上所谓的“高原期”。3、练习布线的起伏现象。在各种技能形成的过程中，都可以看到成绩在某一水平上下小有波动的现象，这是因为影响技能进步的因素太多了。可归纳为两个方面：一是外部条件的变化；二是内部条件的变化。 动作技能练习曲线的个别差异：可从活动的速度和质量上概括为四种类型：1、速度较快，错误很少；2、速度较快，错误较多；3、速度较慢，错误较少；4、速度较慢，错误较多。 （六）动作技能形成的有利条件 简单应用： 举例说明动作技能形成的有利条件：（一）动作概念（或操作程序）的掌握；掌握动作概念是技能形成的关键。（二）示范；示范指教师通过动作和言语活动将动作技能演示给学
首届食品生物技术专业化学实验基础操作技能大赛 活动方案 一、大赛目的 食品是人类赖以生存和发展的物质基础，而食品安全问题是关系到人体健康和国计民生的重大问题。随着经济全球化的迅猛发展，在基本解决食物供应问题的同时，食物的安全卫生问题越来越引起国际社会的关注。食品生物技术专业的学生将在这其中扮演越来越重要的角色。 基础化学基本操作技能是从事食品安全监督等相关岗位所需掌握的。大赛的将对参赛选手的实验技能操作、动手能力训练，培养理论知识，实践动手能力等方面做考评，以满足学院专业开设的特殊要求和用人单位的基本要求，食品生物技术专业将主要通过“实验技能大赛”的形式，给同学们提供一个学习锻炼的平台。 二、赛项概览 1. 赛项名称：2015年吉职院基础化学实验操作技能大赛 2. 参赛对象：现代农林工程学院食品生物技术专业学生 3. 竞赛方式：采取实验理论（笔试）考试与实际操作技能测试相结合，全面检验大学生的理论素养和实践能力。每人竞赛总分为100分，笔试占30分、实际操作占70分，最后总评确定最后分数来确定名次。 4 竞赛时间：2015年12月19日-12月20日【初定】 5. 竞赛地点 A、实验理论笔试：学院楼（4号教学楼）B401 B、实验技能测试：1号实训楼501室和502室 三、竞赛内容与规则 竞赛试题、范围或大纲；此次竞赛采取采取理论（笔试）考试与实际操作技能测试相结合，全面检验大学生的理论素养和实践能力。 A、实验理论笔试： ①笔试范围：实验理论笔试涵盖无机化学、分析化学、有机化学、食品生物化学等实验内容，还包括数据处理、化学实验室基本知识、化学实验室安全、电和气
的使用、重要常规化学品的安全使用、常规化学实验仪器的使用、基本的实验操作规范等。 ②笔试题型：单项选择（共10分，0.5分/题）、多项选择（共10分，1分/题）、判断（共5分，0.5分/题）和简答(共5分、2.5分/题)。 B、实验技能测试：着重测试学生综合运用基础知识解决实际问题的能力与实验操作基本技能。实验操作考试的范围主要是无机化学和分析化学的相关实验，考察基本的化学实验技能、基本化学计算、实验操作、数据采集和分析处理能力，常规仪器的使用、实验总结与分析能力。 四、赛事安排 （1）本次竞赛从2015年11月25日正式启动，将在不同时间段发布进行相关竞赛的通知。 （2）竞赛日程 报名时间截止日期2015年12月14日17:00 2015年12月19日9:00-11:00 实验理论笔试 2015年12月19日14:00-17:00 实验技能测试 2015年12月24日公布获奖名单 所有竞赛环节均为参赛选手独立完成，在实验技能测测试阶段除已准备好的实验材料及器皿如因故还需其他的材料或器皿，不得向周边选手借用，需举手示意评委决定。 （3）竞赛实施规则 ①实验竞赛包括实验理论考试和实际操作技能测试，实际操作技能测试以现场实际操作的方式进行，选手按要求完成实验，如选手身体临时出现状况，可以停止实验。 ②理论考试由统一口令开始和结束，不得超时。 ③实验环节选手按统一口令开始实验，实验完成后，立即举手向监考老师示意，并报告自己的实验台号。选手结束实验后，不得再进行操作。实验有一定限时，超时者按规定扣分。 ④参赛选手的最终名次依据实验笔试（占30%）和实验操作（占70%）综合成绩分类排定，若出现成绩相同时，完成实验用时少者名次在前。
实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 基质胶铺板： 用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的
第第九九章章 动动 物物实实验验基基本本操操作作技技术术动物实验是医学研究的基本手段,是药物安全性评价的必经途径三娴熟的动物实验操作技术和技巧,是顺利完成动物实验并取得准确二可靠的结果和较好的反应重复性的保证三对实验动物饲养管理人员和兽医技术人员来说,动物不会讲话,不领人情,具有自卫本能,随时准备攻击兽医及其他工作人员,更不会自动地服药和接受必要的检查和治疗,这无疑给平时的饲养管理和兽医治疗工作增添不少麻烦三所以无论是饲养人员还是动物实验人员都必须熟练掌握常规的和一些特殊的实验动物学技术,才能科学合理地养好实验动物,规范熟练地开展动物实验,有效地对患病动物进行检查二诊断和治疗三同时也不会造成动物的应激反应或伤害,也不致给饲养管理和动物实验技术人员自身造成意外的伤害三 第一节 实验动物的抓取与固定 一二大二小鼠的抓取固定法 1. 小鼠的抓取固定方法先用右手抓取鼠尾并提起(图91),置于鼠盒的笼盖或实验台上向后拉,在它向前爬时,用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤,用左手小指钩起鼠尾,中指和无名指抵 住其背部即可,适宜作灌胃,皮下二肌肉二腹腔注射等实验操作(图92)三 图91 大、小鼠尾部抓取 图92 小鼠抓取固定 2.大鼠的抓取固定方法基本上与抓取小鼠相同,轻轻抓住鼠尾根部,将大鼠提起置于鼠盒笼盖上,迅速用左手
拇指和食指捏住鼠耳后下方,固定其头部,不让其转动,余下二指紧捏鼠背皮肤,置于左掌心,右手即可进行腹腔二肌肉二皮下注射与灌胃或其他实验操作三注意不要用袭击方法抓取大鼠,否则易被咬伤三进行解剖手术和心脏采血时,可先麻醉动物,取背卧位,再用细绳活结或大头针将鼠前后肢分别固定在板上三进行尾静脉注射或采血时,可用鼠静脉注射架固定,先选择合适固定架,打开鼠筒盖,将鼠尾提起,鼠身放入固定架,露出尾巴,盖好筒盖,即可进行尾静脉注射或尾静脉采血等操作三 二二豚鼠的抓取固定法 豚鼠的抓取固定法基本上与大鼠相同,只是由于豚鼠较胆小,易受惊,所以抓取时必须稳二准和迅速三可先用一手迅速抓住鼠背肩胛上方,用力下压固定后,以拇指和食指环握颈部,再用另一只手托住臀部即可三 三二家兔的抓取固定法 抓取家兔一般用右手抓住兔颈部的毛皮,并提起,用左手托其臀部或腹部,让其身体重量大部分集中在左手上三注意不能用手抓双耳或腹部,以免损伤动物三 家兔的固定分为盒式二台式两种三如做兔耳血管注射和兔耳采血,可用盒式固定;如做呼吸二血压测定试验和手术,则可用台式固定三台式固定的方法是将家兔固定在兔台上,四肢用粗棉绳活结绑住,拉直四肢,用绳绑在兔台四周的固定栓上,头用固定夹固定,或用一根粗棉绳兜住兔的切齿,绑在兔台铁柱上三 四二犬的抓取固定法 毕格犬能主动配合实验人员,抓取时动作要温柔,一般不会攻击人三抓取杂种狗时,为了防止其咬人,最好首先让饲养员帮助绑住狗嘴,或先轻轻抚摸其颈背部皮毛,然后用布带迅速兜住狗的下颌,绕到上颌打一个结,再绕回下颌打第二个结,然后将布带引至头后,颈项部再打两个结,这样就将狗嘴捆绑住了,注意松紧要适宜三如狗过于凶猛,可先用狗头钳夹住其颈部,将狗按倒在地,再扎其嘴三 犬的固定也可先将狗麻醉后,采用头部固定和四肢固定法三头部固定可用圆形铁圈的狗头固定器,铁圈中央有一弓形铁,与螺丝棒相连,下面有一根平直铁闩,操作时,先将狗舌拉出,把狗嘴插入固定的铁圈内,再用平直铁闩横贯于尖牙后部的上下颌之间,然后向下旋转螺丝棒,使弓形铁逐渐下压在狗的下颌骨上,把铁柄固定在实验台的铁柱上即可三四肢固定法与家兔相同三 五二猪的抓取固定法 猪身溜圆,力大,缺少控制部位,猪齿容易伤害固定者,在抓取猪时要注意保护自己三最有效的方法是实验者双手抓住猪的双后肢的小腿部,提起后腿,猪便无法移动,此时助手再用橡皮带固定或注射麻醉剂三猪亦可采用挤压式不锈钢笼固定法三不提倡采用抓猪尾巴来提举后身的方法,因抓猪尾巴易引起猪尖叫,且易滑脱三 六二猴的抓取固定法 一般采用网罩法和挤压式不锈钢笼固定法,后者与犬的方法相似三网罩法是实验人员一
Transwell实验原理与操作步骤 Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 （2）趋化性实验： 可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 ①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 ②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 （3）肿瘤细胞迁移实验： 常用8.0、12.0μm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
运动技能迁移在体育教育训练中应用 （天津中德应用技术大学） 在体育教学中，除了迁移现象和迁移规律比较广泛存在之外，运动技能的迁移的存在也可谓频繁，通常最容易最忽视的是运动技能的迁移，然而运动技能的迁移却与体育教学息息相关。因此，作为体育教学教师，应对运动技能迁移的规律进行熟练掌握，本文针对运动技能迁移的知识以及运动技能在高校体育教学中应用进行一系列探讨，并提出了自己的一些意见或建议，希望对体育教学质量的提升起到一定的促进作用。 运动技能迁移体育教学 前言 各种运动技能在体育教学和体育运动训练中，互相吸引、互相促进，呈相辅相成的关系发展，为了快速掌握运动技能迁移规律，必须对其有一个科学的认识，并进行科学化研究，从而促进运动技术水平的快速提升。目前来讲，对于运动技能的研究理论方面过于泛泛，但对技能迁移方面的各项目之间的论述却只有寥寥几笔，鉴于此，往往使学生在体育教学训练中对各项目之间的迁移规律时常性忽略，由此遏制了学生能够充分发挥运动潜能的机制，导致学生运动技能
的训练一直处于瓶颈状态，无明显提升，甚至运动技能有出现下滑状况，因此，笔者结合自身平时教学实践经验，总结出了以下几点观点，希望对广大同仁有所帮助。 1通过运动技能正迁移促进体育教学 在体育教育训练中，学生的对体育项目的认知来自于教师的合理引导和启发。教师需要设置科学的教学程序，将体育理论知识和技能的逻辑关系充分体现出来，对各个体育项目进行分化训练，在此基础上再加强综合连贯性的训练。教师需要根据学生的个性特点和认知规律科学安排教学内容，必须保证教学内容由易到难，由浅到深，这种循序渐进的教学过程更符合学生的接受规律，学生也能更好的掌握各个体育项目的动作。每个体育动作的形成过程分为若干步骤，因此教学程序设计需要一环扣一环，学生的基础动作打牢固才能更好的做复杂的动作。教师可以引导学生交叉运用自己的体育技能，从而实现运动技能迁移的目标。例如：教师组织学生练习短跑技术时，需要先练习小跑步，摆臂和后蹬跑等辅助性动作，这些体育技能的迁移可以促使学生掌握短跑技术，可以促进体育教学活动的开展，从而达到高效的教学目标。 2创造时机开展运动技能迁移教学 体育教育训练中，运动技能的迁移需要一定的条件。教师需要创设条件完成运动迁移教学。教师需要对教材内容进
《基本实验操作技能》专题复习 【复习目标】 1．能够进行药品的取用、简单仪器的使用和连接、能熟练进行加热、过滤、蒸发、溶液配制等基本实验操作。2．根据实验目的能选择实验药品和仪器。 3．能对基本实验操作原理和注意事项有一定了解和熟悉。 4.能完成初中阶段基础实验解读和分析，以及进行简单实验的评价和设计。 【应用示例】 例1．某同学做氧化铜与稀硫酸反应的实验，操作示意图如下，其中操作有错误的是（） A．加入氧化铜B．倾倒稀硫酸C．加热反应物D．洗涤试管 【解析】取用粉末状或小颗粒状的药品时要用药匙或纸槽，先将试管横放，把盛药品的药匙或纸槽小心地送入试管底 部，再使试管直立；取用液体时：①试剂瓶瓶口要紧挨试管口，防止液体流出；②标签向着手心，防止液体流出腐蚀 标签；③瓶塞倒放桌面上，防止污染瓶塞，从而污染药品；给液体加热时，①试管内液体不能超过其体积的1/3，防止 沸腾溅出；②试管与桌面成约45°角；在洗涤试管时轻轻地刷，不能太用力，防止捣碎试管。 例2．（陕西中考）下图是实验室常用的实验仪器。请回答下列问题： （1）配制一定溶质质量分数的NaCl溶液时，要溶解已称好的NaCl固体，就选择的仪器是(填序号)。 （2）进行过滤操作时，除选用上述有关仪器外，还缺少的一种实验用品是，仪器⑤所起的作用是。 下列混合物的分离能直接用过滤的方法完成的是（填序号)。 A．从酒精溶液中分离出酒精B．从浑浊的河水中分离出泥沙C．从海水中分离出氯化镁 （3）实验室用高锰酸钾制取氧气时，应选择的实验仪器是（填序号)。 【解析】：实验仪器的选择是难点，但同学们只要透彻理解课本中提到的实验原理就可以顺利作答此类题目。 （1）根据溶解固体溶质所需要用到的仪器分析即可，溶解固体溶质需要用到：烧杯、玻璃棒， （2）根据过滤操作所需要用到的仪器及实验用品分析即可，过滤操作需要的仪器及实验用品有：漏斗、烧杯、玻璃棒、 滤纸，过滤操作是用来分离液体和不溶性固体的。 （3）实验室制取氧气有三种方法，即氯酸钾受热分解制氧气、高锰酸钾受热分解制氧气、双氧水分解制氧气，前两种 属于固体加热制氧气，最后一种属于液体不需要加热制氧气．观察上图中所给的仪器，可知此题让我们选择加热固体 制取氧气。 例3．请你和小明一起进行实验室制取二氧化碳的探究。 （ 从制取和收集的角度分析，一般选择第①组药品，该组药品发生反应的化学方程式为__________________________； 不选择第③药品的原因是________________________。 （2）选择装置。通过对制取氧气装置的分析，他选择用过氧化氢制取氧气的发生装置。你认为他选择的依据是 ___________________________________________。 （3）制取气体。将药品装入所选装置制取气体，并用向上排空气法收集。验满方法是________________。 （ 4）气体检验。将生成的气体通入石蕊试液中，溶液变红，于是他确定该气体是二氧化碳。他的检验方法是否正确？ 请说明理由。______________________________________________________________________________________。 【解析】：本题是对实验室制取二氧化碳原理、装置选择及验满、检验等相关知识的综合考查，难度中等。块状石灰石 和稀盐酸反应制取二氧化碳气体，是固体和液体反应，不需加热，所以可以选用过氧化氢制氧气的发生装置，发生装 置选择的依据是根据反应物的状态和反应条件；CO2验满方法是将燃着的木条放在集气瓶口，观察木条是否熄灭；由 于其他气体（如HCl气体）通入石蕊试液中，也可以使溶液变红，因此无法确定该气体是二氧化碳。 【备考精练】 一、选择题（每小题只有一个选项符合题意） 1．（2013·宜宾）下列有关仪器使用或用途的叙述中正确的是（） A．试管：加热时所盛液体体积不超过试管容积的2/3 B．胶头滴管：向试管中滴加液体时应将胶头滴管伸入试管内 C ．酒精灯：熄灭酒精灯时可用嘴吹灭D．玻璃棒：常用作搅拌、过滤或转移液体 2．（2013 ·烟台）科学探究离不开化学实验基本操作。下列实验操作正确的是（） A．加热液体B．过滤 C．测定溶液pH D．稀释浓硫酸 3．（2013·陕西）下列有关实验现象描述不正确的是（） A．细铁丝在空气中剧烈燃烧B．蜡烛逐渐熄灭C．铝片上有划痕D．冷却后粗铜丝b端略上升 4．有下列仪器，在实验中使用仪器的说法错误的是（） A．做木炭在氧气中燃烧的实验时，夹取红热的木炭时用c B．粗盐提纯时，过滤食盐要用到的仪器是a、b和e C．粗盐提纯时，蒸发滤液要用到的仪器是a、c、d和f D．配制一定溶质质量分数的氯化钠溶液实验时，溶解氯化钠要用b和c 5．下列图示实验能达到目的的是（） 6．利用下列仪器制取相关气体，不能实现的是（） A．用锌和稀硫酸制取氢气B．用双氧水和二氧化锰制取氧气 C．用高锰酸钾加热分解制取氧气D．用石灰石和稀盐酸制取二氧化碳
细胞迁移和侵袭实验 实验准备： 细胞，24孔板，transwell小室（8μm，24孔板专用），ECM Gel，10%FBS+培养基，无血清培养基，10 μ、200 μL、1000 μL移液器及配套枪头，1.5 mL EP 管，冰盒 实验设计： 实验分组一般分为阴性组（上下层均没有趋化因素），实验组（按照实验需要，上层或者下层加入趋化因素），对照组（趋化因素与实验组中的相反）。如果有特别需要，可以再加上阳性组（上下层都有趋化因素）。 实验操作（请细读注意事项）： 一、细胞侵袭实验 1.ECM Gel原液提前1 h放在4 ℃冰箱中解冻，实验前转移到冰盒中。 2.将1.5 mL EP、枪头盒、transwell放在24孔板里面后，置于冰上预冷。 3.根据自己的使用量，按照ECM Gel : 无血清培养基=1 : 7.5在冰上稀释成使 用液。 4.把枪头剪去一小段（约3 μm）后在冰上吸取40 μL/孔ECM Gel使用液轻轻 加入transwell上室中，加入时慢慢移动枪头，保证液体平铺在底部。 5.放在37 ℃孵箱15 min，让胶凝固。 6.消化、离心、计数细胞后，按照2.5x104 / mL用无血清培养基稀释细胞， 制成细胞悬液（如果细胞很多，这一步可以提前，在4、5之前做）。 7.按照每孔200 μL，将细胞悬液加入transwell上室，同时在transwell下室加 入10%FBS+培养基500 μL，放入37 ℃孵箱培养。 8.若干小时后取出，吸去transwell上室多余液体，用PBS清洗两次，用棉棒 在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。 9.在上室中加入结晶紫染液，染色5 min，回收染液，用流水缓缓冲去染液， 再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分。 10.在正置显微镜上放置一块载玻片，将transwell小孔倒置放在上面，拍照。 11.在100倍视野下，对膜的上下左右及中间计数，做平均数。
红细胞计数 1、加稀释液取小试管1支，加红细胞稀释液2ml。 2、加血用清洁干燥微量吸管或一次性微量吸管采集末梢血或抗凝血10ul，擦去管外余血， 轻轻加至红细胞稀释液底部，再轻吸上清液清洗吸管2-3次，立即混匀。 3、充池混匀后用微量吸管或玻璃棒将红细胞悬液充入计数池，室温下平放3-5分钟，待 细胞下沉后于显微镜下计数。 4、计数用高倍镜依次计数中央大方格内4角和正中5个中方格内的红细胞。 5、计算 红细胞/L=N/200×1012/L N：表示5个中方格内数得的红细胞数。 白细胞计数 1、加稀释液用吸管吸取白细胞稀释液0.38ml于小试管中。 2、吸取血液用微量吸管吸取新鲜全血或末梢血20ul，擦去管尖外部余血，将吸管插入小试管中白细胞稀释液的底部，轻轻放出血液，并吸取上层白细胞稀释液清洗吸管2-3次。 3、混匀将试管中血液与稀释液混匀，待细胞悬液完全变为棕褐色。 4、充池再次将小试管中的细胞悬液混匀。用滴棒蘸取细胞悬液1滴，充入改良Neubauer 计数板的计数池中，室温静置2-3分钟，待白细胞完全下沉。 5、计数在低倍镜下计数四角4个大方格内的白细胞总数。 6、计算白细胞=4个大方格内白细胞数（N）/20×109/L 白细胞分类计数 1、将血涂片用瑞氏染液染色，冲洗干净，自然干燥后待用。 2、镜下观察低倍镜下观察白细胞的分布和染色情况。 3、观察选择血涂片体尾交界处细胞分布均匀、着色良好的区域，按一定的方向顺序对所见到的每1个白细胞进行分类，并用白细胞分类计数器作好记录，共计数100个白细胞。计算求出各类细胞所占的百分比率。 血涂片的制备和瑞氏染色 1、采血：用微量吸管在距载玻片一端1cm处加1滴抗凝血。 2、推片：左手平执载波片，右手持推片从后方或前方接近血滴，使血液沿推片边缘展开成适当的宽度，立即将推片与载波片呈30度到45度角，轻压推片边缘将血液推制成厚薄适宜的血涂片，血涂片应呈舌、头、尾三部分。 3、干燥：将推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。 4、标记：在载玻片的一端用记号笔编号。 5、染色：血涂片自然干燥后，用蜡笔在两端画线，以防染色时染液外溢。随后将玻片平置于染色架上，滴加染液3-5滴，使其盖满血涂片，大约1分钟后，滴加等量或稍多的II液，用吸耳球轻轻混匀。 6、冲洗：1分钟后，用流水冲去染液，待干。 7、观察结果：将干燥后的血涂片置显微镜下观察。用低倍镜观察血涂片体尾交界处的血细胞。 ABO血型鉴定 （一）正定型法
一、Transwell小室制备 1. 无基质胶Transwell小室制备 ①包被基底膜： 用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜： 吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。 2. 有基质胶的Transwell小室制备 Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 μl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。 ②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48 h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24 h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象 在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2 h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。
体育教学与训练中运动技能迁移的运用 摘要体育教学和训练中，运动技能迁移的现象时有发生，一方面，运动技能的迁移有利于了解和掌握运动技能，另一方面，对运动技术的临场发挥和运用又有阻碍租用，科学的正向的迁移对缩短运动技能掌握时间和迅速开展新运动的学习、新问题的解决具有重要促进作用。 本文阐述了运动技能迁移的相关内容，并提出了体育教学和训练中，运动技能迁移的正确应用的建议。 关键词体育教学；体育训练；运动技能迁移；应用体育教学与训练中，一种运动的学习对其他运动产生影响是十分普遍的现象，这种迁移表现在理论知识和动作技能等运动学习的各方面，只有正确的运用这种迁移，才能提高体育教学与训练的效率。 一、运动技能的种类1、正迁移正迁移是指已经掌握的运动技能对新运动的学习产生的正向促进作用。 例如，掌握了篮球技术手球学习难度就会降低；脚背正面踢球技术的掌握对脚背外侧踢球具有促进作用；掌握了跳山羊，很快就学会了跳箱技术。 2、负迁移负迁移是指已经掌握的运动技能对新运动的学习产生负面的阻碍作用。 例如，会骑三轮车的人在学习自行车时就会比完全不会骑车的人更难，因为三轮车的平衡技术给自行车的学习带来了干扰，阻碍了自行车平衡的掌握，但是，负迁移不是永久的，它是可以通过锻炼来消除的[1]。 3、零迁移零迁移是指前后所学的两种运动几乎没有任何关联性
和相似性，不会产生任何影响。 二、运动技能迁移的方式1、运动与运动之间的迁移已经掌握的运动技能对新的运动技能的学习具有影响，例如，掌握了单杠屈身上技术对双杠杠端屈身上的学习和掌握具有促进影响。 2、语言与运动之间的迁移运动前的语言训练对实际运动技能的掌握具有促进作用，例如在运动前用语言训练见到不同的肢体信号做不同的对应动作，在实际运动过程中，经过这种语言训练的人会比未经过训练的人反应更快，学习和掌握速度也会大大提升[2]。 3、两侧迁移两侧迁移是指身体任何一侧的训练都会对另一侧造成影响，例如，通过对左手的训练，右手的技能也得到提高，这种迁移也可以表现为一侧手的训练对同侧或另一侧脚的影响、一侧脚的训练对同侧或另一侧的手或脚的影响。 通常，这种迁移在对称部位表现的最明显，但优势侧对劣势侧的影响要大于劣势侧对优势侧的影响。 三、运动迁移在体育教学和训练中的正确应用1、对已经掌握的运动技能进行巩固练习，注意两种技能的学习间隔为提高体育教学和训练的效果，体育教师在教学过程中要加强学生对已学内容的巩固，只有对原有技能掌握熟练，才能在运动训练过程中最大限度的发挥正迁移的作用，同时，一种技能巩固程度越高，越不容易发生干扰，若原有运动技能没有彻底巩固，在新技能的学习过程中就很容易受到原有技能的干扰，导致混乱，对两种技能的掌握都有阻碍作用，因此，体育教师在教学过程中，要注意两种运动学习的间隔时间，通常要在
妇产科基本技能操作 一、妇科检查法 二、妊娠中晚期检查法（产科四步触诊法、听胎心法） 三、骨盆外测量 四、阴道手术前消毒铺巾 五、子宫内膜活组织检查 六、宫颈脱落细胞检查 七、宫颈活组织检查 八、正常分娩基本操作（接生过程） 九、人工流产术（负压吸引术） 十、妇科阴道手术常规 产科手术操作常规 一、会阴切开缝合术 二、产钳术常规（低位产钳） 三、胎头吸引术常规 四、剖宫产术常规 五、人工破膜常规 六、会阴三度裂伤修补术常规 七、新生儿窒息复苏常规
妇产科基本技能操作 一、妇科检查法 一、适应证 二、准备工作 1．用物：一次性会阴垫、窥器、手套。 2．患者解小便，排空膀胱后，取膀胱截石位。有尿失禁者，检查前不需排空膀 胱。检查者面向患者，立在患者两腿之间。 三、操作方法 1．外阴部观察外阴发育及阴毛分布情况，有无皮炎、溃疡及肿块，分开小阴唇，暴露阴道前庭、尿道口和阴道口。嘱患者用力向下屏气，观察有无阴道前后壁的脱垂和子宫脱垂。 2．阴道窥器检查：检查者用左手将两侧阴唇分开，右手将窥器斜行沿着阴道后 侧壁缓慢插入阴道内，插入后逐渐旋转至前方，摆正后缓慢张开两叶，暴露宫颈、阴道壁及穹窿部，然后旋转至一侧以暴露侧壁。观察阴道粘膜、阴道分泌物及宫颈有无异常。 3．双合诊：检查者戴手套，右手（或左手）食中两指顺阴道后壁轻轻插入，检 查阴道通畅度和深度，再扪及宫颈大小、形状硬度及外口情况，有无接触性出血。随后将阴道内两指放在宫颈后方，另一只手手掌心朝下手指平放在患者腹部平脐处，当阴道内手指向上向前抬举宫颈时，腹部手指往下往后按压腹壁，并逐渐向耻骨联合部移动，扪及子宫的位置、大小、形状、软硬度、活动度以及有无压痛。将阴道内两指由宫颈后方移至一侧穹窿部，尽可能往上向盆腔深部扪触，与此同时另一手从同侧下腹壁髂嵴水平开始，由上往下按压腹壁，与阴道内手指相互对合，以触摸附件区有无肿块、增厚或压痛。 4．检查结果记录： 外阴：发育情况及婚产式（未婚、已婚未产或经产式）。有异常发现时详 细描述。 阴道：是否通畅，粘膜情况，分泌物量、色、性状以及有无臭味。宫颈：大小、硬度，有无糜烂、撕裂、息肉、腺囊肿，有无接触性出血、举痛等。
一、Transwell小室制备 1、无基质胶Transwell小室制备 ①包被基底膜: 用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN的话,可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原(collagen)的话,一般配成0、5 mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜: 吸出培养板中残余液体,每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液,37 ℃,30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法:在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3、9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置37 ℃30 min使Matrigel 聚合成凝胶。 2、有基质胶的Transwell小室制备 Chemicon公司的ECM550系列说明书要求,将小室放入培养板中,在上室加入300 μl预温的无血清培养基,室温下静置15－30 min,使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。 二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h,进一步去除血清的影响。但这一步并不就是必须的。 ②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1－2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105,个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索,因为不同细胞,其侵袭能力就是不同的。个人经验,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,如果最后用计数法统计结果的话将难以计数;而过少的话,可能还没到检测的时间点,所有的细胞都已穿过,因此最少也要保证在收样的时候,上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为,对照组与处理尽量不要分开计数,因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数,那么计数一定要多重复几次,力求准确,尽量保证对照组与处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室,不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求,请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。 ②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基,不同的培养板加的量有不同要求,具体请参考说明书。这里要特别注意的就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。 ③培养细胞:常规培养12－48 h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例,我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力,还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度就是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞,24 h内对细胞增殖并无明显抑制,但24 h后,抑制作用就开始出现了。所以,用这个浓度来做Transwell,处理时间也必须限定在24 h内,否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡,使处理组细胞数目少于对照组,那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少,究竟就是由于侵袭被抑制引起,还就是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以,同样,过短也不行,因为细胞内会有一定量的MMPs储存,短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去,进而发挥作用,影响MMPs表达,到最后释放到培养基中,还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点,也可选择多个时间点研究时间依赖效应,但前提就是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外,我瞧到细胞在小室内的形态不就是正常培养贴壁的形态,而就是圆形的,仍就是悬浮时的形态,不过会聚集成团,所以瞧到细胞不正常贴壁也不要紧张,就是正常现象 在培养过程中,膜下会逐渐有少量小气泡产生,这就是正常现象,可不予处理,但我遇到过培养一段时间后,膜下出现了大气泡,幸亏及时发现,否则后果将非常严重。因此,个人建议,最好接种细胞后1－2 h把培养板从培养箱里拿出来瞧瞧,确信没有大气泡产生。
实验二实验基本技能训练——加热操作与试管的使用 一、酒精灯的使用： 1．酒精灯的使用 1.1培养学生的技能目标：酒精的添加及加热固体、液体的方法。 1.2构造及装置(结合装置示意图说明)： 结合上图可看出酒精灯主要由灯体，灯芯，灯芯座，灯帽，和酒精构成。 1.3操作步骤 ⑴检：检查灯芯，并修平整。 ⑵加：添加酒精，体积不超过酒精灯容积的2/3且不少于1/3。禁止往燃着的酒精灯中添加 酒精。 ⑶点：点燃，用火柴点燃，禁止用另一只酒精灯引燃。 ⑷灭：用灯帽盖灭，不可用嘴吹灭、 1.4加热方法 加热时应先用酒精灯的外焰预热，再集中加热。因为火焰的组成为外焰、内焰、焰心三部分。焰心含有足量的酒精蒸汽，但氧气含量最少；内焰酒精蒸汽温度，但氧气含量不足，燃烧不完全；外焰与空气充分接触，氧化完全，所以外焰温度最高，内焰低，焰心更低。 1.5注意事项 酒精灯如长期不用，必须倒出灯内酒精，并在灯帽与灯颈之间夹上小纸条，以防粘连。 1.6改进 实验室里，由于通风的原因，火焰常不稳定，请问有什么办法使火焰不再摇晃不定？ 办法一：使用挡风板，但板相对较大，不利操作。 办法二：利用用易拉罐作一挡风筒。 办法三：请你自己思考一或几种： 办法：可在灯芯座上加上一圈金属网。 小结： 关于酒精灯的使用，你是否还有其它建议？ 1、新酒精灯需要配置灯芯，将灯芯修剪到浸入酒精4~5 cm，可以调整露出陶瓷套管的灯芯长度，来控制火焰的高度，但不宜超过3mm，否则会使火焰不稳定。对于旧灯，尤其是长时间没有使用的酒精灯，应该取下灯帽并提起陶瓷套管，用洗耳球或嘴轻轻地向灯壶内吹气，以赶走
其中聚集的酒精蒸气，接着再检查灯芯，如果灯芯不整齐或者烧焦的话，应用剪刀修剪整齐。使用前还应该检查灯壶是否有破损。 2、酒精灯在使用之前需要检查酒精储量，酒精若少于容积的1/2，就应该添加酒精，但酒精不能超过容积的2/3。[5]添加酒精应将陶瓷套管取出，用漏斗或者玻璃棒引流添加，以免漏撒，而点燃的酒精灯应先熄灭再添加，否则容易引起火灾。添加酒精后还应该擦拭桌面，保持干净干燥，以免点火时发生危险。 3、点燃酒精灯前要调整灯芯，使得灯芯浸满酒精，否则容易将灯芯烧焦。[2]点燃酒精灯必须使用火柴，不能用已经点燃的酒精灯来引燃另一个酒精灯，否则容易使酒精撒漏引起火灾。 4、使用中的酒精灯，应放置在适当的高度，使用木块垫高，不能使用书本。挡风可以使用专用挡板，也不能使用书本。使用中不可以倾斜拿取和放置，以免酒精撒出，谨防碰倒酒精灯。 5、如果需要稳定火焰以及提高火焰温度，可以在火焰周围增加一个金属网罩。[2] 使用酒精灯应该遵守实验室规则。 6、若酒精灯不慎翻倒，造成小面积着火，可以使用湿抹布盖灭。火熄灭后，不可立即移开抹布，否则可能引起复燃。如果大面积着火，甚至发生火灾，应使用灭火器灭火，并且报告消防部门。灭火后还应该打开门窗通风，使酒精蒸气排散。如果发生烧伤，应该按烧伤处理方法及时处理。 7、如果需要稳定火焰以及提高火焰温度，可以在火焰周围增加一个金属网罩。[2] 使用酒精灯应该遵守实验室规则。 二、试管的使用 1.实验目的：熟悉试管的用途；熟练掌握试管操作 2.思考与练习： ⑴试管的用途：盛放与加热固体、液体；收集气体；用作少量物质的反应容器。 ⑵试管操作训练：（结合图形写出注意事项） 试管的持拿（手持、试管夹）；取用固体、液体的操作；固体、液体的加热；气体的收集； 试管的持拿： 手持：