芳香物、卤化物和杀虫剂等，因此在污水的三级处理过程中也具有潜在应用价值。研究显示，特氏杜氏藻中的金属结合肽和植物螯合肽可将无机砷代谢成砷聚合物，从而达到去除环境中重金属的目的。
6环境指示
相对其他测试生物(如动物)而言，藻类对生活污水或工业废水有更高的敏感性。利用藻类来指示环境毒性的研究，最近有很多报道。Santin-Montanya等报道了7种微藻对海洋环境杀虫剂的测试方法，指出普氏杜氏藻是禾草灭、稀禾定、苯嗪草酮、二氯吡啶酸等杀虫剂的最佳指示剂。黄小娟等［4］利用杜氏藻生长阻碍实验，测定排放到环境中特别是饮用水中的有机毒物，从而得知被测化合物的生物毒性。这种行之有效的测试饮用水污染的方法，在水质污染监测和控制方面有着广阔的应用前景。
综上所述，杜氏藻是一种优越的经济藻类，具有独特的生理特性。随着科技的发展以及消费者对天然产品的需求日益增加，杜氏藻的效能和应用价值将越来越广泛地被开发出来，进而在医药、食品、养殖业、化妆品等领域发挥越来越重要的作用。
主要参考文献
1Leon R.,Vila M.,Hernanz D.et al.Production of phytoene by herbicide-treated microalgae Dunaliella bardawil in two-phase systems.Biotechnol Bioeng,2005,92:695—701.
2尹鸿萍,盛玉青.盐藻多糖体内抑菌及抗炎作用的研究.中国生化药物杂志，2006,27(6):361—363.
3朱红红,尹鸿萍.盐藻多糖抗病毒实验研究.南京中医药大学学报,2007,23(5):310—312.
4黄小娟,沈洛夫,姜建国等.卤代物对盐藻生长抑制实验的联合效应的观察.癌变·畸变·突变,2005,17(1):27—28.
（E-mail:chendefu@https://www.doczj.com/doc/446678104.html,）
基因敲除（gene knock-out）是指借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法，通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将模式生物正常的功能基因的编码区破坏，使特定基因失活，以研究该基因的功能，或者通过外源基因来替换宿主基因组中的相应部分，以便测定它们是否具有相同的功能，或者将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。
1基因敲除小鼠技术的建立
目前，比较广泛应用的基因敲除动物主要是基因敲除小鼠，因为基因敲除技术基于完善的胚胎干细胞系统和胚胎重建技术。人类几乎所有的疾病都与基因有关，基因敲除动物模型的建立,为研究人类疾病提供了一个崭新方法,尤其是遗传性疾病。通过基因敲除动物，能够通过表型变化，生理指标检测等直接分析被敲除基因的功能。
基因敲除又称基因打靶(gene targeting)，是通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，精细地定点修饰和改造基因DNA片段的技术。它是于20世纪80年代后半期在胚胎干细胞技术和同源重组技术基础上发展起来的，具有位点专一性强、打靶后目的片段可以与染色体DNA共同稳定遗传的特点，目前已成为一种较理想的改造生物遗传物质的实验方法。
基因敲除小鼠在疾病研究中的应用
桑景荭刘欣
（首都医科大学基础医学院北京100069）
摘要人类疾病动物模型在揭示人类疾病的发生机制或建立治疗方法中具有极重要的作用。然而，许多疾病难以用人工诱发的方法制造动物模型,还有许多疾病在实验动物身上不发生,而难以通过自发或人工定向培育的方法获得动物模型。基因敲除技术的出现,为人类精确地研究基因与疾病的直接关系提供了可能,而且可以在个体发生的每个阶段中进行遗传功能的分析。综述了基因敲除小鼠模型在几种疾病研究中的研究与应用及其发展前景。
关键词基因敲除小鼠动物模型动脉粥样硬化2型糖尿病帕金森病
中国图书分类号：R332Q31文献标识码：A
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2007年诺贝尔生理学或医学奖授予了来自美国的Mario R．Capecchi、Oliver Smithies和来自英国的Martin J．Evans。他们因利用基因靶向技术使小鼠体内的特定基因失去活性，培育出研究价值极高的“基因敲除小鼠”而获此殊荣。诺贝尔奖评审委员会在新闻公报中说到：“今年的奖项所涉及的发现引领人们掌握了一个无比强大的研究武器”。
在生物、医学等各方面的研究中，模型生物的建立非常重要。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。其中最具代表性的应用就是在人类疾病动物模型方面的应用，人类的很多疾病，都是由基因决定的，构建相应的基因敲除动物模型，对人类疾病的研究来说不失为一个好方法。
迄今为止，基因敲除技术已经帮助人们构建了数百个人类疾病的小鼠模型，包括心血管疾病、神经退化性疾病、糖尿病、癌症等小鼠模型。通过对这些模型的研究，可以找到相关疾病的潜在治疗靶点。预计在不久的将来，有可能完成小鼠所有基因的敲除实验，来研究不同基因在生命活动中所扮演的具体角色。
2基因敲除小鼠疾病模型的建立与相关疾病研究
2.1在动脉粥样硬化(artherosclerosis)研究中的应用据统计，全球每年死于心血管疾病的人数达到1700万~1900万，约占总死亡人数的30%。因此，很长时间以来，对于心血管疾病的研究都是医学和生命科学关注的焦点。用于心血管疾病研究的经典实验动物模型通常是采用手术、饲喂或是药物处理的方法制作，譬如动脉粥样硬化的模型通常以饲喂高胆固醇配合维生素D的方法，或是手术破坏血管内膜获得；心肌缺血和心肌缺血再灌注损伤模型通常采用手术结扎冠脉。然而，随着科学技术的发展以及人类对心血管疾病发生机理的深入了解，基因工程技术也逐步应用到了心血管疾病研究领域，为研究提供了更加便利，快速和真实的动物模型。通过基因靶向技术得到的小鼠在心血管疾病的研究中发挥了重要作用，其中比较突出的是动脉粥样硬化模型。
动脉粥样硬化是一种与炎症反应相关的进行性疾病，它会随着年龄的增加而逐渐的发展。目前对于动脉粥样硬化的发生机制存在着许多假说，但是这些假说最终都汇集到动脉内皮受损导致的炎症，而不同的假说只是内皮受损的机制不同。在这些假说中，脂浸润导致内皮损伤的机制由于实验证据颇多，被广泛的认同。脂浸润假说认为，血液中过多的脂类物质（包括甘油三酯，胆固醇等）与载脂蛋白结合而成的低密度脂蛋白（LDL）可以浸润渗透入血管内皮，从而被内皮细胞吸收导致细胞死亡，进而引发炎症。另外，进入内皮的脂类分子经过超氧化作用形成至炎作用极强的致炎因子，诱导炎性细胞侵入血管内皮。经典动脉粥样硬化动物模型同样是利用脂代谢紊乱诱发动脉硬化来造模的。而目前常用的基因敲除小鼠模型通常有2种，一种是敲除了低密度脂蛋白受体（LdlR）的基因工程小鼠，另一种是敲除了载脂蛋白E （ApoE）的基因工程小鼠。
事实上，这2种敲除方式所利用的原理十分相似。敲除了LdlR的小鼠由于其细胞几乎无法吸收低密度脂蛋白，而造成内环境（血液）中低密度脂蛋白的含量维持在很高的水平，促进了脂浸润的过程，从而诱发动脉粥样硬化。而载脂蛋白E 是脂蛋白的成分之一，同时它又是低密度脂蛋白受体的配体，也就是说，低密度脂蛋白是通过ApoE与LdlR的相互识别才可以进入细胞的。因此，敲除了ApoE的小鼠由于LDL无法与受体相识别从而滞留在血液当中。这2种基因敲除小鼠作为动脉粥样硬化模型的质量相当高，一般8周龄的小鼠就可以发现明显的硬化斑块。有研究者就利用Ldlr-/-的小鼠研究发现动脉粥炎硬化形成的炎症反应过程中，肥大细胞的浸润是非常关键的一步，去除肥大细胞或是一只肥大细胞脱颗粒作用可以很显著的减少动脉粥样硬化的形成，这个成果对于动脉粥样硬化的预防与治疗中有很重要的意义。
由于动脉粥样硬化是绝大多数心血管疾病的诱因，包括最常见的高血压症，以及常诱发紧急事件的冠心病、急性心肌梗塞、主动脉瘤和主动脉夹层、硬膜下出血和蛛网膜下出血等。基因敲除LdlR或ApoE的小鼠为攻克这些疾病，提供了强有力的实验工具。
2.2在2型糖尿病（diabetes mellitus）研究中的应
用2型糖尿病人存在着明显的胰岛素抵抗，产生胰岛素抵抗的主要原因是胰岛素信号转导出现缺陷，同时也影响胰岛素的分泌。胰岛素的形成是一个复杂的、多基因参与的过程。利用基因敲除技术可以探究单个基因在产生胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷中的作用。现在通过基因敲除模型，已经发现了多种与2型糖尿病有关的基因，如IR基因、Glu-4基因、PPARγ等。
通过实验发现：胰岛素受体(IR)基因缺失杂合子小鼠无明显的代谢异常，仅10％在成年时出现糖尿病。IR缺失纯合子(IR)小鼠出生时表型与野生型小鼠相似，但哺乳不久即出现代谢异常，生长迟缓等症状，最后发生糖尿病酮症酸中毒，在出生后1周内死亡。胰岛素受体底物1(IRS-1)是IR和胰岛素样生长因子1(IGF-1)受体酪氨酸激酶的重要底物。利用基因敲除产生的IRS-1-/-小鼠出现生长迟缓和外周胰岛素抵抗，并有高甘油三脂血症，胰岛素代偿性分泌增加，空腹血糖保持正常。IRS-1-/-小鼠保留部分胰岛素作用促使了另一胰岛素受体底物IRs-2的发现。在ZRS小鼠肌肉中，胰岛素诱导的磷脂酰肌醇3激酶（PJ3k）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）活化水平下降，而在肝脏中显示正常，这是由于酪氨酸磷酸化的IRS-2在IRS-1-/-小鼠肝脏中增加，代偿了IRS-1的缺失，介导胰岛素的信号转导。在肌肉中，这种代偿作用并不存在。IRS-2-/-小鼠存在着外周胰岛素抵抗和B细胞功能的障碍，在早期即出现明显的糖耐量异常，10周时发展成糖尿病。组织病理学显示IRS-2-/-小鼠的胰岛B细胞体积明显减小，以致不能代偿外周胰岛素抵抗。这是第一个胰岛素信号蛋白单基因突变影响胰岛素分泌和功能的2型糖尿病动物模型，然而至今还未发现2型糖尿病病人的IRS-2的突变，IRS-1的突变却出现在10％～20％的2型糖尿病病人中。
纯合子Glut-4-/-小鼠没有出现糖尿病表型，仅表现轻度的胰岛素抵抗和糖耐量异常，其空腹和餐后乳酸和FFAs水平下降。雄性Glut-4+/-小鼠并未随年龄增长变得肥胖，但是Glut-4在骨骼肌的表达下降90％～95％，出现外周胰岛素抵抗，随后发展成高血压和糖尿病。Glut-4的一个等位基因敲除可导致严重的外周胰岛素抵抗，而肝的胰岛素敏感性依然存在，表明骨骼肌和脂肪组织Glut-4蛋白的表达异常足以改变体内的糖平衡。另外，这种小鼠还出现与2型糖尿病病人相似的糖尿病性心肌病和脂肪肝。因此，Glut-4+/-小鼠是研究非肥胖性2型糖尿病发病的良好模型。
过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ属于核受体超家族，参与脂肪生成。在人类PPAR-γ突变与某一类型的肥胖和严重的胰岛素抵抗相关。PPAR-γ是胰岛素增敏剂噻唑烷二酮(TZD)类药物的主要功能受体。PPAR-γ-/-小鼠于胚胎期死亡。PPAR-γ+/-小鼠体重正常，血糖、胰岛素浓度和游离脂肪酸(FFA)浓度亦无明显改变，但PPAR-γ抑制瘦素表达作用的部分丧失，瘦素表达升高；口服葡萄糖实验后糖耐量正常，但血胰岛素浓度较低，这表明胰岛索敏感性升高。
PPAR-γ在胰岛素敏感性的调控中起双重角色，噻唑烷二酮类激活的PPAR-γ增强了脂肪细胞的分化，产生小而对胰岛素敏感的脂肪细胞。相反，在PPARγ2个等位基因存在时，PPARγ的高表达却促进高脂饮食下的脂肪细胞肥大，形成大的脂肪细胞，产生胰岛素抵抗。
2.3在帕金森病（Parkinson disease PD）研究中的应用帕金森病是一种严重危害中老年健康的中枢神经系统退行性疾病。随着社会老龄化，其患病率逐步升高。因此，对PD的研究越来越受到关注。
PD动物模型的制作是研究的基础和关键，无论研究其发病机制，还是探索新的治疗方法都离不开PD动物模型。然而，PD在动物中没有自发的倾向，进行PD实验研究需要建立适当的动物模型。随着基因工程技术的不断发展，尤其1997年发现了遗传因素在PD发病中的重要作用，表达致病基因的转基因动物，或通过基因敲除技术建立各种疾病相关基因的敲除鼠模型，在探索PD 的发病机制、疾病诊断、预防及治疗等方面起着越来越重要的作用。
通过破坏基因外显子3建立的Nurrl（nuclear receptor1）基因敲除小鼠模型，具有症状相类性、病理一致性、慢性进行性及可早期神经保护介入等特点，可作为PD理想的动物模型。
Nurrl，即核受体相关因子1，是一种转录因子，属于核甾体／甲状腺激素受体超家族成员。Nurrl在中脑优势表达，作为基因转录调控蛋白与
黑质多巴胺能神经元细胞的发育、发展和生存有密切的关系。普遍认为它是帕金森病相关基因。现有研究表明Nurrl对中脑多巴胺能神经元的发育、生存及其功能维持起重要作用，Nurrl的激活可增加多巴胺表型标志基因如酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运蛋白(DAT)等靶基因表达。更有研究表明Nurrl参与了PD的发病过程。
为了研究Nurrl基因的生物学功能，Nurrl基因敲除小鼠模型已由Cormeely等建立，这种小鼠表现大量多巴胺能前体神经元凋亡，最终导致黑质体多巴胺能神经元发育不全。当Nurrl+/-组小鼠长到15个月或更大的时候，开始呈现出PD的症状，提示黑质多巴胺能功能缺陷呈慢性进行性缺陷，表现为在旋转爬杆试验中运动执行功能的明显损害，在行为、生物化学及病理组织学的许多特征与在PD所见到的慢性进行性的黑质多巴胺能神经元退化相似。因此，Nurrl+/-小鼠是一种有用的动物模型来研究PD的发病机制和探索疾病的治疗策略。
虽然家族性PD只占本病总数的5％～10％，但对它们的研究却有望成为打开PD发病机制神秘大门的一把钥匙，而对具体发病机制的阐明则有利于PD的根本治疗，即神经保护治疗。帕金森病的神经保护治疗是指一个过程，即某种治疗能有益地影响PD的病理生理学基础，主要有线粒体复合物－1缺陷、自由基损害和氧化应激、蛋白体功能障碍、凋亡、炎症（小胶质细胞活化），同“多巴胺拟拟剂等对症治疗”相比，它可能推迟发病或延缓病情的发展。
Nurrl基因敲除小鼠可作为帕金森病研究的动物模型，是因为动物模型的症状应与同人类患者的特性相似，PD渐进发展，在经过一个长期的过程后出现典型的临床症状。在临床症状出现前，可对新药和治疗对策能给予评价。对于PD的早期诊断和早期防治，一直是学界研究的热点和难点，故对Nurrl基因敲除模型进行早期治疗，进行神经保护治疗是防治PD的主要切入点。
3展望
基因敲除动物模型建立，将为哺乳动物正常生物学研究提供一个很有力的手段，该模型对生物学、免疫学、肿瘤学、神经生物学及医学和育种学等产生深远的影响。尤其是人类基因测序工作已完成，人类将进入后基因组时代(post—genomic time)，即研究人类功能基因各自的作用和表型。基因敲除动物模型的建立为这项宏大的工程提供一种有效的方法。基因敲除小鼠的应用在深度和广度方面必将会有长足的进展，深度方面比如覆盖小鼠全基因组的基因敲除小鼠资源库的构建；广度方面则体现在对其他动物，尤其是人的发育与相关疾病方面的研究。随着基因敲除技术的不断改进以及基因敲除的更加深入广泛的应用，相信在不久的将来，基因敲除技术能给人类疾病方面的研究和生命科学的发展带来更多惊喜。
主要参考文献
1卢丽,陈系古,黄冰.基因敲除动物的研究和应用.中国实验动物学报，2006，14（2）：152—156.
2刘英,张瑞君,伍志传等.转基因疾病动物模型的研究进展.
动物医学进展,2006,27(12):44—49.
3贺松，张德纯.基因敲除方法及其应用.中国微生态学杂志，2009,21(2):181—184.
4Chao Li,Zhong Huang,Ronald Kingsley et al.Biochemical A-lterations in the Retinas of Very Low-Density Lipoprotein Re-ceptor Knockout Mice.Arch Ophthalmol.2007,125:795—803. 5谢谨捷，杨娅.基因敲除鼠在动脉粥样硬化研究中的应用.
基础医学与临床，2008，28（4）：400—402.
6刘清南,袁中华.敲除Adipophilin基因对脂质代谢相关疾病的作用.中国生物化学与分子生物学报,2009,25(6):495—500. 7Veurink G.,Liu D.,Taddei K.et al.Reduction of inclusion body pathology in ApoE-deficient mice fed a combination of antio-xidants.Free Radic Biol Med,2003,34(8)1070—1077.
8LASSILA M.,JANDELEIT-DAHM K.,SEAH K.K.et al.Imatin-ib attenuates diabetic mephropathy in apolipoprote in E-knock out mice.J Am Soc Nephrol,2005,16(2):363—373.
9周丽斌.基因敲除技术在2型糖尿病研究中的应用.国外医学：内分泌学分册，2002，3：177—180.
10曲军卫，王勇，周晓军等.应用基因敲除技术研究胰岛素抵抗的进展.中国糖尿病杂志，2006，6：474—475.
11万海英，汤华.基因敲除技术现状及应用.医学分子生物学杂志，2007，4（1）：86—90.
12王小同.中医药抗帕金森病理想的动物模型Nurr1基因敲除小鼠.中华医学药学刊，2007，25（6）：1117—1119.
13Jiang C.,Wan X.,He Y.et al.Age-dependent dopaminergicd-ysfunction in Nurrl knockout mice.Exp Neurol,2005,191(1):
154—162.
14姚庆和，张华，高国栋.帕金森病小鼠模型行为学检测方法的比较研究.中国实验动物学报，2006，14（4）：264—270.
（E-mail:sangjinghong@https://www.doczj.com/doc/446678104.html,
刘欣lxlgh@https://www.doczj.com/doc/446678104.html,）
.. 一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout） 常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。 二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout） 条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。 条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。 三、基因敲入小鼠（Knockin） 基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。 此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。 获得嵌合体及之后品系纯化详细流程： 基因敲除其他方法： 一、ZFN技术制作基因敲除鼠 ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。 这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。 二、TALEN技术制作基因敲除鼠 TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。 ;.
转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项 高度标准化的新兴产业 一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies 于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程 图2.基因敲除鼠制作过程示意图 1. Knockout载体设计与构建
基因敲除技术 点击次数: 2605 发布日期: -5-25 来源: 本站仅供参考, 谢 绝转载, 否则责任自负 1．概述: 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术, 是经过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。一般意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理, 用设计的同源片段替代靶基因片段, 从而达到基因敲除的 目的。随着基因敲除技术的发展, 除了同源重组外, 新的原理和技术也逐渐被应用, 比较成功的有基因的插入突变和iRNA, 它们同样能够达到基因敲除的目的。2．实现基因敲除的多种原理和方法: 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初, 胚胎干细胞( ES细胞) 分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年, 首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到 1987年, Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在, 运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的 使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1):
图1.基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤 a．基因载体的构建: 把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子 都重组到带有标记基因(如neo 基因, TK 基因等)的载体上, 成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能, 因此一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得: 现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞, 最常见的是鼠, 而兔, 猪, 鸡等的胚胎干细胞也有使用。常见的鼠的种系是１２９及其杂合体, 因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向, 是基因敲除的理想实验动物。而其它遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2, 3] ｃ．同源重组: 将重组载体经过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中, 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组, 将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中, 从而得以表示。一般地, 显微注射命中率较高, 但技术难度较大, 电穿孔命中率比显微注射低, 但便于使用。[4,5] ｄ．选择筛选已击中的细胞: 由于基因转移的同源重组自然发生率极低, 动物的重组概率为10－2～10-5, 植物的概率为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。当前常见的方法是正负筛选法( PNS法) , 标记基因的特异位点表示法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。[6]
CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA 的片段整合到CRISPR 中，并利用相应的CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。 原理 此系统的工作原理是crRNA（CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶Cas9 蛋白在与crRNA 配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （singleguide RNA ），足以引导Cas9 对DNA 的定点切割。 作为一种RNA 导向的dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifying factor），能够共定位RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的Cas9（Cas9 nuclease-null）融合，并表达适当的sgRNA ，可靶定任何dsDNA 序列，而sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9 的结合。因此，Cas9 能在任何dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。 应用 基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。 2013 年1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的RNA 将Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过RNA 注射的方式将CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关G 蛋白偶联受体Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。 CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。 技术优缺点 CRISPR （Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats）是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞（包括iPS）的特定的基因组位点上进行切割，修饰。Rudolf Jaenisch 研究组将Cas9与Te1和Tet2特异的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达80%。他们将Cas9/sgRNA 与带突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。在ES细胞中他们更是成功的一次敲除了五个基因。与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变。但该系统是否有脱靶效应尚需进一步的研究。 传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种修饰，仍将是模式动物的构建的主要技术。核酸酶ZFN/TALEN 尤其是CRISPR/Cas技术如果能解决脱靶效应的话，有可能会广泛应用于小鼠，大鼠及其他模式动物的制备和研究中，成为传统的转基因和基因打靶技术的重要补充。
基因敲除小鼠pc鉴 一、技术介绍与研究进展 敲除动物技术已经/ 基因、基因敲入转该技术从上世成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，原核显史，经典技术如DNA纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历 在小鼠模型构建方面日趋微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，制备技术一样，逐渐从完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的 催生了数以百基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，然存在一些难以计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍TALEN和费用高昂等，而ZFN克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。二、同源重组技术原理同源重组的原理发展起来的，年代中后期基于DNA基因敲除鼠技术是上世纪80）homologous recombination1987年根据同源重组（在Capecchi和Smithies），这的外源基因的定点整合（EStargeted integration的原理，首次实现了），gene knockout（基因敲除）或gene targeting（基因打靶一技术称为 利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝
尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图图制作流程 三、． 基因敲除鼠制作过程示意图图2. 载体设计与构建1. Knockout根据研究项目具体情况和要求把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的的载体上，成为重
课题-基因敲除小鼠的pcr鉴定
一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN 等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。 二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"
（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程
如何设计条件性基因敲除小鼠模型 摘要： 小鼠和大鼠可谓是生命科学实验室里的明星，成功的小鼠和大鼠模型可谓是“生命科学的好帮手”。很多人可能想自己设计或是了解条件性基因敲除小鼠，在此做个小结，供大家参考。 小鼠和大鼠可谓是生命科学实验室里的明星，成功的小鼠和大鼠模型可谓是“生命科学的好帮手”。很多人可能想自己设计或是了解条件性基因敲除小鼠，在此做个小结，供大家参考。 条件性基因敲除小鼠的设计利用了Cre/LoxP或Flipe/Frt原理。它们都是位点特异性重组酶系统。这里以Cre/LoxP系统为例。比如在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个loxP序列，得到flox(flanked by loxP)小鼠。将flox小鼠与带有细胞特异性表达Cre 的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。此外，若与控制Cre表达的其他诱导系统(比如CreERT2)相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。 Cre/loxP系统来源于噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。该系统含有两个组成成分：一个是一段长34bp的DNA序列(LoxP序列)，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。LoxP的方向由中间这8个碱基决定。这段LoxP序列是Cre重组酶识别的位点。令一个组成部分是Cre重组酶。它是由噬菌体编码的一种由343个氨基酸组成的蛋白。Cre可以介导两个LoxP位点的重组，从而引起两个LoxP之间DNA序列的缺失。如果将Cre重组酶cDNA通过基因工程的手段置于组织或细胞特异性启动子之下，可以得到Cre组织/细胞特异性表达的Cre小鼠，也叫Cre工具小鼠。跟Flox小鼠交配之后，可以得到条件性基因敲除小鼠。 所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个LoxP序列。这段序列就是Flanked by LoxP，也就叫做Flox小鼠。这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得。这种小鼠跟Cre工具小鼠交配，由于Cre的表达，介导两个LoxP位点序列的重组，从而敲除两个LoxP之间的序列。由于不同Cre工具小鼠的Cre表达有组织/细胞特异性，就可以达到在不同组织、细胞里特异性敲除目的基因的目标。比如上皮细胞、胸腺细胞、T细胞、B细胞、心肌细胞、肠道、肺脏等。 那如何设计条件性基因敲除小鼠呢?这里所说的设计主要是Flox小鼠的设计。所谓条件性敲除，是说除了特定细胞外，其它细胞里面没有任何的基因表达异常。一般情况下，不要在第一个外显子前面放置LoxP序列。因为第一个外显子前面一般是启动子。放置LoxP 序列有可能会破坏或改变启动子活性。条件性敲除一般是敲掉最早引起移码突变的外显子。这样的话，最好不要敲除有起始密码子ATG的外显子。否则的话，基因可能会利用ORF 内的ATG编码一个缺少部分N端序列的蛋白，这个蛋白很可能有全部或部分野生蛋白的功能。在选择要敲除的外显子的时候(各放一个LoxP在一个外显子的两侧)，该外显子的碱基数目不能是3N，否则新基因pre-RNA拼接得到的mRNA不能产生移码突变。会产生一个
基于CRISPR Cas9技术基因敲除小鼠（Cas9-KO）的制作方法 一、CRISPR/Cas9靶向基因敲除小鼠制作的基本技术原理： 通过CRISPR/Cas9基因敲除技术，crRNA通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合，形成双链RNA。这一tracrRNA:crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶标的特定位点剪切双链DNA。在与crRNA引导序列互补的位点，Cas9蛋白的HNH核酸酶结构域剪切互补链而Cas9 RuvC-like 结构域剪切非互补链，实现敲除目的基因的功能，制备基因敲除小鼠模型。 二、具体步骤如下： 一）模型制作策略制作：利用生物信息学手段(NCBI&IMPC&MGI)，分别仔细分析目的基因敲除后小鼠的生存能力及繁育能力，并结合邻近基因的影响，最终选择合适的敲除区域进行敲除方案的设计，出具相应的制作策略。 二）载体的设计和构建：使用麻省理工学院的CRISPR Design工具 （https://www.doczj.com/doc/446678104.html,/），依据中靶Score的高低及脱靶Score的高低设计一对长度为20bp的针对靶标DNA的寡聚核苷酸链序列用于制备sgRNA，并在该靶区域设计引物用于后续阳性小鼠的基因鉴定。 1、制备sgRNA的实验方法步骤： 1）线性化pUC57-GDNA-T7载体 中提pUC57-GDNA-T7载体，用BsaI线性化过夜。胶回收保存备用。 2）引物退火及加磷酸 将上下游引物（干粉）稀释，再进行引物退火及加磷酸。 3）连接&阳性菌落筛选
取步骤二中的加磷酸产物与线性化载体pUC57-GDNA-T7进行连接，该连接反应在干式恒温器中进行。对连接产物进行转化，涂板，37°C培养箱过夜培养。再用PCR&测序的方法筛选阳性克隆，再将测序正确的克隆进行甘油菌保种，-80°C保存备用 4）制备转录模板 以构建好的sgRNA载体为模板进行PCR扩增，将PCR产物切胶回收，回收产物离心后倒掉上清留DNA沉淀，再溶解DNA。再吸1 μl测DNA浓度，浓度应介于300-500ng/μl，OD260/280介于1.8-2.0范围内。 5）最后进行sgRNA转录，将得到的sgRNA测浓度，跑电泳，分装保存。 三）Cas9/sgRNA的显微注射：将转录好的Cas9 mRNA，sgRNA混合使用显微操作仪将混合物显微注射到小鼠受精卵的胞浆中，再将受精卵移植到假孕的母鼠子宫中，等待F0代小鼠出生。 四）F0 小鼠的鉴定：在F0代小鼠出生后5-7天时，采用剪脚趾法标记小鼠，并将剪取鼠尾组织用在靶区域设计的引物进行鉴定，选取PCR阳性的样品进行测序。 五）F0代小鼠的可遗传性检测：将PCR以及测序正确的F0代小鼠与野生型C57BL/6小鼠进行交配，产生F1代小鼠，依据F0代小鼠的鉴定方法对F1代小鼠进行鉴定，获得的阳性F1代杂合子小鼠即可稳定遗传。
B-Cas9敲进小鼠——一个神奇的基因敲除小鼠制备工具CRISPR/Cas9技术自问世以来就受到了科学家们的青睐。随着基因敲除技术不断更新完善，最近诞生了一种可以快速、高效制备基因敲除小鼠的工具模型--B-Cas9敲进小鼠。B-Cas9敲进小鼠自身携带Cas9蛋白，只需注射sgRNA就可以对基因进行编辑。那么，我们为什么需要B-Cas9敲进小鼠？它有哪些优势、应用领域如何呢？B-Cas9敲进小鼠又是如何制备的呢？ 1）B-Cas9敲除小鼠的优势 不仅可以缩短敲除小鼠的制备周期，还可以提高敲除效率。在携带有Cas9蛋白的小鼠体内注射sgRNA病毒，便可即时获得敲除小鼠；若在小鼠体内注射多个sgRNA病毒，就可以实现多基因同时敲除。 2）B-Cas9敲除小鼠的应用 不仅可以快速制备组织特异性基因敲除小鼠模型；其多基因变异更接近于肿瘤的异质性，还可以制备多基因敲除的癌症模型；除此之外, B-Cas9敲进小鼠还可以结合sgRNA文库进行高通量筛选。 3）B-Cas9敲除小鼠的制备原理 将表达Cas9蛋白的序列插入到Rosa26位点当中，并在Cas9前面添加TetO元件，以达到控制Cas9表达，实现可诱导型、组织特异性表达的效果。B-Cas9敲进小鼠只有在注射了Dox后，Dox与Teto复合体结合才能诱导Cas9蛋白的表达。（打靶策略如下图）
4）B-Cas9敲进小鼠与国外引进的Cas9敲进小鼠作比较，我们不难发现，B-Cas9敲进小鼠更加有优势。时间上省去了运输和隔离的3-4个月，费用也减少一半多。从遗传背景和技术改造来看，B-Cas9敲进小鼠的遗传背景是纯净的C57BL/6背景，而国外引进的Cas9敲进小鼠是129背景上回交的。B-Cas9敲进小鼠最大的优势在于其可诱导、可逆性表达Cas9,让实验更加方便,易于操控。
基因敲除小鼠的PCR鉴定 一、实验目的： 通过PCR扩增程序及琼脂糖凝胶电泳方法鉴定凝血因子IX基因敲除小鼠的基因型。 二、实验原理： 真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。 1.PCR原理： PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 1) 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2) 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 3) 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 2.琼脂糖凝胶电泳原理： 在pH8.0~8.3的缓冲液中，核酸分子带负电荷，向正极移动。由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同，因此在自由泳动时，各种核酸分子的迁移率相似，无法分开。然而，在浓度适当的凝胶中，由于分子筛效应，使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异，从而把它们分开。核酸在凝胶中的迁移率取决于其分子大小、高级结构、胶浓度和电场强度，与分子的碱基组成及电泳温度（4~30℃之间）无明显关系。一般说，同样构象的分子迁移率与分子量对数及胶浓度成反比，与电场强度（小于5V/cm）成正比。 三、实验操作 1.获取鼠尾组织 剪鼠尾0.5cm置于试管中，加入500ul裂解液和10ul蛋白酶K(20mg/ml)，55℃水浴过夜，至鼠尾溶解 2.提取基因组DNA 1) 试管中加入300ul饱和NaCl，充分混匀，12500rpm 离心20min
一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN 等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。 二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），
利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程
使用CRISPR-CAS系统构建可遗传的基因敲除小鼠和大鼠致编辑：CRISPR-CAS系统已经成为一种细胞和模式生物中有效的基因编辑技术。我们使用CRISPR-CAS系统，通过同时注入两种单导向RNA靶向Uhrf2,同时带入Cas9 mRNA来诱导小鼠的DNA片段缺失。此外，我们通过一种单一的显微注射方法得到了敲除Mc3R和Mc4R两种基因的大鼠。在小鼠和大鼠中均观察到较高的种系转移效率（突变可遗传）。 成簇有序间隔短回文重复关联蛋白系统（CRISPR-CAS系统）是一种在细菌和古细菌中演变的针对病毒和质粒入侵的基于RNA的后天免疫系统。【Bamboo注：该系统由一段Cas基因（双链DNA核酸酶）加一段特异序列组成，Cas作用为结合导向RNA,切割目的基因，导向RNA为CRISPR序列转录而成，有二级结构】根据作用机制不同，CRISPR-CAS系统目前有三种类型。在第二类型（下文称该系统）中，CRISPR序列转录RNA（crRNA）和反式激活RNA(TraceRNA)结合后有能力引导Cas9核酸内切酶到特定的序列，从而导致目标DNA双链缺失。【Bamboo注：机理：摄取了病毒DNA后，CRISPR 序列在转录产物tracrRNA,表达产物CAS蛋白，RNA酶共同作用下产生导向RNA,导向RNA含有病毒DNA序列，可遗传给下一代，再遇到病毒DNA时将其剪切】之前的研究表明在哺乳动物中有多种基因工程使用RNA介导的Cas9核酸酶系统。最近，使用该系统进行高效基因编辑已经在斑马鱼、小鼠和细菌中实现。几个小组也证明通过该系统介导的在细胞和斑马鱼中基因靶向效率与ZFNs（锌指核酸酶）和TALENs（转录活化因子效应核酸酶）【Bamboo注：另外两种常见DNA编辑方式】相似或较高。虽然已经有报道在单个小鼠胚胎中可使用该系统打乱多个基因，但是在动物体中尚未见该系统介导的突变种系转移。此外，长的特异的基因组DNA片段能否被该系统敲除也是未知的。CRISPR-CAS系统基因打靶在其他哺乳动物模型，例如实验室大鼠的效用，还需要确定。在这里，俺们报告俺们使用该系统在小鼠和大鼠中实现了高效的，可遗传的基因敲除。 图1使用该系统产生基因突变鼠。(a)该系统构建：Spacer-核酸引导序列；DR-分隔核酸引导序列的小重复片段；NLS-核酸定位信号序列。(b) F0代大鼠注射导向RNA后突变体的检测：Mc4r靶向前后（-，+）分别使用T7E1酶切Mc4r F0代大鼠尾基因组PCR产物。箭头为突变带，M是Marker.(c) Mc3r和Mc4r基因的序列。红框为核苷酸替换。右侧显示碱基对序列改变。通过DNA测序分析六组克隆扩增的PCR产物序列。各基因型在六组克隆的发生率列在右侧。 为了测试该系统在小鼠中的活动，初始试验选用了细胞中基因组Th位点已经被有效靶向的小鼠。首先，我们向FVB小鼠品系雄性原核（受精卵核物质融合前）中注入不同浓度的线性DNA(针对特定CrDNA和tracrRNA的人工编码Cas9核酸内切酶基因)（图1a），在子鼠中检测Th位点基因突变情况。同ZFNs（锌指核酸酶）和TALENs （转录活化因子效应核酸酶）相似，该系统诱导的双链DNA缺失主要被NHEJ(非同源
PCR方法在ApoE基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用 摘要目的为ApoE基因敲除鼠探索快速、简单的基因型PCR检测方法。方法设计两对引物扩增野生型ApoE基因和ApoE缺陷突变基因的DNA片段，用PCR仪梯度方案测试最佳退火温度，然后用PCR鉴定方案检测小鼠基因型并将所得基因型结果与已经过经典的Southern blot方法检测得到的基因型结果比较。结果野生型仅在155 bp处有一条条带，突变纯舍子仅在245 bp处有一条条带，杂合子则在155和245bp处出现两条条带。用PCR方法获得的ApoE基因分析结果与经典的Southern blot方法获得的结果完全一致。结论用PCR方法分析ApoE基因敲除鼠的基因型具有快速、简单、廉价和适用的特点。 关键词聚合酶链反应基因型基因打靶载脂蛋白E Genotype identification of ApoE Gene Knockout Mice with Polymerase Chain Reaction Objective This study was to explore a simple and quick polymerase chain reaction（PCR）method for genotyping of ApoE knockout mice.Method Two pairs of primers were designed to amplify genomic DNA fragment of wild-type ApoE gene and the same region on ApoE targeting veceor respectively.A gradient PCR strategy was used to test the best annealing temperature. Results A 155bp band was found in wild-type ApoE mice,a 245 bp band in homozygous mutated ApoE mice and both bands in hetemzygous mice.The genotyping results were completely coincided with those from typical Southern blot. Conclusion PCR is a simple,fast and practical method for the genotyping of ApoE gene knockout mice. Key words Poiymerase Chain Reaction genotype gene targeting ApoE 载脂蛋白(apolipoprotein，ApoE)是清除乳糜微粒和极低密度脂蛋白的受体的配体，因此，缺乏ApoE则会导致血液循环中富含胆同醇的物质积累而更加容易引起动脉粥样硬化
基因敲除技术 1．概述： 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2．1． 利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)： a． 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2，3] ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重
基金项目：国家自然科学基金资助（３１２７１２７１ ）＊通讯作者文章编号：１ ００７－４２８７（２０１９）０７－１２３９－０６Ｔ ＳＣ１转基因敲除小鼠动物模型的构建及敲除效果的初步研究 王 红１， ２，３，蒋 莉４，王 岩５，许振凯６，王威平６，方 航１，２，３，孙 鹏７，８，９＊，白晓春１，２，３，６＊（１． 南方医科大学附属第三医院，广东广州５１０６３０；２．广东省骨科研究院，广东广州５１０６３０；３．广东省骨科医院，广东广州５１０６３０；４．吉林大学第一医院急诊科，吉林长春１３００２１； ５． 吉林大学中日联谊医院科学研究中心，吉林长春１３００３３；６．南方医科大学，广东广州５１０５１５；７．中山大学肿瘤防治中心麻醉科，广东广州５１００６０；８．华南肿瘤学国家重点实验室广东广州５１００６０； ９． 肿瘤医学省部共建协同创新中心，广东广州５１００６０）摘要：目的 为探讨ｍＴＯＲ信号通路在骨骼发育过程中的机制作用，建立骨骼发育相关的ＴＳＣ１转基因小鼠， 提供稳定的动物模型。方法 取８周龄健康清洁级ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ小鼠分别与肢芽干细胞特异性重组酶（Ｐｒｘ－１－Ｃ ｒｅ）小鼠、软骨细胞特异性重组酶（Ｃｏｌ２ａｌ－Ｃｒｅ）小鼠及成骨细胞特异性重组酶（Ｏｓｘ－Ｃ ｒｅ）小鼠进行杂交。将繁殖出的小鼠继续与ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ小鼠回交，并对其子代小鼠的基因型进行鉴定及ｍＴＯＲ活性检测。结果 杂交后分别获得肢芽 干细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠、软骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠和成骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠各８只。与正常组 比较，上述３种转基因小鼠ｐ－ Ｓ６均比正常组升高（Ｐ＜０．０５）。结论 本实验成功应用Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系统构建肢芽干细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠、软骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠、成骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠，均提示ｍＴＯＲ活性增高， 有明显ＴＳＣ１敲除效果，为ｍＴＯＲ信号通路研究骨与软骨发育的机制作用提供实验基础。 关键词：基因敲除小鼠；骨发育；Ｔ ＳＣ１；ｍＴＯＲ信号通路中图分类号：Ｑ７８６文献标识码：Ａ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＳＣ１ｔｒａｎｓｇ ｅｎｉｃ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｅｆｆｅｃｔ ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇ１，２，３，ＪＩＡＮＧ Ｌｉ４，ＷＡＮＧ Ｙａｎ５，ｅｔ ａｌ．（１．Ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ａｆｆ ｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；２．Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；３．Ｏｒｔｈｐａｅｄｉｃ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｇｕａｎｇ ｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；４．Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｊｉ Ｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ；５．Ｃｈｉｎａ－Ｊａｐａｎ Ｕｎｉｏｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００３３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊ ｅｃｔｉｖｅ Ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｓ ａｉｍｅｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ＴＳＣ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ａｂｏｕｔ ｂｏｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄ ｔｏ ｐｒｏ－ｖｉｄｅ ａ ｓｔａｂｌｅ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｍＴＯＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｂｏｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８－ｗｅｅｋ－ｏｌｄ ｈｅａｌｔｈｙ ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ ｍｉｃｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ ｗｉｔｈ ｌｉｍｂ ｂｕｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ（Ｐｒｘ－１－Ｃｒｅ）ｃｈｏｎｄｒｏ－ｃｙ ｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ（Ｃｏｌ２ａｌ－Ｃｒｅ）ｍｉｃｅ ａｎｄ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ（Ｏｓｘ－Ｃｒｅ）ｍｉｃｅ．Ｔｈｅｂｒｅｅｄｉｎｇ ｍｉｃｅ ａｒｅ ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ ｔｏ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ ｗｉｔｈ ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ ｍｉｃｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｍＴＯＲ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｏｆｆ－ｓｐｒｉｎｇ ｍｉｃｅ ｉｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｆｔｅｒ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｗｅ ｏｂｔａｉｎ ８ｌｉｍｂ ｂｕｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ．Ａｎｄ ｐ －Ｓ６ｏｆ ｔｈｏｓｅ ３ｔｒａｎｓ－ｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｌｉｍｂ ｂｕｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｐ ｅｃｉｆｉｃ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ａｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｂｙ Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅｙ ｓｈｏｗ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈ ｍＴＯＲ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ ｈａｖｅ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｅｆｆｅｃｔ，ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙ ａｂｏｕｔ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｂｏｎｅ ａｎｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｙ ｍＴＯＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ；ｂｏｎｅ ａｎｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；ＴＳＣ１；ｍＴＯＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ（Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉａｇ ｎ，２０１９，２３：１２３９） 结节性硬化复合物１（Ｔｕｂｅｒｏｕｓ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｃｏｍ－ｐ ｌｅｘ１，ＴＳＣ１），是人类的一种抑癌基因，与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐ ａｍ－ｙｃｉｎ，ｍＴＯＲ）有着密切的联系。目前研究发现，ｍＴＯＲ能整合细胞内外各种信号，是机体与细胞感受营养的信号通路［１］。ＴＳＣ１位于ｍＴＯＲ信号通路的上游，对ｍＴＯＲ有一定抑制作用。既往研究主要集中ｍＴＯＲ信号通路对心脑疾病及肿瘤发病机制的探讨，而近期实验发现ｍＴＯＲ信号通路在骨骼— ９３２１—中国实验诊断学 ２０１９年７月 第２３卷 第７期