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高效液相色谱-串联质谱法测定减肥保健食品中酚酞
马微1,2，陈冬东3，王海波1，付丽4，代汉慧3，王秀君3，唐英章3
1.东宁出入境检验检疫局 (东宁 157200)；
2.中国农业大学 (北京 100083)；
3.中国检验检疫科学研究院 (北京 100123)；
4.郑州
牧业工程高等学校 (郑州 450011)
摘要建立测定减肥保健食品中非法添加药物酚酞的高效液相色谱-串联质谱分析方法。该方法对不同类型的减肥保健食品经超声波提取15 min，以Waters Atlantis T3柱(150 mm×2.1 mm, 3 μm)分离后，进行HPLC/MS/MS多反应监测模式下的定性及定量分析。酚酞在(0.5~100) μg/L的范围内相关系数为0.999 4。回收率71.3%~92.6%；日内精密度均小于8%，日间精密度均小于10%。在检测的20种样品中，检出含有酚酞的样品9个，检出率为45%。该方法分析速度快，灵敏度高，重现性好，可用于不同减肥保健食品中非法添加酚酞的快速检测。
关键词高效液相色谱-串联质谱；酚酞；质谱裂解途径；基质效应
Determination of Phenolphthalein Added in the Weight-loss Functional Foods by Ultrasonication-high Performance Liquid Chromatography Tandem Mass
Spectrometry
Ma Wei 1’2，Chen Dong-dong 3，Wang Hai-bo 1，Fu Li 4，Dai Han-hui 3，Wang Xiu-jun 3，
Tang Ying-zhang 3
1.Dongning Entry-Exist Inspection And Quarantine Bureau (Dongning 157200)；
2.China Agriculture University, (Beijing 100083)；
3.National Academy of inspection And Quarantine (Beijing 100123)；
4.Zhengzhou College of
Animal Husbandry Engineering (Zhengzhou 450011))
Abstract To develop a comprehensive analytical method for the determination of phenolphthalein in the weight-loss functional foods by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry . Various weight-loss functional foods were extracted under ultrasonication in 15 min. Qualitative and quantitative analysis was carried out for the 20 samples under the MRM mode after the chromatographic separation on waters atlantis T3 (150 mm ×2.1 mm, 3 μm) column. Phenolphthalein was linear in the range (0.5~100) μg/L and the linear correlation coef ? cient reached 0.999 4. The mean recoveries were 71.3%~92.6%, with the intra-day precision less than 8% and the inter-day precision less than 10%. Phenolphthalein was measured in nine out of twenty samples. The detected ratio was 45%. The method is reliable, sensitive, reproducible and adapts to the determination of phenolphthalein in different weight-loss functional foods.
Keywords high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry ；phenolphthalein ；mass spectrum fragmentation pathways ；matrix effect 基金项目: 国家科技支撑计划农业领域课题（2006BAD27B02）
酚酞（phenolphthalein）属于接触性轻泻药，口服后在肠内遇胆汁及碱性体液形成可溶性钠盐，刺激结肠黏膜促进肠蠕动，并可阻止肠液被肠壁吸收而起到缓泻作用[1]，所以常被非法添加到标榜为纯天然制剂的减肥保健食品中，使消费者服用后立即产生“少吃多排”现象，从而迅速减轻体重。但长期服用会带来严重不良反应，诱发顽固性便秘、结肠炎、流产、大出血、甚至肠癌等病[2-3]。《中华人民共和国食品安全法》第五十条明确规定：“生产经营的食品中不得添加药品”，因此亟需建立一种标准方法，对减肥保健食品质量进行监督和控制。
国内外公开报道的各种酚酞检测方法有紫外分光光度法[4]、间接碘量法[5]和高效液相色谱法[6]，针对的都是药物制剂的检测，对于减肥保健品中非法添加酚酞药物的检测有紫外分光光度法[7]、薄层色谱法[8]和高效液相色谱法[9]等，并没有进行确证分析。由于高效液相色谱与串联四级杆质谱联用，能够充分发挥串联质谱的高选择性、高灵敏度的优势，因此采用多反应监测扫描方式可提供特征的母离子及其子离子信息，为目标化合物的定性定量提供了可靠依据。本实验针对不同基质的减肥保健食品，利用超声萃取技术进行提取，建立减肥保健食品中酚酞的高效液相色
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谱-串联质谱分析方法，为减肥保健食品中非法添加酚酞的检测提供可靠的分析平台。1 材料与方法1.1 材料
ACQUITY超高效液相色谱议、Quattro micro API 三重四级杆质谱仪、Waters micromass 四极杆飞行时间高分辨质谱仪、MassLynx数据处理系统：美国 Waters公司；KQ-600B型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；MS2型漩涡振荡器：德国IKA公司。
酚酞：中国药品生物制品检定所；甲醇，HPLC 级：美国Fisher公司；其它试剂均为分析纯：北京化工厂。氮气、氩气(>99.999%)；实验用水为经Milli-Q 净化系统(0.22 μm过滤膜)过滤的去离子水。
精密称取酚酞10.0 mg，用甲醇溶解并稀释，配制成浓度为1.0 g/L的标准储备溶液，-18℃冰箱保存备用。临用时，用甲醇稀释上述标准储备溶液，配制成不同浓度的标准工作液。1.2 方法
1.2.1 色谱条件
Waters Atlantis T3柱(150 mm ×2.1 mm, 3 μm) ；流动相：甲醇(A)和10 mmol/L乙酸铵水溶液(B)，等度洗脱：(0~8) min，55% A，45% B；流速0.2 mL/min，柱温30℃；样品室温度20℃；进样量为10 μL。1.2.2 三重四极杆质谱条件
电喷雾离子源；正离子扫描；毛细管电压3.5 kV；射频透镜电压0.5 V；离子源温度120℃；去溶剂气温度350℃；去溶剂气流量600 L/h；锥孔气流量60 L/h；光电倍增器电压650 V；碰撞气体为氩气，碰撞气压(2.6 ×10-4 ) Pa，多反应监测(MRM)模式检测，质谱分析参数见表1。
表1 酚酞的质谱分析参数
试剂名电离监测离子对 /-1锥孔电压碰撞能量 1.2.3 四极杆－飞行时间高分辨质谱条件
电喷雾离子源（ESI）；采用正离子模式检测；毛细管电压3.0 kV；离子源温度100℃；去溶剂气温度350℃；去溶剂气流量600 L/h；锥孔气流量50 L/h；碰撞气体为氩气；微通道板电压1 800 V，每0.1 s采集一次谱图，质量扫描范围m/z(100~500)。1.2.4 样品处理
精密称取不同减肥保健食品试样0.5 g置于25 mL 比色管中，准确加入25.0 mL甲醇，涡旋混匀，超声提取15 min后，过0.22 μm有机微孔滤膜后上机测定。
2 结果与讨论
2.1 色谱、质谱条件的优化2.1.1 色谱条件的优化
以酚酞的标准品溶液为研究对象，采用不同比例的甲醇-水，乙腈-水等二元溶剂体系作为流动相进行实验，结果表明以不同比例的甲醇-水为流动相时酚酞的仪器响应信号较高。进一步比较研究在甲醇-水流动相体系中分别加入0.1%甲酸、5 mmol/L乙酸铵、10 mmol/L乙酸铵等的影响。结果表明：以甲醇-10 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相获得了最优的色谱分离效果和质谱信号响应，得到对称、尖锐的峰形,且基线平稳，酚酞的MRM色谱图见图1。
图1 酚酞的MRM图
2.1.2 质谱条件的优化
由于酚酞的结构上含有电负性强的O原子，因此选用ESI正离子检测模式，灵敏度较高。在做子离子选择的二级质谱时，若碰撞能量太低，则不能有效产生子离子，而碰撞能过高，则会降低离子传输效率和离子流强度。这样母离子碎裂比例太大，以至于分子离子峰的强度过低，无法在二级质谱图中表现出来。
因此碰撞能量的选择非常关键。
图3 酚酞的二级质谱图（四极杆飞行时间质谱仪）分别对酚酞的标准溶液进行三重四极杆质谱仪和四极杆－飞行时间质谱仪的二级谱图（见图2，3)进行分析，酚酞的二级质谱碎片主要有m/z225、197、141、105、77。根据欧盟2002/657/EC指令规定对于质谱确证方法必须达到4个确证点的要求，低分辨液
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相色谱－质谱联用仪检测应在确定母离子的基础上选择两个以上的子离子[10]。选择离子丰度高、基线噪音低的离子对m/z319>225，m/z319>105作为监测离子对(定性离子)，选择离子丰度最高的m/z319>225作为定量离子。
2.2 超声萃取条件的选择
本实验选用超声提取技术，并对提取条件进行优化。首先探讨料液比对提取效率的影响。分别配制10 mL/g、25 mL/g、50mL/g、75 mL/g、100 mL/g共5个料液比进行实验，结果50 mL/g的料液比例可以将样品中的酚酞药物提取完全，且又节约了提取试剂；然后通过改变不同的时间对提取效果的影响进行研究，分别超声提取5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，比较回收率。结果表明，超声15 min即可将样品中的酚酞药物提取完全，因此确定最佳提取时间为15 min。
2.3 样品稀释液的选择
本实验最初将过完滤膜的甲醇溶解液直接上样分析，结果发生了“溶剂效应”，酚酞的峰形前伸且展宽，灵敏度较低。这可能是由于酚酞对固定相的较少保留而移向主谱带之前。采用降低进样量的方式，防止由于进样量太大超过柱的样品容量而造成谱峰前伸[11]。同时，由于非法添加的酚酞量比较大，需要进一步稀释，又选用流动相（45%的乙酸铵水溶液和55%的甲醇）作为稀释液，谱峰变成钟形对称的高斯峰，且灵敏度较高。这可能是由于溶解液中甲醇的含量越高，溶解液的酸度越小，给出的质子少[12]，酚酞电离不完全而造成灵敏度降低。2.4 线性范围和检出限
精确配制一系列标准工作溶液，在选定的色谱条件和质谱条件下进行测定，得出酚酞的线性方程为Y =27.44 X ＋1 318.56，在(0.5~100) μg/L的范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.999 4。逐级稀释酚酞标准溶液，以10倍信噪比为基准，仪器的定量限（LOQ）为1.5 μg/L，以信噪比为3估算检出限(LOD)为0.5 μg/L。
2.5 方法的回收率和精密度
采用经测定不含有酚酞的减肥咖啡、减肥茶、减肥胶囊、苹果醋咀嚼片、减肥蛋白素等不同基质类型的减肥保健食品，分别进行添加回收率和精密度实验，样品添加不同浓度标准溶液，按本方法进行实验，用高效液相色谱-串联四级杆质谱进样测定。在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率(每个添加浓度平行测定6次)为71.3%~92.6%，其回收率结果见表2。在一日内的不同时间点和不同日期(5 d内)测定的日内精密度均小于8%，日间精密度均小于10%。3 样品测定
应用本方法对减肥咖啡、减肥茶、减肥胶囊、苹
果醋咀嚼片、减肥蛋白素等不同基质类型的20种减肥保健食品进行了分析测定，其中9种样品中均含酚酞表2 不同基质减肥保健品中酚酞添加回收率结果(n
=6)
加入量 /mg·kg -1
21020减肥咖啡回收率 /%
73.285.683.5RSD /%
7.8 6.67.1减肥茶回收率 /%
71.385.384.3RSD /%
7.97.6 6.1减肥胶囊回收率 /%
73.786.385.1RSD /%
6.5 5.1 3.7苹果醋咀嚼片回收率 /%84.692.6.90.7RSD /% 5.4 3.7 5.5减肥蛋白素回收率 /%
84.292.191.2RSD /%
6.8
3.6
4.1
4 结论
本试验建立了减肥咖啡、减肥茶、减肥胶囊、苹果醋咀嚼片、减肥蛋白素等不同基质类型的减肥保健食品中非法添加酚酞的准确定性和定量检测方法。该方法操作简单、快速,结果准确,可应用于减肥保健食品的实际检验工作和产品质量控制。
参考文献
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消毒产品中丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星测定?液相色谱-串联质谱法 Determination of clobetasol propionate and levofloxacin hydrochloride in disinfection product - LC-MS-MS method 1 范围 本方法规定了膏霜类消毒产品中丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星残留量液相色谱-串联质谱测定方法。 本方法适用于膏霜类消毒产品中丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星残留量的测定。 取样量为0.1g时，本方法对丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星的检出限见表1。 表1 丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星的检出限、保留时间和特征离子 中文名称英文名称 检出限 （μg/g） 保留时 间（min） 特征离子(m/z) 丙酸氯倍他索Clobetasol propionate 0.009 7.83 467.0/355.2/373.4 盐酸左氧氟沙星Levofloxacin hydrochloride 0.06 1.11 362.0/260.9/318.2 2 规范性引用文件 3 原理 试样中丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星用甲醇提取，提取液经0.45μm滤膜过滤，用C18柱分离后，用液相色谱-串联质谱仪测定，正离子扫描，离子对定性，峰面积定量。 4 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为不含有机物的纯水，纯水中干扰物的浓度需低于方法中待测物的检出限。 4.1甲醇：农药残留级。 4.2乙腈：农药残留级。 4.3甲酸：分析纯。
4.4标准品：丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星均购自中国药品生物制品检定所，纯度≥99.8%。 4.5标准溶液：准确称取丙酸氯倍他索适量，用乙腈－水（1：1）配制成100μg/mL 的标准贮备液。准确称取盐酸左氧氟沙星适量，用纯水配制成100μg/mL的标准贮备液。准确量取上述标准贮备溶液适量，用乙腈稀释配制成浓度为10.0μg/mL 的混合标准中间溶液，将标准中间溶液转移到安瓿瓶中于4 C保存。临用前，再根据需要用甲醇配制成不同浓度的标准使用溶液。 4.6甲酸溶液(0.2%，v/v)：量取2mL甲酸，用纯水定容至1000mL。 4.7 0.45μm滤膜。 5 仪器 5.1 液相色谱-串联质谱联用仪：HP1100高效液相色谱仪(Agilent) - API 4000质谱仪(Applied Biosystems) ，电喷雾离子化源(ESIMS，NI/PI模式)。 5.2 分析天平：感量0.1mg和0.001g。 5.3实验室纯水机：Barnstead纯水机。 5.4涡旋振荡器：Scientific Industries 涡旋振荡器。 5.5 具塞试管：10mL。 6 试样的制备与保存 6.1 试样的制备 取有代表性样品5g，搅拌均匀，制成实验室样品。 6.2 试样保存 制备好的试样置于室温保存。 7 测定步骤 7.1样品前处理 称取0.1g~0.2g样品(精确到0.001 g) ，置于10mL试管中，加入3.00mL甲醇溶液，涡旋振摇使样品分散后，超声振荡10min。静置，吸取上清液经滤膜（4.7）过滤后，供液相色谱-串联质谱测定。
一、开机 water 2695/micromass zq4000: 开机步骤 1. 分别打开质谱、液相色谱和计算机电源，此时质谱主机内置的CPU会通过网线与计算机主机建立通讯联系，这个时间大约需要1至2分钟。 2. 等液相色谱通过自检后，进入Idle状态，依照液相色谱操作程序，依次进行操作。（具体根据液相色谱不同型号来执行，下面以2695为例）。 a.打开脱气机 (Degasser On)。 b.湿灌注(Wet Prime)。 c.Purge Injector。 d.平衡色谱柱。 3.双击桌面上的 MassLynx 4.0图标进入质谱软件。 4.检查机械泵的油的状态（每星期），如果发现浑浊、缺油等状况，或者已经累积运行超过3000小时，请及时更换机械泵油。 5.点击质谱调谐图标（MS Tune）进入质谱调谐窗口。 6.选择菜单“Options –Pump”，这时机械泵将开始工作，同时分子涡轮泵会开始抽真空。几分钟后，ZQ就会达到真空要求，ZQ前面板右上角的状态灯“Vacuum”将变绿。 7.点击真空状态图标，检查真空规的状态，以确认真空达到要求。 8. 确认氮气气源输出已经打开，气体输出压力为90 psi。 9.设置源温度（Source Temp）到目标温度。 关机 1．点击质谱调谐图标进入调谐窗口。 2.点击Standby 让MS 进入待机状态时，这时状态灯会由绿变红，这一过程是关质谱高电压的过程。 3．停止液相色谱流速，如果还需要冲洗色谱柱，可以将液相色谱管路从质谱移开到废液瓶。4．等脱溶剂气温度（ESI）或APCI探头温度降到常温，点击气体图标关闭氮气。 5．逆时针方向拧开机械泵上的Gas Ballast 阀，运行20分钟后关闭（镇气）。 a) 对于ESI源，至少每星期做一次。 b) 对于APCI源，每天做一次。 6．再次确认机械泵的Ballast阀是否已经关闭。 7．选择Option / Vent，这时质谱开始泄真空，ZQ 前面板的状态灯“Vacuum”开始闪烁，几分钟后机械泵会停止运行，这时可以关闭质谱电源。 FINNIGEN DECA 开关机及校正流程—— 1开机前准备事项 （1）确保质谱总电源开关（白色开关）及主板电源开关（黑色开关）处于关闭状态（O）； （2）检查真空泵油液面，确保泵内油页面处于标定的上下两线之间； （3）查看离子源洁净程度，ESI源查看喷口是否有固体析出，毛细管口是否完好；APCI喷口是否有积液； （4）气体压力，打开高纯氮气钢瓶总阀，调节出口压力调至0.65MPa，打开高纯氦气钢瓶总阀,调节出口压力调至0.25Mpa; （5）检查壳气及辅助气接口连接紧固，松开液相管路与离子源的接口； （6）开启动力电源，电压稳定，正常；
液相色谱串联质谱联用仪检测技术 实验指导 （2014、2015级） 课程内容（一个实验8学时）： （1）AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用。 （2）利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7种农药的残留量。 吉林农业大学农业部参茸质检中心 2017.03
实验一AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用 一.实验目的和意义 通过学习液质联用仪的构成和使用方法，及其在定性、定量分析中的应用，培养学生使用液质联用仪进行仪器分析的能力，并培养学生严谨的科学态度、细致的工作作风、实事求是的数据报告和良好的实验习惯（准备充分、操作规范，记录简明，台面整洁、实验有序，良好的环保和公德意识）。培养培养学生的动手能力、理论联系实际的能力、统筹思维能力、创新能力、独立分析解决实际问题的能力、查阅手册资料并运用其数据资料的能力以及归纳总结的能力等。 （一）检测仪器 1、仪器名称高效液相色谱串联质谱联用仪（简称LC-MS-MS）。型号：4500 QTRAP（美国Applied Biosystems公司）。 2、仪器组成液相色谱部分：岛津LC-30A，配有在线脱气机、超高压二元泵、自动进样器；串联质谱部分：QTRAP4500，配有ESI离子源、串联四级杆/线性离子阱。 3、主要性能指标离子化方式：ESI电离质量范围：（5 ~ 1700）amu 分辨率：> 6900 质量稳定性：0.1 amu/12h 灵敏度：1pg reserpine, ESI+, MRM扫描（m/z : 609/195），信噪比S/N > 120:1 扫描速度：4000 amu/sec 质量准确度：< 0.01%（全质量数范围） 4、方法原理高效液相色谱二元泵将流动相泵人系统并混合，自动进样器将待测样品注入流动相中，随流动相进入色谱柱，由于样品不同组分在色谱柱中保留时间不同，各组分被分开，依次进入离子源。在离子源中，各组分以ESI或APCI方式电离，被加速后进入质量分析器。4500QTRAP 的质量分析器主要由Q1、Q2、Q3三组四级杆串联组成。Q1可将分子离子按质荷比（m/z）大小分开；Q2是碰撞室，可将母离子进一步破碎为碎片离子；Q3具有四级杆和线性离子阱两种功能，作为四级杆时可将分子离子或碎片离子按质荷比大小分开，作为离子阱还可富集离子从而提高检测灵敏度。各组分的不同离子在质量分析器中被破碎、分离，并按质荷比大小依次抵达监测器，经记录即得到按不同质荷比排列的离子质谱图。4500QTRAP通过串联四级杆/线性离子阱两种不同质谱技术的结合，可以在单次分析中对复杂样本中的单个成分同时进行定性和定量，也可以对多个化合物进行定量分析。整台仪器的控制、数据采集、数据处理、结果输出均由PC计算机Windows操作系统支持下的Analyst软件控制完成。
附件 面膜类化妆品中氟轻松检测方法 （高效液相色谱-串联质谱法） 1范围 本方法规定了面膜类化妆品中氟轻松的高效液相色谱-串联质谱测定方法。 本方法适用于面膜类化妆品中氟轻松的定性定量测定。 2方法提要 面膜类化妆品用饱和氯化钠溶液分散，用乙腈从分散液中提取氟轻松，用亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀提取液中大分子基质，经固相萃取小柱净化，用高效液相色谱仪分离，质谱检测器检测，采用保留时间和特征离子对丰度比定性，以待测物质相对应离子峰面积定量，以标准曲线法计算含量。 本方法的检出限为0.03 μg/g，定量限为0.05 μg/g。 3试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为纯化水。 3.1甲醇：色谱纯。 3.2乙腈：色谱纯。 3.3冰醋酸：优级纯。 3.4饱和氯化钠溶液。 3.5 10%亚铁氰化钾溶液：称取115 g亚铁氰化钾K4Fe(CN)6·3H2O固体，
用水溶解定容至1000 mL。 3.6 20%乙酸锌溶液：称取239 g乙酸锌C4H6O4Zn·2H2O固体，用水溶解定容至1000 mL。 3.7Oasis HLB固相萃取小柱或相当者：60 mg，3 mL。 3.8 标准物质：氟轻松，纯度不小于99.0%；标准物质的分子式、相对分子质量、CAS登录号、化学结构图参见附录A。 3.9 标准储备液（ρ=1g/L）：准确称取氟轻松标准物质（3.8）10mg，精确到0.01 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，于－18℃下冷冻保存。 3.10 标准工作溶液：临用时，取标准储备液（3.9）适量，用乙腈稀释成0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.80μg/mL系列浓度的标准工作溶液。 4仪器和设备 4.1 高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（ESI源）。 4.2 分析天平：感量0.0001g；0.00001g。 4.3 涡旋混合器。 4.4离心机：转速5000r/min，容量10mL；50mL。 4.5 固相萃取装置。 5分析步骤 5.1样品处理 5.1.1提取 称取样品（带有载体的面膜，去除载体后取样）0.2 g，精确至0.0001 g，置15 mL具塞离心管中，加入3 mL饱和氯化钠溶液（3.4），于涡旋混合器上混合使样品分散，准确加入2 mL乙腈，充分涡旋提取2 min，以
液相色谱-质谱联用(LC-MS) LCMS分别的含义是：L液相C色谱M质谱S分离（友情赠送：G是气相^_^） LC-MS/MS就是液相色谱质谱/质谱联用 MS/MS是质谱-质谱联用（通常我们称为串联质谱，二维质谱法，序贯质谱等） LC-MS/MS与LC-MS比较，M（质谱）分离的步骤是串联的，不是单一的。 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。 色谱法的最早应用是用于分离植物色素，其方法是这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。色谱法也由此而得名。 现在的色谱法早已不局限于色素的分离，其方法也早已得到了极大的发展，但其分离的原理仍然是一样的。我们仍然叫它色谱分析。 一、色谱分离基本原理： 由以上方法可知，在色谱法中存在两相，一相是固定不动的，我们把它叫做固定相；另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。 色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。 使用外力使含有样品的流动相（气体、液体）通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用。 由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。 二、色谱分类方法： 色谱分析法有很多种类，从不同的角度出发可以有不同的分类方法。 从两相的状态分类：
液相色谱串联质谱的 小知识
一、开机 water 2695/micromass zq4000: 开机步骤 1. 分别打开质谱、液相色谱和计算机电源，此时质谱主机内置的CPU会通过网线与计算机主机建立通讯联系，这个时间大约需要1至2分钟。 2. 等液相色谱通过自检后，进入Idle状态，依照液相色谱操作程序，依次进行操作。（具体根据液相色谱不同型号来执行，下面以2695为例）。 a.打开脱气机 (Degasser On)。 b.湿灌注(Wet Prime)。 c.Purge Injector。 d.平衡色谱柱。 3.双击桌面上的 MassLynx 4.0图标进入质谱软件。 4.检查机械泵的油的状态（每星期），如果发现浑浊、缺油等状况，或者已经累积运行超过3000小时，请及时更换机械泵油。 5.点击质谱调谐图标（MS Tune）进入质谱调谐窗口。 6.选择菜单“Options –Pump”，这时机械泵将开始工作，同时分子涡轮泵会开始抽真空。几分钟后，ZQ就会达到真空要求，ZQ前面板右上角的状态灯“Vacuum”将变绿。 7.点击真空状态图标，检查真空规的状态，以确认真空达到要求。 8. 确认氮气气源输出已经打开，气体输出压力为90 psi。 9.设置源温度（Source Temp）到目标温度。 关机 1．点击质谱调谐图标进入调谐窗口。 2.点击Standby 让MS 进入待机状态时，这时状态灯会由绿变红，这一过程是关质谱高电压的过程。 3．停止液相色谱流速，如果还需要冲洗色谱柱，可以将液相色谱管路从质谱移开到废液瓶。 4．等脱溶剂气温度（ESI）或APCI探头温度降到常温，点击气体图标关闭氮气。 5．逆时针方向拧开机械泵上的Gas Ballast 阀，运行20分钟后关闭（镇气）。 a) 对于ESI源，至少每星期做一次。 b) 对于APCI源，每天做一次。 6．再次确认机械泵的Ballast阀是否已经关闭。 7．选择Option / Vent，这时质谱开始泄真空，ZQ 前面板的状态灯“Vacuum”开始闪烁，几分钟后机械泵会停止运行，这时可以关闭质谱电源。 FINNIGEN DECA 开关机及校正流程—— 1开机前准备事项 （1）确保质谱总电源开关（白色开关）及主板电源开关（黑色开关）处于关闭状态（O）； （2）检查真空泵油液面，确保泵内油页面处于标定的上下两线之间； （3）查看离子源洁净程度，ESI源查看喷口是否有固体析出，毛细管口是否完好；APCI喷口是否有积液； （4）气体压力，打开高纯氮气钢瓶总阀，调节出口压力调至0.65MPa，打开高纯氦气钢瓶总阀,调节出口压力调至0.25Mpa;
液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）法测定癫痫患者血清中 卡马西平的浓度 谢 华ì，王 荣，贾正平?， 徐丽婷 （兰州军区兰州总医院临床药理基地，兰州 730050） 摘要目的：本文建立了液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）法测定患者血清中的卡马西平浓度的方法。方法：色谱柱：Zorbax Extend-C18柱（150×4.6 mm I.D，5μm）；流动相：甲醇-0.01mmol·L-1乙酸 胺溶液（80:20，v/v）；流速：0.3 mL·min-1。结果：卡马西平浓度在2～40 ng·mL-1范围内，峰面积与浓度线性关系良好，平均回收率为101.1%，日内精密度、日间精密度的RSD分别为3.39%和4.11%。并测定了10名患者血清中卡马西平的浓度。结论：本方法具有良好的灵敏度、准确度、精确度及专属性，结果准确，重现性好，易于操作，可用于患者血清中卡马西平浓度的测定。 关键词卡马西平；LC/MS/MS；血清 Content Determination of Carbamazepine in epileptic patient serum by Liquid Chromatographic Tandem Mass Spectrometry XIE Hua, JIA Zheng-ping*, WANG Rong, XU Li-ting (Base of Clinic Pharmacology, Lanzhou General Hospital, Lanzhou Command, Lanzhou 730050, China) ABSTRACT OBJECTIVE:An analytical method based on Liquid Chromatography with tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) detection was developed for the content determination of carbamazepine in epileptic patient serum. METHODS: The method included that the column was Zorbax Extend-C18(150×4.6 mm I.D.，5μm ); mobile phase was methanol-0.01mmol·L-1amine acetic acid (80:20，v/v) at a flow rate of 0.3 mL·min-1. RESULTS: The method was proved to be linear in the range of 2~40ng·mL-1 with a regression confficient of 0.9976. The average recovery rate was 101.1%(n=5). The RSD of average contents of intra-day and inter-day was 3.39% and 4.11% respectively. The carbamazepine concentrations of ten epileptic patient’s serums were detected. CONCLUSION: This method is accurate, precise, sensitive and specific to be used in the content determination of carbamazepine serum. KEY WORDS Carbamazepine; LC/MS/MS; Serum ?基金项目：国家科技部重大项目（2008ZXJ09014-010） ì主管药师。研究方向：临床治疗药物监测。电话：(0931)8994675; E-mial: xiehua-72@https://www.doczj.com/doc/427521620.html, ?通讯作者：教授，主任药师，博士。研究方向：临床药学。电话：(0931)8994652。
固相萃取-高效液相色谱串联质谱法 测定原料奶中5种环境雌激素残留量的研究 李雪1,2，牟光庆1，陈历俊1,2,*，姜铁民2 （1.大连工业大学食品学院，辽宁大连116034； 2.北京三元食品股份有限公司，北京100076） 摘要：建立固相萃取-高效液相色谱串联质谱法测定原料乳中环境雌激素（雌酮、雌二醇、雌三醇、己烯雌酚、双酚A）的方法。原料乳用NH2-SPE固相萃取小柱进行富集，旋转蒸发浓缩后，采用高效液相色谱串联质谱法测定。实验结果表明：各待测物在0.01 ~0.5μg/mL 范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0.9978，加标回收率为68.5%~105.6%，RSD 为2.56%~7.59%，最低检出限为0.22 ~0.56μg/L（S/N=3）。本方法操作简便，快速灵敏，适合于牛奶中痕量环境雌激素的残留分析检测。 关键词：高效液相色谱串联质谱，固相萃取，环境雌激素，原料奶，残留检测Research of the determination of 5 kinds of environmental estrogens residues in raw milk by solid phase extraction-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry LI Xue1,2,MU Guang-qing1,CHEN Li-jun1,2,*,JIANG Tie-min2 （1.College of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University , Dalian 116034,China; 2.Beijing Sanyuan Foods Co., Ltd, Beijing 100076,China） Abstract: A solid phase extraction-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for simultaneous determination of environmental estrogens including estrone,estradiol,estriol,diethylstilbestrol and bisphenol A in raw milk was established. 5 kinds of environmental estrogens were extracted from the raw milk sample by a NH2-SPE column, and concentrated with a rotary evaporator. The extract was analyzed by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometric.Results showed that:a good linear range from 0.01~0.5μg/mL with correlation coefficient of above 0.9978 was obtained.The extraction recovery were 68.5%~105.6% and the relative standard deviation were 2.56%~7.59%.The limit of detection was 0.22~0.56μg/L(S/N=3).The descri bed method was simple,sensitive and accurate. *通讯作者：陈历俊，chlj@https://www.doczj.com/doc/427521620.html,。 作者简介：李雪(1986-)，女，硕士研究生，研究方向：食品安全。 基金资助：奶牛产业技术体系北京市创新团队建设项目；国家科技部“863”计划(2011AA100903) 。
浅谈液相色谱质谱联用技术 刘谦 保定出入境检验检疫局，保定 071000 摘要：液相色谱-质谱联用技术以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，经纯化后的样品在液相色谱和质谱部分经过分离和离子化，经由检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，结合了色谱对复杂样品的高分离能力和质谱的高选择性，高灵敏度及能够提供相对分子量和结构信息的优点，在药物分析，食品检测等领域有广泛的应用。 关键词：液相色谱质谱食品检测 高效液相色谱是一种准确度高，分离范围广的快速分离方法，它对化合物的结构破坏性小，适合有机分子和生物分子的分离。质谱具有其他分析方法无可比拟的灵敏度，对于未知化合物的结构分析定性十分准确，对相应的标准样品要求也比较低。质谱可以和气相联用如GC/MS,也可以和高效液相色谱联用如HPLC/MS。由于色谱和质谱灵敏度相当，再加上分离效果很好的色谱可以作为质谱的进样系统，质谱作为色谱的鉴定仪速度快，分离好，应用广。色谱-质谱联用成为最好的用于分析微量有机混合物的仪器。 在1970年后，质谱-质谱法（mass separetion-mass spectra Characterization）迅猛发展起来。这种方法让母离子进一步裂解，从而获得裂解过程和分子结构的信息，通常我们称为串联质谱，二维质谱法，序贯质谱等。 我们知道，质谱的分析建立在物质离子化的基础上，按照荷质比分离离子，通过测量离子谱峰的强度实现分析目的。通过色谱纯化后的样品气化离子化形成的离子在电场和磁场的综合作用下，按照质量数和电荷数的比值大小依次排列成谱被记录下来。常见的质谱图的纵坐标是离子信号强度，横坐标就是离子核质比。在液相色谱质谱中通常所用的离子源有ESI 和APCI，我们常用的是ESI。ESI 是比APCI软电离程度较小的电离方式，应用范围较APCI 的大，只有少部分有机分子ESI 做不出，可以用APCI 辅助解决问题。一般用ESI 和 APCI 搭配使用比 ESI 和APCI 的应用范围更广一些。 下面说一说ESI和API源的异同点。 ESI 和APCI通常产生(M+H)+或(M-H)-等准分子离子，源参数调整简单，容易使用，仪器灵敏度高。对APCI源来说，不足就是给出的结构信息有限，样品易发生热裂解，低质量时基线噪声大。ESI通常只产生分子离子峰，可以直接测定混合物，并可以测定热不稳定的极性
第39卷2011年4月 分析化学(FEN XI H U A XU E) 研究报告Chinese Journal o f Analytical Chemistr y 第4期534~539 DOI:10.3724/SP.J.1096.2011.00534 高效液相色谱 串联质谱法分析大肠杆菌代谢组中样品提取方法的比较 梅辉 1,2 戴军 *1 刘文卫3 凌霞3 朱鹏飞3 赵志军 1 1 (江南大学食品科学与技术国家重点实验室,无锡214122) 2 (江南大学食品学院,无锡214122) 3 (无锡市疾病预防控制中心,无锡214002) 摘 要 比较了基于液相色谱和串联质谱联用技术(L C M S/M S)的E.co li 代谢组分析的5种不同样品提取方法。在对样品进行淬灭和洗涤后,分别使用冷甲醇法、热乙醇法、甲醇/氯仿法、热甲醇法和高氯酸法对样品平行提取3次,每个样品重复进样3次。结果显示,冷甲醇法所得到的相对提取率最高,且重复性好(RSD <5%)。从相对提取率、重复性等方面综合考察5种提取方法,从优到劣依次为:冷甲醇法>甲醇/氯仿法>高氯酸法>热乙醇法>热甲醇法。此外,以冷甲醇法的提取溶剂配制系列不同浓度的代谢物标样测定的结果表明,本方法的代谢物检测线性较好,线性范围较宽,提取溶剂的基体效应对代谢物的定量分析影响较小。本方法的检出限为0.05~0.36m mol/L 。 关键词 代谢组分析;液 质联用;提取方法;大肠杆菌 2010 07 20收稿;2010 10 29接受 本文系江南大学食品科学与技术国家重点实验室自由探索课题基金(No.SKLF T S 200803)资助项目*E mail:d j998lc@https://www.doczj.com/doc/427521620.html, 1 引 言 饲料工业的发展及在医药工业上应用的不断扩大使色氨酸的需求量越来越大,目前我国色氨酸主要依赖进口。采用微生物直接发酵法生产色氨酸,其合成代谢途径较长,代谢流弱,调控机制复杂,很难实现工业化。代谢组学技术已应用于微生物表型分类、突变体筛选、代谢途径及微生物代谢工程等方面,但有关色氨酸生产的代谢组学及其分析策略的研究尚未见报道。 微生物代谢组学定义为对胞内所有低分子量代谢物的定性和定量分析[1]。微生物样品前处理是对代谢物进行准确定性和定量的关键步骤,一般包括微生物培养、淬灭、洗涤和代谢产物的提取等步骤[2]。本实验所研究的E scherichia coli (E.coli )全部代谢物仅占细胞干重的3%~5%,但其化学成分的复杂性和生物活性的多样性远超过一般化学合成和组合化学体系[3]。应用现代分析技术对大部分中心代谢途径的磷酸化代谢产物以及三羧酸循环中间代谢物的提取方法已有报道[4~6],多采用气 质联用(GC MS)[7]检测目标代谢物。但气 质联用法往往需要衍生化,且高温条件下易导致热敏性化合物的变性分解。本研究对生产色氨酸的E.coli 发酵液进行淬灭、洗涤处理后,分别运用冷甲醇法、热乙醇法、甲醇/氯仿法、热甲醇法和高氯酸法提取胞内代谢物,在LC M S/M S 的多反应检测模式(M RM )对目标代谢物进行检测,由于胞内代谢物数量巨大,而在代谢流研究磷酸化糖和磷酸化有机酸、有机酸和氨基酸起到关键作用。因此分别选择以上3类物质中有代表性的8种代谢物(共计24种)作为考察对象,比较5种提取方法的提取率及重复性。结果表明,冷甲醇法的相对提取率及其重复性均优于其它方法。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 1200型高效液相色谱仪(Agilent 公司);3200Q TRA P 质谱仪(Applied Biosystems 公司),配有电喷雾离子源;3L 发酵罐(NBS);高速冷冻离心机(T erm o 公司),超低温冰箱(NBS 公司);真空冷冻干燥机(Labconco 公司);JY 2006电子分析天平(Mettler T pledo 公司);YDS 6液氮罐(乐山东亚公司)。 苹果酸、富马酸、琥珀酸、柠檬酸、草酰乙酸、2 酮戊二酸、邻氨基苯甲酸的标准品均购自BBI 公司,其它
DO I :10.3724/S P.J .1096.2010.00214 固相萃取 液相色谱串联质谱法测定城市污水中他莫昔芬和来曲唑 刘先军 1,2 张晶1 邵兵 *1,2 尹杰 1,3 1 (北京市疾病预防控制中心,北京100013) 2 (首都医科大学公共卫生与家庭医学学院,北京100058) 3 (北京大学医学部公共卫生学院,北京100191) 摘 要 他莫昔芬和来曲唑常用于治疗雌激素依赖型乳腺癌。本研究建立了城市污水中他莫昔芬和来曲唑的超高效液相色谱 串联质谱(UPLC M S /M S)联用检测方法。水样通过O asis HLB 固相萃取柱富集后串联氨基柱,先用6mL 甲醇洗脱,再用3mL 甲醇洗脱氨基柱,合并洗脱液后浓缩。使用ACQU I TY U PLC T M BE H C 18反相柱,流动相为0.1%甲酸 乙腈,在梯度条件下分离;目标分析物使用超高效液相色谱 电喷雾串联质谱进行测定。本方法对他莫昔芬和来曲唑的线性范围分别是1.0~100 g /L 和0.1~100 g /L,相关系数R 2>0 997,检出限分别为1.0和0.1ng /L,进水和出水的3个不同水平的加标平均回收率为68.8%~103 0%,相对标准偏差小于15%。本方法可用于城市污水中相关物质的分析。关键词 超高效液相 串联质谱法;他莫昔芬;来曲唑;环境污水;固相萃取 2009 06 22收稿;2009 11 18接受本文系国家自然科学基金(N os .20607004,20837003)资助项目*E m ai:l s h aob i ngch @s i na .co m 1 引 言 现有毒理学实验和野外调查研究表明,一些人工合成的化合物表现出类激素或抗激素作用 [1~5] ,其 中环境雌激素类物质如烷基酚、双酚A 、多氯联苯类等报道较多[6~8] ,而有关环境抗雌激素类物质的研 究却较少[9~13] 。他莫昔芬和来曲唑是典型的抗雌激素药物,主要用于治疗雌激素依赖型乳腺癌。据估计2005年国内他莫昔芬的年产量约为5万吨,这些药物在使用后最终会随着医疗废水、生活污水等排放进入污水处理系统。2006年,Roberts 等 [10] 在英国北部泰恩河下游污水处理厂出水中检测出他莫昔 芬,检出率为100%,最高浓度达212ng /L ;同年,Ann ick 等[11] 在瑞士Lausanne 和M o r ges 两个污水处理 厂出水中检测出1~4ng /L 他莫昔芬。有关环境水体中来曲唑的存在水平的报道很少。他莫昔芬及其光解产物能抑制网纹蚤等水生物生长分化,具有明显的慢性毒性作用[12] 。因此,研究环境水体中抗雌 激素类药物的存在水平和生态效应具有重要意义。 本研究以抗雌激素类药物他莫昔芬和来曲唑为研究对象,利用固相萃取富集净化,液相色谱 串联质谱技术分析城市生活污水中相关化合物,并应用于实际污水样品分析。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 W aters AC QU I TY TM 超高效液相色谱,M icro m ass Quattro Pre m ier XE 质谱仪(W aters 公司)。O asis HLB (500m g ,6mL)、Sep Pak C 18(500m g ,6mL)、Sep Pak NH 2(500m g ,3mL)和Sep Pak S ilica(500m g ,6mL)固相萃取(SPE )柱(W aters 公司);GF /A 玻璃纤维滤纸(W hat m an 公司)。 甲醇、乙腈(H PLC 级,D i k m a 公司),甲酸(H PLC 级,Fl u ka 公司),NH 3 H 2O 和H C l(分析纯,北京化学试剂公司)。他莫昔芬和来曲唑标准品(加拿大To r onto Research Che m icals 公司)。2.2 标准溶液的配制 准确称取他莫昔芬和来曲唑标准品各0.0100g ,分别置于10mL 棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容,混匀,配制成1.0g /L 的标准储备溶液,-18 避光保存。精密量取他莫昔芬和来曲唑储备液各 第38卷2010年2月 分析化学(FENX I HUAXU E) 研究报告Ch i nese Journa l o f A na l y tica l Che m i stry 第2期214~218
液相色谱串联质谱仪期间核查实验方法 1 目的 用于质检站（检验公司）的液相色谱串联质谱仪在两次校准期间的仪器核查，以确保设备持续符合计量要求。 2 范围 适用于质检站（检验公司）液相色谱串联质谱仪的校准核查工作。 3 程序 3.1 信噪比 根据仪器供应商推荐的条件或者附录A 设定液相色谱条件并优化质谱条件，将检测离子的m/z 设定为表1中特征离子的m/z ，经色谱柱注入相应量的利血平。观察色谱图，记录其色谱峰峰高作为Hs 。同时记录信号峰后1min~3min 时间内的基线输出信号的最大值与最小值之差，记做Hn 。根据公式（1）计算信噪比S/N ，连续测量6次，以6次测量S/N 的平均值作为信噪比的结果。 S/N = Hs/Hn （1） 式中：Hs ——提取离子（m/z ）的色谱峰峰高； Hn ——基线噪声值。 表1 信噪比测试条件 3.2 面积重复性 将检测离子的m/z 设为表2中特征离子的m/z ，经色谱柱注入相应量的利血平。观察色谱图，记录其色谱峰的峰面积。连续测量6次。根据公式（2）计算相对标准偏差（RSD ），作为面积重复性的结果。 %100x 1 1 6)x x (RSD 6 1 i 2 i ?? --= ∑= （2）
式中：x i——第i次测量的峰面积； x——6次测量的算术平均值； i——测量序号。 表2 面积重复性测量条件 3.3 性能指标 以上测量项目可根据日常检测项目情况具体安排核查项目，指标应满足表3要求。 表3 液相色谱串联色谱仪性能指标 附录A 液相色谱和质谱参数 色谱柱：C18色谱柱。 流速：0.2mL/min~0.4 mL/min。 流动相：ESI+与APCI+模式，甲醇：水=8：2（0.1%甲酸） ESI-模式，甲醇：水=8：2（0.1%甲酸+0.2%氨水）质谱调谐：首先使用仪器的质谱优化功能进行优化。可采用浓度为1.0μg/mL 的利血平溶液标准物质，以直接注入或经液相色谱进样的方式分别对质谱的毛细管电压值、锥孔电压值、碰撞能量、雾化气温度和气流大小等参数进行优化，使利血平在m/z 609的离子峰最高。 编制：批准：
应用文集 DGLC-31 在线全二维液相色谱串联质谱分析刺五加提取物成分关键词：提取物，刺五加，在线全二维，液质联用 DGLC-31 Determination of constituents in Radix Acanthopanacis Semticosi extracts by online 2D-HPLC method using LC-MS Key words：extracts, Radix Acanthopanacis Semticosi, online 2D-HPLC, LC-MS 引言 高效液相色谱技术已成为中药复杂体系研究的强有力的分析技术支撑，在中药质量控制方面占据重要的地位。当前，随着新型色谱固定相和填料技术的不断发展，为中药各类成分的分析提供多种选择。然而很多中药复方中通常涵盖强极性、中等极性和弱极性等化学成分，这种性质决定了其很难用单一的分离模式进行分离，复杂性超出了单一色谱分离系统的分离能力。在这种情况下，结合多种分离方式的多维色谱分离模式，可以增加色谱系统的分离能力，扩大分离空间，增加色谱峰容量，减少色谱峰重叠。多维液相色谱分离技术已成为液相色谱发展的一个重要方向。 刺五加是五加科五加属的一种落叶灌木，主要的药用部分是它的根及根皮，药材名又称五加参，是中药五加皮的一种。我国民间很早就将其作为药材使用，以达到扶正固本，益智安神，补肾健脾的功效。其系统的化学研究已比较深入，主要含有甾体类、香豆素类、木质素类、酚类、糖类、三萜类及有机酸、微量元素等。本文拟采用全二维液相色谱分离技术结合质谱对刺五加水提取物进行系统的物质基础分析。 测试条件 仪器：Ultimate DGP 3600系列，包括带有在线脱气单元的双三元梯度泵；柱温箱（配置一个六通阀和一个十通阀）；DAD检测器。仪器条件及连接图见表1，一维和二维分离梯度程序见图1。 表1 仪器条件及连接图 一维分析柱Hypersil GOLD PFP，5μm 4.6×150mm（P/N: 25405-154630） 二维分析柱Acclaim Polar AdvantageⅡC18，120°3μm 4.6×50mm（S/N 001160 P/N: 063189） 柱温40℃ 流动相A一维分析泵：甲醇； 二维分析泵：乙腈 流动相B0.1%甲酸 流速0.5mL/min for 一维分析泵；2.4 mL/min for 二维泵 检测UV@218，230，275nm 进样量 5 μL
·189·检验医学2019年3月第34卷第3期Laboratory Medicine，March 2019，V ol. 34，No. 3 液相色谱串联质谱临床检测方法的开发与验证 中国医师协会检验医师分会临床质谱检验医学专业委员会 摘要：液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）是近年来发展极为迅速的新技术。该技术结合了液相色谱的高分离性能和质谱的高敏感性、高特异性等优势，被广泛应用于化工、生物、医药、食品、临床医学、环境等领域。在临床检验和诊断领域，LC-MS/MS作为传统诊断技术的补充，可提供更为准确、可靠的依据，使许多疾病得到准确、快速的诊断。文章结合目前已公布的LC-MS/MS方法相关验证指南、文献及实际操作经验，系统介绍了LC-MS/MS方法开发的关键流程，并以25-羟基维生素D3 [25（OH）D3]为实例介绍方法验证的关键要素，为LC-MS/MS技术临床应用方法的建立、验证和实施提供参考。 关键词：液相色谱串联质谱；方法开发；方法验证 Consensus of method development and validation of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in clinical laboratories Clinical Mass Spectrometry Committee，Chinese Medical Doctor Association of Laboratory Medicine. Abstract：Liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） is an emerging technology which has developed rapidly in recent years. It has combined the separation properties of liquid chromatography and the high sensitivity and specificity of mass spectrometry，which is widely applied in various areas，such as chemistry，biology，pharmaceutical science，food，clinic and environmental science. Especially in the field of clinical laboratory and diagnostics，LC-MS/MS used as a complement to traditional diagnostic techniques can often provide more accurate and reliable testing results in accurate and rapid diagnosis of diseases. In this review，some internationally published LC-MS/MS method validation guidelines，related literature and practical experience were summarized，and some key processes of LC-MS/MS development were introduced. Using 25-hydroxyvitamin D3 [25（OH）D3] as an example，the key elements of method validation were reviewed，in order to provide a reference for the establishment，veri?cation and implementation of LC-MS/MS. Key words：Liquid chromatography-tandem mass spectrometry；Method development；Method validation 文章编号：1673-8640（2019）03-0189-08 中图分类号：R446.1 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2019.03.001 近年来，各种检验新理论和新技术不断涌现，极大地推动了临床检验学科的发展。液相色谱串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技术集液相色谱对复杂样本的高分离性能和质谱的高敏感性、高特异性于一体，在临床检验领域被广泛应用，如维生素D和激素检测、新生儿遗传代谢病筛查、治疗药物监测、药物中毒与药物滥用分析以及其他功能医学检测等，尤其在生物样本小分子物质的定量检测上应用越来越广泛。与传统的临床检验方法相比，LC-MS/MS技术具有敏感性高、特异性好、准确度高，且可以同时检测多个目标分析物等优点，有很好的临床应用前景；但也存在自动化程度低、仪器复杂、尚难以标准化等问题。为保障临床LC-MS/ MS技术的规范化使用，有必要在实验室建立液相色谱质谱方法时提供开发和验证的指导性意见。相信随着质谱仪敏感性的不断提高、样本前处理技术的持续改进、标准化方法和试剂的逐渐开发，LC-MS/MS技术将在临床检验领域发挥更大作用。 在采用LC-MS/MS技术开展临床检验前，必须建立相应的检测方法并对其进行验证。由于临床检测多针对生物样本（血清、血浆、全血、尿液、唾液、脑脊液、干血滤纸片、组织等），因此在方法开发过程中，需要对样本前处理方法、色谱条件和质谱条件进行开发和优化，确保建立的方法适合临床检测需求。为了保证检测结果的