柱亲和介质用于内毒素去除的研究唐守万 孔 亮 欧俊杰 邹汉法3
(中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心,大连116023)
摘 要 以琼脂糖凝胶为基质,采用不同方法活化后,键合多粘菌素B 配基,制备了3种用于内毒素去除的亲和介质。亲和介质的配基键合量及对内毒素的去除率随间隔臂长度的增加而增加。考察了盐浓度、pH 、温度及流速对亲和介质3去除内毒素的影响。结果表明,亲和介质3在NaCl 浓度为0.05~0.5mol/L,pH 为6~10,温度为25~55℃,流速为0.20~0.80mL /m in 范围内对内毒素去除效果最佳,去除率大于90%。
关键词 琼脂糖凝胶,内毒素,多粘菌素B,亲和介质,去除率
2005206214收稿;2005210217接受
本文系国家自然科学基金(No .20327002)资助1 引 言
内毒素是革兰氏阴性杆菌生长时释放或死亡时由细胞壁裂解产生的一类脂多糖类物质,极微量(ng 级)内毒素进入人体就会引起高热,腹泻,血管扩张,甚至昏厥或死亡。因此,对医药制剂、饮用水中内毒素的去除一直是一项重要的任务。去除内毒素的方法有活性炭、离子交换树脂吸附,酸、碱或氧化剂化学分解、膜过滤等,这些方法存在选择性差、样品回收率低的缺点。近年来,以组胺酸、组胺[1~5]、多粘菌素B [6,7]等为配基的亲和色谱获得了巨大成功。因为尽管不同来源的内毒素分子结构千差万别,但其L i p id A 部分都含有多个磷酸酯基,在一定条件下可呈电负性,同时L i p id A 中的胺基葡萄糖基会与某些特定的物质基团产生特异性亲和作用。本实验以琼脂糖凝胶为基质,采用不同方法活化后,键合配基多粘菌素B ,制备了3种用于内毒素去除的亲和介质。考察了间隔臂长度对配基键合量及内毒素去除的影响。同时研究了亲和介质3对内毒素去除的最佳条件。
2 实验部分
2.1 仪器和试剂
V 2550紫外2可见分光光度计(日本Jasco 公司);HZ Q 2Q 全温振荡器(哈尔滨东联电子技术开发有限公司);LC 210ADvp 泵(日本Shi m adzu 公司)。多粘菌素B 硫酸盐(P MB ,华美生物工程公司北京分公司);Sephar ose CL 24B (瑞典Phar macia 公司);甘氨酸盐酸盐(北京石鹰化工厂);二甲基亚砜(DMS O,天津市科密欧试剂开发中心);茚三酮(永嘉精细化工厂);30%H 2O 2(中外合资上海远大过氧化物有限公司);硼氢化钠(中国医药集团上海化学试剂公司);氯化亚锡(湖北省天门化学试剂厂);细菌内毒素工作标准品、细菌内毒素国家标准品(中国药品生物制品检定所);细菌内毒素检查用水(中国湛江海洋生物制品厂);鲎三肽(Boc 2Leu 2Gly 2A rg 2P NA )试剂盒(上海伊华医学科技有限公司)。其它试剂均为分析纯。
2.2 亲和介质的制备
Sephar ose CL 24B 经环氧氯丙烷活化后,直接键合多粘菌素B (P MB )或与乙二胺、己二胺反应,经戊二醛交联后键合P MB ,得到用于内毒素去除的亲和介质,反应过程如图1所示。用乙二胺代替亲和介质3制备过程中的己二胺,即得到亲和介质2。
2.3 亲和介质配基多粘菌素B 含量的测定
采用茚三酮试剂法(50mg SnCl 2和400mg 茚三酮溶于10mL DMS O 与2mL 2mol/L 乙酸钠的混合液中)测定配基P MB 的含量[8]
。键合有P MB 配基的琼脂糖在2mol/L HCl,90℃下水解4h;离心取上清液,用2mol/L Na OH 中和至pH 7。取样品100μL,加入0.5mL 茚三酮试剂和0.9mL 水,90℃孵育第34卷2006年4月 分析化学(FE NX I HUAXUE ) 研究报告Chinese Journal of Analytical Che m istry
第4期455~458
15m in 。溶液冷却至室温后,以在相同条件下活化但未键合P MB 的琼脂糖凝胶的上清液为对照测定其在570n m 处的吸收值
。
图1 亲和介质的制备过程Fig .1 Preparati on p r ocess of affinity matrices
2.4 内毒素吸附实验
考察间隔臂对亲和介质去除内毒素的影响以及盐浓度、pH 、温度对亲和介质3去除内毒素的影响时,均采用静态法。分别用0.2mol/L Na OH 含20%(V /V )乙醇、1.5mol/L Na OH 、生理盐水、无热原水淋洗亲和介质,充分解离与亲和介质结合的内毒素。准确称取亲和介质10mg,加入16Eu /mL 的内毒素溶液1mL,放入振荡器中,以130r/m in,振荡2h,离心取上清测定内毒素含量。实验中内毒素溶液均用内毒素检查用水配制。盐浓度、pH 对内毒素去除的影响实验在25℃下进行。
考察pH 对亲和介质3去除内毒素的影响时,内毒素溶解在以下几种缓冲液中:10mmol/L 乙酸钠(pH =5)、1.15mmol/L Na 2HP O 426.6mmol/L NaH 2P O 4(pH =6)、2.59mmol/L Na 2HP O 421.6mmol/L
Na 2HP O 4(pH =7)、10mmol/L 巴比妥钠(pH =8,9)、7.2mmol/L 甘氨酸2Na OH (pH =10)和4.9mmol/L 甘氨酸2Na OH (pH =11)。缓冲液中NaCl 的浓度为0.15mol/L 。
考察流速对内毒素去除的影响时,亲和介质3装入50mm ×4.6mm i .d .的色谱柱中。在1mL /m in 流速下,首先用含20%(V /V )乙醇的0.2mol/L Na OH 溶液冲洗泵系统、柱子分别1h 、0.5h;然后用含0115mol/L NaCl 的无热原水,冲洗泵系统及柱子0.5h 。细菌内毒素国家标准品溶于(30Eu /mL )含0115mol/L NaCl 的无热原水中。30mL 上述内毒素溶液在不同流速下流过亲和介质,收集滤液,测定其中的内毒素含量。
采用鲎三肽显色定量法测定样品中内毒素含量,具体步骤按鲎三肽试剂盒使用说明书进行。与内毒素接触的器具按如下操作消毒灭菌:玻璃器具洗净后,400℃干烧4h 灭菌。塑料器具用30%H 2O 2浸泡过夜后,分别用生理盐水、无热原水洗净,60℃烘干后使用。
3 结果与讨论
3.1 标准曲线的绘制
配制一定浓度的内毒素标准溶液,经鲎三肽显色后,测定溶液在545n m 处的吸收值。以吸收值y 对浓度x (Eu /mL )做标准曲线。细菌内毒素工作标准品标准曲线:y =6.61x -0.04,r =0.975,n =5,线性范围为0.03~0.5Eu /mL;细菌内毒素国家标准品标准曲线:y =3.07x -0.29,r =0.996,n =5,线性范围为0.0625~1.0Eu /mL 。
3.2 不同活化方法对亲和配基键合量的影响
由表1可知,配基P MB 的键合量随间隔臂长度的增加而增加;亲和介质1配基的键合量最小,为0131mg/g;而亲和介质2与3配基的键合量相近,分别为8.14和8.69mg/g 。这是因为:间隔臂长度的增加减小了配基与基质之间的空间位阻,增加了P MB 分子与反应活性位点的接触几率;环氧基团、醛基
654 分析化学第34卷
与氨基反应的活性相比,醛基的反应活性更高,更易于配基P MB 的键合。
3.3 间隔臂对内毒素去除的影响
亲和色谱的研究表明,配基与大分子的接触几率随间隔臂长度的增加而增加。由表1间隔臂长度对内毒素去除的影响可知,介质对内毒素的去除率随间隔臂长度的增加而增加;适当提高离子强度有利于内毒素的去除。这是因为内毒素相对分子质量一般在数万以上,适当增加间隔臂的长度,才能克服介质与内毒素分子间的空间位阻,使介质产生有效的亲和作用。P MB 与内毒素之间的作用主要是静电和疏水作用,适当提高溶液的离子强度会增强配基P MB 与内毒素分子之间的疏水作用,从而有利于内毒素的去除。
表1 间隔臂对P MB 键合量及内毒素去除率的影响
Table 1 Effect of s pacer on poly myxin B (P MB )content and endot oxin removal
亲和介质
Affinity matrix
间隔臂Spacer 间隔臂长度Chain length (nm )P MB 键合量Content of P MB (mg/g )去除率(%)Removal efficiency C NaCl (mol/L )00.151
-CH 2CH (OH )CH 2-0.460.3180.8084.302
-CH 2CH (OH )CH 2NH (CH 2)2NH (CH 2)5- 1.678.1486.3997.943-CH 2CH (OH )CH 2NH (CH 2)6NH (CH 2)5- 2.288.6989.8398.34
3.4 亲和介质3去除内毒素的最佳条件
3.4.1 NaC l 浓度对内毒素去除的影响 由表2NaCl 浓度对亲和介质3去除内毒素的影响可知,NaCl 浓度由0增加到0.05mol/L 时,内毒素的去除率由77.63%迅速增至98.34%;NaCl 浓度为0.05~0.50mol/L 时,内毒素的去除率没有明显变化,均大于95%;而当NaCl 浓度继续增至2.0和5.0mol/L 时,去除率又迅速降至77.16%和68.57%。这是因为亲和配基P MB 与内毒素之间的作用主要是疏水与静电作用,而盐浓度即离子强度的变化会反方向影响这两种作用:离子强度增大会增强亲和配基P MB 与内毒素之间的疏水作用,同时又会减小两者之间的静电作用;离子强度减小会减小亲和配基P MB 与内毒素之间的疏水作用,同时又会增大两者之间的静电作用。疏水作用与静电作用的协同作用导致了上述结果。表2 盐浓度对内毒素去除的影响
Table 2 Effect of salt concentrati on on endot oxin re moval
C NaCl (mol/L )
内毒素浓度(Eu /mL )Concentrati on of endot oxin 吸附前Bef ore 吸附后After 去除率Re moval efficiency (%)C NaCl (mol/L )内毒素浓度(Eu /mL )Concentrati on of endot oxin 吸附前Before 吸附后After 去除率Re moval efficiency (%)0
16 3.5877.630.50160.5496.600.05
160.2698.34 2.016 3.6577.160.10
160.7595.28 5.016 5.03
68.570.20160.2798.30
3.4.2 pH 对内毒素去除的影响 由图2可知:在pH 为6~10时,亲和介质对内毒素的去除率均在92%以上;而当pH 超过此范围时,内毒素去除效果明显降低,去除率小于81%。在低pH 时,内毒素分子中的磷酸酯基和羧基离子化减小。在分子内疏水作用的驱使下内毒素分子趋于更为紧凑的结构,从而减少了相互作用的位点,导致去除率的下降[9,10]
。随着溶液pH 的增大,内毒素分子的紧凑结构被分子内静电相互作用破坏,舒展的结构使内毒素分子与固载于琼脂糖上的配基产生更为有效的作用,导致
去除率的升高。研究表明[11],在高pH 下由于聚合物基质的疏水折叠产生的孔收缩会导致结合蛋白的
活性位点大量下降。在高pH 下内毒素去除率的下降可能是因为键合于基质上的疏水配基的构像发生扭曲变形所致。同时,内毒素分子的磷酸酯基和羧基与配基P MB 上胺基的离子化随着pH 的变化反方向变化,也可能是造成上述现象的原因。
3.4.3 温度对内毒素去除的影响 考察了NaCl 浓度为0.15mol/L 时温度对内毒素去除的影响。由图3可知,亲和介质对内毒素的去除率随着温度的升高而升高。这可能是因为温度升高后,内毒素分子布朗运动加快,与介质表面作用位点接触几率增多而引起的。
3.4.4 流速对内毒素去除的影响 考察了室温下流速对内毒素去除的影响。图4表明,随着流速的增
754第4期唐守万等:柱亲和介质用于内毒素去除的研究
大,亲和介质对内毒素的去除率下降。这可能是因为随着流速的增加,内毒素与亲和介质间的相互作用不够充分引起的。在流速为0.80mL /m in 时,对内毒素的去除率仍大于90%
。
3.5 结论
以琼脂糖凝胶为基质,经不同方法活化后,键合配基多粘菌素B ,制备了3种用于内毒素去除的亲和介质。配基键合量及对内毒素的去除率随间隔臂长度的增加而增加。亲和介质3在NaCl 浓度为0105~0.5mol/L,pH 为6~10,温度为25~55℃,流速在0.20~0.80mL /m in 范围内去除内毒素效果最佳,去除率大于90%。
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Prepara ti on of Aff i n ity M a tr i ces for Endotox i n Re m ova l
Tang Shou wan,Kong L iang,Ou Junjie,Zou Hanfa
3(N ational Chro m atographic Research &A nalysis Center ,D alian Institute of Che m ical Physics,
Chinese A cade m y of Sciences,D alian 116023)Abstract Three affinity matrices f or ads or p ti on of endooxin fr om aqueous s oluti on were studied by covalently bonding poly myxin B varying hydr ocarbon lengths t o Sephar ose CL 24B.The content of ligand and ads or p ti on efficiency increased with increasing length of s pacers .The effect of salt,pH,te mperature and fl ow rates on endot oxin ads or p ti on f or affinity matrix 3was investigated .It showed that in the range of NaCl concentrati on of 0.05-0.5mol/L,pH 6-10,te mperature 25-55℃and fl ow rate of 0.20-0.80mL /m in,the ads or p ti on efficiency was over 90%.
Keywords Sephar ose,endot oxin,poly myxin B ,affinity matrix,re moval efficiency
(Received 14June 2005;accep ted 17Oct ober 2005)
854 分析化学第34卷
细菌内毒素检查法 一、细菌内毒素检查法的定义: ●本法是利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝聚反应的机理,以判断供试品中的细菌内毒素限度是否符合规定的一种方法。 二、背景介绍: ●1、细菌内毒素 ●2、热原 ●3、鲎 1、细菌内毒素 ●细菌内毒素是一种革兰氏阴性细菌细胞壁的产物,当其死亡或菌体裂解时释放出的一类具有多种生物活性的毒性物质 特性: ●(1).致热性:内毒素作用人体细胞,使之释放内源性热原,刺激下丘脑体温调节中枢,引起发热反应。 ●(2).耐热性:需250度干热30分钟才能彻底灭活。 ●(3).分子极性:多糖链亲水,脂肪链疏水,在水中呈不均匀分布。 ●(4).鲎反应:能与鲎试剂发生多级酶促反应,形成凝胶。 2、热原 2.1热原是指临床上引起哺乳动物发热反应的物质 2.2 细胞分裂素(IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 ) 内源性热原{ 产生细胞分裂素的物质 内毒素热原 外源性热原{非内毒素热原(病毒、细菌、真 菌、抗体-抗原复合物、细胞分裂素) 2.3热原和内毒素的关系: 2.3.1热原是否就是内毒素? 在学术上仍有争议,热原不仅是细菌内毒素。但在药检的范畴,细菌内毒素是主要的热原物质,可以说无内毒素就无热原,控制内毒素就是控制热原。 3、鲎 3.1鲎(horseshoe crab)是一类与三叶虫(现在只有化石)一样古老的动物。鲎的祖先出现在地质历史时期古生代的泥盆纪,当时恐龙尚未崛起,原始鱼类刚刚问世,随着时间的推移,与它同时代的动物或者进化、或者灭绝,而惟独只有鲎从4 亿多年前问世至今仍保留其原始而古老的相貌,所以鲎有―活化石‖之称。又具有很高的药用价值。 3.2鲎试剂 鲎的血液中含有铜离子,它的血液是蓝色的。鲎血液颜色呈蓝色,是因为鲎血浆的主要成分是血蓝蛋白。这种蓝色血液的提取物——―鲎试剂‖。鲎试剂是由海洋生物鲎的血液提取物制成的―鲎试剂‖,能够准确、快速地检测人体是否因细菌感染而致病;鲎试剂在制药行业中,用于检测细菌内毒素。目前使用的鲎试剂分为美洲鲎试剂和东方鲎鲎试剂两大类。
2013版 苏微黄曲霉毒素M1免疫亲和柱 使用说明书 【产品用途】 免疫亲和柱可选择性吸附样品液中的黄曲霉毒 素M1, 从而对黄曲霉毒素M1样品起到特异性的纯化作用, 过柱净化后的样品液可直接用于高效液相色谱进行黄曲霉毒素M1含量的检测。 亲和柱与HPLC配合使用可达到快速测定的目的, 以改善信噪比,可提高检测方法的准确度。 【产品性能】 柱吸附能力:≥100ng/支; 回收率:75%~90%。 【测定原理】 本产品测定的基础是抗原抗体反应,黄曲霉毒素M1(AFM1)单克隆抗体连接在柱内凝胶介质上,样品中的AFM1经过提取、过滤、稀释,然后将样品提取液缓慢通过AFM1免疫亲和柱,在免疫亲和柱内,AFM1与抗体结合,洗涤液通过免疫亲和柱除去未被结合的杂质。最后采用乙腈洗脱AFM1,然后进行相关分析。 【产品组成】 标准品(选配); 20支/盒,3mL柱管/支 说明书1份; 【所需材料】(不提供) (1)设备及器皿耗材:天平、粉碎机、离心机、高速均质器(18000r/min~22000 r/min);量筒、50mL 玻璃漏斗、微量移液器(100μL~1000μL)、定量滤纸、玻璃微纤维滤纸(whatman934-AH,直径11cm,孔径1.5μm)、20mL玻璃注射器等。 (2)试剂:乙腈(色谱级)、蒸馏水或去离子水。【样品制备及净化】 ----乳:将试样在水浴中加热至35℃~37℃。用中速定性滤纸过滤(根据情况,可使用多层滤纸进行过滤),或者在7000rpm离心15min。至少收集20mL试样。----乳粉:称取10g样品(精确至0.01g),置于250mL 的烧杯中。将50mL已预热到50℃的水加入乳粉中,搅拌溶解。若乳粉不能完全溶解,将烧杯在50℃的水浴中放置至少30min,仔细混匀。将溶解的乳粉冷却至20℃,移入100ml容量瓶中,用少量的水分次淋洗烧杯,淋洗液一并移入容量瓶中,再用水定容至刻度。用中速定性滤纸过滤(根据情况,可使用多层滤纸进行过滤),或者在7000rpm离心15min。至少收集20mL试样。 ----取20mL上样检测。 * 根据需要可以增加样品量,但水溶液的量也应相应增加。 【亲和柱净化】 注意:整个纯化过程尽量不要让柱子干燥! ----取出免疫亲和柱,将上方塞子取出斜剪断,再插回亲和柱上; (3ml的免疫亲和柱去掉上方塞子,安装上转接头,将转接头另一端与针筒固定后使用) ----将柱子与气控操作架上的针筒连接固定,20mL 处理后的溶液上样; ----去掉亲和柱下方堵头,调节开关,使液体以 1d/2~3s的速度流出; ----待液体排干后,用蒸馏水或去离子水洗涤2次,每次10mL,流速1d/s; ----待液体排干后,上样3mL乙腈,用玻璃样品瓶接洗脱液,流速1d/2~3s; ----洗脱后洗脱液用氮气吹至仅含少量液体,并用流动相稀释,再用于HPLC。 * 使用前,免疫亲和柱恢复至室温(22~25℃)。* 每次上样前都要将上次液体完全排干。 * 洗脱液要用玻璃样品瓶装,且避光保存于-20℃,
注射用水细菌内毒素分析方法确认方案文件编号:YZ-VP-2020-00 方案起草日期 方案审核日期 方案批准日期 药业有限公司
目录 1. 概述 (3) 2. 确认目的 (3) 3. 适用范围 (3) 4. 确认小组成员及职责 (3) 5. 风险评估 (3) 6. 确认方案编制依据 (4) 7. 确认内容 (4) 7.1 确认人员培训 (4) 7.2 确认前准备工作 (4) 7.3 确认所需仪器 (4) 7.4 确认所需试剂 (4) 7.5 确认所需供试品 (5) 7.6 试验过程 (5) 8. 偏差处理 (6) 9. 确认结果评定与结论 (6) 10. 再验证周期 (7) 11. 确认进度安排 (7) 12. 附件 (7) 13. 变更历史 (7)
1. 概述: 依据细菌内毒素分析方法确认的试验原理,采用本公司注射用水进行细菌内毒素分析方法确认,得到其无干扰浓度。本方案中细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。 2. 确认目的: 为了确保注射用水细菌内毒素分析方法的可靠性,需在实际检验条件下,确认其对细菌内毒素检查试验有无干扰作用,以确认所采用的方法适合于注射用水的细菌内毒素检查。 3. 适用范围: 适用于注射用水细菌内毒素分析方法的确认。 4. 确认小组成员及职责: 姓名工作部门或职务职责 质量管理负责人负责方案及报告的批准 质量保证负责人负责跟踪方案的实施 质量控制负责人小组组长;负责方案的组织协调工作;负责各阶段确认结果汇总及评价;负责小组成员的培训及培训效果的评价 质量控制负责方案及报告的起草,并按照批准后的方案进行方法确认,并完成所有数据分析及试验记录 质量控制负责供试品的取样 5. 风险评估: 确认小组成员对注射用水细菌内毒素分析方法确认方案进行了风险评估分析,并制定了相应的控制措施以最大限度地降低风险。具体情况见下表: 风险识别风险分析评估S P D RPN 风险级别控制措施 分析方法验证活动的立项管理方法验证没有 按照公司验证 标准管理规程 的要求进行立 项 44464高级 对分析方法验证活 动进行立项,并开展 验证 分析方法验证方案管理分析方法验证 活动无方案, 或方案没有审 核、审批过程 34448高级 由验证小组验证方 案,并对验证方案进 行审核和批准
3.2.1原本法用于去除实验用玻璃器皿上的内毒素。将玻璃器皿置于烤箱中,加热到250℃,持续30min,即可去除内毒素。 3.2.2方法与步骤1、内毒素去除效率的评估(1)制备浓度分别为1000和1000EU/mL 的CSE溶液。按内毒素测量方法检测这些溶液。(2)向所有待去除内毒素的玻璃器皿滴入1mL的CSE溶液。(每种类型的玻璃器皿至少有3EU的CSE)。(3)将玻璃器皿置放烤箱中,在60℃下,干烤持续30min,烘干,然后在烤箱中,250℃下,干烤30min。(4)加入适量的LAL水,剧烈振荡5min,以清洗玻璃器皿,然后测量清洗后的LAL水中的内毒素的浓度。(5)比较原来的内毒素含量和现存的内毒素浓度。当内毒素含量至少减少了3—log时,该方法有效。必要时,重复操作,去除内毒素。用鲎度验法计算内毒素去除的百分比。2、去除实验玻璃器皿上的内毒素确定可使内毒素玻璃器皿上的内毒素对于用来配置无同一内毒素溶液的玻璃器皿,重复操作,直至内毒素含量下降3—log。(例如,1000 IEU和10000 10EU)数个加热循环后,用前述的鲎试验法,测定内毒素含量。3、对照阴性对照:用只盛有LAL水的玻璃器皿,在250℃下,干烤30min并用LAL法测量内毒素的含量。阳性对照:干燥(60℃,30min)每种玻璃器皿中的内毒素溶液,不经过干烤(250℃,30min)去内毒素的操作,然后测定其内毒素质量。 3.2.3质控与提示(1)保烤箱散热均匀,为此,在操作过程中,可将玻璃器皿放置在烤箱中的每一层上,当温度在250℃后,温度的波动不要超过±15℃。(2)用含100EU的内毒素过行的检测,可用来确定去内毒素的效率。用含10000EU的内毒素进行的检测,可用来确定对内毒素含量较高的器皿去除内毒素的效率。(3)如果如果不理想,可增加每一次操作的时间和操作次数。(4)其他技术适用于培养基的内毒素,例如,超滤,反向渗透,但比较昂贵。选取有效的滤过膜,确保去内毒素后,培养基的营养成分不丢失并且内毒素含量下降3—log。
百奥思科赭曲霉毒素A免疫亲和柱操作说明书 【概要】 赭曲霉毒素A (Ochratoxin A)是曲霉属和青霉属的真菌形成的次级代谢产物,属烈性的肾脏毒和肝脏毒,广泛存在于各种食物中,谷物及其副产品是赭曲霉毒素A的主要来源。动物实验表明摄入了被这种毒素污染的饲料后,会发生急性或慢性中毒症。防止污染赭曲霉毒素A的食品和饲料直接或间接地进入人类食物链,加强对赭曲霉毒素A的检测十分重要。 【适用范围及性能】 本公司真菌毒素免疫柱系列产品测试形式是一个高性能的免疫亲和柱,设计用于在进行HPLC(高效液相色谱法)、GC-MS(气相色谱-质谱联用仪)、ELISA(酶联免疫吸附剂测定)之前清理(净化)或浓缩样本。 用于定性、定量检测谷物、酒类等食品和饲料等样本中的赭曲霉毒素A时的样品前处理。 柱容量:≥200ng 回收率:≥90% 【试验原理】 本产品的测定的基础是抗原抗体反应,赭曲霉毒素A单克隆抗体连接在柱内凝胶上,样品中的赭曲霉毒素A经过提取、过滤、稀释,然后将样品提取液缓慢的通过赭曲霉毒素A 免疫亲和层析柱,在免疫亲和柱内,赭曲霉毒素A与抗体结合,之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他物质。用甲醇洗脱赭曲霉毒素A,然后注入到分析仪器中用于检测。 【包装组成】 25支/盒,3mL柱管/支 产品说明书1份 【需要而未提供的设备及试剂】 设备: ┅┅高速均质器或组织匀浆机 ┅┅粉碎机 ┅┅200ml/50ml量筒┅┅天平:感量0.1g ┅┅微量移液器:单道100μl~1000μl ┅┅槽纹滤纸(折叠快速定性或定量滤纸) ┅┅玻璃微纤维滤纸(1.5μm孔径) ┅┅50ml漏斗 ┅┅一次性玻璃试管 ┅┅泵流操作架(包括空气泵,不同容积的玻璃注射器等)试剂: ┅┅甲醇(色谱级) ┅┅蒸馏水或去离子水 ┅┅pH7.0磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲液):称取8.0g氯化钠, 1.2g磷酸氢二钠,0.2g磷酸二氢钾,0.2g氯化钾,用 990mL纯水溶解,然后用浓盐酸调节pH值至7.0,最后用纯水稀释至1000mL ┅┅清洗缓冲液:25g 氯化钠+5g碳酸氢钠+0.1mL吐温-20 用纯水稀释至1000 mL 【试剂配制】 样品提取液:配制甲醇-水(8:2)溶液作为样品提取液 【样本处理步骤】 (一)花生,玉米,大米,小麦及其制品和饲料 ┅┅称取20g粉碎的样品于100mL容量瓶中,加入5.0g氯化钠,以甲醇-水(8:2)溶液定容; ┅┅转移到均质杯中,以均质器高速搅拌,提取2分钟; ┅┅4000r/min离心5min或用定量滤纸过滤; ┅┅取10mL滤液并加入40mLPBS缓冲液稀释,用玻璃微纤维滤纸过滤,取过滤后液体待测; ┅┅将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。准确移取 10.0mL样品提取液注入玻璃注射器; ┅┅将空气压力泵与玻璃注射器连接,调节压力使溶液以约1滴/S流速缓慢通过免疫亲和柱,直至2~3mL空气通过柱体; ┅┅以10.0mL清洗缓冲液淋洗柱子1次,流速为1滴-2滴/S,弃去全部流出液, ┅┅再以10.0mL水淋洗柱子1次,流速为1滴-2滴/S,弃去全部流出液,并使2mL~3mL空气通过柱体;
答卷人部门得分 工号考试日期:年月日 本试卷得分在60分(含)以上为合格,否则为不合格。 一.选择题(每题4分,共20分) 1、细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准,用于凝胶法时,其内毒素含量小于:。( ) A、0.010EU/ml B、0.005EU/ml C、0.015EU/ml D、0.020EU/ml 2、耐热器皿常用去除可能存在的外源性内毒素。( ) A、干热灭菌法(160℃、30分钟以上) B、干热灭菌法(250℃、30分钟以上) C、干热灭菌法(170℃、30分钟以上) D、干热灭菌法(250℃、15分钟) 3、细菌内毒素的成分是。(B) A、H抗原 B、脂多糖 C、肽聚糖 D、荚膜多糖 4、供试品溶液本身为强酸、强碱,或本身具有偏酸偏碱的缓冲作用时,排出干扰的方法为:( ) A、将供试品的pH值调节至6.0~8.0 B、添加适量钙离子、镁离子 C、将供试品适当加热 D、选择适当的超滤设备进行滤除 5、细菌内毒素检查法主要依靠细菌内毒素可以活化,来检测细菌内毒素。( ) A、凝固蛋白原 B、凝固酶原 C、B因子 D、C因子 二、多选题(每题4分,共20分) 1、无菌药品附录中规定,必要时,物料的质量标准中应当包括:检查项目。( ) A、微生物限度 B、细菌内毒素 C、热原 D、培养基的外观 2、细菌内毒素的活性单位的表达方式包括:。( ) A、EU B、IU
C、IE D、L 3、细菌内毒素检查时常见的干扰因素包括:。( ) A、含有螯合剂 B、含有某些抗凝因子 C、含有葡聚糖类物质 D、含有干扰作用的小分子 4、对于存在内毒素污染的物质或器具,则可以选择下述方法去除:。( ) A、加热法 B、酸碱法 C、蒸馏法 D、吸附法 5、热原污染的途径。( ) A、注射用水 B、从原辅料中带入 C、从容器、用具、管道和装置等带入 D、制备过程中的污染 三.判断题(每空5分,共20分) 1. 平皿法操作时应先注入培养基,再加入1ml供试液。() 2. 制备的菌液若在室温下放置,应在2小时内使用,若保存在2-8℃可在24小时内使用() 3. 培基适用性检查是通过检验用培养基与对照培养基的比较,以阳性菌的生长状态或特征来评价判断检验用培养基是否符合检验要求。() 4. 微生物计数方法适用性试验时,各试验菌株的接种量不大于100cfu () 四、简答题(每题4分,共20分) 1.目前有几种细菌内毒素检测方法?简要介绍其原理和方法? 2.如何确定药品细菌内毒素的限值?
去内毒素质粒提取Protocol 内毒性也称为脂多糖或LPS,是革兰氏阴性(如大肠杆菌,E.coli)胞膜上一种成分。细菌外膜的外部脂质成分完全由内毒素分子组成。一个E.coli包含约2百万个LPS分子,每个LPS 分子又由疏水性的脂质A、复杂的多糖链以及带负电荷的磷酸基团组成。因此每个内毒素既包含疏水区域也包含了亲水和带电区域,从而赋予其与其它分子相互作用的独特性质。 图1. 内毒素结构图。 细菌在其活跃生长时表面的内毒素成分较少,而一旦其死亡则会释放大量内毒素。在质粒提取的裂解过程中,内毒素会从细菌的外膜释放到裂解液中。内毒素的存在会严重的影响质粒转染细胞的效率,此外会激活造血细胞(如B细胞、巨噬细胞等)的非特异免疫反应,造成实验的假阳性,所以转染级质粒的提取纯化必须去除内毒素。 内毒素如何测定? 历史上,内毒素测定主要是基于内毒素与鲎(一种海洋节支动物,也称马蹄型蟹)血液中的变形细胞冻融后的溶解物(鲎试剂)接触时可发生凝血反应。鲎试剂与细菌内毒素产生凝胶反应的机理是:鲎的血液及淋巴液中有一种有核的变形细胞,胞浆内有大量的致密颗粒,内含凝固酶及凝固蛋白原。当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物(鲎试剂)接触时,可激活凝固酶原,继而使可溶性的凝固蛋白原变成凝固蛋白而使鲎变形细胞冻融物呈凝胶状态。现在已经发展出更加灵敏的光度计测试方法,该方法主要基于鲎试剂以及一种人工合成的可产生颜色反应的底物。 LPS污染通常用内毒素单位(Endotoxin Units, EU)表示,通常情况下,1ng LPS对应于1到10个EU。
Protocol 常用的试剂盒选择包括Qiagen、Sigma都挺好用的。或者omega、天根等。在选择取出内毒素的质粒提取试剂盒的时候有一个小窍门,就是有的盒子上写着“Endofree”字样,这种试剂盒是专门用来提取用于细胞转染实验的质粒的。一般这种质粒提取试剂盒采用独特的硅胶膜吸附技术,高效专一地结合质粒DNA。同时采用特殊的溶液P4和过滤柱CS,可以有效的去除内毒素、蛋白等杂质。没有这个字样的试剂盒,对于常规的分子克隆实验,如,PCR,酶切,克隆等完全够用了。 如果不是特别的试验,建议采用手工方法,丁香园战友推荐以下的protocol提的质粒免疫动物没有问题,曾用于制备DNA疫苗,可进行大量的去内毒素质粒提取。 1)挑取一个新鲜菌落接种于含5ml LB及相应抗生素的试管,37℃培养8-12小时。 2)用上述新鲜培养物小提质粒鉴定后,剩余的菌液接种于含相应抗生素的400ml LB培养基中,37℃培养12-16小时。 3)用500ml离心筒收集菌液,5000rpm离心10分钟,弃上清。 4)用40ml预冷的STE重悬菌体,转移至2支30ml离心管中,6000rpm 5分钟,弃上清。 5)用3ml预冷的溶液I重悬菌体,再加入6ml新鲜配制的溶液II,轻轻颠倒混匀;再加入4.5ml预冷的溶液III,轻轻颠倒混匀。 6)4℃12000rpm离心10分钟,将上清转移至另外的30ml管中。 7)加等体积的异丙醇,颠倒混匀,置于-20℃20分钟以上。 8)4℃12000rpm离心15分钟,弃上清,70%乙醇洗涤沉淀,37℃蒸发至沉淀边缘透明。 9)加入5ml TE使DNA溶解后,加入5mol/L的LiCl溶液5ml,轻轻混匀,-20℃放置5-10分钟。 10)4℃12000rpm离心15分钟,转移上清,加入等体积的异丙醇,-20℃放置20分钟以上。 11)4℃12000rpm离心15分钟,弃上清,用70%的乙醇洗涤沉淀,倒置控干后,37℃蒸发至沉淀基本透明。 12)用2ml TE溶解沉淀,并加入50μl/管的RNase(5mg/ml),37℃消化过夜。
苏微呕吐毒素免疫亲和柱 使用说明书 【产品用途】 呕吐毒素(DON)免疫亲和柱适合于和DON酶免分析试剂盒、HPLC或液质结合使用,定量检测DON。适用于谷物、饲料等样本中的DON净化处理,提高了样品的纯度,纯化后的提取液可用不同的分析方法测定。 【产品性能】 柱吸附能力:≥1000ng/支; 回收率:75%~90%。 柱内凝胶:Protein A琼脂糖凝胶 特点:载量大,单抗定向偶联,易洗脱,回收率高。 【测定原理】 本产品测定的基础是抗原抗体反应,呕吐毒素(DON)单克隆抗体连接在柱内凝胶介质上,样品中的DON经过提取、过滤、稀释,然后将样品提取液缓慢通过DON免疫亲和柱,在免疫亲和柱内,DON与抗体结合,洗涤液通过免疫亲和柱除去未被结合的杂质。最后采用甲醇洗脱DON,然后进行相关分析。 【产品组成】 标准品(选配); 25支/盒;125μL凝胶/每支柱管 说明书1份。 【所需材料】(不提供) (1)设备及器皿耗材:天平、粉碎机、离心机、高速均质器(18000r/min~22000 r/min);量筒、50mL玻璃漏斗、微量移液器(100μL~1000μL)、定量滤纸、玻璃微纤维滤纸(直径11cm,孔径1.5μm)、20mL玻璃注射器等。 (2)试剂:甲醇(色谱级)、聚乙二醇8000(PEG)、蒸馏水或去离子水。 【样品制备及净化】 ----准确称取25.0g粉碎的样品,加入5g聚乙二醇8000,并与125mL水混合,以均质器高速搅拌提取2min或振荡提取30min, ----用快速定性滤纸过滤,并用玻璃微纤维滤纸过滤,至滤液澄清,备用。【亲和柱净化】 注意:整个纯化过程尽量不要让柱子干燥! ----将柱子上方堵头取出后斜剪断,然后再插回柱子上;----将20mL注射器连接于免疫亲和柱上部,用5~10mL pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)或者去离子水平衡柱子,以1滴/秒的速度缓慢通过免疫亲和柱,(用注射器加以正压或用真空泵施加负压,也可以使用泵流操作架配合免疫亲和柱); ----准确移取2mL上述滤液(相当于0.4g样品)注入注射器中,调节针筒压力使其以1滴/2秒的速度缓慢通过免疫亲和柱; ----用20mL 水冲洗柱子,弃去流出液,流速1滴/秒,直至2~3mL空气通过柱体,保证柱子内没有残余液体; ----准确加入1.0mL色谱级甲醇洗脱,流速1滴/2~3秒,直至2~3mL空气通过柱体,保证柱子内没有残余液体。收集全部洗脱液,可根据实际测定条件进行稀释或氮气吹干后流动相定容,再进行相关测定。 【注意事项】 (1)呕吐毒素对人体有害,应戴手套操作。凡接触到标样的玻璃器皿都要用5%次氯酸钠浸泡过夜。 (2)不要使用过有效期的免疫亲和柱。 (3)免疫亲和柱应在2~8℃保存。不要冷冻。 (4)使用前,免疫亲和柱需至少提前半小时回温至室温(25℃左右)。 (5)按以上的提取过程,样品通过柱子的实际体积等于0.4g 原物质,分析方法的检测限可以通过改变进柱的样品体积而改变。 (6)样本中DON含量高于柱容量时,需适当降低上样体积。 (7)必须保证过柱的样品提取液pH在6~8之间,可用盐酸或氢氧化钠调整。 (8)称取的样品量以及提取液的体积可根据实际情况按比例调整,建议最低不少于5g样。 【保存期】 有效期为12个月。 生产日期见包装盒。
去内毒素的方法及检查方法 注:这部分内容为内毒素的检测方法及去除方法。 热原(pyrogen)是微生物产生的内毒素,是由磷脂、脂多糖和蛋白质组成的复合物,微量即可引起恒温动物体温异常升高。其中脂多糖具有很强的热原活性。由革兰氏阴性杆菌产生的热原致热能力最强,真菌、病毒也可以产生热原。 【相关链接】热原的危害 一、热原的性质及除去热原的方法 1.高温法 热原的耐热性能良好,60℃加热1h不被分解破坏,100℃不降解,但180℃3~4h、200℃60min或250℃30~45min可使热原彻底破坏。因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等,均可采用此法破坏热原。但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。 2.吸附法 热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用,故广泛用于注射剂生产,但应注意吸附药液所造成的主药的损失。 3.超滤法 热原分子量为1×106左右,体积较小,约1~5nm,可以通过一般滤器和微孔滤膜,但采用超滤法如用 3.0~15nm超滤膜可将其除去。
4.蒸馏法 热原能溶于水但不挥发,但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中,因此制备注射用水时,原水中的热原可经蒸馏除去,但需多次蒸馏,,并加有隔沫装置,单次蒸馏往往效果不理想。 5.酸碱法 热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理,破坏热原。 6.其它 包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。 二、热原的检查方法 《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法,细菌内毒素检查采用鲎试剂法。 1.热原检查法 由于家兔对热原的反应与人基本相似,目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。 《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品,静脉注入家兔体内,在规定时间内,观察家兔体温升高的情况,以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml,试验结果接近人体真实情况,但操作繁琐费时,不能用于注射剂生产过程中的质量监控,且不适用
细菌内毒素控制及检测培训试题及答案2018.5 姓名:成绩: 一、单选题(每题4分,共20分) 1、细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准,用于凝胶法时,其内毒素含量小于:。(C) A、0.010EU/ml B、0.005EU/ml C、0.015EU/ml D、0.020EU/ml 2、耐热器皿常用去除可能存在的外源性内毒素。(B) A、干热灭菌法(160℃、30分钟以上) B、干热灭菌法(250℃、30分钟以上) C、干热灭菌法(170℃、30分钟以上) D、干热灭菌法(250℃、15分钟) 3、细菌内毒素的成分是。(B) A、H抗原 B、脂多糖 C、肽聚糖 D、荚膜多糖 4、供试品溶液本身为强酸、强碱,或本身具有偏酸偏碱的缓冲作用时,排出干扰的方法为:(A) A、将供试品的pH值调节至6.0~8.0 B、添加适量钙离子、镁离子 C、将供试品适当加热 D、选择适当的超滤设备进行滤除 5、细菌内毒素检查法主要依靠细菌内毒素可以活化,来检测细菌内毒素。(D) A、凝固蛋白原 B、凝固酶原 C、B因子 D、C因子
二、多选题(每题4分,共20分) 1、无菌药品附录中规定,必要时,物料的质量标准中应当包括:检查项目。(ABCD) A、微生物限度 B、细菌内毒素 C、热原 D、培养基的外观 2、细菌内毒素的活性单位的表达方式包括:。(AB) A、EU B、IU C、IE D、L 3、细菌内毒素检查时常见的干扰因素包括:。(AB CD) A、含有螯合剂 B、含有某些抗凝因子 C、含有葡聚糖类物质 D、含有干扰作用的小分子 4、对于存在内毒素污染的物质或器具,则可以选择下述方法去除:。(ABCD) A、加热法 B、酸碱法 C、蒸馏法 D、吸附法 5、热原污染的途径:。(ABCD) A、注射用水 B、从原辅料中带入 C、从容器、用具、管道和装置等带入 D、制备过程中的污染 三、判断题(每题 4分,共20 分)
苏微黄曲霉毒素B1免疫亲和柱 使用说明书 【产品用途】 黄曲霉毒素B1(AFB1)免疫亲和柱适合于和AFB1酶免分析试剂盒、HPLC或液质结合使用,定量检测AFB1。用该免疫亲和柱净化样品,提高了样品的纯度。纯化后的样品可用不同的分析方法测定。 【适应范围及产品性能】 用于定性、定量检测谷物、粮油、饲料等样本中AFB1时的样本前处理。 柱吸附能力:≥50ng/支,≥100ng/支(可根据要求选择相应柱容量); 回收率:75%~90%。 柱内凝胶:Protein A琼脂糖凝胶 特点:载量大,单抗定向偶联,易洗脱,回收率高。 【测定原理】 本产品测定的基础是抗原抗体反应,黄曲霉毒素B1(AFB1)单克隆抗体连接在柱内凝胶介质上,样品中的AFB1经过提取、过滤、稀释,然后将样品提取液缓慢通过AFB1免疫亲和柱,在免疫亲和柱内,AFB1与抗体结合,洗涤液通过免疫亲和柱除去未被结合的杂质。最后采用甲醇洗脱AFB1,然后进行相关分析。 【产品组成】 标准品(选配); 25支/盒;1mL柱管/支; 说明书1份; 【所需材料】(不提供) (1)设备及器皿耗材:天平、粉碎机、离心机、高速均质器(18000r/min~22000 r/min);量筒、50mL玻璃漏斗、微量移液器(100μL~1000μL)、定量滤纸、玻璃微纤维滤纸(直径11cm,孔径1.5μm)、20mL玻璃注射器等。 (2)试剂:甲醇(色谱级)、pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)、pH7.0磷酸盐缓冲液(PBS)、吐温-20、蒸馏水或去离子水。【样品制备及净化】 (1)谷物、花生及其制品 ----准确称取25.0g粉碎的样品,加入5.0g氯化钠,----与125.0mL甲醇-水溶液(7+3)混合,以均质器高速搅拌提取2min或振荡提取30min, ----用定量滤纸过滤, ----准确移取15mL滤液并加入30mL水稀释,用玻璃微纤维滤纸过滤,至滤液澄清,备用。 ----准确移取15.0mL混合液进行过亲和柱。 (2)酱油 ----准确称取50.0g样品,加入2.5g氯化钠, ----加入甲醇-水溶液(8+2)至100mL,以均质器高速搅拌提取2min或振荡提取30min, ----用定量滤纸过滤, ----准确移取10.0mL滤液并加入40.0mL水稀释,用玻璃微纤维滤纸过滤,至滤液澄清,备用。 ----将滤液调至PH为中性。 ----准确移取10.0mL混合液进行过亲和柱。 (3)醋 ----准确称取5.0g样品,加入1.0g氯化钠, ----用pH7.0的磷酸盐缓冲液稀释至25.0mL,混匀, ----用定量滤纸过滤, ----加10.0mL滤液加入10.0mL pH7.0的磷酸盐缓冲液,混匀,用玻璃微纤维滤纸过滤至滤液澄清,备用。 ----将滤液调至PH为中性。 ----准确移取10.0mL混合液进行过亲和柱。 (4)植物油脂 ----准确称取25.0g样品,加入5.0g氯化钠, ----加入甲醇-水(7+3)至125.0mL,以均质器高速搅拌提取2min或振荡提取30min, ----用定量滤纸过滤, ----准确移取15.0mL滤液加入30.0mL水稀释,用玻璃微纤维滤纸过滤,至滤液澄清,备用。 ----准确移取15.0mL混合液进行过亲和柱。 (5)草药、香料及茶叶 ----准确称取25.0g粉碎的样品,加入5.0g氯化钠, ----与125.0mL甲醇-水溶液(7+3)混合,以均质器高速搅拌提取2min或振荡提取30min, ----用定量滤纸过滤,
内毒素清除剂使用说明 货号:E1040 规格:20ml/100ml 保存:4℃半年有效,-20℃长期储存。 产品简介: 内毒素清除剂主要用于清除DNA、蛋白质或其他液体样品中的内毒素。在特定的pH值、盐浓度和温度条件下,内毒素清除剂能与DNA、重组蛋白以及液体样品中的内毒素特异性结合,经过室温高速离心后,DNA或蛋白质等保留在水相,而内毒素则被浓缩到极小体积的下层相而被清除。经过3次以上重复抽提后可将活性为5000~50000EU/ml的内毒素水平降低到5~0.5EU/ml以下,即降低1000~10000倍。 操作步骤: 提取前请将内毒素清除剂放在冰上冰浴5min,期间翻转瓶子数次使试剂均匀预冷。 1、a)已纯化的质粒DNA内毒素清除:吸取500μl DNA溶液于微型离心管,加入1/10体积3M NaAc pH5.2或1/20体积5M NaCl溶液,冰浴5min。 b)在提取质粒DNA过程中清除内毒素:以碱裂解法提取质粒为例,在加入裂解液和中和液并离心去除碎片之后,吸取含质粒DNA的上清于新离心管中,冰浴5min。 2、加入1/5体积预冷的内毒素清除剂,振荡混匀,溶液变浑浊。
3、冰浴5min,溶液应变清亮。 4、37℃水浴5min,不时振荡,溶液又变浑浊。 5、12000rpm室温离心5min,溶液应分为两相,上层水相含DNA,下层油状相含内毒素。 6、将含DNA的上层水相转移到新管,弃油状相,重复抽提三次,即重复步骤2-6三次。 7、加入 2.5体积无水乙醇,-20℃沉淀30min或过夜;12000rpm离心10min,弃上清;加入70%乙醇洗涤沉淀,12000rpm离心5min弃上清;空气干燥沉淀,加入100~200μl无内毒素的高纯水或TE溶解沉淀。 8、用内毒素检测试剂测定样品中内毒素活性,并与初始样品比较。 注意事项: 1、DNA浓度>1mg/ml时清除内毒素效率降低。由于DNA和蛋白质本身的性质,清除程序可导致10-20%的DNA丢失,所幸的是与清除内毒素的艰难相比DNA更容易提取制备。 2、所有溶液应用无内毒素的高纯水配制,所有器械材料均应不含内毒素,玻璃器皿可高温烘烤,非挥发性水溶液可高压120℃高温处理。 相关试剂: D1140无内毒素质粒小量提取试剂盒 D1150无内毒素质粒大量提取试剂盒 12100DMEM(H)
2013版 苏微黄曲霉毒素B1免疫亲和柱 使用说明书 【产品用途】 黄曲霉毒素B1(AFB1)免疫亲和柱适合于和AFB1酶免分析试剂盒、HPLC或液质结合使用,定量检测AFB1。用该免疫亲和柱净化样品,提高了样品的纯度。纯化后的样品可用不同的分析方法测定。 【适应范围及产品性能】 用于定性、定量检测谷物、粮油、饲料等样本中AFB1时的样本前处理。 柱吸附能力:≥100ng/支(可根据要求选择相应柱容量); 回收率:75%~90%。 柱内凝胶:Protein A琼脂糖凝胶 特点:载量大,单抗定向偶联,易洗脱,回收率高。 【测定原理】 本产品测定的基础是抗原抗体反应,黄曲霉毒素B1(AFB1)单克隆抗体连接在柱内凝胶介质上,样品中的AFB1经过提取、过滤、稀释,然后将样品提取液缓慢通过AFB1免疫亲和柱,在免疫亲和柱内,AFB1与抗体结合,洗涤液通过免疫亲和柱除去未被结合的杂质。最后采用甲醇洗脱AFB1,然后进行相关分析。 【产品组成】 标准品(选配)。 25支/盒,1mL柱管/支;20支/盒,3mL柱管/支。 说明书1份。 【所需材料】(不提供) (1)设备及器皿耗材:天平、粉碎机、离心机、高速均质器(18000r/min~22000 r/min);量筒、50mL玻璃漏斗、微量移液器(100μL~1000μL)、定量滤纸、玻璃微纤维滤纸(直径11cm,孔径1.5μm)、20mL玻璃注射器等。 (2)试剂:甲醇(色谱级)、pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)、pH7.0磷酸盐缓冲液(PBS)、吐温-20、蒸馏水或去离子水。【样品制备及净化】 (1)谷物、花生及其制品 ----准确称取25.0g粉碎的样品,加入5.0g氯化钠,----与125.0mL甲醇-水溶液(7+3)混合,以均质器高速搅拌提取2min或振荡提取30min, ----用定量滤纸过滤, ----准确移取15mL滤液并加入30mL水稀释,用玻璃微纤维滤纸过滤,至滤液澄清,备用。 ----准确移取15.0mL混合液进行过亲和柱。 (2)酱油 ----准确称取50.0g样品,加入2.5g氯化钠, ----加入甲醇-水溶液(8+2)至100mL,以均质器高速搅拌提取2min或振荡提取30min, ----用定量滤纸过滤, ----准确移取10.0mL滤液并加入40.0mL水稀释,用玻璃微纤维滤纸过滤,至滤液澄清,备用。 ----将滤液调至PH为中性。 ----准确移取10.0mL混合液进行过亲和柱。 (3)醋 ----准确称取5.0g样品,加入1.0g氯化钠, ----用pH7.0的磷酸盐缓冲液稀释至25.0mL,混匀, ----用定量滤纸过滤, ----加10.0mL滤液加入10.0mL pH7.0的磷酸盐缓冲液,混匀,用玻璃微纤维滤纸过滤至滤液澄清,备用。 ----将滤液调至PH为中性。 ----准确移取10.0mL混合液进行过亲和柱。 (4)植物油脂 ----准确称取25.0g样品,加入5.0g氯化钠, ----加入甲醇-水(7+3)至125.0mL,以均质器高速搅拌提取2min或振荡提取30min, ----用定量滤纸过滤, ----准确移取15.0mL滤液加入30.0mL水稀释,用玻璃微纤维滤纸过滤,至滤液澄清,备用。 ----准确移取15.0mL混合液进行过亲和柱。 (5)草药、香料及茶叶 ----准确称取25.0g粉碎的样品,加入5.0g氯化钠, ----与125.0mL甲醇-水溶液(7+3)混合,以均质器高速搅拌提取2min或振荡提取30min, ----用定量滤纸过滤,
河豚毒素(TTX)免疫亲和柱说明书 产品编号:MC01B 1、用途: 免疫亲和柱可选择性吸附样品液中的河豚毒素,从而对样品起到非常针对性的纯化作用,过柱净化后的样品液可直接用于HPLC分析。 亲和柱与HPLC配合使用可达到快速测定的目的,以改善信噪比,提高检测方法的准确度。 2、概述: 河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)是豚鱼类(俗称河豚鱼)及其它生物体内含有的一种生物碱(氨基全氢喹唑啉型化合物),是自然界中所发现的毒性最大的神经毒素之一;其毒性比剧毒的氰化钠还要高1250多倍,0.5mg 即可致人于死命。 3、原理: 测定的基础是抗原抗体反应,抗体连接在柱体内,样品经过提取、稀释,缓慢的通过河豚毒素免疫亲和柱,在免疫亲和柱内河豚毒素与抗体结合,之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。用洗脱液洗脱河豚毒素,然后注入到分析仪器中用于检测。 4、包装组成: 盒中包括各种规格的河豚毒素免疫亲和柱及1份说明书。 5、需要的材料但盒中不提供: 5.1设备 ----HPLC ----气控操作架 ----空气泵 ----天平 ----涡旋仪 ----离心机 ----25mL/50mL量筒 ----离心管 ----1mL移液器 ----刻度试管 ----针头滤器 ----注射器 ----样品瓶 ----转接头(配3mL免疫亲和柱使用) 5.2 试剂
----甲醇(样品处理用分析纯,分析用色谱纯) ----乙酸(分析纯) ----NaCl(分析纯) ----十二水合磷酸氢二钠(分析纯) ----二水合磷酸二氢钠(分析纯) ----蒸馏水或去离子水。 6、注意事项: ----使用前,免疫亲和柱需回至室温(22~25℃); ----亲和柱2~8℃储存,不得冻存; ----不要使用过了有效日期的免疫亲和柱; ----取样量:根据需要可以适当增加或减少取样量,注意提取液量要相应改变; ----柱容量:柱容量是1000ng,当样本中待检毒素的含量除以稀释倍数高于柱容量时,需要适当降低上样液体积,重新检测。 ----上机检测的溶剂与流动相保持一致可以消除溶剂效应影响; ----河豚毒素具有强烈的神经毒性,应戴手套口罩操作; ----使用过的容器及河豚毒素溶液最好用次氯酸钠溶液(5%V/V)浸泡过夜。 7、溶液配制: 7.1 1%乙酸-甲醇溶液 ----移取5mL乙酸,用甲醇溶液稀释并定容至500mL; 7.2 PBS溶液(0.05M pH7.3): ----称取十二水合磷酸氢二钠6.45g,二水合磷酸二氢钠1.0875g,氯化钠4.25g,用去离子水溶解并定容至500mL; 7.3 洗脱液(2%乙酸-甲醇) ----移取10mL乙酸,用甲醇溶液稀释并定容至500mL; 8、样品处理: ----称取2g样品,加入10mL 1%乙酸-甲醇溶液,涡旋振荡3min; ----于40℃水浴超声提取15min; ----冷却至室温后,于6000r/min离心5min; ----取上清,7mL上清液加入28mL PBS溶液进行稀释【用适量的1N 氢氧化钠溶液调整pH值至7左右】;----用玻璃微纤维滤纸过滤; ----移取10mL滤液作为上样液检测。 稀释倍数:2.5 9、操作程序: ----取出免疫亲和柱,将注射器筒的下端直接穿透亲和柱上方的塞子,完成亲和柱筒与亲和柱的连接,将其放置在气控操作架上进行固定,去掉亲和柱下方堵头,排尽柱内保存液; ----取10mL步骤8中的待上样液,注入到注射器筒中; ----调节开关,使液体以1~2滴/秒的速度流出; ----待液体排干,用10mL蒸馏水洗涤1次,流速2~3滴/秒; ----待液体排干,往柱管内加入2mL洗脱液,堵上亲和柱堵头静置2min,用试管收集洗脱液,流速1滴/秒,再加入2mL洗脱液,收集洗脱液,待液体排干后,将洗脱液于40℃下氮气吹至近干,用流动相定容至1mL;----混匀后用0.22μm滤器过滤至样品瓶进行液相检测。 * 使用前,免疫亲和柱需回至室温(22~25℃)。
抗黄曲霉毒素M1免疫亲和柱的制备 (黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江省大庆市 163319) (齐齐哈尔大学食品与生物工程学院,黑龙江省齐齐哈尔市 161006) (北京华安麦科生物技术有限公司,北京市 102200) 摘要:【目的】制备黄曲霉毒素M1污染样品的净化前处理免疫亲和柱。【方法】利用无血清培养基制备的高纯度抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体和溴化氰活化的Sepharose 4B进行偶联、装柱后通过IC-ELSIA对免疫亲和柱的性能评价确立了最佳反应条件。【结果】免疫亲和柱的有效柱容量为500ng, 经添加回收试验测定的平均回收率为92.46%,变异系数2.3%~7.2%。【结论】利用高纯度抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体和溴化氰活化的Sepharose 4B制备的免疫亲和柱可应用于乳制品等食品中黄曲霉毒素M1污染度测定的样品快速前处理。 关键词:黄曲霉毒素M1;免疫亲和柱;无血清培养基 Preparation of Immunoaffinity Column for Anti-AFM1 Sun Xing-Rong1,Pei Shi-Chun2,Liu Jia-Peng3,Wang Ying4 (1 Food Science College, HLJ August First Land Reclamation University, Daqing 163319, China) (2 Food and Biological Engineering College, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China) (3,4Beijing Huaan Magnech Bio-Tech Co., Ltd.,Beijing 102200, China) Abstract:[objective] preparation of aflatoxin M1immunoaffinity column for clean-up contaminated samples. [Method] prepared high-purity anti-aflatoxin M1monoclonal antibody with serum-free medium and coupled with CNBr Activated Sepharose 4B, the column has been evaluated through IC-ELISA and established the optimum reaction conditions. [Results] the capacity of immunoaffinity column was 500 ng , the average recovery of aflatoxin M1was 92.46 %,the variation coefficients were 2.3% ~ 7.2%. [Conclusions] the immunoaffinity columns was prepared by coupling high-purity anti-aflatoxin M1 monoclonal antibody with CNBr Activated Sepharose 4B can be applied to detect contamination samples fast, such as aflatoxin M1 in dairy products. Keywords: aflatoxin M1, immunoaffinity column, serum-free medium 黄曲霉毒素(Aflatoxin, AF)是食品中广泛存在的一种高致癌性真菌毒素,是Asperillus flavus 和Asperillus parasiticus 的二次代谢产物, 黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1, AFM1)