生物工程与下游技术知识点整理
第十三章β内酰胺类抗生素
1、（掌握青霉素的性质并分析流程，会设计提取分离纯化的流程）
青霉素的理化性质
（1）酸碱性：有一个酸性基团；解离常数pK值为 2.7；
（2）溶解度：青霉素是有机酸，易溶于醇，酸，醚，酯；氯仿是多种青霉素游离酸的很好溶剂；在水中溶解度很小，迅速丧失抗菌能力；
青霉素的金属盐易溶于水；易溶于低级醇；略溶于乙醇，丁醇，酮类，醋酸乙酯；
含有少量水分时，溶解度大大增加；不溶于乙醚，氯仿，醋酸戊酯；
青霉素的分离纯化工艺（工业钾盐生产工艺流程）课本277页
发酵液，冷到10℃下，
1/3体积中性过滤，板框压滤或鼓式过滤，
10％硫酸调pH5，加PPB溶液（十五烷基溴化吡啶，絮凝剂），板框过滤或鼓式过滤，冲水量20－30％；滤洗液；
加1/3BA（醋酸丁酯），加PPB，10％硫酸调pH2－2.5，逆流萃取；得一次丁酯萃取液；
加0.3％活性炭搅拌10min，压滤，
－10℃冷冻脱水，水分在0.9%以下，过滤得BA清液；
加温到15℃，加醋酸钾－乙醇溶液适当搅拌，结晶后静置1h以下，甩滤，得湿晶体；
湿晶体放洗涤罐，丁醇（4－6L/10亿）洗涤，乙酸乙酯（2L/10亿）顶洗，挖出粉子真空干燥；得青霉素G钾盐成品；
2、头孢菌素C
（1）头孢菌素C性质：为两性化合物，C为氨基酸，水溶性很大，稳定性差；
大孔网状吸附剂从发酵液中初步分离头C，离子交换法纯化，络盐沉淀法结晶；
（2）分离纯化工艺流程
头C发酵液，硫酸酸化，板框过滤，得头C滤液；
大孔网状吸附剂吸附，得饱和树脂；丙酮水溶液解吸，得一次头C解吸液；
阴离子树脂吸附，醋酸钠解吸；
加醋酸锌，得头C锌络盐结晶；板框过滤，得头C锌盐湿品；
气流干燥，得头C锌盐成品；
（3）头C分离纯化工艺要点
A、发酵液预处理
发酵液冷到15℃以下，硫酸酸化到pH2.5－3，放置一段时间；板框或真空鼓式过滤机过滤，并用水顶洗滤渣；收集，合并滤液，洗液，低温10℃保存；
B、大孔网状吸附剂的吸附和解吸
头C最适吸附pH2.5－3，XAD4的吸附容量为15－20g/L；
2－4倍体积去离子水洗涤，除去硫酸根等阴离子，以免干扰离子交换树脂的纯化；
15－25％乙醇，丙酮，或异丙醇水溶液来解吸。
C、离子交换树脂的纯化
采用弱碱性阴离子交换树脂，树脂用醋酸溶液处理成醋酸型，开始吸附；
去离子水洗涤树脂，1.5－2.5％醋酸钠（钾）水溶液解吸；
D、沉淀结晶
头C可与二价重金属离子铜锌钴铁铅Ni形成难溶性络盐微晶沉淀；锌盐最普遍；
头C锌盐，淡黄色微晶粉末，不溶于水及氯仿，甲醇，乙醇；
离子交换解吸液，放结晶罐中，5℃，加醋酸锌，搅拌溶解，加结晶液体积30％的乙醇或丙酮，析出头C锌盐微晶沉淀；
选择性较差，需在一定浓度下才能析出络盐结晶；只适用于纯化后的头C溶液；
E、膜分离
发酵液通过微孔滤膜MF，除去菌丝，固形物；
超滤UF（除大分子物质），除去分子量10000以上的蛋白质，多糖，深棕色色素，获得色浅的头C滤液；
反渗透膜RO浓缩（除水）
3、克拉维酸的分离纯化
（1）萃取：溶剂萃取法
发酵滤液，盐酸调pH2，3/4体积正丁醇，多级逆流萃取，5℃萃取；
1/20体积水，用20％氢氧化钠水溶液调pH7；液液离心机，水相反抽提液；
浓缩洗脱液，5℃Zerolit FFIP氯型阴离子交换树脂，0－0.35M氯化钠梯度吸脱，合并活性部分，减压浓缩；
Amberlite XAD4树脂脱盐，能吸附克拉维酸，不吸附无机盐；1％正丁醇或无盐水洗脱，混合活性部分，真空浓缩和冷冻干燥；
（2）离子交换：吸附于强碱性阴离子交换树脂上，用含盐水溶液洗脱；
发酵滤液，pH6.2，通过Zerolit FFIP氯型强碱性阴离子交换树脂，冷的1mol/L氯化钠洗脱；浓缩液，pH6，25℃的滤液，通过Amberlite XAD4树脂，用0.1mol/L氯化钠洗涤，5℃无盐水洗脱；
脱盐浓缩液，离子交换色层分离；Zerolit FFIP树脂氯型阴离子交换树脂，0－0.35M氯化钠梯度洗脱，5℃；
浓缩洗脱液，5℃Amberlite XAD4树脂脱盐，混合活性部分，浓缩和冷冻干燥。
第十四章氨基糖苷类抗生素
1、离子交换法分离纯化链霉素（强碱）的工艺
发酵液，1－2倍量水稀释，（高价离子在稀溶液中优先吸附）
草酸酸化，pH2.8-3.2，
加热70－75℃，
板框过滤或固体排出式离心分离，冷到15℃以下；
10%氢氧化钠中和pH6.7－7.2，110－Na型树脂吸附，得饱和树脂，水洗到澄清，5－6％硫酸洗脱；洗脱液；
401树脂吸附，得饱和树脂，先用无盐水挤压，再以8％硫酸单罐循环洗脱3－4次；
得二次洗脱液，1X14H型精制，330－OH型中和；
调pH4.3－5，0.2-3％炭，透光度90％以上；
小于35℃薄膜浓缩，硫酸调pH4.5，加2－3％活性炭，得酸性脱色液；
氢氧化钙调pH5.5-6，加1.5％－2％活性炭到透光度90％以上；
无菌过滤，喷雾干燥进风120－135℃，出风84－85℃；
2、卡那霉素的分离纯化工艺
（1）硫酸卡那霉素：易溶于水，不溶于乙醇(水中加乙醇沉淀)，丙酮，苯，醋酸乙酯；
（2）分离纯化工艺流程
发酵液，盐酸调pH5－5.5，加水稀释，
1X12H型强酸阳离子树脂吸附，搅拌4h，
用稀盐酸，氯化铵洗涤，无盐水洗到无氯离子；
强碱型树脂201X4脱色，2－2.8％氨水洗脱，
硫酸调pH3.2－3.4，乙醇中结晶2h，离心得粗晶；95％及50％乙醇分次洗涤，
无盐水溶解到20万u/ml，调pH7，加1－5％活性炭脱色达滤；精制液，无菌过滤，喷雾干燥，进风116℃出风88℃，得粉针剂原药；
精制液，制成水针剂；
3、庆大霉素的分离纯化工艺
（1）庆大霉素：易溶于水，不溶于乙醇，丙酮，氯仿，乙醚，苯；
（2）分离纯化工艺流程
发酵液，盐酸调pH1.5－2.5，氢氧化钠中和到pH6.8－7.2；
加水稀释；
1x2H型吸附6h；得饱和树脂；
用稀盐酸，氯化铵洗涤，无盐水洗到无氯离子，
4－5％氨水洗脱；
强碱性201x4脱色；浓缩去氨，10％硫酸调pH5，加4％活性炭，40℃脱色；成品浓缩液；无菌过滤进风115℃，出风85℃，得硫酸庆大霉素成品；
第十五章四环类抗生素
（两性物质，沉淀法）
四环类抗生素的分离纯化
沉淀法：四环类抗生素在碱性下能和钙，镁，钡，某些季铵碱形成复合物而沉淀；
一）钙镁
1 四环素：
发酵液调pH9，加氯化钙形成钙盐沉淀；将沉淀以草酸溶解，析出草酸钙；过滤，滤液调pH4.6－4.8；析出四环素粗碱；
粗碱溶于草酸水，活性炭脱色；调pH4，得四环素碱成品；
2金霉素：
发酵液加碳酸钙，氯化镁，调pH7.8形成沉淀；
沉淀用草酸－盐酸调pH1.6－1.7溶解；
加黄血盐（除铁离子），硫酸锌去蛋白；过滤，加4－6％盐酸，升温40℃，金霉素盐酸盐析出；
3土霉素
加0.5-1％溴代十六烷吡啶（季铵碱），调pH9.6-10；沉淀析出；
沉淀用水洗涤，溶于4份体积5％草酸和1份体积浓盐酸；得到的溶液pH1－1.2；活性炭脱色；调pH4－4.5；析出土霉素碱粗品；
第十六章大环内酯类抗生素
（弱碱，萃取）
1、性质：无色碱性化合物，微溶于水，在水中溶解度随温度升高降低；易溶于醇酮酯（醋
酸乙酯，醋酸丁酯），氯仿；易溶于酸性水溶液且成盐，盐易溶于水
2、红霉素分离纯化工艺（溶剂萃取法）
（1）单纯溶剂萃取法提取红霉素
发酵液预处理：加甲醛，硫酸锌，氢氧化钠调pH7.8－8.2；过滤，滤洗液；
萃取：BA（醋酸丁酯）二级逆流萃取，一级pH10－10.2，二级pH10.4-10.6；一次BA萃取液；
反萃取：醋酸缓冲液作二级逆流萃取，一级pH5，二级pH4.6；醋酸缓冲液；
萃取：BA作二级萃取；二次BA萃取液；
结晶：加10％丙酮，－5℃静置24－36h；离心，蒸馏水洗涤，得湿晶体；
干燥：制颗粒干燥20h，70－80℃真空干燥；得红霉素碱成品；
（2）溶剂萃取法结合中间盐沉淀的工艺流程
发酵液预处理：
提取：BA二次逆流萃取，BA萃取液；
中间盐沉淀：缓缓加入计量的乳酸，加完后继续搅拌30min；得红霉素乳酸盐湿晶体；BA洗涤，55℃干燥；干晶体；搅拌下加入计量的水－丙酮液溶解，pH6左右；氨水或碳酸氢钠调pH10，搅拌30min，55℃，得红霉素湿晶体；甩滤，水洗到pH7－8，55℃烘干，得红霉素碱成品；
（3）大孔树脂吸附法的工艺流程
发酵液，0.1%甲醛，3％硫酸锌，氢氧化钠调pH7.8－8.2；过滤；
树脂吸附：CAD40树脂吸附，流速1/25v/v.min；
树脂洗涤：饱和树脂，40℃水洗涤；
树脂解吸：氨水pH10，丁酯用2％氨水混合，流速1/130v/v.min；丁酯萃取液；
反萃取：pH4.7－5.2，醋酸缓冲液；
BA萃取：碱化pH9.8－10，38－40℃；
结晶：加10％丙醇，－5℃静置24h离心过滤洗涤；
干燥：湿晶体，制颗粒，70－80℃干燥；得红霉素碱成品；
3、麦迪霉素分离纯化工艺
发酵液，草酸酸化pH2.5-3；滤洗液；
氢氧化钠调pH8.5-9，BA提取二次；得一次BA萃取液；
盐酸调pH2-2.5，一次酸水提取液；
氢氧化钠调pH8.5-9，BA提取2次；
盐酸调pH2-3.5，蒸馏水提取；
去残溶剂：减压空气搅拌；
结晶：5%氢氧化钠调pH8.5-9，40℃搅拌20min；
洗涤，干燥：热pH8.5无盐水洗涤，60-70℃真空干燥，得成品；
4、螺旋霉素分离纯化工艺
发酵液，加硫酸铝，搅拌20min，过滤，得滤液；
加15-20％BA，氢氧化钠调pH9，得BA萃取液；
洗涤：无盐水洗涤BA；
5-10％磷酸缓冲液，补加6M盐酸调pH2-2.5；得磷酸缓冲液；
除残余BA后过滤；
结晶：10M氢氧化钠调pH9，升温到60℃，保温20min；得湿晶体；
分离去母液；
干燥：70-80℃真空干燥；得螺旋霉素成品；
第十七章氨基酸类药物的分离纯化
1、氨基酸的理化性质
（1）物理性质
无色晶体，具特殊晶型；易溶于酸碱溶液；
在水中溶解度差异大，精氨酸，组氨酸，赖氨酸（都是碱性氨基酸）溶解度最大；胱氨酸，酪氨酸溶解度最小；不溶于有机溶剂，但脯氨酸溶于乙醇；
（2）两性解离及等电点PI（可用等电点沉淀法）
带电情况取决于溶液的pH；
pH＞PI时，氨基酸带负电；
pH＜PI时，氨基酸带正电；
pH＝PI时，溶解度最低，易于沉淀；
不同氨基酸PI各异；同一pH下各种氨基酸所带电荷的质和量不一致，可应用离子交换法或电泳法分离；
2、氨基酸分离纯化实例（给出条件会设计）
胱氨酸
（1）特性：六角形片状白色结晶，或结品性粉末，无味，pI4.6；难溶于水，不溶于乙醇，乙醚，及其他有机溶剂；易溶于酸碱溶液中，热碱液中易分解；
（2）提取和纯化：毛发酸水解，等电点沉淀，盐酸溶解，活性炭脱色，除酪氨酸，结晶；水解：
人发或猪毛，洗净，2倍量10M盐酸，预热70－80℃，间歇搅拌，1－1.5h内升温到110℃，6.5－7h；过滤，得滤液；
中和：
用30－40％的氢氧化钠中和到pH4.8，继续搅拌15min，复测pH，放置36h，过滤得胱氨酸粗品；滤液可分离精氨酸，亮氨酸，谷氨酸
初步纯化：
取胱氨酸粗品，加10M盐酸，加热到65－70℃，搅拌溶解30min，加2％活性炭，升温到85－90℃，保温30min，过滤，滤液加热到80－85℃，搅拌，用30－40％氢氧化钠中和到pH4.8，静置，结晶析出，趁热过滤得沉淀，离心甩干；滤液回收酪氨酸；
纯化：
取胱氨酸沉淀，加1M盐酸，加热到70℃溶解，加活性炭，升温到85℃，搅拌30min脱色，过滤，得无色透明澄清滤液；加15倍蒸馏水，加热到75－80℃，搅拌下用12％氨水中和到pH3.5－4；胱氨酸结晶析出；过滤得胱氨酸结晶；蒸馏水洗到无氯离子，真空干燥；
异亮氨酸
（1）特性：无臭，味微苦；pI6.02；几乎不溶于乙醇或乙醚；乙醇中形成菱形叶片状或片状结晶；溶于热乙醇，25℃在水中溶解度4.17，7.5℃为6.08；
（2）制备，分离，纯化
菌种培养与发酵：菌种AS1.998；
种子培养基：葡萄糖，尿素，玉米浆，豆饼水解液，pH6.5；1000ml三角瓶装200ml；30℃摇床培养16h；
二级种子：另加菜籽油；接种量3.5％，培养8h；
发酵培养基：硫酸铵，豆饼水解液，玉米浆，淀粉水解糖，碳酸钙，pH7.2；30－32℃，通气发酵60h，25－50h间不断补加尿素，氨水；
预处理：发酵液100℃10min，冷却过滤，滤液加硫酸和草酸调pH3.5，过滤除沉淀；
离子交换分离：滤液以 1.5％树脂量的流速经007X1（732）阳离子交换树脂H型（40X100cm），100L去离子水洗涤，氨水（60℃，0.5M氨水）以3L/min流速洗脱，
分步收集；合并pH3－12的洗脱液，70－80℃减压蒸馏浓缩到黏稠状，加去离子水，浓缩，重复三次，以除去氨；
脱色，浓缩，结晶：浓缩液加去离子水到原体积的1/4，搅拌均匀，2M盐酸调pH3.5，加1％活性炭，70℃搅拌1h，过滤，滤液减压浓缩；2M氨水调pH6，5℃过夜，滤取沉淀，105℃烘干得异亮氨酸粗品；
精制：取异亮氨酸粗品，加浓盐酸，去离子水，加热到80℃，搅拌溶解，加氯化钠到饱和，用氢氧化钠调pH10.5，过滤，滤液用盐酸调pH6，5℃过夜，滤取沉淀；沉淀用去离子水加热80℃溶解，加氯化钠和1％活性炭，70℃搅拌1h，过滤，滤液减压浓缩；氨水调pH6，5℃结晶过夜；滤取结晶，105℃烘干得异亮氨酸粗品；
天冬氨酸（酸性氨基酸）
（1）特性：白色菱形叶片状结晶，pI2.97；溶于水及盐酸，25℃水中溶解度0.8，75℃水中为2.88；不溶于乙醇，乙醚；
（2）制备，分离，纯化
天冬氨酸酶的制备：大肠杆菌AS1.881，斜面：肉汁培养基；摇瓶：玉米浆，延胡索酸，硫酸镁，氨水调pH6；37℃振荡培养24h；逐级扩大培养；发酵液用1M盐酸调pH5，45℃1h，冷却到室温，离心收集菌体（含天冬氨酸酶）；
细胞固定：湿菌体，悬浮于生理盐水，40℃保温，加明胶溶液（40℃，12％），戊二醛溶液，充分搅拌均匀，5℃过夜，切成3－5mm的立方小块，浸于戊二醛溶液中过夜；蒸馏水充分洗涤，滤干得含天冬氨酸酶的固定化细胞；装于填充床式反应器，制成生物反应堆，备用；
转化反应：延胡索酸铵底物液37℃，按一定流速流过生物反应堆，收集转化液；
分离，纯化：过滤，滤液用1M盐酸调pH2.8，5℃结晶过夜；滤取结晶，少量冷水洗涤，抽干，105℃干燥得天冬氨酸粗品；粗品用稀氨水溶解成15％溶液，加1％活性炭，70℃搅拌脱色1h，过滤，滤液用1M盐酸调pH2.8，5℃结晶过夜，滤取结晶，少量冷水洗涤，抽干，85℃真空干燥得天冬氨酸精品；
谷氨酸分离纯化
利用谷氨酸与锌作用,在pH6.3条件下生成难溶于水的谷氨酸锌盐沉淀,达到从谷氨酸发酵液中分离谷氨酸的目的。然后,于酸性条件下溶解谷氨酸锌盐,再调至谷氨酸等电点,析出谷氨酸。
谷氨酸钙(19238-49-4)的制备方法：由发酵法所得的谷氨酸，与氢氧化钙或碳酸钙中和后脱色、结晶精制而成。
赖氨酸的提取
（1）发酵液除菌体及滤液酸化
发酵液中加入絮凝剂絮凝后过滤除菌体，也可用高速离心液固分离设备直接分离出菌体，回收的菌体可进一步加工利用，澄清的滤液用盐酸调节PH4.0后待用。
（2）离子交换提取
赖氨酸的离子交换提取一般用铵型732＃树脂
离交结束后，要用水洗柱，以除去可溶性和非可溶性杂质，提高赖氨酸质量，水洗后，用2-3mol/L浓度的氨水洗脱，洗脱高峰赖氨酸含量可达6-8%，如用高浓度氨水（15-20%）洗脱，洗脱高峰赖氨酸浓度可达15-16%
第十八章蛋白质的分离纯化（重要）
（两性解离）
1、蛋白质的提取：
蛋白质在不同溶剂中的溶解度，取决于蛋白质分子中非极性疏水基团和极性亲水基团的比例，以及这些基团在蛋白质中相对空间位置；
水溶液提取：蛋白质提取中最常用的溶剂；
盐浓度：低浓度盐溶液和缓冲液可提高蛋白质在溶液中的稳定性及溶解度；等渗盐溶液，
如0.02-0.05M磷酸盐缓冲液或0.15M氯化钠溶液；如果是胞外蛋白质，等渗溶液可减少胞内蛋白质的释放；有些蛋白质在低浓度盐溶液中溶解度低，提高盐浓度，如脱氧核糖核蛋白，1M以上的氯化钠提取；有些蛋白质在盐溶液中溶解度低，用水提取；
2、包涵体制备：
菌体细胞破碎：如超声波法；包涵体的洗涤和收集：含不同添加剂的磷酸盐缓冲液，离心收集沉淀；
（1）包涵体溶解前处理：用温和表面活性剂如TritonX100或低浓度弱变性剂如尿素处理，除去脂质和部分膜蛋白，浓度以不溶解包涵体中表达产物为原则；
（2）包涵体溶解，表达产物变性
包涵体溶解：
盐酸胍，尿素：破坏离子间相互作用，解除维系蛋白质稳定性的非共价键，引起蛋白质的去折叠和变性，但不破坏共价键；
SDS：破坏蛋白质肽键间的疏水相互作用；
先进行预实验：测定包涵体中表达产物开始溶解和完全溶解所需试剂浓度及作用时间；一般能使表达产物溶解的盐酸胍浓度为5－8M，尿素为6－8M，SDS为1－2％；
（3）重组蛋白的复性：溶液稀释，使变性剂浓度变低，促使蛋白质复性；通过透析，超滤，电渗析除去变性剂；
3、重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子分离纯化（重要）（pI5.4）
分离和纯化，以包涵体的形式表达；
（1）收集菌体细胞：发酵后的工程菌，7000rpm30min，50mM Tris盐酸缓冲液反复洗涤，离心三次，去上清；
（2）细胞破碎，包涵体收集：菌体细胞，加4倍体积20mM磷酸盐缓冲液（含5mM EDTA），冷浴搅匀，超声破碎器中破菌，每次30s，间隔30s，反复破碎直到革兰氏镜检无完整的菌体；5000g离心30min，去上清，沉淀含包涵体
（3）包涵体的洗涤：沉淀加9倍体积20mM磷酸盐缓冲液（含0.5% TritonX100），5000g 离心30min，沉淀加9倍体积20mM磷酸盐缓冲液（含0.5M脲）同法离心，沉淀加入6倍体积20mM磷酸盐缓冲液（含5mMEDTA），10000g离心30min，收集沉淀；
（4）包涵体的变性与复性：沉淀加8M脲，振摇12h，40000g30min；逐步稀释法将脲浓度稀释到0.1M，复性24h，17000g30min，上清液为复性粗产品；
（5）色谱纯化：
1）疏水色谱
Phenyl－Sepharose6FF色谱柱用50mM磷酸－7％硫酸铵（pH6.9）平衡；复性粗产品加硫酸铵使浓度达7％，上样，用50mM磷酸－7％硫酸铵（pH6.9），20mM磷酸盐缓冲液（pH7），30％异丙醇依次洗脱，280nm紫外检测，收集洗脱峰，电泳检定；
2）离子交换色谱
装DEAE－SepharoseFF色谱柱，20mM磷酸盐缓冲液（pH6.5），20mM磷酸盐－0.15M 氯化钠（pH6.5），20mM磷酸盐－1M氯化钠（pH6.4）分别洗脱，收集洗脱峰，电泳检定；3）凝胶色谱
装SephacrylS200色谱柱，20mM磷酸盐－0.15M氯化钠（pH6.5）平衡，上样后以相同缓冲液洗脱，收集吸收峰，产品经0.2um滤膜过滤；HPLC检测为单一峰，纯度99％；SDS －PAGE显示为一条带；
4、重组胸腺素α1（pI4.2）
分离纯化
（1）菌体的收集与裂解：离心收集菌体，盐酸胍（7M，pH7.5）4℃搅拌裂解3h，离
心收集上清；
（2）透析除盐酸胍：上清液用生理盐水2000ml透析24h，中间换一次生理盐水；
离心收集上清，用磷酸盐缓冲液（10mM，pH5.5）2000ml透析24h，中间换一次PB；离心收集上清；
（3）融合蛋白的纯化：SP－SepharoseFF阳离子柱用PB（10mM，pH5.5）平衡，上样时收集穿过峰液；DEAE－SepharoseFF阴离子柱用上述缓冲液平衡，上样后用0－0.5M氯化钠的PB梯度洗脱，收集主峰，用水透析除盐，测蛋白浓度，冷冻干燥得融合蛋白；
（4）融合蛋白的裂解：按蛋白质：CNBr为1：3的比例，加入到70％的甲酸溶液中混匀，避光室温裂解24h，加10倍体积纯水灭活CNBr，橱内充分排风30min，冷冻干燥；
（5）单体的纯化：SP－SepharoseFF阳离子柱用醋酸钠－醋酸缓冲液（10mM，pH5）平衡，冻干样品加缓冲液溶解，4℃搅拌过夜，离心上清过SP－SepharoseFF阳离子柱；收集穿过峰液，冷冻干燥；用Tris－盐酸缓冲液（50mM，pH8）溶解后上Q－SepharoseFF阴离子柱，用0－0.5M氯化钠溶液梯度洗脱，收集主峰，测定蛋白浓度；HPLC法检定产品纯度98％以上；
5、人神经细胞生长因子（pI8.86）
分离纯化：以人胎盘为原料提取hNGF；
（1）胎盘绒毛的分离：取人胎盘，用注射器向脐带总动脉注入生理盐水，并轻揉胎盘，直到洗尽血污，分离绒毛叶；
（2）提取：取来自100个胎盘的绒毛叶剪碎，加20％预冷的PBS（pH6.8，含1mMEDTA）；匀浆，每次3min，共3次；4℃8000rpm30min；上清以尼龙膜过滤，除去脂肪；滤液中加尿素到5M，调pH4，静置2h，以解离hNGF高分子聚合体；8000rpm30min，收集上清；（3）超滤分离：上清液以分子量截留值为30KD的超滤膜超滤，滤液再用10KD的超滤膜超滤；当截留液剩下1000ml时，加pH4，50mM醋酸钠－醋酸缓冲液2000ml，再浓缩到1000ml，反复5次，收集截留液，对平衡缓冲液充分透析；
（4）离子交换色谱纯化：CM52离子交换纤维柱，平衡缓冲液平衡，透析液上样，以平衡缓冲液洗脱穿过峰，换用Tris盐酸缓冲液（pH9，50mM）洗脱，收集洗脱峰（含hNGF）；从100个胎盘中提取纯化得hNGF148.6mg；
SDS－PAGE银染显示为单一条带；HPLC层析得单一峰；
6、L天冬酰胺酶（pI4.6）
分离纯化
（1）菌体丙酮粉的制备：天冬酰胺酶为胞内酶；丙酮脱水，脱脂制成细胞干粉来破坏细胞；（2）提取：菌体粉悬浮于硼酸－硼酸钠缓冲液中（pH8，0.01M）37℃搅拌1.5h，将胞内酶抽提出来，离心，收集上清液；
（3）盐析分离：离心上清液中加硫酸铵使饱和度43％，充分沉淀后离心，除去杂蛋白沉淀，上清液中加硫酸铵使饱和度85％以沉淀酶，充分沉淀后离心，收集沉淀；
（4）脱盐：沉淀溶于蒸馏水，利用分子量截留置为10kD的膜超滤，浓缩到一定体积后，向浓缩液中加蒸馏水使达到原来的体积，如此反复使透过液中检不出硫酸根离子为止；（5）沉淀粗酶：浓缩液pH调到L天冬酰胺酶pI附近（pH4.3－4.5），加入2倍体积冷丙酮使酶沉淀；抽滤收集沉淀，挥尽丙酮，得天冬酰胺酶粗品；
（6）纯化：乙醇分级沉淀：酶粗品溶解，中性条件下加1.1倍酒精，沉淀除杂蛋白，清液用醋酸调pH到pI，继续加乙醇沉淀酶；
第十九章核酸的分离纯化
DNA和RNA都是极性化合物，溶于水，不溶于乙醇，乙醚，氯仿；
钠盐比游离酸易溶于水；
1、RNA的提取
组织捣碎，制成组织匀浆，用0.14M氯化钠提取，把细胞质中RNA蛋白提取出来，留下含DNA的细胞核物质，调节pH4.5，沉淀RNA蛋白；
2、RNA的分离纯化
（1）氯仿处理：将RNA蛋白溶液与等体积的氯仿－戊醇（3：1）剧烈振荡，离心，上层水溶液含RNA，蛋白质，下层为氯仿和戊醇；两层之间为变性的蛋白质；上层水相再用氯仿－戊醇混合液处理；并反复数次，到两层之间无蛋白质胶状物为止；
也可将RNA蛋白溶于碳酸氢钠溶液中，用含少量辛醇的氯仿长时间连续振荡多次，除蛋白质，RNA留在水溶液中；
溶液中的RNA可通过加入2.5倍量的冷无水乙醇使RNA以钠盐形式沉淀下来；
（2）苯酚处理法：90％的新蒸馏苯酚提取，冷冻离心，RNA溶于上层水相中，变性蛋白质和DNA留在酚层内，需反复多次；
将含RNA的水相合并后加入相当于2.5倍体积的冷无水乙醇，将RNA沉淀出来；
制备RNA时常加入皂土，以吸附蛋白质和RNA酶等杂质，抑制RNA酶对RNA的降解；加少量8羟基喹啉以防止苯酚的氧化；
（3）去污剂处理法：用SDS等去污剂使蛋白质变性沉淀，然后离心去除沉淀，再用冷乙醇将RNA沉淀出来；
（4）盐酸胍处理法：盐酸胍溶液，终浓度2M，38℃，大部分蛋白质溶解，再冷到0℃左右，RNA沉淀出来，离心获得RNA沉淀；不能完全去除RNA中的蛋白质，需用氯仿处理法进一步除去产品中的蛋白质；
（5）浓盐处理法：RNA蛋白溶于10％氯化钠溶液中，加热到90℃，离心除去不溶物，加乙醇使RNA沉淀，或调节pH2－2.5使RNA沉淀；
3、DNA则用1M氯化钠提取
第二十章多糖的分离纯化
（一般以阴离子形式存在，可离子交换法和季铵盐沉淀法（沉淀用高离子强度的盐溶液溶解）分离纯化，另外，多糖溶于水，不溶于乙醇，可用水提取，用乙醇沉淀）
利用离子交换法的洗脱方式：逐步提高盐浓度（梯度洗脱），或分步提高盐浓度（阶段洗脱）；
生物碱（酸提碱析）
例如：苦参粗粉，
2%盐酸溶解；过滤，收集（滤液）；
加乙醚，目的是（脱脂，脱色）；
加NaCO3碱化，用（氯仿）萃取，加NaCl的目的是（促进目的产物进入萃取相）；
离子交换法纯化长春碱：
离子交换树脂对长春花中文多灵、长春质碱和长春碱的富集研究
通过D-113、110、D-151、001x7、D-072、D-062离子交换树脂对长春花中文多灵、长春质碱和长春碱的静态吸附容量、吸附率和解吸率等指标的考察,筛选出最佳树脂为D-151.
吸附:上样溶液浓度为0.41mg生药/mL, pH为6.0,流速为3mL/min;
解吸附:洗脱剂为20%乙醇除杂,90%乙醇(含2%氨水)洗脱.
洛伐他汀羧酸上强碱（阴离子）树脂：
洛伐他汀在发酵中以洛伐他汀羧酸形式存在于菌丝体内, 在加入氢氧化钠的碱性条件下可以洛伐他汀酸钠的形式而溶水。根据这一特性, 以6mol/L 氢氧化钠调整发酵液pH11；
采用大孔阴离子交换树脂D273作吸附剂,
洛伐他汀发酵液预处理后树脂吸附，流速1/30;
解吸采用添加4%氢氧化钠的75%乙醇, 流速1/100。
离子交换纤维对银杏叶黄酮静态吸附和解吸的研究：
黄酮（酸性）用碱性树脂：
在静态条件下,用强碱性阴离子交换纤维分离纯化银杏叶中的黄酮.
最佳吸附条件为:溶剂为20%乙醇溶液,黄酮浓度为0.4045 mg/mL,温度为70℃,pH值为4;
最佳解吸条件为:解吸剂为70%乙醇溶液,温度为70 ℃,酸度调节剂为3 mol/L的盐酸,且酸度调节剂与解吸剂的体积比为1∶4.
大孔树脂吸附分离长春花中的文多灵、长春质碱和长春碱：
筛选出AB-8大孔吸附树脂作为分离长春花生物碱的载体，
长春花原料用稀硫酸溶液提取，
提取液用氨水调节pH值为8，然后采用AB-8大孔吸附树脂柱吸附，
用20%乙醇洗涤除去强极性成分，
在30℃下用pH=4的50%乙醇解吸，得单吲哚生物碱文多灵和长春质碱，再用90%乙醇解吸，得双吲哚生物碱长春碱
黄酮类物质沉淀：
生物科学 业务培养目标：本专业培养具备生物科学的基本理论、基本知识和较强的实验技能，能在科研机构、高等学校及企事业单位等从事科学研究、教学工作及管理工作的生物科学高级专门人才。 业务培养要求：本专业学生主要学习生物科学方面的基本理论、基本知识，受到基础研究和应用基础研究方面的科学思维和科学实验训练，具有较好的科学素养及一定的教学、科研能力。 毕业生应获得以下几方面的知识和能力： 1.掌握数学、物理、化学等方面的基本理论和基本知识； 2.掌握动物生物学、植物生物学、微生物学、生物化学、细胞生物学、遗传学、发育生物学、神经生物学、分子生物学、生态学等方面的基本理论、基本知识和基本实验技能； 3.了解相近专业的一般原理和知识； 4.了解国家科技政策、知识产权等有关政策和法规； 5.了解生物科学的理论前沿、应用前景和最新发展动态； 6.掌握资料查询、文献检索及运用现代信息技术获取相关信息的基本方法；具有一定的实验设计，创造实验条件，归纳、整理、分析实验结果，撰写论文，参与学术交流的能力。 主干学科：生物学 主要课程：动物生物学、植物生物学、微生物学、生物化学、细胞生物学、遗传学、发育生物学、神经生物学、分子生物学、生态学等 主要实践性教学环节：包括野外实习、毕业论文等，一般安排10周～20周。 主要专业实验：动物生物学实验、植物生物学实验、微生物学实验、细胞生物学实验、遗传学实验、生物化学实验、分子生物学实验等 修业年限：四年 授予学位：理学学士 生物技术
业务培养目标：本专业培养具备生命科学的基本理论和较系统的生物技术的基本理论、基本知识、基本技能，能在科研机构或高等学校从事科学研究或教学工作，能在工业、医药、食品、农、林、牧、渔、环保、园林等行业的企业、事业和行政管理部门从事与生物技术有关的应用研究、技术开发、生产管理和行政管理等工作的高级专门人才。 业务培养要求：本专业学生主要学习生物技术方面的基本理论、基本知识，受到应用基础研究和技术开发方面的科学思维和科学实验训练，具有较好的科学素养及初步的教学、研究、开发与管理的基本能力。 毕业生应获得以下几方面的知识和能力： 1.掌握数学、物理、化学等方面的基本理论和基本知识； 2.掌握基础生物学、生物化学、分子生物学、微生物学、基因工程、发酵工程及细胞工程等方面的基本理论、基本知识和基本实验技能，以及生物技术及其产品开发的基本原理和基本方法； 3.了解相近专业的一般原理和知识； 4.熟悉国家生物技术产业政策、知识产权及生物工程安全条例等有关政策和法规； 5.了解生物技术的理论前沿、应用前景和最新发展动态，以及生物技术产业发展状况； 6.掌握资料查询、文献检索及运用现代信息技术获取相关信息的基本方法；具有一定的实验设计，创造实验条件，归纳、整理、分析实验结果，撰写论文，参与学术交流的能力。 主干学科：生物学 主要课程：微生物学、细胞生物学、遗传学、生物化学、分子生物学、基因工程、细胞工程、微生物工程、生化工程、生物工程下游技术、发酵工程设备等 主要实践性教学环节：包括教学实习、生产实习和毕业论文(设计)等，一般安排10周～20周。 主要专业实验：微生物学实验、细胞生物学实验、遗传学实验、生物化学实验、分子生物学实验、生物技术大实验等 修业年限：四年 授予学位：理学学士
生物工程下游技术生物工程下游技术的定义 指从动植物与微生物的有机体或器官、生物工程产物（发酵液、培养液）及其生物化学产品中提取、分离、纯化有用物质的技术过程。 实质：是研究如何从混合物中把一种或几种物质分离出来的科学技术。 1.生化工程分离技术 预处理 结晶干燥 离心法：离心过滤、离心沉降、超离心 萃取法：有机溶剂、双水相、液膜、反胶团、超临界 层析法：凝胶过滤层析、反相层析、亲和、疏水相互作用、聚焦、离子交换 膜分离：微滤、超滤、 反渗透、透析、电渗透 2.生物物质常用的分离技术 氨基酸：结晶和离子交换法 蛋白质和多肽：离子交换层析、电泳 糖类：吸附层析 脂质：有机溶剂萃取、超临界流体萃取和层析 抗生素：有机溶剂萃取、离子交换、结晶和吸附层析 3. 生物分离方法的选择与评价 原则： 步聚少，次序合理，产品规格（注射，非注射），生产规模，物料组成，产品形式，产品稳定性，危害性，物性：溶解度、电荷、分子大小、功能团、稳定性、挥发性，废水处理 4.浓缩率：浓缩程度一般用浓缩率(concentration factor)表达，是一个以浓缩为目的的分离过程的最重要指标。浓缩率为m，mt=mx则目标产物未得到任何程度的分离纯化。 5.分离因子：分离因子又称分离系数。产品中目标产物浓度越高，杂质浓度越低，则分离因子越大，分离效率越高。 6. 回收率：无论是以浓缩还是以分离为目的操作过程，目标产物均应以较大的比例回收, 回收率R：
生物分离操作多为间歇过程（分批操作），若原料液和产品溶液的体积分别为VC和VP。 1 生物产品与普通化工产品分离过程有何不同？ 2 设计生物产品的分离工艺应考虑哪些因素？ 3 分离纯化的回收率与浓缩率如何计算？ 4 现代生物分离工程研究方向有哪些特点？ 5 分离纯化指标有哪些? 简述pH对发酵液过滤特性的影响，并举例说明。 答：（1） pH直接影响发酵液中某些物质的电离程度和电荷性质，因此适当调节pH值可以改善发酵液的过滤特性。（2）氨基酸和蛋白质在酸性条件下带正电，碱性条件下带负电，等电点时净电荷为零，两性物质在等电点下的溶解度最小，等电点沉淀法在生物工业分离中广泛使用。（3）如味精生产，利用等电点沉淀法提取谷氨酸，一般蛋白质也在酸性范围达到等电点；膜分离中可通过调整pH 值改变易吸附分子的电荷性质，减少膜堵塞和膜污染；此外，细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在特定pH下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤进行。 第二章 1.预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率： ⑴改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度。 ⑵相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。 ⑶尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）； 2.预处理的方法 凝聚和絮凝 加热法 调节悬浮液的pH值 杂蛋白的去处 高价无机离子的去处 助滤剂 反应剂 3凝聚与絮凝：.凝聚与絮凝处理过程就是将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使其聚集起来,增大体积以便固液分离。 凝聚和絮凝技术常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中。 凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。
第三章 发酵液预处理与固液分离 1.加水稀释法 （稀释后要过滤速率提高的百分比要 大于加水量） 1.降低液体黏度 2.加热法 2.调整PH （如利用蛋白质的等电点） 3.凝聚：在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电 位下降，而使胶体体系不稳定的现象。 过滤特性改变 凝聚值越小，凝聚能力就越强 絮凝：在有些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大 絮凝团的过程。 混凝：包括上述两种法。 4.加入助滤剂 （最常见的是硅藻土） 5.加入反应剂 1. Ca 2+ : 加草酸钠 除杂 Mg 2+ :加三聚磷酸钠 C a 2+ ：加黄血盐 1.沉淀法 2.杂蛋白的除去： 2.变性法 （有加热法，调PH ，加酒精， 丙酮等有机溶剂或表面活性剂 等。） 3.吸附法 (加入某些吸附剂或沉淀剂吸附 杂蛋白而除去) 1.离心 公式：Q=v ω2Z g d v L S ?-=μ ρρ18)(2 固液分离手段 θπctg r r g n Z )(323132-= 2.过滤 （1）板框过滤机 （适合固体含量在１％—１０％的悬浮液 的分离） （２）真空转鼓过滤机 （适合固体含量大于１０％） （３）硅藻土过滤机 （适合固体含量小于０．１％）
第五章细胞破壁 细胞破壁１．破壁法：（１）珠磨法原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠， 英砂，氧化铝等研磨剂一起快速搅拌或研磨， 研磨剂，珠子与细胞之间的互相剪切，碰撞， 使细胞破碎。 （2 ）高压匀浆法原理：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀， 由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞 破碎。 是大规模细胞破碎的常用法。 （3）超声破碎法（适合实验室用） （4 ）酶溶法1 .外加酶法 2. 自溶法（1）加热法 （2）干燥法 （5）化学渗透法 2.破碎率的测定（1）直接测定法破碎前利用显微镜计数器直接计数 破碎后用染色的法把破碎的细胞与未受损 的细胞分开。即可直接计算破碎率。 （2）目的产物测定法通过测定破碎液中目的产物的释放量 来估算破碎率。 （3）导电率测定法根据导电率随着破碎率的增加而呈线性 增加 第五章．溶剂萃取与浸取 一、溶剂萃取过程的理论基础： ——是把目标物质从第一个液相中依靠更强大的溶解力抽提到第二个液相中。如把水相中的醋酸抽提到醋乙酯中。 1．萃取溶剂的选择 根据萃取目标产物的介电常数，寻找极性相接近的溶剂为萃取溶剂。好的溶剂应满足以下要求： ①萃取容量大，单位体积萃取溶剂能萃取大量产物； ②选择性好，只萃取产物而不萃取杂物； ③有利于相的分散和两相分离，与被萃取相互溶度小，且粘度小，界面传力小 ④易回收和再生； ⑤化学致定性好，不易分解，对设备腐蚀性小； ⑥经济性好，价廉易得； ⑦安全性好，闪点高，对人体无毒或低毒。
2007-2010年中央与地方共建高等学校共建专项资金项目 生物技术工程实验室建设 可行性论证报告 重庆科技学院 生物系 二○○七年六月二十日
一、总论 1、学科基本情况 原化学与生物工程学院是一个多学科及交叉学科并存的综合性学院，有化学与化学工程、生物技术、环境科学三个一级学科，以及交叉学科覆盖了全院八个专业：化学工程与工艺、应用化学、精细化工、工业分析、商品质量检测、生物制药、制药工程、环境工程，其中已有化学工程与工艺、应用化学两个本科专业。07年3月学校完成了学科专业结构布局调整，进行资源重组，由原来的化学与生物工程学院，新组建成立了化学化工学院和生物系。生物系现有15人，副教授1人，讲师7人，助教4人，全部具有硕士学位，其中博士5人。现有生物制药、制药工程两个专业，2001年以来形成了以能力培养为主线，以基础知识的传授和学习能力的培养、工程观念和创新能力的培养为两个教学重心。全面体现“厚基础、宽口径、重实践、高素质、创造性”整体思路，突出本专业在新药研究与开发方面所形成的特色。 2、实验室现状 化学化工实验室始建于1950年，经过五十六年的发展与建设，特别是经过2004、2005年中央与地方共建基础化学实验室及化工原理实验室的建设，生物系和化学化工学院现共有：制药工程实验室、微生物实验室、生化技术实验室、化工原理实验室、化工仿真实验室、基础化学实验室、化学工程与工艺实验室等实验室，拥有包括高效液相色谱仪、气相色谱仪、原子吸收仪、紫外分光光度仪、红外光谱仪、元素分析仪、发射光谱仪等贵重精密仪器，设备总价值505多万元设备。 3、建设概况 （1）概况 项目名称：生物技术工程实验室建设 项目类型：仪器设备购置 项目需要的投入总额：1200万元。其中对中央财政专项资金的最低需求960万元。 （2）预期目标： 为了全面贯彻落实教育部、财政部《关于实施高等学校本科教学教学质量与教学改革工程的意见》文件精神，集中力量有效提升专业实验室的水平，保证本科教学质量，对2千多平方米的教学实验设备进行整体建设，推进实验教学内容、方法、手段、队伍、管理及实验教学模式的改革与创新。 ①该项目建设完成后，“生物技术工程实验室”的设备档次、规模、台套数满足“质量工程”的要求，增加了设计性、综合性、创新性实验内容，使实验开出率达到100%、设备利用率90%以上，全面提高本科实验教学质量，使学生的综合素质和实践能力得到培养和锻炼；该项目建设完成后，可进一步加强产学研密切合作，与社会、行业以及企事业单位共同建设实习、实践教学基地，培养出一大批社会需要的适用人才。
省高等教育自学考试大纲 课程名称：生物工程下游技术课程代码：6705 第一部分课程性质与目标 一、课程性质与特点 生物工程下游技术这门课程适合于理工科专业生物工程专业进行学习。本课程的容更多的涉及到工业应用。下游技术是对于由生物界自然产生的生物体或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应、微生物转化等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术，也称为下游工程或下游加工过程，是生物技术产品产业化的必经之路。目前所指的下游技术大多数属于“物质分离”畴。主要研究的是物质分离的方法原理及相关的仪器设备。生物工程下游技术这门课程涉及到物理，化学，生物化学，发酵工程，生物工程与设备等多门学科。 二、课程目标与基本要求 通过学习生物工程下游技术这门课程应掌握以下基本知识点： 1.生物工程下游技术的研究对象和发展历程 2.下游技术的理论基础 3.发酵液预处理，微生物细胞破碎方法和设备 4.溶剂萃取和浸取，超临界流体萃取，双水相萃取，反胶团萃取，膜分离过程，液膜分离，离子交换法，色谱法等主要分离单元操作技术及分离过程的特点，工艺设计与设备选型通过学习了解各种分离方法的原理，适用围，熟悉常用分离设备的操作，在实际应用中可以选择合适的分离方法对仪器进行操作达到分离的目的。通过学习，具备对生物产品的分离、纯化技术的应用能力，及对生物物质提纯最佳方案的设计能力。 三、与本专业其他课程的关系 本课程的容更多的涉及到工业应用。下游技术对各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。在生物工程专业课程的学习中，是一门将生物工程上游技术应用到实际生产中所需要借助的手段。 《物理学》，《无机化学》，《有机化学》，《物理化学》等基础课是这门课程的基础，《微
生物工程下游技术复习题 第一章绪论 生物下游加工过程的几个阶段 预处理和固液分离, 提取（初步分离）, 精制（高度纯化）, 成品制作. 评价分离效果的重要参数:纯度，回收率，浓缩率。
第二章发酵液预处理和固液分离 主要名词：凝聚、絮凝 凝聚：指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象； 絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。1.改变发酵液过滤特性的方法 调酸（等电点），热处理，电解质处理，添加凝聚剂，添加表面活性物质，添加反应剂冷冻-解冻，添加助滤剂 2.发酵液的相对纯化 （1）高价无机离子的去除方法 （2）杂蛋白的去除方法 沉淀法，变性法，吸附法。 3常用的固液分离方法： 重力沉降，浮选，旋液分离，介质过滤，离心。 （1）离心 离心机种类：碟片式。管式。倾析式。 （2）过滤（澄清过滤，滤饼过滤） 过滤机种类：按推动力分为4种重力过滤，加压过滤，真空过滤，离心过滤。 板框压滤机，真空转鼓过滤机 第三章细胞破碎和包涵体复性 细胞破碎的主要方法和适用对象，了解基本机理
方法：珠磨法原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。 高压匀浆法原理：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。不适用范围：易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀） 珠磨法固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难 高压匀浆法液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌 超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作X-press法固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合 酶溶法酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差化学渗透法改变细胞膜的渗透性具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差渗透压法渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用 冻结融化法反复冻结-融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物 干燥法改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活 第四章沉淀法 1.蛋白质的表面特征 蛋白质组成 20种氨基酸构成的两性高分子电解质，包括疏水性氨基酸和亲水性氨基酸 蛋白质折叠趋势 疏水性氨基酸：向内部折叠的趋势 亲水性氨基酸：分布于蛋白质外表面的趋势 结果 在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残基暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区
华南师范大学实验报告 学生姓名：黎嘉俊学号：008 专业：生物工程年级、班级：10工程一班课程名称：生物工程下游技术实验实验项目：黑曲霉β-D甘露聚糖 酶的纯化 实验类型：□验证□设计□综合实验时间：2013年9月17日 实验指导老师：江学文实验评分： 一．实验目的 < 1、粗酶的制备 2、硫酸铵分级沉淀 3、透析袋的处理方法和使用 二．原理 1、盐析原理：中性盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化层逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。 2、透析袋脱盐：酸性β-甘露聚糖相对分子质量为39000和40000，选择MWCO（切割分子量或截留分子量）14000的透析袋，透过掉分子量小于1000的蛋白质；并借助分子扩散脱盐。 三．实验试剂和器材 纱布1卷、脱脂棉1包、琼脂条1包、透析袋MWCO（分子量）7000 [ 四．实验步骤
1、将黑曲霉菌株斜面接种三角瓶固体发酵培养基,℃恒温培养 72 h。 2、称取10克发酵麸曲，加100毫升的醋酸缓冲液，温度℃，转速135rpm，摇 床摇60 min后，用￠15㎝滤纸过滤。 3、取滤液40毫升，在不断搅拌下分步加入（NH4）2SO4 克（待加入部分溶解 后再加入剩余部分）。 4、置冰箱中5℃下静止沉淀过夜。 5、标准曲线的绘制：分别吸取%标准甘露糖溶液、、、、，分别定容至50ml。 再分别吸取上述溶液各于试管中各加,5-二硝基水杨酸显色液（DNS试剂）， 煮沸5min（另作1管对照，取蒸馏水，加试剂，同样煮沸5min）。冷却后， 用721型分光光度计在530nm波长下比色，记录各管的光密度值，以光密 度作纵坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为横坐标，绘制标准曲线。五．实验结果 （ 0.1%标准甘露糖溶液体积/ml0246810 OD100.0970.4150.873 1.254 1.674 OD200.0970.4160.873 1.256 1.674 OD300.0970.4150.874 1.256 1.674 OD平均值00.0970.4153330.873333 1.255333 1.674 OD标准差000.0005770.0005770.0011550
《生物工程下游技术实验》讲义 实验项目一：“超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术” 实验一：植物超氧化物歧化酶（SOD）活性测量(6学时) 过程 1.每组30g绿豆,洗涤，蒸馏水浸泡过夜，倒去浸泡的水，加入300 ml蒸馏水液，匀浆 机匀浆，二层纱布过滤，离心（3000 rpm）得清液，取少量清液进行SOD活性及蛋白质含量测量，计算材料中SOD总活性单位及比活性单位（units/mg Pr）。 2.所得清液测量其总体积，缓慢加入硫酸铵至35%饱和度（查一般实验手册,约 19.4g/100ml清液），5℃冰箱中静置备用下一实验。 SOD活性的测定：（二种方法取一种，本次实验用前者，要求理解后者的原理） ●邻苯三酚自氧化法：这是最简单的一种检测方法，但干扰因素较多。 ●NBT光化还原法：比较稳定，但受酚类物质干扰。 一、利用连苯三酚自氧化测SOD活性的方法 溶液配制： 1，连苯三酚：630 mg------→100 ml 10 mmol/L HCl (0.085 ml 36%的浓HCl ，用蒸馏水配成100 ml)。共配500ml. 2，pH 8.30 50 mmol/L Tric-HCl： A) 0.1 mol/L Tris: 12.114g-----1000 ml (储备液) B) 0.1 mol/L HCL: 浓盐酸稀释得到（8.5 ml 36%的浓HCl ，用蒸馏水配成1000 ml）(储 备液) ●0.05mol/L pH 8.3: 500ml A+199ml B-------定容到1000ml.. 操作： 25?C，3 ml 50 mmol/L pH8.30 的Tric-HCL 缓冲液，加入10 μl 50 mmol/L 连苯三酚（具体加入量应每次测量前校正，加入的原则是使下面的A325变化控制在0.07 ／min左右），迅速摇匀，倒入光径1 cm的比色杯(应该用石英杯)中，每３０秒测一次Ａ３２５值，自氧化速率的变化（?Ａ）控制在0.07 ／min左右，加入酶液后再测连苯三酚自氧化速率的变化（?Ａ’），酶量的加入控制在使加样后的?Ａ’在0.035/min左右。（以上?Ａ?Ａ’的变化值不需特别严格，?Ａ只要控制在0.1以下0.04以上，?Ａ’变化在?Ａ的约一半左右即可） 一个SOD活性单位（连苯三酚单位）：在以上条件下，加入酶如果在一分钟时间能抑制连苯三酚自氧化速率的一半，此时所加的酶量就为一个SOD的酶活性单位（unit，U）。
第三章 发酵液预处理与固液分离 1.加水稀释法 （稀释后要过滤速率提高的百分比要大于加水量） 1.降低液体黏度 2.加热法 2.调整PH （如利用蛋白质的等电点） 3.凝聚：在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电 位下降，而使胶体体系不稳定的现象。 过滤特性改变 凝聚值越小，凝聚能力就越强 絮凝：在有些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大 絮凝团的过程。 混凝：包括上述两种方法。 4.加入助滤剂 （最常见的是硅藻土） 5.加入反应剂 1. Ca 2+ : 加草酸钠 除杂 Mg 2+ :加三聚磷酸钠 C a 2+ ：加黄血盐 1.沉淀法 2.杂蛋白的除去： 2.变性法 （有加热法，调PH ，加酒精， 丙酮等有机溶剂或表面活性剂 等。） 3.吸附法 (加入某些吸附剂或沉淀剂吸附 杂蛋白而除去) 1.离心 公式：Q=v ω2Z g d v L S ?-=μ ρρ18)(2 固液分离手段 θπctg r r g n Z )(323132-= 2.过滤 （1）板框过滤机 （适合固体含量在１％—１０％的悬浮液 的分离） （２）真空转鼓过滤机 （适合固体含量大于１０％） （３）硅藻土过滤机 （适合固体含量小于０．１％）
第五章细胞破壁 细胞破壁１．破壁方法：（１）珠磨法原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小 珠，石英砂，氧化铝等研磨剂一起快速搅拌或 研磨，研磨剂，珠子与细胞之间的互相剪切， 碰撞，使细胞破碎。 （2 ）高压匀浆法原理：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由 于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破 碎。 是大规模细胞破碎的常用方法。 （3）超声破碎法（适合实验室用） （4 ）酶溶法 1 .外加酶法 2. 自溶法（1）加热法 （2）干燥法 （5）化学渗透法 2.破碎率的测定（1）直接测定法破碎前利用显微镜计数器直接计数 破碎后用染色的方法把破碎的细胞与未受损 的细胞分开。即可直接计算破碎率。 （2）目的产物测定法通过测定破碎液中目的产物的释放量 来估算破碎率。 （3）导电率测定法根据导电率随着破碎率的增加而呈线性 增加 第五章．溶剂萃取与浸取 一、溶剂萃取过程的理论基础： ——是把目标物质从第一个液相中依靠更强大的溶解力抽提到第二个液相中。如把水相中的醋酸抽提到醋乙酯中。 1．萃取溶剂的选择 根据萃取目标产物的介电常数，寻找极性相接近的溶剂为萃取溶剂。好的溶剂应满足以下要求： ①萃取容量大，单位体积萃取溶剂能萃取大量产物； ②选择性好，只萃取产物而不萃取杂物； ③有利于相的分散和两相分离，与被萃取相互溶度小，且粘度小，界面传力小 ④易回收和再生； ⑤化学致定性好，不易分解，对设备腐蚀性小； ⑥经济性好，价廉易得； ⑦安全性好，闪点高，对人体无毒或低毒。
生物工程下游技术实验课程教学大纲 课程名称：生物工程下游技术（Downstream Processing of Bioengineering） 课程编码：1313083216 实验类别：专业课 总学时数：46 实验时数：16 学分：2.5 开课单位：生命科学学院生物技术教研室 适用专业：生物技术 适用对象：本科（四年） 一、课程的性质、类型、目的和任务 本课程为生物技术专业本科生必修的专业课程。是非单独设课课程，在实验中要求： 1、在本实验课程中培养和提高学生运用生物分离技术的原理的能力。 2、掌握生物分离技术的基本方法和技能，培养学生正确记录实验数据和现象、正确处理实验数据和分析实验结果的能力。 3、培养学生严谨认真、实事求是的科学态度和良好的实验作风。 4、在教学中，教师要向学生讲明该实验课的性质、任务，并使学生明确实验课的地位和作用，提高学生学习的主动性。 5、学生实验前，必须预习实验内容，了解每个实验的目的、原理和方法。 6、实验过程中，要求学生操作要规范、做好实验原始记录、爱惜仪器、节约药品、遵守安全制度、使学生养成良好的实验习惯，树立良好的学风。 7、要求学生实验后按时完成实验报告。。 二、本课程与其它课程的联系与分工 本课程宜从三年级第二学期开始，以确保学生学习本课程具有所需要的数学、物理、化学、微生物学、酶工程、微生物工程、细胞工程等基础。 三、课程内容及教学基本要求 [1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”； 实验一、大肠杆菌的超声波破碎 细菌培养和收集[3]；细胞破碎[3]；细胞液分离[2] 实验二、氨基酸的吸附层析 薄板制备[3]；点样[3]；展层[3]；显色[3]；测定Rf值[2] 实验三、蛋白质溶液的凝胶层析脱盐 凝胶柱制备[3]；加样与洗脱[3]；检测[3] 实验四、有机溶剂萃取抗生素 试剂配制[3]；化学效价测定[3]；标准曲线制备[3]
第一章 1.生物产品的哪些特性制约了下游技术的可选范围？ 1生物物料2产品稳定性、产品性质、产品共存物性质的要求。 2.生物工程下游技术分哪几个阶段？ 四个阶段：预处理；提取（初步分离）；精制（纯化）；成品制作。 3.生物工程下游技术的特点有哪些？ 快速分离、保证纯度、高选择性、分离步骤多、需要高度浓缩。 4.生物工程纯化过程选择依据有哪些？ 生产成本要低、工艺步骤要少、操作程序合理、适应产品的技术规格、生产要有规模、产品具有稳定性、环保和安全要求、生产方式。 第二章下游技术的理论基础 1下游技术中都存在哪些过程？ 物理学过程；化学过程；生物学过程。 2下游技术中物理过程按物理化学原理有哪些分类？ @根据相性质分为：机械分离（非均相）：过滤、重大沉降、离心；传质分离（均相）：均相。 @物理化学原理：平衡分离：1.气体传质：吸收2.气液传质：精馏3.液液传质：萃取4.液固传质：浸取、结晶、吸附、离子交换、色谱分析 5.气固传质：干燥、吸附、升华；速率分离（差速分离）：1.膜分离：超滤、反渗透、电渗析2.均分离：电泳、磁泳、离心沉降。 3什么是对流传递扩散传递及扩散传递的重要性？ 对流传递是由流体的宏观运动引起；扩散传递分为分子传递（由分子的随机热运动引起）和涡流传递（由微团的脉动引起）尽管对流传质速度要扩散传质速度大很多，但在很多情况下，扩散传递都是非常重要的，特别是存在异相界面物质传递的情况下，物质在异相界面间境界膜中的扩散速率往往成为物质传递速率的限制性因素。 4生物反应器的放大原则？ 几何相似、恒定等体积功率放大、恒定传氧系数放大、恒定剪切力恒定叶端速度放大、恒定的混合时间放大。 第三章发酵液的预处理1发酵液预处理的目的？ 固液分离（分离菌体及其它悬浮颗粒）、除去一些可溶性杂质、改变滤液的性质以利于后续的提取与精制。 2发酵液预处理的方法有哪些？并简述各种方法的原理特点和应用36 降低液体黏度（加水稀释法、加热法）、凝聚和絮凝法、调节PH法、加入助滤剂法、加吸附剂法或加盐法（加入反应剂）。 3发酵液进行过滤的目的是什么？影响发酵液过滤速度的因素有哪些？ 目的：以压力差为推动力，依靠过滤介质将固体和液体分离 影响因素：1.从进料侧至过滤介质另一侧的压力降2.过滤面积3.滤饼阻力（厚度、颗粒大小）4.滤液黏度5.过滤介质和初始滤饼层的阻力。4发酵液过滤的方法有哪些？ 并简述各种方法的类型特点和应用39 方法：常压过滤、加压过滤、真空过滤、离心过滤。 5如何进行过滤介质的选择和条件的优化？ 过滤介质除具有过滤作用外，还是滤饼的支撑物，它应具有足够的机械强度和尽可能小的流动阻力。合理选择过滤介质取决于许多因素，其中过滤介质所能截留的固体粒子大小以及对滤液的透过性是过滤介质最主要的技术特性过滤介质种类1.织物介质：绵、丝、毛、麻等2.粒状介质：硅藻胶、活性炭、白土 3.多孔固体介质：多孔陶瓷、玻璃、塑料4.微孔纤维素和金属薄膜介质：醋酸纤维素 过滤条件的优化：1.改善发酵液物理性质：降低滤饼比阻、降低发酵液黏度、降低固体浓度、热处理 2.改善设备结构：扩大设备尺寸、增加过滤面积。 6发酵液的构成？ 微生物（菌体）、残存的固体培养基、未被微生物完全利用的糖无机盐蛋白质以及微生物的各种代谢产物。 7发酵液特性有哪些？ 1目标产物浓度普遍较低，悬浮液中大部分是水2菌体细胞等固体粒子的性质差异较大，且具有一定的可压缩性3菌体细胞等悬浮颗粒小，其相对密度和液相相近4液相黏度大，多为非牛顿型流体5性质不稳定易随时间变化，如易受空气氧化微生物污染蛋白质酶水解等作用的影响。
1.请描述生物工程下游技术的一般工艺流程，并分析各步可采用方 法及其原理 按生产过程分，下游技术工艺过程大致可分为4个阶段，即预处理、提取（初步分离）、精制（纯化）、成品制作。 发酵液→预处理→细胞分离→细胞破壁→碎片分离→提取→精制→成品制作加热过滤匀浆法离心沉淀(重)结晶浓缩 调PH 离心研磨法双水相吸附离子交换干燥 絮凝膜分离酶解法膜分离萃取色谱分离无菌加工 超滤膜分离成型 结晶 （1）预处理和固液分离 加热法：加热可降低液体黏度，只适用于产物对热较稳定的发酵液。在适当的温度和受热时间下可使菌体或蛋白质凝聚形成较大颗粒的凝聚物，改善发酵液固液分离特性。加热是蛋白质变性凝固的有效方法。 调节PH法：PH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，调节PH可以改变菌体和蛋白质的带电性质，从而改变其过滤特性。蛋白质属于两性电解质，两性电解质在溶液中的PH处于等电点时分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加溶解度最小。因此，调节溶液的PH，可使蛋白质溶解度下降而析出，这是除去蛋白质的有效方法。改变PH，还能使蛋白质变性凝固。 絮凝：在某些高分子絮凝剂的存在下。基于桥架的作用，使胶粒形成絮凝团的过程。 （2）提取（初步分离）
沉淀：在溶液中加入沉淀剂使溶质溶解度降低，生成无定形固体从溶液中析出的过程。原理：沉淀分离就是通过沉淀，在固-液分相后，除去留在液相或沉积在固相中的非必要成分。 吸附：吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸附剂表面的过程。吸附的原理：固体内部分子所受分子间的作用力是对称的，而固体表面分子所受力是不对称的。向内的一面受内部分子的作用力较大，而表面向外一面所受的作用力较小，因而当气体分子或溶液中溶质分子在运动过程中碰到固体表面时就会被吸引而停留在固体表面上。 萃取：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的技术。原理：利用各物质在不同溶剂中具有不同的溶解度的原理来达到将目标产物分离纯化的目的。 超滤：超滤是利用膜的透过性能，在静压差的推动力作用下，达到分离离子、分子及其某种微粒目的的膜分离技术。原理：超滤是一种筛分过程，在一定的压力作用下，含有大小分子溶质的溶液流过超滤膜表面时，溶剂和小分子物质（如无机盐类）透过膜，作为透过液被收集起来；而大分子溶质（如有机胶体）则被膜截留而作为浓缩液被回收。 结晶：将形成晶型物质的过程称为“结晶”。原理：通过结晶溶液中的大部分杂质会留在母液中，再通过过滤、洗涤即可得到纯度高的晶体。 （3）精制（纯化）
动物生物反应器 专业：生物技术班级：093姓名：贺霞霞 一、概述 1、生物反应器：生物反应器是利用生物体所具有的生物功能，在体外或体内通过生化反应或生物自身的代谢获得目标产物的装置系统、细胞、组织器官等等。 2、内容：生物反应器听起来有些陌生，基本原理却相当简单。胃就是人体内部加工食物的一个复杂生物反应器。食物在胃里经过各种酶的消化，变成我们能吸收的营养成分。生物工程上的生物反应器是在体外模拟生物体的功能，设计出来用于生产或检测各种化学品的反应装置。或者说，生物反应器是利用酶或生物体（如微生物）所具有的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统，是一种生物功能模拟机，如发酵罐、固定化酶或固定化细胞反应器等。 生物反应器（bioreactor）经历了三个发展阶段：细菌、细胞基因工程、转基因动物生物反应器。转基因动物生物反应器的出现之所以受到人们极大的关注，是因为它克服了前两者的缺陷，即细胞基因工程产物往往不具备生物活性，必须经过糖基化、羟基化等一系列修饰加工后才能成为有效的药物，而细胞基因工程又因为的培养条件要求相当苛刻、成本太高而限制了规模生产。另外，转基因动物生物反应器还具有产品质量高、容易提纯的特点。一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫做动物生物反应器。几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可以经过人为驯化为生物反应器。从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织或器官要方便产物的获得，例如乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器、动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引人注目。 二、动物生物反应器的介绍 1、转基因动物与生物反应器
生物工程下游技术期末闭卷考试题库 一、选择题（每题1分，共20分） 1、在发酵液中常加入 B ，以除去发酵液中的钙离子。 A. 硫酸 B. 草酸 C. 盐酸 D. 硝酸 2、在发酵液中加入草酸，其作用是ABCD 。 A. 去除钙离子 B. 去除部分镁离子 C. 改善发酵液的过滤性能 D. 有助于目标产物转入液相。 3、在发酵液中加入三聚磷酸钠，它和 B 形成可溶性络合物，可消除对离子交换的影响。 A. Ca2+ B. Mg2+ C.Zn2+ D. Fe3+ 4、环丝氨酸的发酵液中，加入磷酸盐的主要目的是去除AD 。 A. Ca2+ B. Fe3+ C. Zn2+ D. Mg2+ 5、在发酵液中加入黄血盐，可去除 C ，使其形成普鲁士蓝沉淀。 A. Ca2+ B. Zn2+ C. Fe3+ D. Mg2+ 6、发酵液中，细胞絮凝机理是 A 。 A. 胶体理论 B. 高聚物架桥理论 C. 双电层理论 D. 盐析理论 7、在生物产品分离中， C 技术可代替或改善离心和过滤方法，富集或除去发酵液中的细胞或细胞碎片。 A. 凝聚 B. 双水相萃取 C. 絮凝 D. 色谱 8、高压匀浆法提高细胞破碎率的方法有 ABC 。 A. 适当地增加压力 B. 增加通过匀浆器的次数 C. 适当地增加温度 D. 提高搅拌器的转速 9、下列 AB 可采用高压匀浆法进行细胞破碎。 A. 大多数细菌 B. 酵母 C. 放线菌和霉菌 D.包涵体 10、珠磨法提高细胞破碎率的方法有 BCD 。 A. 适当的增加压力 B. 增加装珠量 C. 延长破碎时间 D. 提高转速 11、下列 ABCD 可采用珠磨法进行细胞破碎。 A. 大多数细菌 B. 酵母菌 C. 放线菌和霉菌 D. 含有亚细胞器（如包涵体）的微生物细胞 12、下列 AC 可采用渗透压冲击法进行破碎。 A. 动物细胞 B. 酵母菌 C. 革兰氏阴性细菌 D. 革兰阳性细菌 13、下列 AC 可采用冷冻－融化法进行破碎。 A. 动物细胞 B. 酵母菌 C. 革兰氏阴性细菌 D. 革兰阳性细菌 14、下列 C 可采用EDTA法进行破壁。 A. 动物细胞 B. 酵母菌 C. 革兰氏阴性细菌 D. 革兰阳性细菌 15、关于用化学渗透法破壁的优点，下列说法正确的是 ABC 。
一、概念 1、生物制药：是指运用微生物学、生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，利 用生物技术的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。 2、基因工程：是指在体外按既定的目的和方案，将一目的基因片段，与载体结合，构成DNA重组体，随即引入受体细 胞中，随细胞繁殖而扩增，同时也可进行基因表达，产生特定的基因产物或新性状的遗传物质的技术。 3、载体：是携带外源DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具，载体本质是DNA 。 4、质粒：是染色体外能自主复制的双链闭环DNA分子。 5、沉淀：是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。 6、盐析：是一种根据蛋白质在高浓度盐溶液中的溶解度低的特点来分离蛋白质的方法。 7、等电点沉淀法：是利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。 8、凝胶过滤层析：是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。 9、离子交换层析：带有不同电荷的物质，对层析柱中的离子交换剂亲和力不同，通达改变冲洗液的离子强度和pH值， 将物质依次从层析柱中洗脱分离出来的方法。 10、亲和层析：就是根据生物大分特异性的分子识别建立的一种纯化方法 11、膜分离：在压力、电场或温差作用下，某些物质可以透过膜，而另些物质则被选择性的拦截，从而使溶液中不同 组分，或混和气体的不同组分被分离,这种分子级的分离称为膜分离。 12、电泳：在直流电场中，带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳。 13、分光光度技术：利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定 量分析和物质结构分析的方法 二、简答题 1、现代生物制药下游技术包括哪些内容 1.生物反应器及大规模细胞培养 2.生物细胞破碎技术 3.生物分子的分离纯化技术 4.生物分子含量检测技术 5.生物分子鉴定技术 6.生物分子活性检测技术 2、基因工程基本操作过程 包括目的基因的制备、基因载体的选择、DNA重组、DNA重组体的转化、重组体的筛选和鉴定、外源基因的表达 3、生物化学样品制备特点 ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。 ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。 ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活就是生物大分子提取 制备最困难之处。 ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响， 很难准确估计和判断。 ⑸为保护所提取物质的生理活性及结构上的完整性，生化分离方法多采取温和的“多阶式”进行（常说逐层剥皮式）。 常常少至几个多至几十个步骤，并不断变换各种分离方法，才能达到纯化目的 4、生化分离制备实验设计基本思路 ⑴确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。 ⑵建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。 ⑶通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。 ⑷生物材料的破碎和预处理。 ⑸分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。 ⑹生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电 泳都是一个峰。 ⑺产物的浓缩，干燥和保存。 5、蛋白质盐析的原理及优缺点 原理：蛋白质是由疏水性氨基酸和亲水性氨基酸组成的，在水中蛋白质折叠后，由亲水性氨基酸与周围的水分子形成水化膜，因此，蛋白质在水溶液中的溶解度是由它周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质
生物工程下游技术教学大纲(生物技术及应用专业适用) 辽宁农业职业技术学院 2007年2月
第一部分生物工程下游技术教学基本要求 一、课程的性质、地位及任务 生物工程下游技术是在生物工程的基础上建立起来的，酶工程、基因工程、细胞工程等技术在社会生活中已经发挥了巨大的作用，生物产品的种类及应用也得到了前所未有的发展，如何进一步使这些生物制品更好的服务于社会，主要取决于生产的规模和提取技术的深化。该课程以细胞的扩大、目标产物的分离纯化、目标产物的分析检测为主线。让学生了解细胞的扩大和目标产物的分离纯化的方法和手段，掌握基本的操作方法。提高学生独立思考问题、分析问题的能力，为全面提高学生的素质服务。 二、课程教学的基本要求 1、初步掌握生物反应器的特点及分类，掌握生物反应器优化的原则。 2、初步掌握动植物细胞大规模培养的方法和专用的生物反应器类型 3、掌握细胞破碎、蛋白质复性和固液分离的原理和方法。 4、掌握膜分离技术的原理，掌握膜分离技术。 5、掌握线性色谱与非线性色谱分离和纯化理论与技术。 6、掌握凝聚过滤与离子交换层析介质的主要品种。 7、掌握有机高分子基质与无机基质高效液相色谱填料结构特征与类型。 8、掌握电泳分离技术的原理与应用。 9、掌握蛋白质分析检测技术与质量控制方法。
说明 本大纲是根据2005级三年制生物技术及应用专业教学计划而制订的。 生物工程下游技术为生物技术及应用专业的主干课之一，是生化工程、微生物工程、细胞工程、生物工程的延续，在教学内容上要求注重理论知识的实用性、针对性、体现前沿性。本课程的教学任务在于使学生掌握细胞大规模培养的方法，目标产物的分离与纯化技术原理与相关操作，同时适当介绍当前生物工程发展的最新概况与应用前景。为从事相关工作奠定基础。 本课程以课堂理论教学和实验、两种形式进行教学，其中理论教学34学时，实验46学时，共计80学时，理论与实验分别安排在第二、三学期进行。 执行本大纲时应注意的若干问题如下： 1、根据高职教育的特点，课堂讲授注意少而精，强调理论的应用性，并做到学以 致用。 2、本课程涉及植物学、动物学、微生物学、植物组织培养学、动、植物生理生化、生物工程学等多门科学，实践性强，教学难度较大。这样在理论讲授时应注意采用启发式、讨论式、案例教学、问题情境法等多种有效的教学方法，并充分有效利用现代教育技术手段，做到深入浅出，直观易懂，以加深学生对教学内容的理解和消化，对于前沿性问题开设专题讨论，使学生融入教学中调动积极性，提高认识，加强理解。 3.采用多媒体教学注意课件与教学内容的适合性，并注意与传统教学方法的协调运用，以提高教学效果。 4.突出学生的主体地位，加强教学互动，加强课堂理论教学与学生素质培养相结合，做到既教书又育人。 5.采取灵活多样的考核方法，加强过程考核，注重教学信息反馈、教研与教改，保证教学质量。 6.建议本课程在植物学、动物学、微生物学、植物生理生化之后开设。并有优质的实验条件作保障。