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提供领先的基因组学解决方案Providing Advanced Genomic Solutions
参考文献
[ 1 ] Li Y, Zhou G, Jiang W, et al. De novo assembly of soybean wild relatives for pan-genome analysis of diversity and agronomic traits[J]. Nature biotechnology, 2014, 32(10): 1045-1052.
[ 2 ] Da Silva C, Zamperin G, et al. The high polyphenol content of grapevine cultivar tannat berries is conferred primarily by genes that are not shared with the reference genome. Plant Cell, 2013, 25(12):4777-88.
[ 3 ] Qi XP, Li M, et al. Identification of a novel salt tolerance gene in wild soybean by whole-genome sequencing. Nature Communica－ tions, 2014(5).
挖掘特异基因 解析特有性状
重要品种
全基因组 de novo 所研究品种
小片段文库大片段文库
HiSeq测序(>100X)
基因组组装 注释
全基因组序列比对
转录组遗传图谱等辅助验证
重要农艺性状解析
基因家族聚类分析
所研究品种基因组序列
已发表品种
基因组序列
已发表品种基因集合
所研究品种基因集合
变异检测
小的插入 缺失
SNP 倒位 易位大的插入 缺失
基因挖掘
新基因鉴定拷贝数扩增基因基因丢失正选择基因鉴定
物种 品种
发表杂志（年份） 物种 品种发表杂志（年份）
大豆
棉花
番茄
土豆
水稻
葡萄猪栽培大豆7种野生大豆
野生耐盐大豆雷德氏棉 亚洲棉
陆地棉栽培番茄
抗病番茄栽培土豆
耐寒土豆
Nature (2010)
Nature Biotechnology (2014) Nature Communications (2014) Nature (2012)Nature Genetics (2014)Nature Biotechnology (2015)Nature (2012) Nature Genetics (2014) Nature (2011) Plant Cell (2015)
栽培水稻（粳稻）栽培水稻（籼稻）
短花药野生稻 非洲栽培稻五种野生稻三种栽培稻葡萄 丹娜葡萄杜洛克猪藏猪
Science (2002)Science (2002)
野生大豆泛基因组
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诺禾致源的项目经验
诺禾致源在动植物全基因组测序领域一直处于领先地位，
以第一通讯作者发表基因组文章5篇（影响因子累计152.474），其中2篇为杂志封面文章。
近年来，诺禾通过自主研发软件与技术革新，成功地将项目周期压缩至14个月内，费用降低一半以上。
特有基因检测
对7株代表性野生大豆品种进行全基因组de novo 测序及比较基因组分析，发现每个大豆品种中有1,000~3,000个品种特有的基因。
高变区变异检测
在传统测序方法中，将研究物种短reads 比对参考基因组无法检测到变异位点；在全基因组de novo 方法中，将组装后的超长序列比对参考基因组可准确识别高变区域内的所有变异位点。性状解析方案设计
通过对重要品种高深度(>100X)测序，并进行基因组组装注释：
找到传统测序无法鉴定的高度变异位点，找到更多更准确的SNP位点；找到参考基因组中
所不存在的基因——品种特有基因。
2. 耐盐大豆耐盐基因的发现
2014年，研究人员对一株耐盐大豆开展了全基因组de novo 测序，并与栽培大豆基因组进行全基因组比对，通过一条跨过长达388 Kb 的重要功能区的scaffold，发现了巨大的结构变异，从而成功鉴定出耐盐基因。该基因在栽培大豆中被插入了一个长达3.4 Kb 的反转座子，影响了阳离子转运体功能，从而使栽培大豆失去了耐盐能力。
传统的测序手段，采用的是短reads 比对，因而对这类大的结构变异检测精度差、灵敏度低、甚至难以实现检测，而全基因组de novo 测序则能很好的克服该问题。阅读原文>>
案例分享
1. 丹娜葡萄全基因组测序揭示高丹宁含量性状的分子机制
丹娜葡萄被认为是丹宁含量最高的葡萄品种之一，由于富含丹宁等抗氧化分子，被认为有延缓衰老的作用。通过对其基因组测序，研究人员发现与丹宁合成有关的关键酶，几乎都能找到新的基因。很显然，只依赖已有的参考基因组，完全无法了解丹娜葡萄高丹宁含量这一性状的遗传基础，而全基因组de novo 测序则完美回答了该问题。阅读原文>>
重要品种基因组的价值
一些物种，虽然已有参考基因组，但仍然无法找到性状关联基因。
一方面，参考基因组与研究物种差异太大；
另一方面，性状相关基因处于基因组快速进化区域，变异极大，传统测序手段难以鉴定。
目前，de novo测序在有参品种重要性状探究方面的应用愈发广泛，
相关研究结果常见于国际顶级杂志上。
基因组重测序 背景介绍 全基因组重测序，是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。与已知序列比对，寻找单核苷酸多态性位点（SNP ）、插入缺失位点（InDel ，Insertion/Deletion ）、结构变异位点（SV ，Structure Variation ）位点及拷贝数变化(CNV) 。 可以寻找到大量基因差异，实现遗传进化分析及重要性状候选基因的预测。涉 及临床医药研究、群体遗传学研究、关联分析、进化分析等众多应用领域。 随着测序成本的大幅度降低以及测序效率的数量级提升， 全基因组重测序已经成为研究人类疾病及动植物分子育种最为快速有效的方法之一。利用illumina Hiseq 2000 平台，将不同插入片段文库和双末端测序相结合，可以高效地挖掘基因序列差异和结构变异等信息， 为客户进行疾病研究、分子育种等提供准确依据。 重测序的两个条件：（1）该物种基因组序列已知；（2）所测序群体之间遗传性差异不大（ >99% 相似度 ） 在已经完成的全基因组测序及其基因功能注释的基础上，采用全基因组鸟枪法（WGS ）对DNA 插入片段进行双末端测序。 技术路线 生物信息学分析
送样要求 1.样品总量：每次样品制备需要大于5ug 的样品。为保证实验质量及延续性，请一次性提供至少20ug的样品。如需多次制备样品，按照制备次数计算样品总量。 2.样品纯度：OD值260/280应在1.8～2.0 之间；无蛋白质、RNA或肉眼可见杂质污染。 3.样品浓度：不低于50 ng/μL。 4.样品质量：基因组完整、无降解，电泳结果基因组DNA主带应在λ‐Hind III digest 最大条带23 Kb以上且主带清晰，无弥散。 5.样品保存：限选择干粉、酒精、TE buffer或超纯水一种，请在样品信息单中注明。 6.样品运输：样品请置于1.5 ml管中，做好标记，使用封口膜封好；基因组DNA如果用乙醇沉淀，可以常温运输；否则建议使用干冰或冰袋运输，并选择较快的运输方式。 提供结果 根据客户需求，提供不同深度的信息分析结果。
6 首页 科技服务 医学检测 科学与技术 市场与支持 加入我们 关于我们提供领先的基因组学解决方案 Providing Advanced Genomic Solutions 诺禾致源 人类疾病基因组重测序分析图3 Circos 图 人类基因组重测序分析6项升级 Novo-Zhonghua Genomes 数据库注释 一些位点的突变可能在千人基因组中或在欧美人群中属于低频突变，但是对于中国人群来说却是常见突变。诺禾致源自建中国人数据库 Novo-Zhonghua Genomes，数据库中的所有样本均来自正常中国人群。已有研究表明，与国际通用的多人种数据库相比，使用单一人种数据库进行疾病研究，可以有效减少假阳性现象。 图2 真核生物基因的结构[6] 复杂疾病变异分类标准 DamLevel Variant Calling Variant Annotation Benign Likely Benign VUS Likely Pathogenic Custom knowledge Clinical Data Pathogenic Family Testing Published + in house data Population frequency Predictions: PolyPhen, SIFT, etc Amino acid conservation Published Disease Information Variant classification Candidate Variants Novo-Zhonghua Genomes 数据库注释 复杂疾病突变位点有害性分类 非编码区（Non-coding region）分析 疾病基因组 CNV/SV 分析 基于基因（Gene-based）的 Burden Analysis （复杂疾病散发样本） 可视化的数据结果展示 基于健康中国人群的千人测序数据，测序深度 > 30× 参考 ACMG 等，推出针对复杂疾病变异位点有害性的分类标准 应用 ENCODE 数据库最新内容，并结合国际通用数据库、自建数 复杂疾病突变位点有害性分类 基于美国医学遗传学会 ACMG[2]与 Duzkale H[3]提出的变异分类标准，诺禾致源疾病基因组信息分析团队推出了一套针对复杂疾病变异位点有害性的分类标准 DamLevel（如下图所示）。DamLevel 将变异位点的有害性分为5个层级：Pathogenic、Likely Pathogenic、VUS(Variant of uncertain significance)、Likely Begnin、Begnin，更好地鉴定个体遗传变异与疾病的相关性。 非编码区（Non-coding region）分析 基因组非编码区变异可以引发多种疾病，包括心脏类疾病、糖尿病、癌症、肥胖症等[4,5]，但目前对非编码区突变的筛选和功能描述仍具挑战性。诺禾致源非编码区分析，应用 ENCODE 数据库最新内容对非编码区突变进行注释，通过国际通用数据库和自建的 Novo-Zhonghua Genomes 数据库进行频率筛选以及保守性过滤，精确定位非编码区中低频且保守的突变，筛选到与疾病相关的非编码区突变。 疾病基因组 CNV/SV 分析 CNV/SV 与基因表达、表型、人类疾病发生发展都有着非常密切的关系[7,8]，诺禾致源疾病基因组信息分析团队研发了一整套 CNV/SV 筛选方法，包括有害性 CNV/SV 筛选和 de novo CNV/SV 分析（基于成三或成四家系）等。利用 DGV、DECIPHER、CNVD 等数据库对变异检出结果进行标记，从结果中进一步过滤掉良性 CNV/SV，经过一系列筛选后，准确鉴定个体 CNV/SV 遗传变异与疾病的相关性。 图4 CNV 分布图 表1 本次产品升级亮点 图5 Burden 分析结果的热图展示 1 2 3 4 5 Novo-Zhonghua Genomes 数据库注释 Novo-Zhonghua Genomes 数据库是诺禾致源自建针对 中国正常人群的数据库，助 力中国人群基因组信息解析。 复杂疾病突变位点 有害性分类 诺禾致源推出的复杂疾病变 异位点有害性的分类标准 （DamLevel），准确标识复杂 疾病的致病性突变位点。 非编码区 （Non-coding region）分析 应用 ENCODE 数据库最新内 容对非编码区进行注释、筛 选，精确定位非编码区中低 频且保守的突变。 疾病基因组 CNV/SV 分析 完整的有害性 CNV/SV 筛选 和 de novo CNV/SV 分析， 准确鉴定个体 CNV/SV 遗传 变异与疾病的相关性。 基于基因 （Gene-based）的 Burden Analysis 针对复杂疾病的研究，通过 检测疾病状态与基因变异的 相关性，寻找特定疾病（或 性状）的易感基因。 可视化的 数据结果展示 灵活易用的测序数据结果展 示，使大量复杂数据的分析 变得轻松而高效，提高数据 可读性。 ? log 10 ( P ? value ) Mutations of Genes Prioritized by Burden Analysis CIR1 PIGP CTSE PRB2 CYP HDAC1 GRK6 PIGK MYL6B EHD2 0810 246 Mutations 4 3 2 1 基于基因（Gene-based）的 Burden Analysis 关联分析是研究复杂疾病的1个重要方法，其通过检测疾病状态与基因变异的相关性，寻找特定疾病（或性状）的易感基因。通常是在具有不同表型的2组个体（一般为患病者和正常对照者）中，基于遗传位点（或基因、单体型）的频率分布差异，间接反映该遗传位点（或基因）可能与疾病（或性状）存在关联性。 Burden Analysis（Gene-based）基于复杂疾病的 case 和 control 散发样本，通过 Fisher's exact test 以及 SKAT 统计方法分析得到候选基因，针对候选基因可以进行富集分析（KEGG 富集分析和 GO 富集分析）与蛋白网络互作分析。 可视化的结果展示 诺禾致源疾病基因组信息分析团队，会为客户提供不断更新的变异注释、项目特异性分析和灵活易用的“变异-基因-疾病”可视化结果，让科学研究更轻松。 图6 疾病与基因关联性展示图 产品名称升级亮点 引领行 业新 标杆 参考文献 [1] Nagasaki M, Yasuda J, Katsuoka F, et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals.[J]. Nature Communications, 2015, 6. 阅读原文 >> [2] Richards S, Aziz N, Bale S, et al Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology[J]. Genetics in Medicine, 2015. 阅读原文 >> [3] Duzkale H, Shen J, McLaughlin H, et al. A systematic approach to assessing the clinical significance of genetic variants[J]. Clinical genetics, 2013, 84(5): 453-463. 阅读原文 >> [4] Yoshinari M, Akihiko M, Dongquan S, et al. A functional polymorphism in the 5' UTR of GDF5 is associated with susceptibility to osteoarthritis.[J]. Nature Genetics, 2007, 39(4):529-33. 阅读原文 >> [5] Kjong-Van L, Ting C. Exploring functional variant discovery in non-coding regions with SInBaD.[J]. Nucleic Acids Research, 2012, 41 (1):e7-e7. 阅读原文 >> [6] https://https://www.doczj.com/doc/4b17066374.html,/wiki/Regulatory_sequence 阅读原文 >> [7] Sudmant P H, Rausch T, Gardner E J, et al. An integrated map of structural variation in 2,504 human genomes.[J]. Nature, 2015, 526 (7571):75-81. 阅读原文 >> [8] Birney E, Soranzo N. Human genomics: The end of the start for population sequencing.[J]. Nature, 2015, 526(7571):52-3. 阅读原文 >> 免费升级7-9月 新签合同 免费升级数据分析
全基因组重测序数据分析 1. 简介(Introduction) 通过高通量测序识别发现de novo的somatic和germ line 突变，结构变异-SNV，包括重排 突变（deletioin, duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；针对重排突变和SNP的功能性进行综合分析；我们将分析基因功能（包括miRNA），重组率（Recombination）情况，杂合性缺失（LOH）以及进化选择与mutation之间的关系；以及这些关系将怎样使 得在disease（cancer）genome中的mutation产生对应的易感机制和功能。我们将在基因组 学以及比较基因组学，群体遗传学综合层面上深入探索疾病基因组和癌症基因组。 实验设计与样本 （1）Case-Control 对照组设计； （2）家庭成员组设计：父母-子女组（4人、3人组或多人）； 初级数据分析 1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。 2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。并根据参考基 因组信息对检测到的变异进行注释。 4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。对于每个InDel的检测，至少需 要3个Paired-End序列的支持。 5．Structure Variation检测及在基因组中的分布: 能够检测到的结构变异类型主要有：插入、缺失、复制、倒位、易位等。根据测序个体序列与参考基因组序列比对分析结果，检测全基因组水平的结构变异并对检测到的变异进行注释。
什么是高通量测序？ 高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。 什么是Sanger法测序（一代测序） Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP 缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing） 全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。 什么是de novo测序 de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，大规模基因组测序渐入佳境，基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。 什么是外显子测序（whole exon sequencing） 外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。 什么是mRNA测序（RNA-seq） 转录组学（transcriptomics）是在基因组学后新兴的一门学科，即研究特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA（包括mRNA和非编码RNA）的类型与拷贝数。Illumina 提供的mRNA测序技术可在整个mRNA领域进行各种相关研究和新的发现。mRNA测序不对引物或探针进行设计，可自由提供关于转录的客观和权威信息。研究人员仅需要一次试验即可快速生成完整的poly-A尾的RNA完整序列信息，并分析基因表达、cSNP、全新的转录、全新异构体、剪接位点、等位基因特异性表达和罕见转录等最全面的转录组信息。简单的样
高通量基因组测序中，什么是测序深度和覆盖度？ 1G=1024M 测序深度是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。假设一个基因大小为2M，测序深度为10X，那么获得的总数据量为20M。(测序深度=总数据量20M/基因组大小2M=10X) 覆盖度是指测序获得的序列占整个基因组的比例。由于基因组中的高GC、重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接组装获得的序列往往无法覆盖有所的区域，这部分没有获得的区域就称为Gap。例如一个细菌基因组测序，覆盖度是98%，那么还有2%的序列区域是没有通过测序获得的。 1、全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因 序的个体，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸多态性位点(SNP)，插入缺失位点(InDel，Insertion/Deletion)、结构变异位点(SV， 技术路线 提取基因组DNA，利用Covaris进行随机打断，电泳回收所需长度的DNA片段(0.2~5Kb)，加上接头, 进行cluster制备(Solexa)或E-PCR (SOLiD)，最后利用Paired-End(Solexa)或者Mate-Pair(SOLiD)的方法对插入片段进行重测序。图1-1，以SOLiD为例，说明整个实验方案。
也称目标外显子组捕获，是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA 捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。是一种选择基因组的编码序列的高效策略，外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel 等具有较大的优势。 外显子(expressed region)是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。外显子是最后出现在成熟RNA中的基因序列，又称表达序列。既存在于最初的转录产物中，也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列。在人类基因中大约有180,000外显子，占人类基因组的1%，约30MB。
DNA样品总量: ≥3 μg 适用范围 样品要求 文库类型测序策略与深度 分析内容项目周期 群体进化（基于全基因组重测序） 标准分析时间为120天，个性化分析需根据项目实际情况进行评估 HiSeq PE150推荐测序深度≥5X/个体350 bp小片段DNA文库 1. 已有参考基因组序列的物种中不同亚群（自然群体） 2. 各亚群间划分明显，同一亚群内的个体有一定代表性 3. 每个亚群选取10个样本左右（推荐动物≥10个，植物≥15个） 4. 总体不少于30个样本与参考基因组比对群体SNP检测、注释及统计系统进化树构建群体遗传结构分析 群体主成分分析连锁不平衡分析选择消除分析候选基因GO和KEGG富集构建单体型图谱种群历史和有效群体大小 技术参数 针对已有参考基因组的物种，对其各亚种进行全基因组重测序获得基因组信息，通过与参考基因组比对，得到大量高准确性的SNP、InDel、SV等变异信息，讨论群体的遗传结构、遗传平衡和影响遗传平衡的因素，从而从分子层面揭示该物种的进化机制、环境适应性等系列问题。该技术能精准地得到全基因组内所有遗传信息，最大程度地挖掘出群体内遗传变异。诺禾具有丰富的群体遗传学项目经验，研究成果发表于Nature Genetics（Li, M, et al. 2013& Zhou, XM, et al. 2014）等。参考文献 [1] Li M, Tian S, Jin L, et al . Genomic analyses identify distinct patterns of selection in domesticated pigs and Tibetan wild boars [J]. Nature genetics, 2013, 45(12): 1431-1438. [2] Zhan S, Zhang W, Niitepo ～ld K, et al . The genetics of monarch butterfly migration and warning colouration [J]. Nature, 2014.案例解析 ［案例一］ 家猪和藏猪的群体进化分析[1] 2013年，诺禾致源科技服务团队与四川农业大学研究者合作发表 该成果。本研究对6个代表性藏猪群体、5个四川盆地特有猪种， 共48个样本进行全基因组重测序，并结合55个欧亚野猪及家猪的 基因组数据进行群体遗传学分析。在藏猪中鉴定出低氧适应、能 量代谢等共268个适应高原环境的快速进化基因，揭示了藏猪高 原适应性的遗传机制。与自然选择相比，人工选择可更有效地塑 造驯养动物基因组；欧亚猪种存在明显的遗传背景差异，欧亚地 理隔离造成的遗传结构差异甚至超过了野生和驯化的差异。［案例二］ 帝王蝶长距离迁飞遗传机制被解密[2] 北美地区的帝王蝶具有迁飞习性，而分布于热带地区的帝王蝶及 其近缘种不具有迁飞特性。该研究从涵盖当今世界上主要的帝王 蝶分布区域中，选取了包括迁飞型和非迁飞型的22个地理种群、 5个近缘种的101只班蝶属蝴蝶进行了全基因组重测序和群体遗传 学分析。结果表明，现存的帝王蝶起源于北美地区，且祖先属于 迁飞型，打破了先前认为包括鸟类等在内的迁飞物种均是热带起 源的普遍认知。其次，利用群体遗传学分析对全基因组进行精细 扫描发现，与飞行相关的肌肉发育进化是帝王蝶实现长距离迁飞 的主要适应性选择。 图1 藏猪及其它猪种的群体遗传结构 图2 帝王蝶样本分布及系统进化树
高通量测序基础知识汇总 一代测序技术：即传统的Sanger测序法，Sanger法是根据核苷酸在待定序列模板上的引物点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，通过检测得到DNA碱基序列。 二代测序技术：next generation sequencing（NGS）又称为高通量测序技术，与传统测序相比，二代测序技术可以一次对几十万到几百万条核酸分子同时进行序列测定，从而使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序（Deep sequencing）。NGS主要的平台有Roche（454 & 454+），Illumina（HiSeq 2000/2500、GA IIx、MiSeq），ABI SOLiD等。 基因：Gene，是遗传的物质基础，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。基因通过复制把遗传信息传递给下一代，使后代出现与亲代相似的性状。 DNA：Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸，一个脱氧核苷酸分子由三部分组成：含氮碱基、脱氧核糖、磷酸。脱氧核糖核酸通过3',5'-磷酸二酯键按一定的顺序彼此相连构成长链，即DNA链，DNA链上特定的核苷酸序列包含有生物的遗传信息，是绝大部分生物遗传信息的载体。
高通量测序基础知识简介 陆桂 什么是高通量测序？ 高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变,一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。 什么是Sanger法测序（一代测序） Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing） 全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。 什么是de novo测序 de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，大规模基因组测序渐入佳境，基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。 什么是外显子测序（whole exon sequencing） 外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。
高通量测序领域常用名词解释大全 什么是高通量测序？ 高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。 什么是Sanger法测序（一代测序） Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing） 全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。 什么是de novo测序 de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，大规模基因组测序渐入佳境，基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。
全基因组从头测序(de novo测序) https://www.doczj.com/doc/4b17066374.html,/view/351686f19e3143323968936a.html 从头测序即de novo 测序，不需要任何参考序列资料即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、细菌、真菌的全基因组序列，从而推进该物种的研究。一个物种基因组序列图谱的完成，意味着这个物种学科和产业的新开端！这也将带动这个物种下游一系列研究的开展。全基因组序列图谱完成后，可以构建该物种的基因组数据库，为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台；为后续的基因挖掘、功能验证提供DNA序列信息。华大科技利用新一代高通量测序技术，可以高效、低成本地完成所有物种的基因组序列图谱。包括研究内容、案例、技术流程、技术参数等，摘自深圳华大科技网站 https://www.doczj.com/doc/4b17066374.html,/service-solutions/ngs/genomics/de-novo-sequencing/ 技术优势: 高通量测序：效率高，成本低；高深度测序：准确率高；全球领先的基因组组装软件：采用华大基因研究院自主研发的SOAPdenovo软件；经验丰富：华大科技已经成功完成上百个物种的全基因组从头测序。 研究内容: 基因组组装■K-mer分析以及基因组大小估计；■基因组杂合模拟（出现杂合时使用）； ■初步组装；■GC-Depth分布分析；■测序深 度分析。基因组注释■Repeat注释； ■基因预测；■基因功能注释；■ ncRNA 注释。动植物进化分析■基因家族鉴定（动物TreeFam；植物OrthoMCL）；■物种系统发育树构建； ■物种分歧时间估算（需要标定时间信息）；■基因组共线性分析； ■全基因组复制分析（动物WGAC；植物WGD）。微生物高级分析 ■基因组圈图；■共线性分析；■基因家族分析； ■CRISPR预测；■基因岛预测（毒力岛）； ■前噬菌体预测；■分泌蛋白预测。 熊猫基因组图谱Nature. 2010.463:311-317. 案例描述 大熊猫有21对染色体，基因组大小2.4 Gb，重复序列含量36%，基因2万多个。熊猫基因组图谱是世界上第一个完全采用新一代测序技术完成的基因组图谱，样品取自北京奥运会吉祥物大熊猫“晶晶”。部分研究成果测序分析结果表明，大熊猫不喜欢吃肉主要是因为T1R1基因失活，无法感觉到肉的鲜味。大熊猫基因组仍然具备很高的杂合率，从而推断具有较高的遗传多态性，不会濒于灭绝。研究人员全面掌握了大熊猫的基因资源，对其在分子水平上的保护具有重要意义。 黄瓜基因组图谱黄三文, 李瑞强, 王俊等. Nature Genetics. 2009. 案例描述国际黄瓜基因组计划是由中国农业科学院蔬菜花卉研究所于2007年初发起并组织，并由深圳华大基因研究院承担基因组测序和组装等技术工作。部分研究成果黄瓜基因组是世界上第一个蔬菜作物的基因组图谱。该项目首次将传
差异位点分析流程步骤分解 数据准备： mkdir 1.QC cd 1.QC ln -s /root/mdna-data/reseq/1.QC/*.fastq . Ls cd .. mkdir 2.mapping cd 2.mapping ln -s /root/mdna-data/reseq/2.mapping/ref.fasta . 步骤1：参考基因建索引 cd 2.mapping ##bwa建索引： bwa index ref.fasta Expected Result：得到一系列BWA 进行alignment 需要的文件。 ##samtools建索引： samtools faidx ref.fasta Expected Result：生成refgene.fasta.fai。每行都是fasta 文件中每条contig 的record，每条record 由contig name, size, location, basesPerLine 和bytesPerLine 组成。 ##生成字典： java -jar /root/mdna_software/picard-tools-1.102/CreateSequenceDictionary.jar R=ref.fasta O=ref.dict Expected Result：生成refgene.dict。描述fasta 文件内容，类似SAM header 格式。 步骤2：bwa比对 ##用bwa作比对： nohup bwa aln -e 3 -i 10 -t 1 -R 100 -q 20 ref.fasta ../1.QC/test_trim1.fastq -f 1.sai & nohup bwa aln -e 3 -i 10 -t 1 -R 100 -q 20 ref.fasta ../1.QC/test_trim2.fastq -f 2.sai & nohup bwa aln -e 3 -i 10 -t 1 -R 100 -q 20 ref.fasta ../1.QC/test_trim_unpaired.fastq -f s.sai & jobs
首页 科技服务 医学检测 科学与技术 市场与支持 加入我们 关于我们 提供领先的基因组学解决方案Providing Advanced Genomic Solutions 参考文献 [ 1 ] Li Y, Zhou G, Jiang W, et al. De novo assembly of soybean wild relatives for pan-genome analysis of diversity and agronomic traits[J]. Nature biotechnology, 2014, 32(10): 1045-1052. [ 2 ] Da Silva C, Zamperin G, et al. The high polyphenol content of grapevine cultivar tannat berries is conferred primarily by genes that are not shared with the reference genome. Plant Cell, 2013, 25(12):4777-88. [ 3 ] Qi XP, Li M, et al. Identification of a novel salt tolerance gene in wild soybean by whole-genome sequencing. Nature Communica－ tions, 2014(5). 挖掘特异基因 解析特有性状 重要品种 全基因组 de novo 所研究品种 小片段文库大片段文库 HiSeq测序(>100X) 基因组组装 注释 全基因组序列比对 转录组遗传图谱等辅助验证 重要农艺性状解析 基因家族聚类分析 所研究品种基因组序列 已发表品种 基因组序列 已发表品种基因集合 所研究品种基因集合 变异检测 小的插入 缺失 SNP 倒位 易位大的插入 缺失 基因挖掘 新基因鉴定拷贝数扩增基因基因丢失正选择基因鉴定 物种 品种 发表杂志（年份） 物种 品种发表杂志（年份） 大豆 棉花 番茄 土豆 水稻 葡萄猪栽培大豆7种野生大豆 野生耐盐大豆雷德氏棉 亚洲棉 陆地棉栽培番茄 抗病番茄栽培土豆 耐寒土豆 Nature (2010) Nature Biotechnology (2014) Nature Communications (2014) Nature (2012)Nature Genetics (2014)Nature Biotechnology (2015)Nature (2012) Nature Genetics (2014) Nature (2011) Plant Cell (2015) 栽培水稻（粳稻）栽培水稻（籼稻） 短花药野生稻 非洲栽培稻五种野生稻三种栽培稻葡萄 丹娜葡萄杜洛克猪藏猪 Science (2002)Science (2002) 野生大豆泛基因组 阅读原文>> 诺禾致源的项目经验 诺禾致源在动植物全基因组测序领域一直处于领先地位， 以第一通讯作者发表基因组文章5篇（影响因子累计152.474），其中2篇为杂志封面文章。 近年来，诺禾通过自主研发软件与技术革新，成功地将项目周期压缩至14个月内，费用降低一半以上。 特有基因检测 对7株代表性野生大豆品种进行全基因组de novo 测序及比较基因组分析，发现每个大豆品种中有1,000~3,000个品种特有的基因。 高变区变异检测 在传统测序方法中，将研究物种短reads 比对参考基因组无法检测到变异位点；在全基因组de novo 方法中，将组装后的超长序列比对参考基因组可准确识别高变区域内的所有变异位点。性状解析方案设计 通过对重要品种高深度(>100X)测序，并进行基因组组装注释： 找到传统测序无法鉴定的高度变异位点，找到更多更准确的SNP位点；找到参考基因组中 所不存在的基因——品种特有基因。 2. 耐盐大豆耐盐基因的发现 2014年，研究人员对一株耐盐大豆开展了全基因组de novo 测序，并与栽培大豆基因组进行全基因组比对，通过一条跨过长达388 Kb 的重要功能区的scaffold，发现了巨大的结构变异，从而成功鉴定出耐盐基因。该基因在栽培大豆中被插入了一个长达3.4 Kb 的反转座子，影响了阳离子转运体功能，从而使栽培大豆失去了耐盐能力。 传统的测序手段，采用的是短reads 比对，因而对这类大的结构变异检测精度差、灵敏度低、甚至难以实现检测，而全基因组de novo 测序则能很好的克服该问题。阅读原文>> 案例分享 1. 丹娜葡萄全基因组测序揭示高丹宁含量性状的分子机制 丹娜葡萄被认为是丹宁含量最高的葡萄品种之一，由于富含丹宁等抗氧化分子，被认为有延缓衰老的作用。通过对其基因组测序，研究人员发现与丹宁合成有关的关键酶，几乎都能找到新的基因。很显然，只依赖已有的参考基因组，完全无法了解丹娜葡萄高丹宁含量这一性状的遗传基础，而全基因组de novo 测序则完美回答了该问题。阅读原文>> 重要品种基因组的价值 一些物种，虽然已有参考基因组，但仍然无法找到性状关联基因。 一方面，参考基因组与研究物种差异太大； 另一方面，性状相关基因处于基因组快速进化区域，变异极大，传统测序手段难以鉴定。 目前，de novo测序在有参品种重要性状探究方面的应用愈发广泛， 相关研究结果常见于国际顶级杂志上。
基于全基因组重测序获得的具LRR结构域基因的抗黄瓜白粉病 功能鉴定 黄瓜白粉病是黄瓜(CucumissativusL.)生产上的三大主要病害之一,发病时不但降低植株的光合效能,同时影响植株产量和果实品质,发病严重时常常引起30%左右的减产。黄瓜抗白粉病新品种选育及应用是克服白粉病危害的根本技术途径。 基于基因组测序技术和生物信息学的方法探究抗病基因已成为可能。本研究利用高通量Illumina测序技术,对实验室多年筛选获得的一个具有高抗白粉病且能稳定遗传的片段代换系SSL508-28和高感白粉病受体亲本D8进行了全基因组重测序,对比黄瓜9930参考基因组信息,在SSL508-28中发现了 468,616 个单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和 67,259小片段插入缺失位点(insertion/deletion,InDel),在D8 中获得了 537,352 个 SNPs 和 91,698个InDels。 通过对比SSL508-28与D8基因组,共得到了 15,682个SNPs和6,262个InDels,这些SNPs和InDels趋向于集中分布在五号染色体上。基于以上结果,我们对获得的SNPs和InDels进行了功能注释,发现有120个SNPs为非同义(non-synonymous)突变,30个InDels为移码突变(frameshift mutation),这些非同义突变SNPs和移码突变InDels分布在94个基因当中。 为了进一步验证94个突变基因对SSL508-28抗白粉病表型的贡献,我们对这94个基因进行了功能分类,其中有5个基因属于抗病(resistance,R)基因家族中NBS-LRR(Nucleotide binding site-leucine-rich repeats)类,利用 qRT-PCR 对这 5 个NBS-LRR基因在D8和SSL508-28中接种白粉菌前后的表达量进行检测,
De novo测序文库构建方法 一、De novo测序的原理 De novo测序不需要任何参考序列，即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。 利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、微生物的全基因组序列，从而推进该物种的研究。 De novo测序没有参考序列，需要建立不同片段大小及类型的测序文库，测序后的信息需要组装和拼接。 拟构建200bp和400bp Ion测序文库，以及Ion mate-pair测序文库。 二、文库构建技术路线 1. Ion 200 or 400-base-read library Workflow 基因组DNA提取 ↓ OD260/280检测，凝胶电泳检测，基因组大小评估，基因组定量 ↓ 超声波打断 ↓ 末端修复 ↓片段纯化 接头连接 ↓纯化 文库片段筛选（E-Gel胶回收） ↓ 文库片段扩增 ↓纯化 Agilent检测，Qubit定量 ↓
OneTouch、ES ↓ 上机测序 2. Ion mate-pair library 基因组DNA提取 ↓ 基因组定量检测 ↓ DNA破碎（HydroShear DNA Shearing Device）（压力挤压破碎大片段DNA） ↓ 末端修复 ↓ 文库片段选择（凝胶电泳，SOLiD凝胶回收试剂盒纯化） ↓ 文库片段定量 ↓ MP接头连接（SOLiD MP接头连接试剂盒） ↓纯化 Qubit定量 ↓ 确定DNA回收量，确定回收到的片段含量（含量不同，使用的试剂量不同） ↓ DNA片段环化 ↓ 分离纯化环状DNA ↓ 定量 ↓
环化DNA缺口修复及SOLiD文库试剂盒纯化 ↓ T7核酸外切酶、S1核酸酶酶切 ↓纯化 末端修复 ↓ 文库片段于链霉素亲和素微珠相连 ↓ 连接Ion接头 ↓ 缺口修复、与扩增凝胶条带检测（确定循环数） ↓ 片段扩增 ↓SOLiD试剂盒纯化 片段切胶回收 ↓ Agilent检测 ↓ Q-PCR定量 ↓ 文库构建完成 三、文库构建用到的试剂盒 Ion Library Adaptors and Primers and 5500 SOLiD Mate-Paired Library Kit Mate-Paired Library Enzyme Module Mate-Paired Library Amplification Module Mate-Paired Library Oligo module Library Micro Column Purification Kit Agencourt AMPure XP 60 mL Kit