2014年的诺贝尔理综奖颁发给了“超分辨荧光显微技术”。也许接下来的几天，媒体会关注StefanHell、EricBetzig二人的传奇经历，或者另一名华人女科学家与该奖项失之交臂的遗憾。但是八卦之外，这项成果背后的科学本身也非常有意思。 这里面有三个关键词：“超分辨”、“荧光”和“显微技术”，我希望能够解释清楚以下几个问题，尤其是后两个问题： 1.为什么需要（光学）显微技术？ 2.为什么光学显微镜的分辨率存在理论极限？ 3.用怎样的方法可以突破这个理论极限以达到“超分辨”？为什么这个理论极限可以被突破？ 5.为什么非得是荧光显微技术，而非普通的明场（透射光）显微技术？ 1.采样定理与显微镜 我们用肉眼观察或者用相机拍摄一个物体时，物体上的每一个细微的点都会在眼睛的视网膜或是相机的感光芯片上成像。那么我们为什么不能看到细菌等微小的东西，为什么不能把照片无限放大以看清远处树木上面的每一片叶子呢？ 这个问题的答案比较简单：因为组成视网膜的每一个感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）、相机芯片上的每一个感光元件（CCD、CMOS等）都是有大小的。比如视网膜中央凹区域的视锥细胞直径平均约为5微米。而由于奈奎斯特-香农采样定理的限制，视网膜上能分清的两个相邻像点的距离是视锥细胞直径的两倍，即10微米。再结合眼球的构造，大致可以推断出，在距离眼睛25厘米的位置，我们能分辨物体上相距为80微米的两个点，换算成点阵密度就是大约320ppi，这也是苹果所谓“视网膜屏”分辨率的来历。
如果要观察小于80微米的物体，比如细菌，就需要先将物体放大，再用眼睛或者相机观察。现代光学显微镜的构造其实非常简单，样品放置在物镜的焦点处，从样品上发射或散射的光经过物镜变成平行（准直）光，再经过一个结像透镜，然后会聚到相机的感光芯片上成像。 按照前面的方法来推算，要区分物体上相距为200纳米的两个点，如果使用科研级相机，比如最近火起来的sCMOS相机（每个感光像素尺寸为6.5微米），只需要使用放大倍率为65倍的物镜就足够了。 那么是否可以通过提高物镜的放大倍率来观察低于200纳米的物体，比如细胞里面微管呢？ 答案是不可以。 2.光学衍射极限 由于光是一种电磁波，具有衍射和干涉的特性。 图1.光学显微镜简化示意图 如上面的简图所示，紫色箭头表示的物体PQ经过物镜等之后在相机上成像为 P'Q'。由于光的衍射，物体上的点如P、Q，在相机上并不是单独的点，而是一个个有一定大小的斑，被称为夫琅禾费衍射斑（或称艾里斑），如右侧的同心圆所示。那么，当P'、Q'相距太近的时候，两个斑会叠加导致难以分辨。这就要求物体上的P、Q要相距一定的距离。 1873年，德国物理学家、卡尔蔡司公司的恩斯特·阿贝（ErnstAbbe）首次推算出衍射导致的分辨率极限。根据瑞利判据——“当一个像斑的中心落到另一个像斑的边缘时，就算这两个像刚好能被分辨”，显微镜能分辨的物体上两点P、Q 的最小距离h为：
2014 年的诺贝尔理综奖颁发给了“超分辨荧光显微技术”。也许接下来的几天，媒体会关注 Stefan Hell、Eric Betzig 二人的传奇经历，或者另一名华人女科学家与该奖项失之交臂的遗憾。但是八卦之外，这项成果背后的科学本身也非常有意思。 这里面有三个关键词：“超分辨”、“荧光”和“显微技术”，我希望能够解释清楚以下几个问题，尤其是后两个问题： 1. 为什么需要（光学）显微技术？ 2. 为什么光学显微镜的分辨率存在理论极限？ 3. 用怎样的方法可以突破这个理论极限以达到“超分辨”？为什么这个理论极限可以被突破？ 5. 为什么非得是荧光显微技术，而非普通的明场（透射光）显微技术？ 1. 采样定理与显微镜 我们用肉眼观察或者用相机拍摄一个物体时，物体上的每一个细微的点都会在眼睛的视网膜或是相机的感光芯片上成像。那么我们为什么不能看到细菌等微小的东西，为什么不能把照片无限放大以看清远处树木上面的每一片叶子呢？ 这个问题的答案比较简单：因为组成视网膜的每一个感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）、相机芯片上的每一个感光元件（CCD、CMOS等）都是有大小的。比如视网膜中央凹区域的视锥细胞直径平均约为 5 微米。而由于奈奎斯特-香农采样定理的限制，视网膜上能分清的两个相邻像点的距离是视锥细胞直径的两倍，即 10 微米。再结合眼球的构造，大致可以推断出，在距离眼睛 25 厘米的位置，我们能分辨物体上相距为 80 微米的两个点，换算成点阵密度就是大约 320 ppi，这也是苹果所谓“视网膜屏”分辨率的来历。 如果要观察小于 80 微米的物体，比如细菌，就需要先将物体放大，再用眼睛或者相机观察。现代光学显微镜的构造其实非常简单，样品放置在物镜的焦点处，从样品上发射或散射的光经过物镜变成平行（准直）光，再经过一个结像透镜，然后会聚到相机的感光芯片上成像。 按照前面的方法来推算，要区分物体上相距为 200 纳米的两个点，如果使用科研级相机，比如最近火起来的 sCMOS 相机（每个感光像素尺寸为 6.5 微米），只需要使用放大倍率为 65 倍的物镜就足够了。 那么是否可以通过提高物镜的放大倍率来观察低于 200 纳米的物体，比如细胞里面微管呢？ 答案是不可以。 2. 光学衍射极限 由于光是一种电磁波，具有衍射和干涉的特性。
超分辨显微成像技术的新发展 马利红 引言 人类获得信息的主要器官是眼睛，然而靠人眼观察客观事物的空间分辨率的极限约为4 ′米，客观世界中人眼不能分辨的所有细微结构称为微观世界。显微成像技术将310- 微观过程或结构成放大图像，以便于人眼能够直接观察。研究微观世界所涉及的学科领域十分广泛，有生物、医学、材料科学、精密机械、微电子学、分子及原子物理、核物理等等，微观世界中细分的微量尺度原则上是无穷的，因而显微学是跨多学科的，其发展也是无止境的。 1665年，Robert Hooke用原始显微镜发现了池塘水中单细胞有机体，它的出现为人类打开了微观世界的大门。光学显微镜由此成为历代生物学家的主要研究工具之一。生物学家把显微镜作为一种主要工具来研究生物器官、组织和细胞，由此奠定了细胞学和组织学的基础，并对生物学、遗传学、微生物学、病理学和医学的发展起到了极大的推动作用。但传统光学显微镜有以下两个主要缺点：(1)受衍射极限的限制，其分辨率与照明波长是同一个数量级，具有一个数值孔径(NA=nsin(q))的传统光学显微镜，分辨极限l，称之为瑞利判据；(2)由于使用的是场光源，观测到的是一个宽视野图像，为0.61/NA 从而降低了信噪比，影响了图像的清晰度和分辨率。随着生物医学、材料科学等的发展对显微提出了更高的要求，不仅希望其具有更高的分辨率，而且能对样品进行无损成像，甚至希望可观察其三维图像。因此，传统的显微镜已不能满足要求。 电子显微镜的分辨率虽然远高于光学显微镜，但它需要在真空条件下工作，因此很难观察活的生物样品，另外电子束的照射也会使生物样品受到辐照损伤。电子显微镜、的局限以及高分辨显微的需求，迫使人们转向超经典衍射极限的光学超分辨理论和技术研究，利用新原理、新技术、新方法来实现光学高分辨力成像和检测。
2超分辨处理理论基础 2.1超分辨率基础知识 2.1.什么是分辨率 分辨率是屏幕图像的精密度，是指显示器所能显示的像素的多少。由于屏幕上的点、线和面都是由像素组成的，显示器可显示的像素越多，画面就越精细，同样的屏幕区域内能显示的信息也越多，所以分辨率是个非常重要的性能指标之一。可以把整个图像想象成是一个大型的棋盘，而分辨率的表示方式就是所有经线和纬线交叉点的数目。 分辨率决定了位图图像细节的精细程度。通常情况下，图像的分辨率越高，所包含的像素就越多，图像就越清晰，印刷的质量也就越好。同时，它也会增加文件占用的存储空间。 用于量度位图图像内数据量多少的一个参数。通常表示成ppi（每英寸像素）。包含的数据越多，图形文件的长度就越大，也能表现更丰富的细节。但更大的文件也需要耗用更多的计算机资源，更多的ram，更大的硬盘空间等等。在另一方面，假如图像包含的数据不够充分（图形分辨率较低），就会显得相当粗糙，特别是把图像放大为一个较大尺寸观看的时候。所以在图片创建期间，我们必须根据图像最终的用途决定正确的分辨率。这里的技巧是要首先保证图像包含足够多的数据，能满足最终输出的需要。同时也要适量，尽量少占用一些计算机的资源。 通常，“分辨率”被表示成每一个方向上的像素数量，比如640x480等。而在某些情况下，它也可以同时表示成“每英寸像素”（ppi）以及图形的长度和宽度。比如72ppi，和8x6英寸。 2.1.1什么是超分辨 图像的超分辨率(super resolution , SR)是指由一幅低分辨率图像(low resolution , LR)或图像序列恢复出高分辨率图像(high resolution , HR )。低分辨率 的图像包含的细节信息较少，但我们可以得到一系列低分辨率的图像，这些图像包含的部分细节信息各有不同，能够相互补充。通过这一系列低分辨的图像，经过一定的处理，可以得到一幅分辨率较高、包含信息较多的图像。这个处理过程就是超分辨率重建。 在图像采集系统中，光学传感器的分辨率不能满足一些特殊应用的需求，而且成像过程受加性噪声及透镜点扩散函数(PSF, Point Spread Function)的影响， 因此，图像成像过程只能获得降质的低分辨率图像}s-ion。尽管随着技术的进步，传感器的分辨率有了明显的提高，但受成本的影响，也限制了其使用范围，而且受工艺等因素的影响，依靠提高传感器的分辨率来提高图像质量的能力是有限的。按照傅立叶光学的观点，在成像系统中的光学透镜是一个低通滤波器，由于受到光学衍射的影响，其传递函数在由衍射极限分辨率所决定的某个截止频率以上的值均为零，图像超分辨率处理试图重构截止频率以外的信息。 另一方面，对于通常的图像显示设备具有固定的分辨率，而对低分辨率的图
突破衍射极限的超高分辨率成像技术发展(修改) -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
结课论文 题目突破衍射极限的超高分辨率成像的技术进展 学生姓名 学号 学院 专业 班级 二〇一五年十二月
一引言 1.1选题意义 光学显微成像具有极为悠久的历史，但一直以来，光学成像一直受到衍射极限的限制而分辨率无法突破200 nm。后来虽然有了电子显微镜、核磁共振显像、x光衍射仪等微观观测或者显像设备，但是使用光学显微镜可以在活体状态下观察生命体使得其在生物、医学观察方面仍有巨大优势。值得庆贺的是近年来，超高分辨率显微技术的发展使得光学显微成像分辨率达到了20 nm以下。其中德国科学家Stefan Hell、美国科学家Eric Betzig和William Moerner因其在超高分辨率显微技术方面的突出贡献获得了2014年的诺贝尔化学奖。在这篇文章中，我们就简要介绍一下超高分辨率显微技术的发展和应用，并对诸位大师致以敬意。 1.2技术 指标 显微技术成像优劣一般通过X-Y平面分辨率与Z 轴分辨率大小来判定，分辨率越高数值越 小。下表是各种显微成像技术的分辨率指标。
STED显微技术50-70 STED+4技术50 50 PALM技术20 30 3D STORM技术20-30 50-60 dSTORM技术30 50 2D SSIM技术50 3D SSIM技术100 200 电子显微镜 X光衍射仪
二衍射极限 衍射极限 我们能看到什么看到多小的范围看得有多清楚几百年来，依靠不断进步的科学手段，微观世界正一层层揭开面纱，让人们可以看得越来越“小”，进而可以进行研究。 人的肉眼能分辨毫米尺度的物体，再小，就要借助工具。1665年，英国科学家罗伯特·虎克制造了第一台用于科学研究的光学显微镜，用它观察薄薄的软木塞切片。虎克看到了残存的植物细胞壁，它们一个个像小房间一样紧挨在一起，这就是“细胞”一词的由来。 此后，显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，帮助科学家第一次发现了细菌和微生物。那么，光学显微镜是否可以无止境地“放大”下去，让我们想看到多小就能看到多小科学家为此做了很多尝试，最终发现，存在一道法逾越的“墙”—衍射极限。 1873年，德国科学家阿贝提出了衍射极限理论：光是一种电磁波，由于存在衍射，一个被观测的点经过光学系统成像后，不可能得到理想的点，而是一个衍射像，每个物点就像一个弥散的斑，如果这两个点靠得很近，弥散斑就叠加在一起，我们看到的就是一团模糊的图像。 阿贝提出，分辨率的极限近似于入射光波长的二分之一(d=λ/2)。可见光的波长通常在380~780纳米之间，根据衍射极限公式，光学显微镜的分辨率极限就在200纳米（微米）左右。如果物体小于微米，你仍旧看到的是一个模糊的光斑。这就是很长一段时间内，光学显微镜的分辨极限——衍射极限。
光学基础知识：摄影镜头调制传输函数MTF解读 作者：老顽童 镜头是摄影师和摄影爱好者投资最高的设备之一，也是决定拍摄质量的最重要的因素。因此，镜头的质量，历来受到极大的重视。我们当然会很关心摄影镜头的测量方法。 摄影的最终产品是照片，所以，根据拍摄照片的质量来评价镜头质量，这是我们最先想到的，也是最基本的测试镜头的方法。实拍照片评价镜头质量的优点是结果直截了当，根据效果判断，比较放心。不过决定照片质量的客观因素很多，而一张照片的“好”与“坏”又需要人的主观判断，很难通过测量得出客观的定量结果。大量的事实表明，影响拍摄质量最重要的因素是镜头的分辨率和反差。反差大小可以通过仪器很容易测量，而分辨率就不那么容易了！现在我们经常采用拍摄标准分辨率板的方法测量镜头的分辨率。将拍摄了标准分辨率板的底片放到显微镜下人工判读，看最高能够分辩多少线条密度。分辨率的单位是线对/毫米(lp/mm)，一黑一白两条线算是一个线对，每毫米能够分辩出的线对数就是分辨率的数值。由于这种方法还是要受到胶片分辨率的客观影响和人工判读的主观影响，所以并不是最准确最理想的方法。 现在，让我们从另一个角度出发，将镜头看作一个信息传递系统：被拍摄景物反射出来的光线是它的输入信息，而胶片上的成像就是它的输出信息。一个优秀的镜头意味着它的输出的像忠实的再现了输入方景物的特性。喜欢音响的朋友都知道，高保真放大器的输出，应当准确地再现输入信号(图1)。当输入端输入频率变化而幅度不变的正弦信号时，输出正弦波信号幅度的变化反映了放大器的频幅特性。频幅特性越平坦，放大器性能越好(图2)！ 图1 放大器准确再现输入信号
图2 放大器的频幅特性 类似的方法也可以用来描述镜头的特性。由数学证明可知，任何周期性图形都可以分解成亮度按正弦变化的图形的叠加，而任何非周期图形又可以看作是周期图形片断的组合。因此，研究镜头对正弦变化的图形的反映，就可以研究镜头的性能！亮度按正弦变化的周期图形叫做“正弦光栅”。为了描述正弦光栅的线条密度，我们引入了“空间频率”的概念。一般正弦波的频率指单位时间(每秒钟)正弦波的周期数，对应的，正弦光栅的空间频率就是单位长度(每毫米)的亮度按照正弦变化的图形的周期数。 图3 正弦光栅 典型的正弦光栅如图3所示。相邻的两个最大值的距离是正弦光栅的空间周期，单位是毫米。空间周期的倒数就是空间频率(Spatial Frequency)，单位是线对/毫米(lp/mm，linepairs/mm)。正弦光栅最亮处与最暗处的差别，反映了图形的反差(对比度)。设最大亮度为Imax，最小亮度为Imin，我们用调制度(Modulation)表示反差的大小。调制度M定义如下： M=(Imax－Imin)/(Imax＋Imin) 很明显，调制度介于0和1之间。调制度越大，意味着反差越大。当最大亮度与最小亮度完全相等时，反差完全消失，这时的调制度等于0。 我们将正弦光栅置于镜头前方、在镜头成像处测量像的调制度，发现当光栅空间频率很低时，像的调制度几乎等于正弦光栅的调制度；随着空间频率的提高，像的调制度逐渐单调下降；空间频率高到一定程度，像的调制度逐渐降低到0、完全失去了反差！ 正弦信号通过镜头后，它的调制度的变化是正弦信号空间频率的函数，这个函数称为调制传递函数MTF(Modulation Transfer Function)。对于原来调制度为M的正弦光栅，如果经过镜头到达像平面的像的调制度为M ’ ，则MTF函数值为： MTF值= M ’ / M 可以看出，MTF值必定介于0和1之间，并且越接近1、镜头的性能越好！ 如果镜头的MTF值等于1，镜头输出的调制度完全反映了输入正弦光栅的反差；而如果输入的正弦光栅的调制度是1，则输出图像的调制度正好等于MTF值！所以，MTF函数代表了镜头在一定空间频率下的反差。
2.1 正则化数学思想见解 正则化在线性代数理论中，不适定问题通常是由一组线性代数方程定义的，而且这组方程组通常来源于有着很大的条件数的不适定反问题。反问题有两种形式。最普遍的形式是已知系统和输出求输入，另一种系统未知的情况通常也被视为反问题。许多反问题很难被解决，但是其他反问题却很容易得到答案。显然，易于解决的问题不会比很难解决的问题更能引起人们的兴趣，我们直接解决它们就可以了。那些很难被解决的问题则被称为不适定的。 一个不适定问题通常是病态的，并且不论是简单地还是复杂地改变问题本身的形式都不会显著地改善病态问题。另一方面，病态问题不一定是不适定的，因为通过改变问题的形式往往可以改善病态问题。在严格的数学意义上，我们通常不可能对不适定问题进行求解并得到准确解答。 其基本理论为： 只考虑一帧图像得： y Hx n =+ (1) 上式就是病态方程, 即方程的解不能同时满足以下三个条件：解的存在；解的唯一性；解连续依赖于观测数据。正则化方法的基本思想是利用关于解的先验知识，构造附加约束以确保问题解的存在、唯一和连续，从而把不适定问题转化为适定问题。采用正则化方法来确定问题的近似解。通常需要求解如下表达形式的目标泛函的极小值： ()()2 J x y Hx p x αα=-+， (2) 2d x y Hx -()=表示数据拟合项，衡量数据拟合程度。 ()p x 为正则项，衡量信号的某种奇异性。正则项函数()p x 对未知图像X 造成了一个约束，使其得到一个稳定解，它的系数表示约束的强度。通常2P(x)Rx = ，R 是约束算子，它根据图像的先验信息对解进行约束,通常是基于一阶微分或二阶微分的高通滤波器算子。 α为正则化变量或动态正则化参数，起平衡正则项和数据项的作用，当它变大时，重建解趋于光滑，反之则数据拟合误差变小。超分辨率重建问题的本质就是在充分拟合观测数据的前提下，使某种奇异性度量最小，从而寻找理想的解X 。 正则项和正则化参数的确定直接影响到复原图像的效果，这也是研究正则化方法的第一步。在正则化方法的实现过程中还会遇到离散算子，迭代算法等问题。为了更好的在去除噪声的同时保留图像边缘以及纹理细节信息，还要结合其他方法对标准正则化方法进行改进。这些内容都将在研究过程中深入讨论。 正则化算法主要涉及到以下几个要点： ·正则化参数 正则化参数α用来调整正则项和数据项的平衡，它的取值将直接影响到复原图像的效果。如果α取值偏小，不能有效地消除高频噪声，会引入寄生波纹和假象；如果α取值偏大，图像会因为丢失很多边缘信息而仍然模糊。 通常情况下，在已知噪声的方差的情况下，参数计算过程如下所示：
超分辨荧光显微技术原 理 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT
2014年的诺贝尔理综奖颁发给了“超分辨荧光显微技术”。也许接下来的几天，媒体会关注StefanHell、EricBetzig二人的传奇经历，或者另一名华人女科学家与该奖项失之交臂的遗憾。但是八卦之外，这项成果背后的科学本身也非常有意思。 这里面有三个关键词：“超分辨”、“荧光”和“显微技术”，我希望能够解释清楚以下几个问题，尤其是后两个问题： 1.为什么需要（光学）显微技术？ 2.为什么光学显微镜的分辨率存在理论极限？ 3.用怎样的方法可以突破这个理论极限以达到“超分辨”为什么这个理论极限可以被突破？ 5.为什么非得是荧光显微技术，而非普通的明场（透射光）显微技术？ 1.采样定理与显微镜 我们用肉眼观察或者用相机拍摄一个物体时，物体上的每一个细微的点都会在眼睛的视网膜或是相机的感光芯片上成像。那么我们为什么不能看到细菌等微小的东西，为什么不能把照片无限放大以看清远处树木上面的每一片叶子呢？ 这个问题的答案比较简单：因为组成视网膜的每一个感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）、相机芯片上的每一个感光元件（CCD、CMOS等）都是有大小的。比如视网膜中央凹区域的视锥细胞直径平均约为5微米。而由于奈奎斯特-香农采样定理的限制，视网膜上能分清的两个相邻像点的距离是视锥细胞直径的两倍，即10微米。再结合眼球的构造，大致可以推断出，在距离眼睛25厘米的位置，我们能分辨物体上相距为80微米的两个点，换算成点阵密度就是大约320ppi，这也是苹果所谓“视网膜屏”分辨率的来历。
光学超分辨技术综述 学号：SA14009025 姓名：邱金峰 摘要：由于无论是源于人类本身对未知世界探索的渴望，还是现代工程技术的各种需要，对微观领域的高分辨率成像都是一个十分重要的研究方向，故本文对国内外光学超分辨技术研究的历史和现状做出综述是十分必要的。 一、背景及意义 人类对未知领域的探索永远是促进科学进步的最强大动力。在众多未知领域中我们身边的微观世界无疑是最令人着迷的。在这一领域中既涉及到生物细胞、遗传基因这些关乎我们自身的重要元素，又涉及到分子结构、基本粒子这些构成我们关于物质知识的核心命题。也只有对微观世界的深入研究才能让我们回答诸如什么是人类能够观测的最小尺度，宇宙是否存在物质的最小极限这样的物理学中的基本问题。而研究往往始于观察，成像又是观察的最基本手段。所以寻找对微观物质高分辨率成像的方法，制造对微观物质高分辨率成像的仪器，就成为了研究微观领域必不可少的首要一环。正是推动科学本身进步这一要求，使科研人员不断地采用各种各样的技术革新来尽可能地提高观测系统的分辨率和有效信息获取量，并尽可能地重建和恢复原始自然图像，以满足人类对未知的微观世界知识获取的渴望。 另一方面，在技术层面上，随着许多新兴的超精密工程学的发展，人们提出了纳米级与亚纳米级分辨率成像的要求。如在巨大规模集成电路（Giga ScaleIntegration circuits）制造中，已经开始使用32nm工艺，并且正在开发22nm工艺；在纳米技术的研究中，从上世纪七十年代，首先提出使用单分子作为电子器件开始，到现在研制中的各种微纳机电系统，各个研究对象的线度也都在数微米到几纳米之间；而在现代生物科技和现代医学技术的发展中，人们不但提出了对大生物分子在纳米级和亚纳米及三维成像的要求，甚至还希望能对活性样品进行动态检测和显微操作。这就要求图像和数据同步、动态地显示在我们面前。 为达到以上要求，人们应用了光学、微电子、计算机、机械制造、信号处理等各个学科的最新成果，来制造先进的现代成像系统。在这些现代成像系统中，又以现代光学成像系统，应用最为广泛。现代光学成像系统除了具备简单高效、使用方便、造价相对较低等传统光学成像系统的特性外，还具有更高的时间和空间成像分辨率，突破了传统意义上的衍射成像分辨率极限。而研究使光学成像系统突破衍射成像分辨率极限，获得高分辨率成像的相关方法也逐渐成为了一个独立的课题——光学超分辨技术。 光学超分辨技术又可以根据成像系统对物体反射或透射光场不同部分的成像作用分为近场光学超分辨技术和远场光学超分辨技术。近场光学超分辨技术的主要思想是采用光纤探头等探测装置对物体表面进行扫描，探测物体表面的倏逝波并对其成像，已达到提高成像分辨率的目的。远场光学超分辨技术则是在传统的光学显微成像系统的基础上应用光瞳滤波、共焦扫描、荧光显微技术以及其他各种频带展宽技术，实现成像分辨极限的突破。 二、历史与现状 在研究光学超分辨成像技术时，就必须首先提到显微术。超分辨技术在某种程度上可以认为是显微术发展的延伸。在19世纪，人们主要利用透镜成像原理
光学基础知识调制传输函 数M T F解读 The document was prepared on January 2, 2021
光学基础知识：摄影镜头调制传输函数MTF解读 作者：老顽童 镜头是摄影师和摄影爱好者投资最高的设备之一，也是决定拍摄质量的最重要的因素。因此，镜头的质量，历来受到极大的重视。我们当然会很关心摄影镜头的测量方法。 摄影的最终产品是照片，所以，根据拍摄照片的质量来评价镜头质量，这是我们最先想到的，也是最基本的测试镜头的方法。实拍照片评价镜头质量的优点是结果直截了当，根据效果判断，比较放心。不过决定照片质量的客观因素很多，而一张照片的“好”与“坏”又需要人的主观判断，很难通过测量得出客观的定量结果。大量的事实表明，影响拍摄质量最重要的因素是镜头的分辨率和反差。反差大小可以通过仪器很容易测量，而分辨率就不那么容易了！现在我们经常采用拍摄标准分辨率板的方法测量镜头的分辨率。将拍摄了标准分辨率板的底片放到显微镜下人工判读，看最高能够分辩多少线条密度。分辨率的单位是线对/毫米(lp/mm)，一黑一白两条线算是一个线对，每毫米能够分辩出的线对数就是分辨率的数值。由于这种方法还是要受到胶片分辨率的客观影响和人工判读的主观影响，所以并不是最准确最理想的方法。 现在，让我们从另一个角度出发，将镜头看作一个信息传递系统：被拍摄景物反射出来的光线是它的输入信息，而胶片上的成像就是它的输出信息。一个优秀的镜头意味着它的输出的像忠实的再现了输入方景物的特性。喜欢音响的朋友都知道，高保真放大器的输出，应当准确地再现输入信号(图1)。当输入端输入频率变化而幅度不变的正弦信号时，输出正弦波信号幅度的变化反映了放大器的频幅特性。频幅特性越平坦，放大器性能越好 (图2)！ 图1 放大器准确再现输入信号 图2 放大器的频幅特性 类似的方法也可以用来描述镜头的特性。由数学证明可知，任何周期性图形都可以分解成亮度按正弦变化的图形的叠加，而任何非周期图形又可以看作是周期图形片断的组合。因此，研究镜头对正弦变化的图形的反映，就可以研究镜头的性能！亮度按正弦变化的周期图形叫做“正弦光栅”。为了描述正弦光栅
Karl Wang Microprobe Photonics Technology Co., Ltd
1671年，荷兰人Leeuwenhoek磨制成世界上第一架 单式显微镜； 1830年，英国人Lister提出用火石和冕牌玻璃制成 物镜以消色差和球差； 德国物理学家Abbe用衍射理论证明普通光学显微镜 存在分辨率极限；后来，Rayleigh给出具体的表达 式 20世纪前半叶，出现暗场显微镜、偏光显微镜、相 衬显微镜、荧光显微镜、干涉显微镜、体视显微镜、 倒置显微镜和离心显微镜等。
激光共聚焦扫描显微镜是80年代发展起来的光机电 一体化的高科技显微镜，可以进行三维成像。 LSCM的分辨率除与激光波长有关外，还取决于针 孔直径和物镜数值孔径； 近场光学显微镜(NSOM)，探头与被观察物的距离小 于光波长，利用所谓“光学隧道效应”，分辨率可 达几纳米； 透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM，探 测二次电子)； 扫描探针显微镜：扫描隧道显微镜(STM)，原子力 显微镜(AFM)，磁力显微镜，静电力显微镜，摩擦 力显微镜等。
SPIM/HELM/SSIM TPM/MPM I2M/I3M/I5M CARS FLIM/FRET STED/STORM NSOM/TRIF 4Pi
LSCM以单色激光作为光源，并用附设光源针孔(pinhole)使光 源成为点光源。同时，在检测器前方也有一个检测针孔，点 光源对标本内焦平面上的每一检测针孔后的光电点扫描，标 本上的被照射点在检测针孔成像，由倍增管或冷电耦合器件 逐点或逐线接受，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像， 光源针孔与检测针孔的位置相对于物镜焦平面是共轭的，焦 平面上的点同时聚焦于光源针孔和检测针孔，焦平面以外的 点不会在检测针孔成像，这就是所谓的“共聚焦”。 LSCM在普通光镜基础上引入共聚焦装置，该装置能够排除非 焦平面及焦平面非焦点光斑信息，大大提高分辨率和图象清 晰度。在此基础上，由于计算机及相应的软件技术组合，可 以对较厚样品进行连续光学切片及三维重建。
光学显微镜有个分辨率的极限问题，大概是半个光学波长，比这个波长更小的物体，就分辨不出来了，比如使用400纳米的光，分辨率就是200纳米左右。这个极 限大概19世纪就知道了，最近二十年才被打破，所以意义重大，所用的手段是纯粹的物理学，所以说今年的化学诺奖是物理学的胜利。 以前有双光子显微镜，可以稍微低于这个分辨率极限，但是实际上就在极限上工作。所谓的超分辨率荧光显微镜，就是打破了这个分辨率的极限，比如还用400纳米的光，可以容易分辨200纳米以下的物体，甚至可以达到20纳米。 以前的显微镜总是用一束光，这束光是一根细丝，聚焦到一个很小的小点上，这个小点就是分辨率极限。由于光的衍射效应，这个小点的大小受到光的波长的限制。这也是自从人类发明光学显微镜以来，困扰了200多年的难题。 阎王爷先生的超 分辨荧光显微镜叫做STED, 基本原理是用两束光，实际上是两束激光，一束是正常的光聚焦到一个小点上，下图左边，这个就是衍射极限的最大分辨率；另一束激光变成中空的筒子一样，下图 中间；两束光聚焦到同一点上，由于第二束光把第一束光给灭了，只有中间那点没有灭掉，所以才能看到，这个更小的小点就是新的分辨率，打破了衍射极限，下图 右边。这就是这个项目的重大意义所在。 这样，使用这样的光学显微镜就可以清楚看到更小的物体，比如纳米材料的形貌，更广泛的应用是在生物学领域，比如下图，等待生物学专业人士来科普。
顺便说一句，中国目前是否有这样的超分辨光学显微镜我还不清楚，北大的席锋那里可能有，质量和运性情况不知道，其他单位没有听说过。 比这个显微镜更低档一点是，双光子显微镜，所用的激光就是飞秒激光，国内估计总共有50台左右，价格每台300万到600万元，全部西方制造，只有五家公司：尼康，奥林巴斯，莱卡和蔡斯等。 更低一点档次的显微镜是激光显微镜，每台大概200万元，国内估计200台到300台之间，只有西方制造。 还有电子显微镜，分辨率可以达到0.1纳米或许更小，远远比这个超分辨的光学显微镜高，但是各有优缺点。以后抽空再来评述。 庄小威的超级显微镜 vs 赵忠贤的高温超导 消息传来，超级显微镜 （这里是俗名，学名是超分辨荧光显微镜）获得2014年诺贝尔化学奖，恭喜！ 其实很多人都看准了这个项目，连我在2012年都留下了笔迹： *********************************************************** 2012-10-4， 我看到的一些诺贝尔奖级别的成果和工作