琥珀酸脱氢酶的作用及丙二酸的抑制作用
【目的】
1 ．掌握琥珀酸脱氢酶作用及丙二酸抑制作用的实验技术与原理。
2 ．深化理解酶的竞争性抑制作用的特点。
【原理】
肌肉组织含有的琥珀酸脱氢酶是一种结合蛋白酶，以 FAD 为辅基。它能催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸， FAD 接受氢生成FAD·2H 。体外实验以美蓝 ( 甲烯蓝 ) 为受氢体，使美蓝还原生成美白 ( 甲烯白 ) 。其反应如下：
琥珀酸脱氢酶活性越高，美蓝脱色所需的时间越短，由于美白易被空气中的氧氧化成美蓝。故实验需在无氧条件下进行，可加一层液体石蜡以隔绝空气。
丙二酸与琥珀酸的化学结构很相似，能和琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酶结合，从而抑制琥珀酸的脱氢作用。其抑制程度与抑制剂和底物二者的浓度有关。本实验通过不同浓度的琥珀酸和丙二酸来观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用。
【器材】
1 ．研钵与剪刀
2 ．漏斗
3 ．纱布
4 ．恒温水浴
【试剂】
1 ． 0.2mol/L 琥珀酸溶液
2 ． 0.02mol/L 琥珀酸溶液
3 ． 0.2mol/L 丙二酸溶液
4 ． 0.02mol/L 丙二酸溶液
以上四种溶液均先用 5mol/L NaOH 溶液调至 pH7.0 ，再用 0.01mol/L NaOH 溶液调至 pH7.4 。直接用琥珀酸钠或丙二酸钠配制亦可。
5 ． 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液（ pH7.4 ）
1/15mol/L Na 2 HPO 4 80.8ml 与 1/15mol/L KH 2 PO 4 19.2ml 混匀即可。
6 ． 0.02% 美蓝溶液
7 ．液体石蜡
【操作】
1 ．肌肉提取液的制备
取用蒸馏水清洗过的新鲜动物肌肉组织约 10g ，置于研钵（或匀浆器）中，研磨成糜状，然后每克肌肉组织加 4 倍体积的冰冷的 pH7.4 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液，混匀，用双层纱布过滤，取滤液备用。
2 ．酶促反应
取试管 5 支，编号，按下表操作。
将上述各试管液混匀后，沿各管壁加入液体石蜡 5 ～ 10 滴，使其在液面形成一薄层以隔绝空气。置于37 ℃ 水浴中保温，记录各管保温开始时间及美蓝开始脱色的时间。
3 ．计算并解释各管美蓝颜色变化原因。
美蓝开始脱色时间－保温开始时间＝美蓝脱色所用时间。
【注意事项】
1 ．加液体石蜡时宜斜执试管，沿管内壁缓缓加入，不要产生气泡。
2 ．加完液体石蜡后，观察结果过程中，不要振摇试管，以免溶液与空气接触而使美白重新氧化变蓝。
3 ．实验完毕，一定要将试管内的液体石蜡洗净。
【思考题】
1 ．试根据实验现象，说明竞争性抑制作用的特点。
2 ．本实验的设计原则是什么？
3 ．做好本实验的关键环节有哪些？
名词解释 1、同工酶是指催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。 2、酶原：有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。 3、别构效应:当底物或底物以外的物质和别构酶分子上的相应部位非共价地结合后,通过酶分子构象的变化影响酶的催化活性,这种效应成为别构效应 4、酶的活性中心：酶的活性中心是指酶分子中直接和底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。 5、酶的抑制剂：能使酶的必需基团或酶活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶的催化活性甚至使酶的催化活性完全丧失的物质。 6、酶的专一性酶对其所催化的底物具有较严格的选择性，即一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并产生一定的产物，酶的这种特性称为酶的特异性。根据酶对其底物结构选择的严格程度不同，酶的特异性可大致分为三种类型，即绝对特异性，相对特异性和立体异构特异性。 7.核酶：有催化作用的RNA。 8、竞争性抑制作用：有的抑制剂与酶的底物结构相似，可与底物竞争跟酶结合，这种抑制称为竞争性抑制作用。 问答题 1、酶的活性中心特点： （1）活性部位在酶分子的总体积中只占相当小的部分； （2）酶的活性部位是一个三维实体； （3）酶的活性部位与底物诱导契合； （4）酶的活性部位是位于酶分子表面的一个裂缝内； （5）底物通过次级键较弱的力结合到酶上； （6）酶活性部位具有柔性或可运动性 2、简述酶具有高效催化的因素 答案要点：
（1）、邻近定向效应：指底物和酶活性部位的邻近，使底物反应浓度有效提高，使分子间反应成为分子内反应。 （2）、张力和形变：底物结合诱导酶分子结构变化，而变化的酶分子又使底物分子的敏感键产生张力甚至形变，促进酶-底物中间产物进入过渡肽。 （3）、酸碱催化: 酶活性部位上的某些基团可以作为良好的质子供体或受体对底物进行酸碱催化, 达到降低反应活化能的目的。 （4）、共价催化：酶和底物形成不稳定的共价中间物，从而促进产物形成。 3、举例说明竞争性抑制的特点和实际意义。 解答要点:有些抑制剂与底物竞争与酶结合,妨碍酶与底物结合,减少酶的作用机会,这种现象成为竞争性抑制. 竞争性抑制的一个特点是当底物浓度很高时,抑制作用可以被解除. 酶的竞争性可逆抑制剂的酶动力学特征是Vmax不变，Km增加.研究酶的竞争性抑制作用在医学,工农业生产上以及基础理论研究上都有一定的意义. 4、很多酶的活性中心均有组氨酸残基参与，请解释原因。 答题要点： 酶蛋白分子中组氨酸的侧链咪唑基pK值为6.0～7.0，在生理条件下，一半解离，一半不解离，因此既可以作为质子供体（不解离部分），又可以作为质子受体（解离部分），既是酸，又是碱，可以作为广义酸碱共同催化反应，因此常参与构成酶的活性中心。 5、简述竞争性抑制剂与非竞争性抑制剂的区别 竞争性抑制剂抑制剂结构与底物相似，共同竞争酶的活性中心，抑制作用大小与抑制剂和底物的相对浓度有关。Km值增大，Vm不变。 非竞争性抑制剂非抑制剂结构与底物不相似或完全不同，它只与活性中心外的必需基团结合，形成EI和EIS，使E和ES都下降。该抑制作用的强弱只与抑制剂浓度有关，Km值不变，Vm下降。 论述题
实验十琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制 一、实验目的 1、掌握竞争性抑制概念及作用机理。 2、了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的简单方法。 二、实验原理存在于心肌、骨骼肌、肝脏等组织中琥珀酸脱氨酸，能使琥珀酸脱氢而成延胡索酸，脱下氢可使甲烯蓝退色，还原为甲稀白。反应如下：草酸、丙二酸等在结构上与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酸的活性中心结合。若酶已与丙二酸等结合，则不能再与琥珀酸结合而使之脱氢，产生抑制作用，且抑制程度取决于琥珀酸与抑制剂在反应体系中浓度的相对比例，所以这种抑制是竞争性抑制。本实验通过观察在由不同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体系中使等量甲稀蓝退色反应时间，从而验证丙二酸对琥珀酸的竞争性抑制作用。这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。 三、实验仪器、材料和试剂 1、仪器：恒温水浴锅，研钵或组织匀浆机 2、材料和试剂（1）新鲜兔肝（2） 0、10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7、4）：0、1mol/L NaH2PO419 ml 加0、1mol/L Na2HPO481ml。 （3）0、093 mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1、5g溶于100 ml蒸馏水中。
（4）0、10 mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1、5g溶于100 ml蒸馏水中。 （5）0、02%甲稀蓝溶液。 （6）液体石蜡。 四、实验操作新鲜兔肝立即剪碎，放于组织匀浆机中研碎，加入pH7、4的0、10 mol/L磷酸盐缓冲液，制备成200 g/L的肝匀浆液备用。取五支试管分别编号，按下表配制反应体系：试剂管号0、093 mol/l琥珀酸钠0、10 mol/l丙二酸钠0、 10mol/l(pH7、4)磷酸缓冲液肝匀浆液0、02%甲烯蓝11ml2ml1ml3滴 21、5ml0、5ml1ml1ml3滴31ml1ml2ml3滴42ml1ml1ml3滴51ml1ml1ml1ml3滴将各管溶液混匀后加一薄层液体石蜡后静置（此时不可摇动!），观察各管中的颜色变化，并记录各管颜色完全变化的时间。思考题: 1、抑制的分类及其特点？ 2、本实验中液体石蜡起什么作用? 本实验需在无氧条件下进行,可加一层液体石蜡以隔绝空气。 3、各管中的反应体系配好后为什么不能再摇动? 4、制备肝浆时用磷酸缓冲液，可否换用蒸馏水，为什么？
第14卷第1期现代农药V ol.14 No.1 专论与综述 琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂的研发进展(Ⅱ) 仇是胜1，柏亚罗2 （1. 江苏嘉隆化工有限公司，江苏徐州 221112；2. 江苏省农药研究所股份有限公司，南京 210024） 摘要：琥珀酸脱氢酶抑制剂类 (SDHI) 杀菌剂历经3代，有18个品种上市或即将上市。尤其是第3代8个吡唑酰胺类杀菌剂的问世，有力地带动了SDHI类杀菌剂市场的迅速发展。介绍了SDHI类杀菌剂的作用机理、构效关系和专利概况，逐个陈述了它们的应用与市场，总结了该类产品的抗性情况及产生机理，并展望了SDHI类杀菌剂的发展前景。 关键词：琥珀酸脱氢酶抑制剂；酰胺类杀菌剂；研究开发；应用；市场；抗性 中图分类号：TQ 455.4＋9文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1671-5284.2015.01.001 Progress on Research and Development of Succinate Dehydrogenase Inhibitor Fungicides (Ⅱ) QIU Shi-sheng1, BAI Ya-luo2 (1. Jiangsu Jialong Chemical Industry Co., Ltd., Jiangsu Xuzhou 221112, China; 2. Jiangsu Pesticide Research Institute Co., Ltd., Nanjing 210024, China) Abstract: Eighteen fungicides of succinate dehydrogenase inhibitors (SDHI) have launched or will launch soon through three-generation-development. Especially, the sales of eight carboxamide fungicides in the 3rd generation, promoted significantly the market development of SDHIs. The paper introduced the mechanism of action, structure- activity relationships and patent profiles of SDHIs. The uses and markets of the all active ingredients were described, their resistance and resistant mechanisms were summaried, and the futures of SDHIs were also prospected. Key words: succinate dehydrogenase inhibitor (SDHI); carboxamide fungicide; R&D; use; market; resistance （续上期） 5.4 呋喃酰胺类 (furan-carboxamides，1个) 甲呋酰胺 (fenfuram) 是由壳牌公司发现、安万特(现拜耳作物科学) 公司开发[2]。 甲呋酰胺是替代汞制剂、具内吸性的拌种剂[9]，可防治谷物上的腥黑穗病和黑粉病(Tilletia和Ustilago spp.)[2]。 甲呋酰胺的主要剂型有：DS和LS[2]。其开发代号为：WL 22361；主要商品名为：Pano-ram[2]。 截至2014年10月11日，甲呋酰胺尚未在欧盟、美国和中国登记[23-25]。 5.5 氧硫杂环己二烯酰胺类 (oxathiincar- boxamides，2个) 5.5.1 萎锈灵 (carboxin) 萎锈灵由美国有利来路(现科聚亚) 公司1966年报道，1969年引入市场[2]。 萎锈灵为内吸性杀菌剂，种子处理可用于大麦、小麦和燕麦等作物，防治黑粉病、腥黑粉病[特别是散黑穗病、黑穗病(Ustilago spp.)]，用药量为每100 kg种子50～200 g；还用于大麦、小麦、燕麦、水稻、棉花、花生、大豆、油菜、蔬菜、玉米、高粱和其他作物上防治种子和幼苗上的病害，如黑穗病、腐烂病和疫病等，特别是丝核菌(Rhizoctonia spp.) 引起的病害。萎锈灵不能与强碱或强酸性农药混配[2]。 萎锈灵可采用闷种、拌种和浸种等方法施用，亦可叶面喷雾防治小麦、豆类、梨等的锈病。其对作物生长具有一定的刺激作用，能使小麦增产[9]。 萎锈灵的主要剂型有：FS、SC、WP和WS等[2]。 萎锈灵的开发代号为：D 735；其单剂产品的 收稿日期：2014–10–13；修回日期：2014–10–18 作者简介：仇是胜 (1967—)，男，江苏省徐州市人，高级工程师，主要从事农药及有机合成工作。Tel：0516–85038670；E–mail：qiuss001@https://www.doczj.com/doc/542174481.html,
丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用 竞争性抑制作用是指，当抑制剂在结构上与底物类似，能与底物竞争酶分子活性中心的结合基团，从而阻碍酶与底物结合。它是可逆的，抑制作用的强弱取决于抑制剂与底物的相对浓度。丙二酸对琥珀酸脱氢酶有竞争性抑制作用。丙二酸的结构和琥珀酸非常相似，可竞争性地与酶的活性中心结合，使其不能与琥珀酸结合。因此可通过研究不同浓度比例的丙二酸和琥珀酸，观察其对琥珀酸脱氢酶活性的影响。 1实验材料 1.1酶提取液实验室提供 1.2仪器滴管；玻璃棒；试管6支 1.3试剂0.2mol/L琥珀酸；0.02mol/L琥珀酸；0.2mol/L丙二酸；0.02mol/L丙 二酸；0.02％甲烯蓝；液体石蜡；蒸馏水 2实验方法 2.1实验原理 琥珀酸经琥珀酸脱氢酶催化，脱氢生成延胡索酸。在体外隔绝空气条件下，从琥珀酸上脱下的一对氢可由人工受氢体甲烯蓝（蓝色）接受后，被还原成甲烯白。抑制剂丙二酸竞争琥珀酸脱氢酶的活性中心，阻碍底物与该酶的结合和催化反应，使甲烯蓝褪色的速度变慢。丙二酸对该酶的抑制程度取决于其与琥珀酸的相对浓度比例。 2.2实验设计 2.2.1竞争性抑制作用鉴定 取6支试管，按下表操作： 试剂\管号 1 2 3 4 5 6 酶提取液20 20 20 20 20 - 0.2mol/L琥珀酸10 10 10 - - 10 0.02mol/L琥珀酸- - - 10 10 - 0.2mol/L丙二酸- 10 - 10 - - 0.02mol/L丙二酸- - 10 - 10 - 蒸馏水10 - - - - 25 0.02％甲烯蓝 4 4 4 4 4 4 各管混匀 液体石蜡15 15 15 15 15 15 放置室温 不断观察各管甲烯蓝褪色置甲烯白（即呈肝匀浆色）的时间，比较各管顺序。 3实验结果 记录各管褪色顺序，得下表： 管号 1 2 3 4 5 6 顺序 1 3 2 5 4 6 1号管中无抑制剂（丙二酸），所以琥珀酸在酶的催化下脱氢，使甲烯蓝褪色速度最快。3号管中底物与抑制剂比例为10:1，所以褪色速度次之。2号管和
实验四酶的竞争性抑制作用 一、目的要求： 通过实验加深对酶的竞争性抑制作用的了解 二、实验原理： 与底物化学结构类似的抑制剂，能与底物竞争和酶活性中心的结合、抑制酶的活性，这种类型的抑制为竞争性抑制。竞争性抑制的程度由抑制剂与底物相对浓度决定。如果底物浓度不变，酶活性被抑制的程度随抑制剂的浓度增加而增强。反之，如果抑制剂浓度不变，则酶活性随底物浓度的增加而逐渐恢复。 本实验观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的影响。琥珀酸脱氢酶的活性，在隔绝空气的条件下，可从加入的甲烯蓝褪色情况来观察。 COOH COOH ︳︳ CH2 琥珀脱氢酶CH ︳+ 甲烯蓝——————→‖+ 甲烯白 CH2 CH ︳︳ COOH COOH 三、实验材料 1、试剂： （1）0.2 mol/L 琥珀酸：称取琥珀酸23.618g，用蒸馏水配成约600ml ,用5mol/L NaOH 调pH至7.4，再加水至1000ml （2）0.02mol/L琥珀酸：用0.2 mol/L 琥珀酸稀释10倍 （3）0.2 mol/L 丙二酸：称取丙二酸22.92g ，用蒸馏水配成约600ml ，5mol/L NaOH调pH 至7.4，再加水至1 000ml （4）0.02mol/L丙二酸：用0.2 mol/L丙二酸稀释10倍 （5）0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4）：取0.2 mol/L Na2HPO4 19ml ，加蒸馏水至200ml (6) 0.02%甲烯蓝 （7）液体石蜡 2、器材 （1）小试管及试管架（2）吸量管（10ml *1）及滴管（8支）（3）研钵 四、实验方法 1、心肌匀浆的制备：取动物（鼠、猪等）心肌1g，置研钵中，剪碎，研磨成匀浆，再加入0.1mol/L 磷酸盐缓冲液10ml ，磨匀，备用 2、取小试管5支并编号，按下表操作：
琥珀酸脱氢酶的作用及丙二酸的抑制作用 【目的】 1 ．掌握琥珀酸脱氢酶作用及丙二酸抑制作用的实验技术与原理。 2 ．深化理解酶的竞争性抑制作用的特点。 【原理】 肌肉组织含有的琥珀酸脱氢酶是一种结合蛋白酶，以 FAD 为辅基。它能催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸， FAD 接受氢生成FAD·2H 。体外实验以美蓝 ( 甲烯蓝 ) 为受氢体，使美蓝还原生成美白 ( 甲烯白 ) 。其反应如下： 琥珀酸脱氢酶活性越高，美蓝脱色所需的时间越短，由于美白易被空气中的氧氧化成美蓝。故实验需在无氧条件下进行，可加一层液体石蜡以隔绝空气。 丙二酸与琥珀酸的化学结构很相似，能和琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酶结合，从而抑制琥珀酸的脱氢作用。其抑制程度与抑制剂和底物二者的浓度有关。本实验通过不同浓度的琥珀酸和丙二酸来观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用。 【器材】 1 ．研钵与剪刀 2 ．漏斗 3 ．纱布 4 ．恒温水浴 【试剂】 1 ． 0.2mol/L 琥珀酸溶液 2 ． 0.02mol/L 琥珀酸溶液 3 ． 0.2mol/L 丙二酸溶液
4 ． 0.02mol/L 丙二酸溶液 以上四种溶液均先用 5mol/L NaOH 溶液调至 pH7.0 ，再用 0.01mol/L NaOH 溶液调至 pH7.4 。直接用琥珀酸钠或丙二酸钠配制亦可。 5 ． 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液（ pH7.4 ） 1/15mol/L Na 2 HPO 4 80.8ml 与 1/15mol/L KH 2 PO 4 19.2ml 混匀即可。 6 ． 0.02% 美蓝溶液 7 ．液体石蜡 【操作】 1 ．肌肉提取液的制备 取用蒸馏水清洗过的新鲜动物肌肉组织约 10g ，置于研钵（或匀浆器）中，研磨成糜状，然后每克肌肉组织加 4 倍体积的冰冷的 pH7.4 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液，混匀，用双层纱布过滤，取滤液备用。 2 ．酶促反应 取试管 5 支，编号，按下表操作。 将上述各试管液混匀后，沿各管壁加入液体石蜡 5 ～ 10 滴，使其在液面形成一薄层以隔绝空气。置于37 ℃ 水浴中保温，记录各管保温开始时间及美蓝开始脱色的时间。 3 ．计算并解释各管美蓝颜色变化原因。
－－第三章酶测试题－－ 一、单项选择题（在备选答案中只有一个是正确的） 1．关于酶的叙述哪项是正确的？ A．所有的酶都含有辅基或辅酶B．只能在体内起催化作用C．大多数酶的化学本质是蛋白质 D．能改变化学反应的平衡点加速反应的进行E．都具有立体异构专一性（特异性） 2．酶原所以没有活性是因为： A．酶蛋白肽链合成不完全B．活性中心未形成或未暴露C．酶原是普通的蛋白质 D．缺乏辅酶或辅基E．是已经变性的蛋白质 3．磺胺类药物的类似物是： A．四氢叶酸B．二氢叶酸C．对氨基苯甲酸D．叶酸E．嘧啶 4．关于酶活性中心的叙述，哪项不正确？ A．酶与底物接触只限于酶分子上与酶活性密切有关的较小区域B．必需基团可位于活性中心之内，也可位于活性中心之外C．一般来说，总是多肽链的一级结构上相邻的几个氨基酸的残基相对集中，形成酶的活性中心D．酶原激活实际上就是完整的活性中心形成的过程E．当底物分子与酶分子相接触时，可引起酶活性中心的构象改变 5．辅酶NADP+分子中含有哪种B族维生素？ A．磷酸吡哆醛B．核黄素C．叶酸D．尼克酰胺E．硫胺素
6．下列关于酶蛋白和辅助因子的叙述，哪一点不正确？ A．酶蛋白或辅助因子单独存在时均无催化作用B．一种酶蛋白只与一种辅助因子结合成一种全酶C．一种辅助因子只能与一种酶蛋白结合成一种全酶D．酶蛋白决定结合酶蛋白反应的专一性E．辅助因子直接参加反应 7．如果有一酶促反应其〔8〕=1/2Km，则v值应等于多少Vmax？ A．0．25 B．0．33 C．0．50 D．0．67 E．0．75 8．有机磷杀虫剂对胆碱酯酶的抑制作用属于： A．可逆性抑制作用B．竞争性抑制作用C．非竞争性抑制作用D．反竞争性抑制作用E．不可逆性抑制作用 9．关于pH对酶活性的影响，以下哪项不对？ A．影响必需基团解离状态B．也能影响底物的解离状态C．酶在一定的pH范围内发挥最高活性D．破坏酶蛋白的一级结构E．pH改变能影响酶的Km值10．丙二酸对于琥珀酸脱氢酶的影响属于： A．反馈抑制B．底物抑制C．竞争性抑制D．非竞争性抑制E．变构调节二、多项选择题（在备选答案中有二个或二个以上是正确的，错选或未选全的均不给分） 1．关于酶的竞争性抑制作用的说法哪些是正确的？ A．抑制剂结构一般与底物结构相似B．Vm不变C．增加底物浓度可减弱抑制剂的影响D．使Km值增大 2．关于酶的非竞争性抑制作用的说法哪些是正确的？ A．增加底物浓度能减少抑制剂的影响B．Vm降低C．抑制剂结构与底物无相似之处D．Km值不变
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制 [原理] 肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸。反应中生成的FADH2可使蓝色的甲烯蓝还原为无色的甲烯白(还原型甲烯蓝)。丙二酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，故能与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶的活性中心。丙二酸与琥珀酸脱氢酶结合后，酶活性受到抑制，则不能再催化琥珀酸的脱氢反应。抑制程度的大小，随抑制剂与底物两者浓度的比例而定。 本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔绝空气的条件下，通过甲烯蓝的褪色程度来判断琥珀酸脱氢酶的活性，并籍此观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用。 CH2COOH CH2 COOH FAD MB?2H（甲烯白） 琥珀酸 琥珀酸脱氢酶 CHCOOH HOOCCH FADH2MB（甲烯蓝） 延胡索酸 [试剂] 1．0.2mol/L琥珀酸: 取琥珀酸钠(MW:270.14)27克加水至500ml。 2．0.02mol/L琥珀酸: 取1液稀释10倍。 3．0.2mol/L丙二酸: 取丙二酸钠(MW:166.05)16.7克加水至500ml。 4．0.02mol/L丙二酸: 取3液稀释10倍。 5．1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲: 1/15mol/LNa2HPO4溶液80.8ml与1/15mol/LKH2PO419.2ml 混合即成。 （1）1/15mol/LNa2HPO4溶液: 取Na2HPO4.12H2O （MW：358.14）23.876 克, 加水至1000ml。 （2）1/15mol/LKH2PO4溶液:取KH2PO4（MW：136.09）1.814克,加水至200ml. 6．0.02％甲烯蓝溶液 7．液体石蜡 [主要器材] 1．新鲜猪心 2．玻璃研钵 3．漏斗
（一）、温度、PH对酶活性的影响 一、实验目的 了解温度对酶活性的影响。了解酶活性的最适PH及掌握一种检测最适PH的方法。 二、实验原理 三、实验步骤 1、温度对酶活性的影响 取3支试管，编号后按下表加入试剂 试剂 试管编号 1 2 3 0.2%淀粉溶液 1.5 1.5 1.5 稀释唾液/ml 1 1 无 煮沸过的稀释唾液/ml 无无 1 摇匀后，将1、3号两试管放入37摄氏度恒温水浴中，2号试管放入冰水中。10min后取出，将2号试管内的液体分为两半，用碘化钾-碘溶液来检验1、2、3号试管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。将2号试管剩下的一半溶液放入37摄氏度水浴中继续保温10min后，再用碘液检验，结果如何？记录并解释结果。 注意事项： 1、唾液制备时，先用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一小口蒸馏水，0.5~1min 后，使其流入量筒，并稀释到50ml。 2、PH对酶活性的影响 取4个标有号码的20ml试管。用吸管按下表添加0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和 0.1mol/L柠檬酸溶液以制备PH=5.0~8.0的4种缓冲液。 试剂 试管编号 1 2 3 4 0.2mol/L磷酸氢二钠/ml 5.15 6.05 7.72 9.72 0.1mol/L柠檬酸/ml 4.85 3.95 2.28 0.28 PH 5 5.8 6.8 8 从4个试管中各取缓冲液3ml，分别注入到4支带有号码的试管中，随后于每个试管中添加0.5%淀粉溶液2ml和稀释唾液2ml。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔分别为1min。将各试管内容物混匀，并依次置于37摄氏度恒温水浴中保温。 第四管加入唾液2min后，每隔1min由第二管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1滴碘化钾-碘溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为棕黄色时，向所有试管中依次添加1或2滴碘化钾-碘溶液。添加碘化钾-碘溶液的时间间隔从第一管起，均为1min。 观察各试管内容物呈现的颜色，分析PH对唾液淀粉酶活性的影响。 注意事项： 1、从第三管中取混合液，是因为它的PH接近唾液淀粉酶的最适PH。 2、间隔1min，是为了有足够的时间去加稀释唾液和足够时间观察颜色，保证各 试管反应时间相同。 四、实验结果 1、温度 1 2 3 浅蓝一半暗 褐 一半浅 蓝深蓝
不同激活剂和抑制剂对1398蛋白酶活力的影响 摘要：【目的】探究不同激活剂、抑制剂对1398蛋白酶活力的影响。【方法】通过分别将不同的试剂加入到各个含有1398蛋白酶液的试管中，然后在进行催化效应。实验结果用与调零组进行对照，以O.D值表示。通过分析不同的O.D值来总结这些试剂对1398蛋白酶活力的影响。【结果】在本次实验中，加入钙离子、镁离子和十二烷基硫酸钠的实验组均没有对1398蛋白酶表现出预期的影响；加入Vc的实验组不能通过O.D值判断Vc对1398蛋白酶是否有抑制作用。【结论】本次实验没有得到预期的实验结果。通过分析发现，钙离子、镁离子和十二烷基硫酸钠均因工作浓度过小导致对酶活力影响不明显；Vc由于是较强的还原剂，使得，在加Folin-酚试剂后，Vc与Folin-酚试剂反应，从而，影响到了酪氨酸与Folin 的反应，进而表现出，O.D大大增高的现象。 关键词：1398酶、激活剂、抑制剂、酶活力 Activting agent and inhibitor affect activity of 1398 enzyme Abstract :The paper is aimed at explorer the vitality of the 1398 enzyme which is be influenced by different activting agent and inhibitor. Add different reagents into the enzyme solution ,as a result ,there is a difference among these activting agent and inhibitor by analysis the O.D of erey group. In this experiment, there is a little diffence when compared the enzyme solution added calcium or magnesium with the norml group. In addition, when added the Vc into enzyme solution, it reflected a strange phenomenon. But the
实验八 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用 【目的】 验证丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。 【原理】 琥珀酸在琥珀酸脱氢酶催化下脱氢生成延胡索酸，脱下的氢被受氢体接受。本实验用亚甲蓝（MB ）作为受氢体，亚甲蓝接受琥珀酸脱下的氢由蓝色还原成无色的甲烯白（MBH 2）。丙二酸与琥珀酸分子结构相似，能竞争性抑制琥珀酸脱氢酶。通过观察亚甲蓝颜色消退的程度，可以判断丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制程度。 COOH CH CH + MB COOH CH 2CH 2+ MBH 2 琥珀酸 亚甲蓝（蓝色） 延胡索酸 还原性亚甲蓝（无色） 琥珀酸脱氢酶 【器材】 试管及试管架、滴管、剪刀、研钵或20ml 匀浆器、电热恒温水浴箱。 【试剂】 1. 0.1mol/L 磷酸缓冲液（PH7.4） 取0.1mol/L Na 2HPO 4溶液19ml 和0.1mol/L NaH 2PO 4溶液81ml 混合即可。 2. 1.5% 琥珀酸钠溶液 3. 1% 丙二酸钠溶液 4. 0.02% 亚甲蓝溶液 5.液状石蜡 【操作】 1. 取新鲜动物肌肉或肝5g 左右，放入研钵，用剪刀将组织剪碎，然后加入10ml 在冰箱中保存的PH7.4的磷酸缓冲液充分研磨均匀（或在匀浆器内进行匀浆，制备成20%匀浆液）。 2. 取4支试管，编号，按下表操作：
表3-11 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用 加入物（滴） 1 2 3 4 匀浆10 10 －10 1.5%琥珀酸钠溶 10 10 10 20 液 1%丙二酸钠溶液－10 10 10 蒸馏水20 10 20 － 0.02%亚甲蓝溶液10 10 10 10 3. 各管混匀后，各加少量液状石蜡覆盖在液体上，置37℃水浴中保温，随时观察各管颜色变化，并记录各管亚甲蓝褪色时间。 【结果及分析】 比较各管亚甲蓝褪色情况，并对实验结果进行分析。 【思考题】 1. 什么是竞争性抑制作用，与非竞争性抑制作用有何不同。 2. 为什么要用石蜡油隔绝空气来进行实验？
实验五琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制 【实验目的】 1、掌握竞争性抑制概念及作用机理。 2、了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的简单方法。 【实验原理】 存在于心肌、骨骼肌、肝脏等组织中琥珀酸脱氨酸，能使琥珀酸脱氢而成延胡索酸，脱下氢可使甲烯蓝退色，还原为甲稀白。反应如下： 草酸、丙二酸等在结构上与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酸的活性中心结合。若酶已与丙二酸等结合，则不能再与琥珀酸结合而使之脱氢，产生抑制作用，且抑制程度取决于琥珀酸与抑制剂在反应体系中浓度的相对比例，所以这种抑制是竞争性抑制。本实验通过观察在由不同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体系中使等量甲稀蓝退色反应时间，从而验证丙二酸对琥珀酸的竞争性抑制作用。 【实验用品】 1、试剂 （1）0.10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）:0.1mol/L NaH2PO419ml 加0.1mol/LNa2HPO481ml。 （2）0.093mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。 （3）0.10mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。 （4）0.02%甲稀蓝溶液。 （5）液体石蜡。 2、器具 （1）0.10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）：0.1mol/L NaH2PO419ml加0.1mol/LNa2HPO481ml。 （2）0.93mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。 （3）0.10mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。 （4）0.02%甲烯蓝溶液。 （5）液体石蜡。 2、器具 （1）恒温水浴箱（2）研钵或组织匀浆机 【实验操作】
1.琥珀酸脱氢酶作用及竞争抑制的观察 2.紫外分光法测定核酸含量 本实验分组为15组，如果为16组，相应材料要增加。 需要的试剂 配制方法 注意事项 1.5%琥珀酸钠溶液 7.5g 琥珀酸钠→500ml →15小瓶 没有琥珀酸钠则用琥珀酸代替后用NaOH 调和至PH7.0 1%丙二酸钠 5g 丙二酸钠→500ml →15小瓶 没有丙二酸钠则用丙二酸代替后用NaOH 调和至PH7.0 0.02%甲稀蓝 0.1g 甲稀蓝→500ml →15小瓶（棕色瓶） 甲稀蓝别名亚甲酰蓝 1/15mol/L Na 2HPO 4 23.6g Na 2HPO 4 →2000ml →15大瓶 石蜡油 可以不用分装 每个房间在水浴锅前放1个 核酸 称一定量的小牛胸腺DNA 融入0.1%的NaOH 5-50ug/mL 浓度 羊的心脏 切碎成小块大约2g 左右 提前购买，将皮、脂肪处理掉分割后放在冰箱里 石英砂 均匀的撒在上面 注：每三个人一组，分为15组。如果人数多可以适当多分几瓶试剂。 胶头滴管 共77个 所需仪器 所需数量 40ml 试剂瓶 45 60ml 试剂瓶 15 试管 ○ 14x15 ○ 22x15 共90个 移液管（优先10ml 的本次用5ml 移液管） 15 研钵 15 种类 数量 心脏提取液 15 1.5%琥珀酸钠 15 1%丙二酸钠 15 0.02%甲稀蓝 15 蒸馏水 15 液体石蜡 2
紫外吸收法测定核酸含量 一、实验目的： 1.掌握紫外吸收法测定核酸含量的原理 2.掌握利用紫外线分光度计测定核酸含量 二、实验原理：DNA和RNA都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260nm波长处紫外线吸收是嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（－C＝C一C＝C 一），能够强烈吸收250~280nm 波长的紫外光。等书上112页 三、实验试剂与器材 DNA样品紫外分光光度计 四、实验步骤 1.取DNA样品5ml，于紫外分光光度计上测定260nm与280nm处的OD值按下式按下式计算核酸浓度 ○1计算核酸浓度 DNA的质量浓度(mg/l)=OD260nm/0.020xL x稀释倍数 ○2计算核酸纯度=OD260nm/OD280nm 2.取DNA样品5ml，沸水浴中加热5min于紫外分光光度计上，测260nm处的OD值比较DNA 前后吸光度OD的差异。 五、实验结果与分析 备注： 紫外光区：100-400nm 可见光区：400-700nm 红外光区：700-500um 比色杯：玻璃比色杯（glass,G）：仅用于可见光区 石英比色杯(silici,S)：用于可见、紫外光区。 比色杯清洗：不能用碱性试剂洗涤，用弱酸性试剂洗涤，或者去污剂洗涤。
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制 目的与要求：了解琥珀酸脱氢酶的作用及酶促反应中的竞争性抑制作用实验原理：肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢转变为延胡索酸（三羧酸循环，线粒体）。反应中生成的FADH2可使甲烯蓝还原为甲烯白。丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，与琥珀酸的分子结构相似，与酶的亲合力高。丙二酸与酶结合后，酶活性受到抑制，则不能催化琥珀酸的脱氢反应。本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔离空气条件下，以甲烯蓝褪色程度来观察、判断丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用。操作步骤：酶提取液的制备酶促反应管的制备37℃酶促反应，观察甲烯蓝褪色程度实验结果：间隔10分钟，记录各管甲烯蓝褪色程度，解释结果。注意事项：充分碾磨家兔肌肉，碾磨器械、纱布要及时清洗。滴加液体石蜡时，倾斜试管，避免产生气泡。观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧化变蓝。改良Mohum法测定谷-丙转氨酶活性目的与要求：了解Mohum法测定谷-丙转氨酶活性的原理及测定方法实验原理：利用丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，在转氨酶作用下生成丙酮酸和谷氨酸，再利用2 4-二硝基苯肼与丙酮酸反应，生成棕色的丙酮酸二硝基苯肼，在520nm波长测定其光密度，与经同样处理标准丙酮酸溶液比较，即可计算谷-丙转氨酶的活性。血清谷-丙转氨酶活性单位定义：每毫升血清在
pH值7.4，37℃保温条件下与底物作用30min后，每生成2.5ug 的丙酮酸为1谷-丙转氨酶单位，正常值为2-40单位/ml。实验步骤：见书Page 77酶活性测定表格。实验结果：谷丙转氨酶活性单位A测定管/A标准管标准管中丙酮酸含量 10/2.5。注意事项：保温温度和时间要精确，即谷丙转氨酶发挥催化作用环境。酶活性单位。微量移液器的使用。..
第三章酶化学 （一）名词解释 1.米氏常数； 2.寡聚酶； 3.比活力(specific activity) 4.变构酶； 5.同工酶； 6.活性中心； 7. 竞争性抑制作用； 8. 非竞争抑制作用； 9. 反竞争性抑制作用10.酶的专一性；11. 酶原的激活；12. 别构效应；13. 正协同效应；14. 共价修饰调节；15. 酶活力；16. 不可逆抑制作用；17. 可逆抑制作用。 1.变构酶活性中心外还有___________，当以v对[S]作图时，它表现出______型曲线，而不是典型的米氏酶所具有的_______曲线。 2.酶活性的国际单位（I.U.）定义为在最适条件下，将底物转化为产物的速度为_______的酶量。 3.对于符合米氏方程的酶，v-[S]曲线的双倒数作图（Lineweaver-Burk作图法）得到的直线，在横轴的截距为___________，纵轴上的截距为____________。 4.若同一种酶有n个底物就有________个K m值，其中K m值最________的底物，一般为该酶的最适底物。 5.蛋白质磷酸化时，需要__________酶，而蛋白质去磷酸化需要_______酶。 6.当底物浓度等于0.25K m时，反应初速度与最大反应速度的比值是______。 7.酶催化反应的实质在于降低反应的______，使底物分子在较低的能量状态下达到______态，从而使反应速度______。 8.___ ____抑制剂不改变酶促反应V max，______抑制剂不改变酶促反应K m。 9.谷丙转氨酶属于___________酶类；它的系统名称是___________。 10.复合酶类有___________和___________两部分组成。 11.合成酶类催化由_______合成一种物质的反应,且必须有_______参加. 12.酶活性中心有两个功能部位,一是___________,一是___________. 13.天冬氨酸转氨甲酰酶的别构激抑活剂为________,别构抑剂_________. 14.对同一种酶来说,酶的比活力越___________,___________越高. 15.解释别构酶作用机理的两个重要模型是___________和___________. 16.磺胺类药物是___________,可干扰___________合成. 17.酶是生物催化剂,其化学本质属于___________或___________ （三）选择题 1.下面关于米氏常数K m的论述哪一个是正确的? 1)与ES复合物形成及分解的速度常数都有关系 2)在不同类型的抑制作用中，K m都改变
琥珀酸脱氢酶染色液(四唑盐法)使用说明 货号：G1910 有效期：6个月有效 名称规格Storage 试剂(A):NBT孵育液50ml4℃避光 试剂(B):NBT对照液10ml4℃避光 产品简介： 琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase，SDH)是此琥珀酸氧化酶系的第一个酶，位于线粒体内。琥珀酸脱氢酶是黄素蛋白酶，分子内含有-SH，决定着酶的活性，故封闭-SH者皆可作为抑制剂。此酶活性最适pH为7.6～8.5。此酶参与三羧酸循环，在组织化学上，常以此酶活性作为三羧循环的代表，亦作为线粒体的标志酶之一。含此酶活性高的组织为心肌、肾小管上皮和肝细胞。此酶对固定剂敏感，故需用新鲜组织切片。Leagene琥珀酸脱氢酶染色液(四唑盐法)以琥珀酸为底物，在酶作用下脱氢，硝基蓝四唑(nitro BT)为受氢体，接受氢后被还原为甲噁，呈蓝紫色，用以代表琥珀酸脱氢酶的活性。NBT孵育液含有特殊的中间递氢体，可使定位更加准确，染色更加清晰。 操作步骤(仅供参考)： 1、冰冻切片，厚6μm，无需固定。 2、切片人NBT孵育液中，置于37℃温箱，浸染约5～30min。 3、蒸馏水冲洗。 4、甘油明胶封固。 染色结果： 酶活性部位蓝紫色沉淀；线粒体蓝紫色颗粒。 阴性对照(可选)： 1、相同切片置于NBT对照液中，37℃温箱浸染约5～30min作为对照。其余步骤同正常步骤，结果为阴性。 2、(可选)相同切片经10%福尔马林浸泡30～60min，再入NBT孵育液，结果为阴性。
注意事项： 1、本染色液适用于冰冻切片。 2、对冰冻切片染色时，应减少切片在室温暴露的时间。 3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
（六）酶的抑制实验 一、实验目的 理解两大类抑制反应的基本原理和主要特点，并掌握可逆抑制反应确定的原 理和方法。 二、实验原理 根据抑制剂与酶结合的特点可分为不可逆抑制和可逆抑制二种类型，其中可 逆抑制有可分为三种类型：竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。 （1）竞争性抑制类型： 酶不能同时与底物和抑制剂结合。动力学特征为：表观米氏常数Km'增加， Vmax'不变。（Ki 为抑制剂常数，[I]为抑制剂浓度）。 ][)][1(][S K I K S V v i m m ++= )][1('i m m K I K K += （2）非竞争性抑制类型： 抑制剂、底物能同时与酶结合，但此复合物不能进一步分解为产物，Km ’不 变，Vmax’下降。 ])[)(][1(][S K K I S V v m i m ++= i m K I V V ][1'+= （3）反竞争性抑制类型： 抑制剂必须在酶和底物结合后方能与酶形成复合物，但此物不能分解为产物。 Km'、Vmax' 都发生变化。 ])[][1(][S K I K S V v i m m ++= i m K I V V ][1'+= )][1('i m m K I K K += 对于有抑制剂存在的酶促反应，也可采用1/v ～1/[S]作图法，求出Km'、Ki 、 Vmax'，并利用各种可逆抑制类型的动力学特点判断抑制类型。 三、实验材料 1、试剂： （1）0.05mol/L 柠檬酸缓冲液； （2）酸性磷酸酯酶原酶液：原酶液用0.05mol/l 柠檬酸缓冲液稀释25 倍左右，
使测定的第五管A405，在0.6-0.7之间； （3）1.2 mmol/L NPP； （4）0.3 mol/L NaOH； （5）10mmol/LKH2PO4 （6）3mmol/LNaF 2、仪器与玻璃器皿： （1）恒温水浴槽； （2）可见光分光光度计； （3）试管、刻度吸管。 四、方法步骤 按表中由上至下操作： 取20支试管按下表编号，1-5号为各不相同底物浓度的样品空白管。各空白管在加入NPP和缓冲液后，先加NaOH，后加酶液。其余各按下表操作。以1-5管中相应的底物浓度做空白，在可见光分光光度计上测A 。 405
实验五琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制 集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）
实验五 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制 【实验目的】 1、掌握竞争性抑制概念及作用机理。 2、了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的简单方法。 【实验原理】 存在于心肌、骨骼肌、肝脏等组织中琥珀酸脱氨酸，能使琥珀酸脱氢而成延胡索酸，脱下氢可使甲烯蓝退色，还原为甲稀白。反应如下： 草酸、丙二酸等在结构上与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酸的活性中心结合。若酶已与丙二酸等结合，则不能再与琥珀酸结合而使之脱氢，产生抑制作用，且抑制程度取决于琥珀酸与抑制剂在反应体系中浓度的相对比例，所以这种抑制是竞争性抑制。本实验通过观察在由不同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体系中使等量甲稀蓝退色反应时间，从而验证丙二酸对琥珀酸的竞争性抑制作用。 【实验用品】 1、试剂 （1）0.10mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4）:0.1mol/L NaH 2PO 419ml 加 0.1mol/LNa 2HPO 481ml 。 （2）0.093mol/L 琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1.5g 溶于100ml 蒸馏水中。 （3）0.10mol/L 丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1.5g 溶于100ml 蒸馏水中。 （4）0.02%甲稀蓝溶液。 （5）液体石蜡。 2、器具 （1）0.10mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4）：0.1mol/L NaH 2PO 419ml 加0.1mol/LNa 2HPO 481ml 。 （2）0.93mol/L 琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1.5g 溶于100ml 蒸馏水中。 （3）0.10mol/L 丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1.5g 溶于100ml 蒸馏水中。 （4）0.02%甲烯蓝溶液。 （5）液体石蜡。 2、器具 （1）恒温水浴箱 （2）研钵或组织匀浆机 【实验操作】 新鲜免肝立即剪碎，放于组织匀浆机中研碎，加入pH7.4的 0.10mol/L 磷酸盐缓冲液，制备成200g/L 的肝匀浆液备用。取五支试管