沸5 min~10 min，12000 rpm离心后加样；
（3）电泳：浓缩胶10 mA恒流电泳至交界处，分离胶20 mA 恒流电泳至溴酚蓝到达凝胶下缘，可根据蛋白分子量的大小确定电泳的位置；
我们是bioworld的机子，一般可以电泳用恒压80V跑到底。
5）Western blot分析
（1）半干转膜仪转膜（具体和实验室机子有关）：剪与凝胶大小一致的PVDF膜一张（膜用之前的处理：甲醇浸泡min,ddH2O 浸泡5min，然后和滤纸一起泡到转缓里），滤纸12张，浸泡于转膜缓冲液中至少20 min，先将滤纸逐层置于转膜仪上，用下胶尺逐层赶尽气泡，加上PVDF膜，赶尽膜与滤纸间的气泡，将聚丙烯酰胺凝胶放在PVDF膜上，赶尽凝胶与尼膜之间的气泡，逐层加上滤纸，要尽量排放整齐；按照0.8 mA/cm2~1 mA/cm2的功率恒流转膜2 h~2.5 h。注意正负极。
我们一般用的是250ma转两个小时。
（2）将PVDF膜放入含5%脱脂奶粉的TBS中封闭2 h；（3）加入5%脱脂奶粉稀释的一抗，4 ℃过夜；（4）次日用TBS洗3次，每次10 min；（5）加入HRP结合的二抗，37 ℃，1 h；（6）TBS洗4次，每次10 min；
（7）显影：这个是根据各个实验室的设备。
实验原理 蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。 电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h或过夜可完成。固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。 蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。 主要溶液 10%分离胶 水 3.3mL、30% 丙烯酰胺混合液 4.0mL、1.0mol/L Tris（pH8.8）2.5mL、10% SDS 0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED 0.004mL 5%浓缩胶 水 2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/L Tris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL 1×Tris –甘氨酸电泳缓冲液 Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS 1g，用去离子水定容至1L 2×SDS凝胶加样缓冲液 Tris-HCl（pH6.8） 100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS 转移缓冲液 Tris 2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1L TBST Tris 1.21g NaCl 8.77g，Tween-20 1 mL，加去离子水至1L Stripping 1.3mL Tris （pH 6.8），4mL10%SDS，140μlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL 实验步骤 1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
提蛋白及WB的步骤 整个过程细胞或蛋白都必须放冰上 准备工作：前一天准备：借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂是否充足、 当天准备：洗玻璃板、开紫外，冰块、碎冰、标记离心管及离心管、细胞刮板、 开低温高速离心机 细胞裂解液配制： 1ml cell lysis 10ul NP-40（离心机后） 25ul 焦磷酸钠 40ul NaF 1ul β-甘油磷酸 2 ul Na3VO4 1ul 蛋白酶抑制剂（用完即放回冰箱） 10ul PMSF（最后加，随加随用，有毒） 细胞裂解和收集 1.观察细胞状态，并准备提蛋白：吸走培养基、用PBS洗细胞两次（倾斜贴壁加PBS，左 右轻轻摇），倾斜贴壁吸走PBS。 2.将细胞盘拿到外间冰上，加裂解液（体积网上推荐：一般106加），冰上静置1-2min。 3.刮细胞：细胞刮板每次用之前拿水涮一涮，甩干，然后从中间到外面打圈刮，再从下往 上，从上往下全面刮，（刮的时候要迅速），最后用枪吸取裂解液至离心管。 细胞破碎 4.超声波破碎细胞：准备三个小烧杯，加满冰块，三个小夹子。（超声波破碎仪的铁棒不 要碰到离心管的壁和底部） 超声波设置： 工作功率5% 工作时间3min 开机时间15s，关机时间30s 温度0度， 报警温度1度 5.4℃、13000r/min，离心15min。（离心机用后一直保持打开的状态，） 蛋白保存 6.蛋白保存及分装：吸上清液至离心管，涡旋、吸一半至另一个管中，涡旋。-80℃保存。注意事项：PMSF一定要现用现加，PMSF在水溶液中不稳定，30min内就会降解一半。样品处理超过1h，补加一次。
BCA测定蛋白浓度 1、测空白板，选差异较小的孔。 BCA测定法波长570，Bracford：595 2、标准蛋白的稀释（5mg/ul）：分装1ml PBS来使用，稀释标准蛋白至ul。 取5ul标准蛋白+45ul PBS 3、加样： 浓度0 BSA（ul）0481216 PBS（ul）20161284 4、样品蛋白稀释20倍：2ul蛋白+18ul PBS 5、配BCA：每个孔200ul，一个样品2个重复，A:B=50:1,根据样品数来计算BCA的用量， 一般防止损耗，多算一个样。 6、加BCA：悬空加、37℃孵育30 min。（手不能碰板的底部，影响测定结果） 7、计时30min 8、配分离胶，灌胶，加水封。 9、计时20min。 10、测蛋白：先振板、再设置参数。 11、计算上样体积: 12、配浓缩胶，灌胶，加梳子，等1-2min，出现缩胶的地方补上。 13、打开干式加热器 10、蛋白质上样：根据计算结果乘以稀释倍数，算出蛋白浓度，以体积最大的为准，其他用 水补足。(最大上样量为20ul，除去buffer的体积，蛋白质最大上样体积为16ul) 标记离心管 加样顺序：水、buffer(1/4)、蛋白、离心-涡旋-离心。100℃变性10min（迅速，确保变性程度一致） 11、计时10min ，变性10min。 12、安装电泳槽: 电泳液（1X）：配制：90ml（10X）+810ml水（只能用一次） 液面刚覆盖胶，不能有气泡。 13、上样：maker 上样量为3ul。依次上样（吸样品时最好一次吸完）枪头不能撬板，笔直打进去 14、电泳 分离胶100V，20min左右、条带都跑开即可。 浓缩胶145V 1h 有等紫色部分跑到底结束。 转膜 准备工作：转移缓冲液(只能用2次)、三层滤纸、海绵、PVDF膜 PVDF膜用之前用甲醇浸泡数秒。 用海绵和滤纸之前先浸湿。 转膜：负极（黑板）海绵-三层滤纸-胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵-正极（白板）。 三层滤纸和膜都需要赶气泡。
Western Blot 原理和操作方法（全） Western Blot 工作原理 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol 的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广旱挠τ? SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. 重要参数 ①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算: T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100% 其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml) ②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度: 蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%) <104 20-30
提蛋白及WB得步骤 整个过程细胞或蛋白都必须放冰上 准备工作:前一天准备:借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂就是否充足、 当天准备:洗玻璃板、开紫外,冰块、碎冰、标记１.５ｍl 离心管及0。6ｍl离心 管、细胞刮板、开低温高速离心机 细胞裂解液配制: 1ml celｌlｙsis 10ul NP－40(离心机后) 25ul 焦磷酸钠 ４0ul ＮaＦ 1ul β—甘油磷酸 2 ul Na3VO４ 1ul 蛋白酶抑制剂(用完即放回冰箱) 10ul PMＳＦ(最后加,随加随用,有毒) 细胞裂解与收集 1.观察细胞状态,并准备提蛋白:吸走培养基、用PBS洗细胞两次(倾斜贴壁加PBS,左右轻轻 摇),倾斜贴壁吸走PBS。 2.将细胞盘拿到外间冰上,加裂解液(体积网上推荐:一般1０6加0。１ml ),冰上静置１-２min。 3.刮细胞:细胞刮板每次用之前拿水涮一涮,甩干,然后从中间到外面打圈刮,再从下往上,从 上往下全面刮,(刮得时候要迅速),最后用枪吸取裂解液至离心管、 细胞破碎 4.超声波破碎细胞:准备三个小烧杯,加满冰块,三个小夹子。(超声波破碎仪得铁棒不要碰到 离心管得壁与底部) 超声波设置: 工作功率5% 工作时间３min 开机时间15s,关机时间３０s 温度０度, 报警温度1度 5.4℃、13００0r／mｉｎ,离心１5mｉn、(离心机用后一直保持打开得状态,) 蛋白保存 6.蛋白保存及分装:吸上清液至0。6ｍl离心管,涡旋、吸一半至另一个管中,涡旋。-80℃保 存。 注意事项:PMSF一定要现用现加,PMSF在水溶液中不稳定,30min内就会降解一半。样品处理超过１ｈ,补加一次。 ＢCA测定蛋白浓度 1、测空白板,选差异较小得孔。 BCA测定法波长570,Bｒacforｄ:595 2、标准蛋白得稀释(5mｇ/ul):分装1ml PBS来使用,稀释标准蛋白至0.5mg/uｌ。 取5ｕｌ标准蛋白+４5ul ＰＢS
细胞总蛋白提取方法 一、溶液配制 1.100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml 称取NaF 41.99mg，超纯水8ml溶解后定容至10ml。 2.100 mM PMSF 3.RIPA溶液100ml 成分分子量终浓度 Tris 121.14 0.6 g 5.0 mM (pH 7.4) NaCl 58.44 0.87 g 150 mM EDTA 372.24 37.22 mg 1 mM NP-40 1 ml 1% SDS 0.1 g 0.1% 脱氧胆酸钠0.5 g 0.5% 溶解于80 ml超纯水中，待溶解后加入HCl调pH值至7.4，定容至100 ml。 ※使用前加入 成分储存浓度加入量终浓度 PMSF 100 mM 10μl/1ml 1 mM NaF 100 mM 10μl/1ml 1 mM Aprotinin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl Leupetin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl 二、方法 1.细胞收取 1)细胞传代至60mm培养皿中，待细胞融合约100%，收集细胞 2)弃培养基，加入PBS 2ml清洗培养皿一次，弃PBS。 3)加入0.05%胰酶2ml，37℃温育1min。 4)待细胞变形后，将细胞吹下转移至一个1.5ml ependorf 管中，10,000rpm×3min，4℃ 5)弃上清，1ml预冷的PBS清洗沉淀，10,000rpm×
6)重复PBS清洗一次 7)弃上清，-80℃冻存待裂解 2.蛋白提取 1)向细胞沉淀中加入200μl RIPA缓冲液(含1mM PMS 1mM NaF、2μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupetin) 后冰上放置40mins 2)10,000rpm×15min，4℃ 将上清转移至一个新的ependorf 管中（约250μl）
这个protocol应该可以满足大部分人的需求。我孤陋寡闻，因需要检测可以溶于两种不同去污剂的蛋白，看到一篇文献里蛋白提取方法，完全被折服了。太强悍了，蛋白还可以这样提。我以前一直以为裂解液裂解后，沉淀里面没有蛋白了，现在才发现沉淀里还含有大量不溶于裂解液里去污剂的蛋白。故将这个protocol发出来供我和一样的新手学习。我以前是裂解细胞，离心，测浓度，然后直接往整管里加loading buffer，再离心取上清，看过这个步骤之后才知道，加loading buffer后沉淀里的许多蛋白会再次溶解。同一种蛋白可能存在溶于不同去污剂的成份。 最后我有一个问题，一瓶细胞按下列步骤提取的蛋白后，能否比较该瓶中同一蛋白在含不同去污剂的裂解液中含量的多少？怎样选择内参？ For cell fractionation analysis, a general protocol was used which allowed for separation of cells into cytoplasmatic, nuclear and membrane/cytoskeleton fractions. Briefly, cells were harvested with a rubber policeman in chilled 50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM MgCl2, measured pH 7.5, plus inhibitors, and ruptured by repeated passage through a 21-gauge needle. Nuclei were collected by centrifugation at 1000 ×g for 3 min and lysed with 1% SDS-lysis buffer. Centrifugation of supernatants at 21,460 ×g for 1 h at 4 °C gave membrane/cytoskeleton as pellet and the cytosolic fraction as supernatant. Membrane/cytoskeleton pellets were then resuspended as whole, SDS-solubilized membrane/cytoskeleton fraction (Tot) with 1% SDS-lysis buffer. Otherwise, membranes were fractionated into Tx-soluble (Sol) and Tx-insoluble (Insol) phases by treatment with TritonX-100-buffer (100 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, measured pH 8, 1.5% TritonX-100, 10% glycerol, plus inhibitors). Centrifugation at 21,460 ×g for 60 min gave a supernatant constituted by the Tx-soluble membrane phase and a residue pellet representing the Tx-insoluble, cytoskeleton-linked membrane phase which was resuspended in SDS-buffer. 翻译版本一 细胞分部分离一般的实验设计是将细胞分离为细胞质的、核的、细胞膜/细胞骨架这几个部分。简单来说就是， 1. 用一端包有橡皮的玻璃棒从冷却的50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM MgCl2, measured pH 7.5, plus inhibitors 中收获细胞，用21号针使传代细胞破裂。 2. 通过离心（1000 ×g for 3 min ）收集细胞核，用1% SDS-lysis buffer溶解。 3. 所得上清液再离心（21,460 ×g for 1 h at 4 °C ）得到的片状沉淀物为细胞膜/细胞骨架，上清中的蛋白为细胞质部分的。 4. 片状的细胞膜/细胞骨架沉淀用1% SDS-lysis buffer全部重悬。另外，用TritonX-100-buffer (100 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, measured pH 8, 1.5% TritonX-100, 10% glycerol, plus inhibitors)处理细胞膜，将膜被分为可溶和不可溶两部分，通过离心（21,460 ×g for 60 min ）取沉淀，用SDS-buffer将细胞骨架相连的膜重悬。 翻译版本二 最好全部冰上操作。 1，弃去培养基用PBS洗2次后，加入冷的裂解液，裂解液配方：50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 调整pH至7.5, 根据需要加入蛋白酶抑制剂，有钱可以买pierce的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（英文好像是cocktail）。 2，在裂解液中用细胞刮子收集所有细胞，转移裂解液至EP管，用21号针头反复吹打裂解细胞。 3，1000g*3min离心，将上清转移至另一EP管(A管)，沉淀用适量含1%SDS的裂解液（上述裂解液加入SDS）溶解即可得到核蛋白。
蛋白质提取方法-------列举10种方法 一、植物组织蛋白质提取方法（summer） 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清夜，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8）45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、植物组织蛋白质提取方法(summer) 三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品： 提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！ 三、组织：肠黏膜（newinbio） 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE 提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）倒转混匀，置室温10min 离心：12000 g，10min，4度，弃上清，加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE 用量）振荡，置室温20min 离心：7500g，5 min，4 度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2 次 沉淀中加入100％乙醇2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀，1％SDS溶解沉淀 离心：10000g，10min，4度 取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的问题：加入1％SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定，SDS 结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，
Western blot实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳、转膜及显色过程步骤 高征 2014年6月
第一部分 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提过程(碧云天试剂盒) 一、原理 在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且很多时候分离出来的核蛋白可以用于转录调控方面的研究，例如EMSA(也称gel shift)，footprinting等。 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。约90分钟就可以完成培养细胞的细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。 本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。本试剂盒可以抽提50个样品，如果每个样品的数量为约二百万细胞或约30-50毫克组织。 二、注意事项 1.需自备PMSF。PMSF一定要在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。 2.抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。 3.本试剂盒对于组织样品，仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果很差。可以抽提的组织样品数通常不足100个。 4.使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用碧云天生产 的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。但不适合用Bradford法测定蛋白浓度。 5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 三、使用说明 1. 准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF 的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。（蛋白酶抑制剂可酌情翻倍） 2. 对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液（0.5%
WB的原理、操作及注意事项 原理： 通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1?5ng （最低可到10- 100pg）中等大小的靶蛋白。 一、抗原的选择和制备 A：样品的制备 1 组织： 组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS0C研磨，加入5X STOFbuffer , 180W6mins , 0C 超声波破碎，5000rpm,5mins 离心，取上清。加入B -ME（9.5ml 加入0.5ml）, 溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml ）煮沸10min，分装后于-20 C保存，用时取出，直接溶解上样。 2 细胞： 细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入 5 x STOPbuffer，收集， 180W6mins , 0C超声波破碎，5000rpm,5mins 离心，取上清。加入B -ME（9.5ml 加入0.5ml）, 溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml ）煮沸10min，分装后于-20 C保存，用时取出，直接溶解上样。3 分泌蛋白的提取（特例）： 直接收集分泌液，加入B -ME、溴酚蓝制样。 B:蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因 1. 双缩脲法： 双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L ?10g/L 含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%^的三 氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1mNaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量 测定。 2. Lowry 法： 此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性 溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深 蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L?400mg/L 含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上 述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液 中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络 合物所还原。 3. 紫外吸收法： 大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1?0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算： M 白虜浓皮（m”/mi）—1 ” 55A”? - 0.76 \ m 280 260
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹技术 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro等建立，主要用于测定蛋白质亚基分子量。Western 印迹是在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳基础上，将电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至一种固相支持物上，应用抗体可与附着于固相支持物上的靶蛋白发生特异性反应的特点，针对特定蛋白进行鉴别和定量。 原理 1．SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂，例如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚，使其氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。在水溶液中蛋白质-SDS胶束的长度与亚基分子量的大小成正比。因此这种胶束在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD～200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅可以分离蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。 2．Western 印迹 在Western印迹法中，待测样品溶解于去污剂和还原剂的溶液中，经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后被转移到固相支持物上（常用硝酸纤维素滤膜），然后可被染色。随后滤膜可与抗靶蛋白的一抗反应。最后，结合上的抗体可用多种二级免疫学试剂（与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的A蛋白或抗免疫球蛋白）检测。Western 印记法可测出1-5ng中等大小的待检蛋白。 方法 1.样品的制备 从细胞中提取蛋白质样品用于Western印记的方法有两种，一是可以在加样缓冲液中直接溶解完整细胞；二是制备细胞提取液。可根据不同的目的采用不同的方法。如果仅是定性实验，可应用第一种方法；如果需测定蛋白含量并进行定量实验，可应用后一种方法。1.1 凝胶加样缓冲液裂解哺乳动物细胞和组织制备蛋白质样品 1）裂解细胞或组织 a.单层培养细胞：用PBS缓冲液漂洗细胞2次，弃去洗液并吸尽残余的PBS液体， 加入一定体积（50～200μl）的加热到85℃的1×SDS凝胶加样缓冲液[50mmol/L Tris.Cl(pH 6.8), 100mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）, 2% SDS, 0.1% 溴酚蓝，10%甘油] 溶解细胞，用细胞刮刀把粘稠状的细胞裂解物收集于一个微量离心管中，用于步骤2）。 b.悬浮培养细胞：用冷的PBS充分洗涤细胞后，去尽残液，加入一定体积用冰预冷 的悬浮缓冲液[0.1mol/L NaCl，0.01mol/L Tris.Cl（pH 7.6），0.001mol/L EDTA （pH 8.0），1μg/ml Aprotinin，100μg/ml PMSF]，涡流振荡混匀后，加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液[100mmol/L Tris.Cl(pH 6.8), 200mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）, 4% SDS, 0.2% 溴酚蓝，20% 甘油]，混匀后，用于步骤2）。
?1 材料与方法 1、1 材料 1、1、１组织与细胞得来源: ?１。1、2 仪器设备?机械组织匀浆器?低温高速离心机(＞40,０0０g) 超速离心机?超生细胞破碎仪 超纯水装置 ??1、1。3 试剂 三氯醋酸(TCＡ) 丙酮 二硫苏糖醇(DＴT) ?尿素?CＨAＰS?PMSF?EDTA ?乙醇?磷酸 考马斯亮蓝Ｒ3５0 ?抑肽素Ａ?亮肽素 试剂纯度均应就是分析纯或以上。? 1。１、４溶液配制?(1) PBS: ?NａCl８g,KCl 0、2 g,Na２HPＯ4 1。44 g,ＫH2PO4,溶于800 ml水中,用HCl调pＨ至7.4,用纯水定容至1 L; ?(2)ＥDTA 储存液: 18.61g Na2EDTA?2Ｈ２O,溶于70 ml纯水中,用10 mol/L NaOH调节ｐH值至8.0(约需2 g ＮａＯH颗粒),定容为100 ml、可高压灭菌后分装备用;?(３) 亮肽素储存液(50 μg/ｍl,100×) １0mｇ/ml溶于水,-75℃保存;使用时配成50 μg/ｍl储液,-２0℃保存; (4) 抑肽素储存液(7０μg／ml,10０×) 1 mg／ｍl溶于甲醇,—75℃保存;使用时配成７0 μg/ml储液,-2０℃保存; (5) PＭＳＦ储存液(１０ｍM,100×): １７.4mｇPMＳF,溶于１ml异丙醇中,—２0℃保存。?ＤTT储存液(1 M): ?０。31ｇDTT溶于2 ｍlＨ2O中,-20℃保存(DTT或含有DTT得溶液不能进行高压处理,可过滤除菌)。?(7) 裂解液: Lysis bufｆｅr Ａ (９M ｕｒeａ,４%ｗ/v ＣＨAＰS, 1％w／v DTT, ０.5％CA and a cｏｃktaiｌof ｐｒoteａｓｅinhibitｏrs)??Lysｉs buffer B (7 M urｅa, 2M ｔhiｏuｒea,4% w/v ＣHＡＰS, 1％w／v DTT,０、５% CA ａnｄａcocktaiｌoｆｐroteａse inhｉbitors) ?Lysｉｓbｕｆｆer C 40 ｍＭTrｉs－base (ｐH 9。5)iｎｕltrapｕｒe H2O Ｌyｓis buffer D (8 Ｍurｅa, 4％CHＡＰS, 4０mM Tris(ｂasｅ), 40 ml) ?Lyｓｉs buffer E ?(５M urea, 2 M tｈioｕreａ, 2％SB3-10, 2％CHAPS,１% w/v DTT, 0、５% CＡandａcocktａｉl ｏｆproteaｓe inhibitors) 100μL SDＳsaｍple solｕｔion (1% w/v SDＳ, 0、3７５M Ｔｒiｓ－HCl, pH8。8, 50 mM DTＴ,２5％v／ｖgly ?LysiｓbｕfｆeｒＦ? ｃeroｌ) ●CA、蛋白酶抑制剂混合物与DＴT在临用前加入。?蛋白酶抑制剂混合物［3]?成分终浓度?蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 μg/ml oｒ 1 mM EDTA 0、３mg/ml (1 ｍM) 抑肽素 0。7 μg/ｍl?亮肽素 0、5μg／ｍl? 1.2 方法?1。1.1组织蛋白提取方法 １、２.1。1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1］?(1)冰上取材,称湿重,置液氮中冻存或直接进行下一步; (2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织; ?(３)将粉末悬浮于含DTT(0。2％w／v)得10％三氯醋酸(w/v)得丙酮溶液中; (4)蛋白–２0℃沉淀过夜; ?(5)35０00×g(6℃)离心30min; ?将沉淀重悬于含０.2％DTT得预冷丙酮中; ?(7)-2０℃放置1h; 350０0×g(6℃)离心30min; (9)在通风橱中让丙酮充分挥发,得到干燥得沉淀; 15℃,40000×ｇ,离心1hr; (10)在裂解液中重新溶解沉淀(5０－10０ｍg组织需要1ml裂解液); ?( ) 11 (12)用Ｂraｄｆoｒd法[2］测定上清得蛋白浓度,分装后置–75℃保存。?1、2、1。2超速离心法?(1)取材; ?(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品
蛋白提取实验步骤： 1、细胞总蛋白提取 A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。 B、对于贴壁细胞: a、用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。 b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。 c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。 C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 2、组织蛋白提取： A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。 B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 注意事项 1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。 2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。 3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打， 或再加入适量裂解液以保证充分裂解。 5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保 存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复 冻融。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！
实验基本步骤 提取细胞蛋白 ↓ BCA定量 ↓ 制备蛋白胶(SＤS-PAGE胶) ↓ 蛋白样品变性 ↓ 电泳 ↓ 转膜 ↓ 封闭 ↓ 一抗 ↓ ＴBＳT洗涤 ↓ 二抗 ↓ TBST洗涤 ↓ 显影 ↓ 结果分析
试剂配制 １。PBS磷酸盐缓冲溶液1L 磷酸二氢钾0、24g 磷酸氢二钠 1.44ｇ 氯化钠 8ｇ 氯化钾 0。2g 加入50０mｌ纯水,调PH=7、2 定容至1L,高压蒸汽灭菌 ２。PBST(PBS+０、05%吐温—2０) 5０0ｍｌPBS+0。２5ml吐温-２0 3。电转液50０mｌ Ｔris １。5g 甘氨酸 7。2ｇ ４０0ｍl水溶解 加入100ml甲醇,置于4℃冰箱预冷 ４.电泳液(1Ｘ) 1０x稀释,５０ｍl1０ｘ电泳液+450ml纯水 5.TBS 6。TBST(TBＳ+0。05%吐温－20) 5０ｍlＴBS+４50ｍl纯水+0.25ml吐温-2０
7、封闭液 ＴＢＳT1X＋５%奶粉 4０ml封闭液=4０mlTBST＋２g奶粉,40℃预热 ＷB实验 一、蛋白样品制备 准备:一管细胞,PBＳ(４℃预冷),PMSF(1０0ｍM),移液枪(1０00ul,１0ul),1、5ｍlEＰ管2个,高速冷冻离心机4℃预冷 1.于—2０℃冰箱中取出一管细胞样品,吸去培养液 2.加入1mｌ4℃预冷得PBS(0、0１M ｐＨ７。２～７、3)。用移液枪轻轻吹成悬浮液后4℃,８0００r离心５ｍin,然后弃去上清、重复以上操作一次,共洗细胞两次以洗去培养液。 3、按1ml裂解液加10 μlＰMSＦ(100 mM),摇匀置于冰上。(ＰMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。) ４.在样品中加入3００ul含PMＳF得裂解液,吹匀,于冰上裂解30 ｍｉn,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动、 5.裂解完后,于4℃下1２000 rpm离心5 miｎ。 7.将离心后得上清分装转移倒0。5 ml得离心管中放于－20℃保存、 二、蛋白含量得测定(BCＡ定量) 准备:96孔板,移液枪(10０0uｌ,10ul,２00ul),ＢCA工作液(A+Ｂ),５０mlＥＰ管,１xPＢS,BＳA标准液 1.将９6孔板分好区域,若不够分则只做两个重复,(外围一圈得孔最好不用) 2.算好孔数(总得)每孔加２0０ｕlBCA工作液(Ａ+B),(A液:B液＝50:1,一般配多些,如６０孔,A液12000ｕl,B液2４0ｕl) 3.将样品稀释到一定倍数才能定量,(10倍,20倍,30倍),每孔需要20uｌ样品(2uｌ样品+１8ulPBS,即稀释10倍),
细胞的总蛋白质提取全 过程及经验 The manuscript was revised on the evening of 2021
细胞的总蛋白质提取全过程及经验 如果你要自己裂解细胞的时候，需要注意的事项：师兄给你的细胞要赶紧裂解，当然了，你还要看是带瓶子给你还是消化好给你的。一般我使用的时候，是将细胞统一从几个培养瓶中消化收集起来，然后赶紧4 度下离心，用预冷的PBS 或者生理盐水洗涤细胞。也有人喜欢在培养瓶中直接加裂解液，这个一般都是做 western 什么用的，需要的蛋白量不是很多，而且大部分时候都是要有活性的蛋白的。一般1000rpm 足够离心了，转速太快，细胞会破碎，然后会损失蛋白。PBS 洗涤的最后一遍，记得将细胞转移到超声管中，也许是由于普通的10mL 离心管有可能承受不了超声的能量吧，我们师兄师姐一般都用超声管来自装细胞，然后加入裂解液直接超声。3s 每次，间歇3s 60 次，400W，重复工作复位2 次，总共超声180 次就差不多了。裂解后的细胞要赶紧在2500g 下离心30-60min，超声管是没有盖子的，可以直接在上面加一层封口膜离心。在离心的时候，去配制沉淀液，丙酮：无水乙醇：冰乙酸=50:50:，体积比。一般我加的是裂解液体积的5 倍。沉淀液要预冷，我喜欢将沉淀液放在-20 度下。细胞离心后，上清液加入到沉淀液中，就会看到比较多的白色沉淀出现，-20 度沉淀>2h，然后就可以高速沉淀下蛋白了。这里我们用的体积比较大，一般的离心管不能用，要用 beckman 专用的那种50mL 离心管，25000g，15-30min。Beckman 离心管比较大，底部是平的，所以蛋白在底部并不是很牢固，在弃去上清液的时候，一定要注意用枪头缓慢的吸出！然后用5mL 做有的丙酮洗涤一遍，再用75%酒精将蛋白转移到4mL 的离心管中，当然，如果你的蛋白很少，的EP tube 也可以使用。之所以用4mL 是因为我每次提取的蛋白量大概>10mg，而冻干后的蛋白复溶后测定浓度，一般要求在5-6mg/mL 之间，所
Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法） 人工肝实验室学习姚瑶 （一）目的蛋白提取： （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。 2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。 共洗三次，每次十分钟。 3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。 4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做） 5、4℃，12000转离心10min。 6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。 （2）组织中总蛋白的提取： 1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。
2、配平后，4℃，14000转离心10min。 3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定： 1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。 3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。 4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。 5、37℃水浴30min。 6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。 7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。 （三）SDS-PAGE电泳： （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样： 1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。