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生物安全柜操作规程及维护............................................................................错误 ! 未定义书签。实验室高压蒸气灭菌器操作程序....................................................................错误 ! 未定义书签。物体表面细菌监测. .............................................错误 ! 未定义书签。医护人员手指细菌监测. .........................................错误 ! 未定义书签。空气中细菌含量的监测. .........................................错误 ! 未定义书签。环境卫生学监测质控标准. .......................................错误 ! 未定义书签。使用中消毒剂与无菌物品保存液的质控程序. .......................错误 ! 未定义书签。一次性医疗用品微生物监测. .....................................错误 ! 未定义书签。紫外线消毒质量控制程序. .......................................错误 ! 未定义书签。污水的细菌监测(总大肠菌群) . ..................................错误 ! 未定义书签。正确洗手的手法................................................错误 ! 未定义书签。
生物安全柜操作规程及维护
1.目的：
为了满足生物安全操作的要求，并且达到在操作时保护操作人员的目的，使细菌操作达
到无菌操作的要求，便于操作的标准化。
2.原理：
通过使用空气超高过滤器（ ULPA）的过滤，使仪器内部的空气洁净度达到100 级，使细菌的一般操作限制在一个相对密闭的环境中，不但保护操作人员，还可满足操作的标准化。
3. 工作条件：
环境温度： 18－ 30℃相对湿度：<80%
安装的环境必须达到一定的洁净度；远离人员通道及有潜在干扰气流的位置；柜后及
两侧各留30cm 的空隙，顶部30-35cm 空隙。
环境必须有良好的通风设备。
4、操作步骤：
生物安全柜的设置已经设置完全，如果需要重新设置请参看HFsafe 生物安全柜使用说明。具体操作步骤为：
将电源插头插入准备好的固定插座，连通电源。
有系统管理员( 即本室负责人) 开启玻璃门门锁，并将总开关置于开位置“！”，此时系统开始上电。
检查显示及按钮的各项功能，具体见后附注（注意：UV 灯的测试除外，开启UV灯时必须将前玻璃门关闭）。
当系统稳定后，对设备进行安全性检查。（检查项目包括：工作室平均垂直风速；工作室内
可操作区域洁净度达到100 级；设备的密封有没有被破坏。所有的安全检查项目中的洁净度
建议由当地卫生防疫部门来进行尘埃粒子数、沉降菌和菌落数的检测，看是否符合其工作室的洁净度要求）。
如果安全性测试通过，系统已经可以使用，请在《使用记录》上写下相应的信息。在使用
时需要注意的是，操作必须在工作台板无孔区域进行，物品也必须放置于无孔区域。
操作者应先把手臂放进安全柜内大约 1 分钟，以使柜子适应并且让气流扫过手臂手臂移入
移出柜内应保持前门气流的连续性，应缓缓移入移出，并且方向和前门垂直；为使跨越前门的动作量降低，在实验开始前应把所需的物品放入柜子；柜子在开始工作前以及完成后至少
要运行 5 分钟是，使柜子净化，以便于污染空气从柜内排出。实验操作方向应从清洁区到污
染区，一般要求为左→右。
当工作完成后需要关机前，将试验使用的所有材料和其他物品从设备中取出。
关闭前玻璃门前，需要维持气流循环一段时间（时间长短视所操作材料的危险性而定）。
关闭风机，停止气流循环。
每日使用后维护( 见后面维护中的第一二步) 。
维护完成后，关闭电源开关。
锁住前玻璃门，并如实填写《使用记录》。
5、仪器的维护：
基本保养：
清洁：在通常的情况下，清洁只需要用少量家用或商用的碗碟清洗剂，将它溶于水后直接
擦洗，就可将设备表面的污染擦掉。请不要擦拭任何玻璃，以免产生摩擦。
在使用过程中每日或每周的清洁:
清洁工作室
消毒（一般使用1000mg/L 的次氯酸钠溶液）和
对操作面板进行消毒和清洗。
用柔性的清洁剂或玻璃专用清洁剂清洗箱体外表面和玻璃。
对照说明书对设备的各种功能进行检查。
将本次工作记录下来。
月清洗：
用清洁剂将所有外表面的尘埃清除。
对设备内部进行消毒处理。
对设备进行功能检验，并在通常使用时检查设备的安全。
将本次清洗记录下来。
每月必须对紫外灯进行照射强度检测。
每年维护：
对设备进行安全性全面的检查，对设备进行维护。包括柜体防泄露、高效过滤器的完整性、
人员保护能力、产品保护能力、下降气流流速、流入气流流速、负压、气流模式、警报和联锁等
的检测。一般安全检测由仪器公司进行。
检查前玻璃门驱动装置的松劲程度。
检查紫外灯管。
将本次维护记录下来。
每两年更换日光灯管。
故障的维护处理：
当故障发生时必须停止一切操作，尽量维持设备内部空气的循环过滤，将正在进行的
试验材料和工具全部取出并妥善管理，然后通知有关部门前来维修。每次仪器出现故障时
必须填写故障登记表，注明故障情况及处理情况。常见的故障，原因及其处理方法见下表：现象原因处理方法备注
照明光源或紫外灯无线路故障检查线路
法点亮灯管坏更换灯管
镇流器失效更换镇流器
蜂鸣器间断报警过滤器失效更换过滤器安全检查
蜂鸣器连续报警可能玻璃门过高向下调整玻璃门
6、注意事项：
只有负责管理本设备的人员才有权关闭风机。
只有经过培训和指导的人员才能操作本设备。
顶部通风口不能被任何东西覆盖以保证排气通畅。
当系统失效时会发出声讯号，此时不能继续操作，否则会导致材料的损失，污染和人身安
全方面的危险。
如果发现过滤器失效，要更换过滤器时，必须由专业人员进行更换。
柜内溅出物的处理：在柜内如果出现危险生物材料溅出，应该不能关闭风机继续运行，覆
盖滤纸或吸水纸于溅出物表面，然后向滤纸上滴加消毒液（1000mg/L 的次氯酸钠溶液）浸泡 5 分钟，用钳子钳取滤纸丢入感染性废物收集袋中，然后用浸泡了消毒液的干净抹布擦拭
柜内表面。
生物安全柜内避免使用明火，因为使用明火会破坏柜内的气流方向。也禁止使用易挥发易
燃易爆物品，以免造成危险。接种环可以使用微波炉或“电炉”，最好使用一次性接种环。
实验室高压蒸气灭菌器操作程序
1．目的：
培养基等的液体灭菌，溶解。
器具等的灭菌。
1.3废弃物的处理灭菌。
2．原理：
高压蒸气灭菌。灭菌温度105℃-135 ℃，溶解温度60℃ -100 ℃，保温温度45℃ -60 ℃；压力兆帕
3．工作条件 :
环境温度 :5 ℃ -35 ℃
背面距离墙10 厘米以上 , 右侧距离墙 5 厘米以上。
需放置在无阳光直接照射及湿度不高, 灰尘少的地方。
4.操作步骤：
放置排气储存桶
注意 : 不得在灭菌器附近放置或放入可燃性物质 , 爆炸性物质 , 氧化性物质 ,
易燃性物质 , 可燃性气体。
在排气容器孔中务必插入排气软管添密件, 关紧盖罩 ,
接通电源开关
注意 : 安装专用电源连接插口, 安装地线 , 可靠接地。
发生异常情况时立即停止运转, 切断电源。检修时要切断电源。
打开盖子
注入加热用水
注意 :需采用蒸馏水或自来水。
放入灭菌物品
;
注意 :不得将灭菌物品装入蒸气不能进入的容器和袋子, 否则无法灭菌
装盛灭菌物品的容器不得密封。不要让灭菌物品堵塞和挤压灭菌器内的
孔和温度传感器。仅对试管 , 烧瓶等容器本身灭菌时, 开口要向下或横放。
物品灭菌时，应同时放入监控指标。用对热敏感的染料标记的变色带子。
灭菌时，将变色带夹放在试验包裹中,以监视灭菌效果，关闭盖子
选择过程 ( 变更设定内容 )( 设定预定运行作业)
注意 :运行中要开启排水阀。
按下操作按钮
R1 或 b1C1D1
灭菌.保温灭菌.溶解器具灭菌
运行注意 : 运行中如有蒸气泄漏时，不要靠近安全阀排气口。
运行完毕 ,打开盖子,取出灭菌物品
注意 : 不要被烫伤 , 脸不要靠近灭菌器。
切断电源开关
排放加热用水
物体表面细菌监测
1.目的规范物体表面采样及监测标准操作规程。
2.适用范围
医院感染监控重点科室，每月常规监测。
发生医院感染暴发流行。
3、职责医院感染管理专职人员或兼职人员应遵守本程序。
4.程序方法
监测对象：选择有代表性的可能污染表面
采样时间：选择消毒处理后， 4 小时内进行采
样面积： 100cm2
25cm 2细菌定量采样皿培养法：
①使用时将采样器去盖，在待测物品上直接接触10 秒钟后加盖（采样皿为一样本面积不得少
于 10cm2）。②将采样皿置35～ 37℃温箱培育18－ 24 小时，直接细菌计数（细菌个数／cm2）和分离鉴定细菌。
棉拭子涂擦法：
对物体表面采样时，将内径为5× 5 cm2的灭菌规格板放在被检物表面，用浸有灭菌生理
盐水的棉拭子，在规格板空心处涂抹 5 次（往返为一次）；移动规格板，按同样方法涂抹采样，
连续采样 4 次（采样 4 次为一样本）剪掉或烧去手接触部分。将棉拭子放入装有10 亳升的灭
菌生理盐水的采样管中，送实验室进行培养鉴定细菌和细菌计数。门把手等小型物体则用棉拭
2
子直接涂擦物体表面，以每件为单位计算，较大门把手等则按面积（cm）计算。
一、二类区域细菌总数≤ 5 CFU/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。
三类区域细菌总数≤ 10 CFU/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。
四类区域细菌总数≤ 15 CFU/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。
母婴同室、婴儿室、新生儿室及科病房的物体表面不得检出沙门菌为合格。
医护人员手指细菌监测
1.目的
规范医务人员手采样标准操作程序。
2.适用范围
手卫生监测。
3.职责
医院院感管理专职人员或兼职人员应遵守本程序。
4.程序
采样时间：在接触病人，人事医疗活动前进行
采样面积及方法：被检人五指并拢，将带有无菌生理盐水的棉拭子放在双手指曲面从指根到
指端来回涂擦各 2 次（往返算一次）并随之转动采样拭子剪去手接触部分，将棉拭子放入10ml
30 cm2）
采样液试管内送检（每只手面积均为
结果计算：
手污染细菌菌落数（Cfu/cm2）＝平器上菌落数×稀释倍数
30
5 结果判断
一、二类区域工作人员细菌总数≤ 5 CFU/cm2，并未检出金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及铜
绿假单胞菌为消毒合格。
三类区域工作人员细菌总数≤ 10 CFU/cm2，并未检出金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及铜绿假
单胞菌为消毒合格。
四类区域工作人员细菌总数≤ 15 CFU/cm2，并未检出金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及铜绿假
单胞菌为消毒合格。
母婴同室、婴儿室、新生儿室及儿科病房的工作人员手上，不得检出沙门菌、大肠埃希菌、
溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌为合格。
注意事项被检人洗手消毒后切勿擦干。
空气中细菌含量的监测
1.目的
正确进行空气细菌含量的监测。
2.适用范围
医院感染监控重点科室，每月常规监测。
发生医院感染暴发流行时。
3.职责医院感染管理专职人员或兼职人员应遵守本程序。
4.程序
采样时间：选择消毒处理后与进行医疗活动期间采样。采样高度：与地面垂直高度为80－ 150cm。布点方法：室内面积≤30 ㎡设三点，≥30 ㎡设五点
采样方法：
平皿暴露法：将 9cm直径的玻璃普通营养琼脂或血琼脂平血，放在室内 3 个或 5 个采样点上，将平皿盖打开，叩放于平皿旁，暴露 5 分钟，盖好。置37℃温箱培养 24－ 48 小时观察结果，并计数 3 个或 5 个平器中的平均菌落数。
3
细菌数 cfu ／ m=N 100 × 5
× 1000＝ 50000 N
AT10AT
A＝平皿面积（cm2）N＝平均菌落数T＝平皿暴露于空气中的时间（分）
5.结果判定
一类区域细菌总数≤ 10 CFU/m3（或 CFU/ 平板），并未检出金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌
为消毒合格。
二类区域细菌总数≤ 200 CFU/m3（或 4 CFU/ 平板），并未检出金黄色葡萄球菌、溶血性链球
菌为消毒合格。
三类区域细菌总数≤ 500 CFU/m3（或 10 CFU/ 平板），并未检出金黄色葡萄球菌、溶血性链球
菌为消毒合格。
一类区域包括层流洁净手术室和层流洁净病房。
二类区域包括普通手术室、产房、婴儿室、早产儿室、普通保护性隔离室、供应室洁净区、烧
伤病房、重症监护病房。
三类区域包括儿科病房、妇产科检查室、注射室、换药室、治疗室、供应室清洁区、急诊室、化验室、各类普通病房和房间。
6.注意事项
采样前，关好门、窗、在无人走动的情况下，静止10 分钟进行采样。
平皿应新鲜透亮，当天领取使用。如为空气采样机采样，按操作说明进行。
环境卫生学监测质控标准
1.目的
规范环境卫生学监测质控标准程序，确保员工和环境的安全。
2.范围
医院感染监控重点科室，每月常规监测。
发生医院感染暴发流行。
3.职责
医院感染管理专职人员或兼职人员应遵守本程序。
4.程序
环境空气、物体表面、医护人员手质控标准
环境类别范围标准
空气物体表面（ cfu/cm2）医护人员手（ cfu/
2）2
（ cfu/cm cm）Ⅰ类层流洁净手术室、层
≤ 10≤ 5≤ 5流洁净病房
Ⅱ类普通手术室、产房、
新生儿室（母婴同室、
病房）、早产儿室、普≤ 200≤ 5≤ 5
通保护性隔离室、供
应室、无菌区
Ⅲ类儿科病房、妇产科检
查室、注射室、换药
≤ 500≤ 15≤ 5室、治疗室、化验室、
各类普通病房和房间
Ⅳ类传染病房及房间－≤ 15≤ 15外科、妇科不能检出绿脓杆菌、婴儿室、新生儿病房、产房不能检出沙门氏菌属。
使用中消毒剂与无菌物品保存液的质控程序
1.目的
规范消毒灭菌程序，保证实验室内的环境安全。
2.范围
适用于微生物实验室内环境日常消毒的操作。
3.职责
实验室负责人及检验人员、消毒人员执行本程序。
4.程序
监测方法：
细菌含量监测
①采样时间：取更换前，使用中的消毒剂和无菌物品保存液；
②采样量及方法；
将被检测消毒液混匀后，用无菌吸管取样1ml 加至 9ml 含中和剂的肉汤培养基内，取其混合液各，接种于两个无菌平器上，一个置36℃± 1℃培养 3 天，另一个置28℃培养 7 天，观察计数和鉴定。
③采样结果计算：
每亳升微生物数（cfu/ml ）＝两种培养温度下平器上的菌落数×稀释的倍数
× 2
浓度的检测：
即用 G－ I 消毒剂浓度试纸测定法。
质控方法：
使用中消毒液细菌菌落总数应＜100cfu/ml ，不得检出致病菌。
无菌器械保存液必须无菌生长。
一次性医疗用品微生物监测
1.目的
规范一次性医疗用品微生物监测的程序，减少环境污染，保护人员安全。
2.范围
微生物实验室内的一次性医疗用品。
3.职责
实验室所有工作人员执行此程序。
4.程序
医疗用品采样检查方法
采样时间：在消毒或无菌处理后存放有效期内采样；
采样量和采样方法：
（ 1）破坏性方法取样：如输液．输血器．注射针等，剪碎取一定量于培养基内培养，35℃, 48小时培养。
（2）不能用破坏性方法取样：可用浸有无菌生理盐水采样棉拭子在被检物体表面涂抹采样，
被采表面＜ 100cm2，取全部；被采表面≥ 100cm2；取 100cm2于培养基里 35℃ ,48 小时培养。质
控标准：
进入人体无菌组织，器官或接触破损皮肤粘膜的医疗用品必须无菌。
接触粘膜的医疗用品，细菌落数应≤ 20cfu/g 或 100cm2，不得检出致病菌。（溶血性链球菌），沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌等。
4.2.3接触皮肤的医疗用品，细菌菌落总数≤20cfu/g或cm2，不得检出致病菌。
紫外线消毒质量控制程序
1.目的
规范紫外线消毒灭菌程序，保证微生物实验室内的环境安全。
2.范围
适用于微生物实验室内环境日常消毒的操作。
3.职责
实验室负责人及检验人员、消毒人员执行本程序。
4.程序
紫外线监测主要是测定照射强度。
方法：可用紫外线强度计离紫外线灯管正中垂直 1 米处，开灯照射 5 分钟后，读出强度计指示表中
数据。
标准和注意事项：
①新管（ 30W）不低于 100uw/cm2, 使用中的旧管在70uw/cm 2以上才符合要求，低于 70uw/cm2者必须更换。每半年要用紫外线强度计监测 1 次，每年强度计可校正一次。
②每 10 平方米面积室内必须安装30W灯管一支，每年用紫外线强度计检测二次。在使用过程中，应保持紫外线光源表面的清洁。用紫外线消毒室内空气时，房间内应保持清洁干燥。减
少尘埃和水雾。温度低于20℃或高于40℃，相对湿度大于50％时应延长照射时间，且应达到足够的剂量。在有人工作环境中，不能使用紫外线光源直接照射到人，臭氧的浓度不得超过。
污水的细菌监测( 总大肠菌群 )
1.目的
规范微生物实验室污水的处理程序，减少污水对人员及环境的危害。
2.范围
微生物实验室内的污水。
3.职责
实验室所有人员执行此程序。
4.程序
采样方法
用采水器或其它灭菌容器采取污水1000ml ，放入灭菌瓶内，如果是经加氯处理的污水，
需加 %硫代硫酸钠5ml 中和余下的氯。
检验方法
总大肠菌群系指一群氯及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌在37℃培养 24 小时，能使乳糖发酵产酸产气，总大肠菌群系指每升污水中，所含的总大肠菌群的数目。
初发酵试验
以无菌手续，于5 管各盛有 3 倍浓缩乳糖单糖蛋白胨培养液5ml的发酵管内，各接种污水样 10ml；于 5 管各盛有单料乳糖蛋白胨培养液约10ml的发酵管内，各接种污水样1ml ，再于5 管各盛有单料乳糖蛋白胨培养液约10ml的发酵管内，各接种1： 10 稀释的污水样1ml相当于原污水样, 将此15 管已接种的发酵管置于37℃恒温箱内，培养24 小时。
平板分离
经培养 24 小时后，产酸产气及只产酸不产气的发酵管，分别接种了伊红美兰培养基或品
红亚硫酸钠培养基上，置37℃恒温箱培养18－ 24 小时，挑选符合下列特征的菌落，取菌落的
一小部分，进行涂片、革兰氏染色、镜检。
伊红美兰培养基上的菌落
（1）深紫黑色，具有金属光泽的菌落；
（2）紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；
（3）淡紫红色，中心色较深的菌落。
品红亚硫酸钠培养基上的菌落：
（1）紫红色，具有金属光泽的菌落；
（2）深红色，不带或略带金属光泽的菌落；
（3）淡红色，中心色较深的菌落。
复发酵试验
上述涂片、镜检的菌落，如为革兰氏阴性无芽胞杆菌，则挑取上述典型菌落1－ 3 个接种于一单管乳糖发酵管内，然后置于37℃恒温箱内，培养 24 小时，产酸产气者（包括小量产气）即证实有大肠菌群存在。
根据证实有大肠菌群存大的阳性管数，查对最可能数（总大肠菌群近似数检索表），报告每斤污水中的大肠菌群数。此表中所列数值系指100ml 水样中的细菌数。因此，需将表中的数
值再乘以10 所得结果为每1000ml 水中的细菌数。
正常值：每升污染含大肠菌群数＜500CFU。
正确洗手的手法
1.目的
规范正确洗手方法的管理程序，保护医务人员人身健康安全。
2.范围
实验室内所有工作人员。
3.职责
实验室内所有工作人员执行此程序。
4.程序
选用质量好的洗手液，保护手及皮肤。
用质量好的消毒液。
选用合适的洗手设备。
正确洗手步骤：
取下饰物及手表，用自来水淋湿双手。
取无菌皂液或洁净肥皂于手上。
用力擦搓掌心、指缝、手背、手指关节、指腹、指尖、拇指10－ 15 分钟。流动水冲洗
用擦手纸巾包住龙头将水关闭，或用肘、脚等关闭水龙头。
用擦手巾擦干双手或用烘器烘干。
5.洗手后，细菌菌落数应符合手质控标准。
目录 生物安全柜操作规程及维护 (3) 实验室高压蒸气灭菌器操作程序 (6) 物体表面细菌监测 (8) 医护人员手指细菌监测 (9) 空气中细菌含量的监测 (10) 环境卫生学监测质控标准 (12) 使用中消毒剂与无菌物品保存液的质控程序 (13) 一次性医疗用品微生物监测 (14) 紫外线消毒质量控制程序 (15) 污水的细菌监测(总大肠菌群) (16) 正确洗手的手法 (18)
生物安全柜操作规程及维护 1.目的： 为了满足生物安全操作的要求，并且达到在操作时保护操作人员的目的，使细菌操作达到无菌操作的要求，便于操作的标准化。 2.原理： 通过使用空气超高过滤器（ULPA）的过滤，使仪器内部的空气洁净度达到100级，使细菌的一般操作限制在一个相对密闭的环境中，不但保护操作人员，还可满足操作的标准化。 3.工作条件： 环境温度：18－30℃相对湿度：<80% 安装的环境必须达到一定的洁净度；远离人员通道及有潜在干扰气流的位置；柜后及两侧各留30cm的空隙，顶部30-35cm空隙。 环境必须有良好的通风设备。 4、操作步骤： 生物安全柜的设置已经设置完全，如果需要重新设置请参看HFsafe生物安全柜使用说明。具体操作步骤为： 4.1将电源插头插入准备好的固定插座，连通电源。 4.2有系统管理员(即本室负责人)开启玻璃门门锁，并将总开关置于开位置“！”，此时系统开始上电。 4.3检查显示及按钮的各项功能，具体见后附注（注意：UV灯的测试除外，开启UV灯时必须将前玻璃门关闭）。 4.4当系统稳定后，对设备进行安全性检查。（检查项目包括：工作室平均垂直风速；工作室内可操作区域洁净度达到100级；设备的密封有没有被破坏。所有的安全检查项目中的洁净度建议由当地卫生防疫部门来进行尘埃粒子数、沉降菌和菌落数的检测，看是否符合其工作室的洁净度要求）。 4.5如果安全性测试通过，系统已经可以使用，请在《使用记录》上写下相应的信息。在使用时需要注意的是，操作必须在工作台板无孔区域进行，物品也必须放置于无孔区域。 4.6操作者应先把手臂放进安全柜内大约1分钟，以使柜子适应并且让气流扫过手臂手臂移入移出柜内应保持前门气流的连续性，应缓缓移入移出，并且方向和前门垂直；为使跨越前门的动作量降低，在实验开始前应把所需的物品放入柜子；柜子在开始工作前以及完成后至少要运行5分钟是，使柜子净化，以便于污染空气从柜内排出。实验操作方向应从清洁区到污染区，一般要求为左→右。 4.7 当工作完成后需要关机前，将试验使用的所有材料和其他物品从设备中取出。
临床微生物检测的基因同源性分析 医院感染的流行病学研究是临床微生物学工作者的重要课题，在医院感染监测的研究中，一个很重要的问题就是如何确定感染途径和传播途径，以采取有效预防和控制措施，从而防止医院感染或者暴发流行，因此对微生物鉴定和菌株同源性分析提出了更高的要求。 目前，传统的细菌鉴定和同源性分析技术已不能很好地满足医院感染诊断和流行病学调查的需要，从型、亚型、株，甚至分子水平上去认识细菌变得愈来愈重要了。近年来分子生物学的理论和技术在细菌感染诊断中的渗透和广泛应用，使得细菌鉴定、耐药基因的检测、分子流行病学调查变得更加准确、简洁和快速。细菌DNA同源性分析技术如脉冲场凝胶电泳、聚合酶链反应、DNA探针杂交以及序列分析等方法是目前在分子水平上分析细菌的主要手段，它在鉴定细菌感染的爆发、确定院内交叉感染、感染病原菌之间的基因同源性等方面有着重要的作用，本文将对常用基因同源性分析方法的机理和过程做简要综述。 一、质粒分型(Plasmid profile assay)： 1、原理： 质粒是可移动的染色体外元件，可以自发丢失或者被宿主稳定地获得，因此流行病学上相关的分离菌株有可能表现出不同的质粒图谱。把质粒提取出来，进行常规的琼脂糖电泳分析，就可以知道分离菌株携带质粒的大小和数目。 2、实验过程：a.质粒抽提；b.0.8%琼脂糖电泳；c.EB染色、凝胶成像。 3、实验方法的评价： 优势： a.步骤比较简单，对实验仪器要求不高。 b.在评价那些从局限的时间和地点（如一个医院中的急性爆发）分离出来的菌株非常有效。 缺点： a.实验结果的重复性不好。 b.分辨力不高。 二、染色体DNA的限制性内切核酸酶分析 (Restriction Endonuclease Assay REA) 1、原理： 限制性内切核酸酶（REA）在特异的核酸识别序列切割DNA，DNA被消化后，所得到的限制性片段的数目和大小是由酶的识别位点和DNA的组成共同决定的。在传统的限制性内切核酸酶分析中，人们用含有相对多的限制性位点的内切核酸酶消化细菌的DNA，这样就会得到成百上千条长度在0.5-50Kb范围内的DNA 片段。恒定的电场琼脂糖电泳，可以根据分子质量的大小将这些DNA片段分开，然后通过EB染色并在紫外灯下观察其图谱。同一种的不同分离菌株的DNA序列的变异可造成限制性位点数目和分布的变化，所以可以导致其REA图谱出现差异。 2、实验流程：a.染色体DNA抽提；b.限制性内切酶消化DNA（主要是Hind III）； c.0.7%琼脂糖电泳； d.EB 染色、凝胶成像。
食品卫生微生物检验实验室操作要求 食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多试验要求在无菌条件下进行，主要原因：一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。 一、无菌操作要求 1. 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 2. 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 3. 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。 4. 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。 5. 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。 6. 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。 7. 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。 8. 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。 二、无菌间使用要求 1. 无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物
品。 2. 无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 3. 无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 4. 处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 5. 在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置 三、消毒灭菌要求 微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。 （一）干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法 1．灭菌前准备 （1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。 （2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。 2．装放 （1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。 （2）大型高压蒸气锅：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。
标准操作规程 目的：建立一个药品微生物限度检验标准操作规程。 范围：适用于本企业生产的所有品种，本企业所有洁净生产区域，QC微生物限度检查室，洁净工作室等。 责任者：QC主任、化验员。 规程： 本规程引至《中国药典》2000年版。 1. 概述：微生物限度检查系指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。我公司QC设无菌操作室，用于微生物限度检查。无菌操作室的管理及使用制度见本文附录一。 2. 抽样：供试品应按批号随即抽样，一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍。抽样时，凡发现有异常可疑的样品，应缺陷选用疑问的样品，但因机构损伤明显破裂的包装不得作为样品，凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、长霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需要再抽样检验。 3. 供试品的保存：供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌因保藏条件所引起致死、损伤或繁殖。供试品在检验之前，应该保持原有包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。 4. 检查： 4.1. 使用设备：电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75％酒精棉球、紫外灯（365nm波长）。 4.2. 检查的全过程应严格遵守无菌操作，严防再污染。使用设备、仪器、人员及无菌操作室常用的消毒、灭菌方法见本文附录二。除另有规定外，供试品制备成供试液后，均在均匀状态取样。制成供试液后，应该在60分钟内注皿操作完毕。 标准操作规程
4.3. 培养：除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30－35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25－28℃，控制菌培养温度为36±1℃，检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位。 4.4. 复检 4.4.1. 菌数测定不合格者应复检，控制菌检查以一次检出为准，不再复试，但应保留检出菌株一个月备查。 4.4.2. 以复试项下不合格项目为准，作单项复试。复试需另取同批号样品，测定2次。 4.4.3. 复试报告，以3次测定结果的算术平均值报告。 4.5. 检验报告 4.5.1. 检验报告以1g、1ml或10cm2为单位。 4.5.2. 测定菌数报告，以每次测定结果全部平均值报告。 4.5.3. 控制菌按检验结果报告，如未检出控制菌时，报告为“按规定抽样检验结果未检出XX菌”，如抽样中任意一样品要检出控制菌时，报告为“按规定抽样，检出XX菌，不符合药品微生物限度标准。” 4.6. 培养基、试药及稀释剂的相关内容见本文件附录三。 4.7. 供试液的制备：按供试液的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。 4.7.1. 供试品的取样及注意事项 供试品取样应有一定数量，以使检验结果具有代表性，正常的供试品一般每批应随机抽取两瓶或两盒以上的包装单位，检验时每次应分取两瓶(盒)以上的样品共10g或10ml。 供试品在检验前，应严格保持包装的原有状态，不得启开，并放在阴凉干燥处，防止微生物再繁殖，以免影响检验结果，凡已将原包装启开，则无代表性应另取样。 供试品稀释后须在1－2小时内操作完毕，防止微生物繁殖或死亡。 供试品稀释成供试液后，应在均匀状态下取样，凡因抑菌或不溶于水的剂型，其供试品应作特殊处理后进行检验。 4.7.2. 液体供试品：取供试品10ml，加入稀释剂90ml中，混匀，作为供试液。油剂可加适量 聚山梨酯80，混匀，吸取相当于10g或10ml供试品，标准操作规程 再稀释成100ml作为供试液；合剂（系指含王桨或蜂蜜者，下同）可用供试品作为供试液。 4.7.3. 固体、半固体或黏稠液供试品：称取供试品10g，置0.9%无菌氯化钠溶液100ml中，用匀浆仪或其他适宜的方法混匀后作为供试液。在制备过程中，必要时可加适量聚山梨酯80，并适当加温，但不应超过45℃。 （1）非水溶性供试品：取供试品5g（5ml）加入含溶化的无菌司盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃左右的0.9%无菌氯化钠溶
sop微生物检查操作规程 1目的 建立微生物限度检查的标准操作规程，确保检验结果的准确性。 2 范畴 适用于本厂质监科化验室对本厂生产的固体制剂及物料进行微生物限度的检查。 3 责任 化验员有责任按照本操作规程进行检验、判定,并对检验结果负责。 4 定义 微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及操纵菌的检查。 5 内容 5.1 总则： 5.1.1供试品应随机抽样。一样抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的 3倍量。 5.1.2 供试品在检查前不得开启，检查全过程均应严格遵守无菌操作规程，严防 再污染。 5.1.3 操纵菌的污染检查应做相应的已知菌对比试验，对比菌株为大肠杆菌 [CMCC（B）44102]，每批试验已知菌加入量为50-100个。 5.1.4 染菌量的检查或操纵菌的检查均应做空白对比试验。 5.1.5 供试品稀释成稀释液后应在平均状态下取样，凡有抑菌成份或防腐剂的供 试品应做专门处理后进行检验。 5.1.6 供试品稀释后应在1小时内操作完毕。
第2页/共6页 5.1.7 除另有规定外，细菌培养温度为30-35℃，霉菌、酵母菌培养温度为 25-28℃，操纵菌培养温度为36℃±1℃。 5.1.8细菌、霉菌检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位；操纵菌检验报告 以每1g、每1ml或每10cm2为单位报告“检出”或“未检出”。 5.2仪器、用具 恒温培养箱、隔水式生化培养箱、电子天平，移液管(1ml、10ml)、试管、离心管、双碟、镊子、剪刀、不锈钢吸管筒、酒精灯、取样勺、称量纸、研钵一个、不锈钢双碟筒。 5.2.1用具的包扎 移液管：用纱布包住移液管，然后放入不锈钢灭菌筒内。 试管、双碟：试管在管口塞上纱布棉塞、双碟放入不锈钢双碟筒内。 无菌衣、裤、帽、口罩：用布口袋将洗净的衣裤、帽子、口罩配套后装入，扎紧袋口，再用牛皮纸包好。 5.2.2用具的灭菌 将包扎好的用具，在121±0.5 ℃蒸汽灭菌柜中灭菌30 分钟，物品取出时切勿赶忙置冷处，以免急速冷却灭菌物品内蒸汽凝造成负压，易致染菌，应置烘箱烘干。 5.3培养基、试剂 5.3.1营养琼脂培养基 称取本品36克，加1升蒸馏水，加热溶解后，按需要进行分装，经121℃15分钟灭菌备用。 5.3.2虎红培养基 称本品30克，加1升蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌116℃20分钟。 5.3.3胆盐乳糖培养菌（BL） 称本品36克，加1升蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌116℃20分钟。 5.3.4曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB） 称本品42克，加1升蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌116℃20分钟。 5.3.5生理盐水 称取9 g 氯化钠，加水1000 ml 溶解，分装后于121℃±0.5℃湿热灭菌30分钟，供作稀释剂用。 5.3.6 75%酒精棉 量取无水乙醇75ml，加水稀释至100ml，摇匀，将脱脂棉与75%酒精混合即得。
微生物实验室安全操作规范 微生物实验室的布局和设计应考虑良好的微生物操作和安全。本质是最大程度的减少微生物菌种的交叉污染，微生物样本的处理环境也是重要，因为环境也能引起也污染的可能。规范微生物实验室内仪器、设备的安全操作及染菌的微生物培养物处理程序，保证微生物实验室安全操作意义重大。 一、员工安全操作规范 1、实验室主任（对实验室直接负责的人员）负责制订和采用生物安全管理计划以及安全或操作手册。 2、实验室安全主管（向实验室主任汇报）提供常规的实验室安全培训。 3、接触微生物或含有微生物的物品后，脱掉手套后和离开实验室前要洗手。 4、禁止在工作区饮食、吸烟、处理隐形眼镜、化妆及储存食物。 5、只有经批准的人员方可进入实验室工作区域。实验室的门应保持关闭。 6、实验过程中，严格按有关操作规程操作，降低溅出和气溶胶的产生。 7、每天至少消毒一次工作台面，活性物质溅出后要随时用75%乙醇或巴氏消毒液消毒。
二、高压灭菌锅的安全使用操作规范： 1、堆放：将需灭菌的物品予以妥善包扎，依次堆放在灭菌锅。需灭菌物品外需黏上高压指示胶带以检验灭菌温度是否达到要求。 2、加水：在锅体内注入生活用水，水位一定要超过电热管2厘米以上（不宜过多）；连续使用时，每次操作前，必须补足上述水位，以免烧坏电热管和意外发生。 3、密封：在每次使用高压锅前，都必须认真检查高压锅的出气伐和安全阀，确保其状态完好，如有故障，在故障排除之前不得使用高压灭菌锅。把堆放好物品的灭菌桶放在锅体内，盖上锅盖并锁紧。 4、加热灭菌：将灭菌器接通电源，指示灯亮，表示电源已正常输入，按下开始按纽电热管开始加热工作；灭菌期间工作人员需监视高压锅指示面板上的压力、温度和时间等。 5、开盖：灭菌结束后，切勿立即将灭菌锅内的蒸汽排出，应待压力表指针归零位后，方可开启锅盖。 三、电炉使用操作程序及注意事项： 1、将盛有液体的玻璃容器（应垫石棉网）或不锈钢器皿置于电炉上，方可打开电炉加热。
表面微生物测试标准操作规程（接触平皿法） 1．目的 建立表面微生物测试标准操作规程，保证测试人员操作规范化、标准化。 2．依据《药品生产质量管理规范》（2010年修订本） 3．范围 本规程适用于本公司对洁净区的表面微生物的检测。 4．责任 质量控制化验员负责实施，QC主管负责监督执行 5．内容 洁净区微生物测试点选择表面微生物监测的采样点数目及其布局根据以下几个方面设置： 空调系统验证的结果 房间的大小和布局 房间的用途 与产品的距离 人流物流方向 如何布点：对于同一洁净区，每个相同的取样物体在其不同的地方采2个样。如墙面2个采样点，地面2个采样点，洁净区主要设备2个采样点。
注：表面微生物监测的取样点数应依下列因素确定： 1.洁净区（室）的大小； 2.设备、管路等的复杂程度； 3.生产活动的重要性； 4.易受污染的部位等。 应考虑包含以下部位：每扇门、每个门把手、地板（至少两点）、墙壁（不易被清洁/消毒的部位，至少两点）、公用介 质的管路（不易被清洁/消毒部位）、生产设备的关键性部位（如灌装针、易与人员接触的塑料帘膜、胶塞筒、传输带）等。根据洁净区内设施、设备等表面对产品和洁净室环境的影响程度，通常将表面分为三类：关键表面（与产品、容器及密封件直接接触或暴露于产品、容器及密封件的表面）一般表面（如设备的外表面、墙壁等）和地板，并且分别设定不同的微生物限度要求。 表面微生物的每点取样面积宜控制在25cm2左右。 为避免干扰，宜在生产活动结束后取样。 洁净区微生物测试频率和限度 日常监控一月一次 接触碟（55mm）50cfu/25cm2 ，警戒40cfu/25cm2 ，纠偏 45cfu/25cm2 。 洁净区表面微生物测试方法（接触平皿法）。 洁净区表面微生物测试必须在动态下监测。
粪便微生物学检验的标准操作程序 1 检验目的 做疾病的病原学诊断，查找于疾病有关的病原菌以及了解微生物与疾病的关系，指导临床治疗及预后和流行病学的调查。 2 原理 正常人的肠道中栖居大量的不同种类的微生物，组成了微生态菌膜屏障。起着健康的作用，腹泻是因为病原细菌或病毒在肠道内繁殖的结果。 3 标本要求 （1）标本类型：粪便。 （2）标本采集：见标本采集手册 （3）标本储存和运输：室温放置，室温运输并立即送检。 （4）标本拒收状态：非无菌方式采集的标本或未按要求部位采取的标本。 4 容器和添加剂类型 均使用灭菌器皿盛放标本 5 试剂 （1）试剂名称：革兰氏染液、氧化酶试剂、3%触酶、血平板、中国蓝平板、SS平板、柯玛嘉平板、相关生化试剂等。 6仪器设备： （1）接种针、接种环、酒精灯 （2）梅里埃ATB药敏鉴定仪 （3）显微镜、SPX-150B型生化培养箱、超净工作台、台式离心机、天平 7 校准程序 (送市计量质量检测研究所校准) 8 标本的处理
8.1 沙门-志贺菌：取粪便少许，增菌后转种或将粪便直接接种SS 及中国蓝或麦康凯、伊红美蓝平板，35℃、18-24h后进行鉴定。 沙门氏菌增菌37℃,16-24h，转钟在平板上，增菌液：粪便等于10:1。志贺菌增菌37℃,4-6h，转种在平板上。 注：伤寒病人在发病1—2周采取血液，发病2—3周采取粪便和尿液。 8.2 霍乱弧菌培养：标本接种于碱性蛋白胨水中，进行增菌，增菌培养孵育6—8h后，取表面菌膜移种于碱性琼脂平板/庆大霉素一亚碲酸钾平板上。 8.3 真菌培养：将标本接种于含氯霉素的沙氏琼脂及血琼脂平板上，置25-35℃和35℃孵育24—48h，来鉴定。 9 操作流程 粪便或肛门试子 分离培养增菌培养 麦康凯或中国蓝亚硒酸增菌培养基GN增菌培养基 （适用于沙门菌属）（适于 志贺菌属） SS琼脂 SS及麦康凯琼脂平板分离 三糖或双糖铁培养基 血清鉴定生化反应鉴定药物敏感性 试验 报告 10 质量控制： 参加我科质量管理小组组织的各项质量控制活动
遂昌县中医院 临床微生物室 标准操作程序 SOP
临床微生物室标准操作程序（SOP）目录 1.标本采集与送检原则标准操作程序----------------------WSW-SOP-1 2.血液及骨髓标本的采集标准操作程序——————————WSW-SOP-2 3.呼吸道标本留取标准操作程序—————————————WSW-SOP-3 4.尿液标本留取标准操作程序——————————————WSW-SOP-4 5.脓及创伤感染标本留取标准操作程序——————————WSW-SOP-5 6.生殖道分泌物标本采集标准操作程序——————————WSW-SOP-6 7.粪便标本采集标准操作程序——————————————WSW-SOP-7 8.穿刺液标本留取标准操作程序--------------------------WSW-SOP-8 9.脑脊液、胆汁标本采集标准操作程序——————————WSW-SOP-9 10.组织标本的采集标准操作程序—————————————WSW-SOP-10 11.静脉道管标本采集标准操作程序————————————WSW-SOP-11 12.眼、耳及乳突分泌物标本采集标准操作程序———————WSW-SOP-12 13.样本接收、核对、接种、培养标准操作程序———————WSW-SOP-13 14.菌株的纯化、鉴定、药敏流程标准操作程序———————WSW-SOP-14 15.普通MicroScan板接种培养流程标准操作程序——————WSW-SOP-15 16.判读普通革兰阳性板标准操作程序----------------------WSW-SOP-16 17.判读普通革兰阴性板标准操作程序----------------------WSW-SOP-17 18.普通Microscan 板报告标准操作程序--------------------WSW-SOP-18 19.常见标本培养结果解释标准操作程序--------------------WSW-SOP-19 20.KB法药敏试验标准操作程序----------------------------WSW-SOP-20 21.超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)检测标准操作程序——————WSW-SOP-21 22.β-内酰胺酶检测标准操作程序-------------------------WSW-SOP-22 23.革兰染色标准操作程序————————————————WSW-SOP-23 24.抗酸染色标准操作程序————————————————WSW-SOP-24 25.解脲/人型支原体培养标准操作程序---------------------WSW-S O P-25 26.AccuStep衣原体抗原检测标准操作程序------------------WSW-SOP-26 27.ATB FUNGUS2真菌药敏标准操作程序--------------------WSW-SOP-27 28.培养基的制备标准操作程序-----------------------------WSW-SOP-28 29.触酶试验标准操作程序---------------------------------WSW-SOP-29 30.氧化酶试验标准操作程序-------------------------------WSW-SOP-30 31.芽管试验标准操作程序---------------------------------WSW-SOP-31 32.临床微生物实验室安全标准操作程序---------------------WSW-SOP-32
微生物检验操作规程 1.0目的 建立微生物检验标准操作规程，保证检验操作规范化。 2.0适用范围 适用于本公司相关的微生物检验活动的全过程。 3.0职责 3.1 微生物检验员负责微生物检验的全过程； 3.2 QC主管负责监督检查本规程的有效实施。 4.0作业内容 4.1无菌操作要求 4.1.1 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 4.1.2专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 4.1.3 接种样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。 4.1.4 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。 4.1.5 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。 4.1.6 接种样品、转种细菌必须在酒精灯旁操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞（即硅氟胶塞）都要通过火焰消毒。
4.1.7 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处。 4.1.8 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。4.2无菌间使用要求 4.2.1 无菌间内应保持清洁，工作后用消毒溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 4.2.2无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 4.2.3处理和接种样品时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 4.3消毒灭菌要求 4.3.1灭菌前准备 （1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。 （2）装培养基的三角瓶，内容物不应超过总体积的2/3（例如500mL的三角瓶最好装300～350mL培养基，以防再次加热融化时爆沸）。 （3）无菌室内使用的毛巾、脱脂棉球用纸包裹，进行湿热灭菌。 4.3.2装放 （1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。 （2）大型高压蒸气锅：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。
临床微生物学检验 确保高压效果的可靠性。 【适用范围】 蒸气式高压锅。 【该SOP变动程序】 本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。 【操作方法】 1．将水加到高压锅内至其刻度线，将欲灭菌物品放入锅内，关闭锅门，拧紧螺丝并确认已经封闭。 2．打开排气阀。 3．打开蒸汽开关，向锅内输入蒸汽或接通电源，使产生蒸汽。 4．观察排气阀的排气情况，待排出的气体由冷气变为蒸汽，压力表达到0.05mPa 时，关闭排气阀。 5．观察压力表，当压力升至0.15mPa时，开始计时。 6．压力达0.15mPa后，可调节进气阀，减少进气量，维持压力并使其稳定在 0.15mPa。电加热时，可切断电源，维持压力持续15分钟，至多不超过30分 钟，否则营养物质破坏。 7．关闭进气阀门或切断电源，让锅内物品自然冷却，不可马上打开排气阀，以免发生意外。 8．待锅内压力降为零时，可打开锅盖，取出物品。 操作人员部门主管质量负责人姓名唐玉贞检验科检验科 日期 06年06月06日
确保培养箱温度恒定。 【适用范围】 各种类型隔水式、温度设定为27℃、35℃、42℃、56℃培养箱。 【该SOP变动程序】 本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。 【操作方法】 1．培养箱应放置于水平地面（或坚固的水平台），电源电压须匹配。 2．从注水口先将隔水箱内的水注满到浮标要求的位置。 3．将温度调节旋扭调至所需温度，然后将电源开关拨至“开”处。 4．每次使用时应在培养箱顶部插入标准温度计，监测实际温度。 5．培养箱工作温度波动范围应控制在±10C以内。 6．培养箱正面贴有温度记录表，记录每天上班和下班时温度，如温度超出正常范围，指示该温度的刻度应划上红圈，并把修正温度记录下来。 7．培养箱内外应保持清洁。 操作人员部门主管质量负责人 姓名唐玉贞检验科检验科 日期 06年06月06日
—、范围：本标准规定了微生物限度的检查方法和操作要求；适用于检品 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。 二、 引用标准：《中国药典》( 通则1105-1106) 三、 目录1.微生物限度标准 2.设备.仪器及用具 3?消毒液、稀释剂.试液及培养基 4. 检查总则(通则1105:非无菌产品微生物限度检查：微生 物计数法，通则1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法) 5. 微生物计数法检查 6. 控制菌检查法 7. 实验技术 &附件 1. 微生物限度标准 非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准 *未做统一规定。 L1成品微生物限度标准
(1).” 一”为不得检出。 (2).目测霉变者以不合格论。 (3).”无”为标准依据或无相应规定。 1.2工艺用水微生物限度标准 1.3内包装材料微生物限度标准 说明：1?”一”为每100 cm2中不得检出。2.目测霉变者以不合格论。3.”无”为标准依据或无相应规定。 2.设施、仪器及用具
2.1、设施： 2丄1?微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台直及环境应定期进行监测。 2.12其它设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30?35?）;霉菌培养箱（25-280 ；电炉（或其它适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300匕）；电冰箱。生化试剂储存箱。 2.2仪器及器mi 2.2.1.菌落计数器；显微镜（1500X）;电子天平或药物天平（感量O.lg）; pH系列比色计。 222?玻璃器皿：锥形瓶（250?300ml,内装玻璃珠若干）.研钵（玻璃或陶瓷制,f 10?12cm）、培养皿（f 9cm）.量筒（100ml）.试管（18x 180mm）及塞、吸管（lml分度0.01, 10ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。 2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于1%?2%盐酸（工业用）液中约2?6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。用于化学分析的玻璃仪器，需用重洛酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2?3次，晾干备用。 2.3用过的玻璃器皿： 231未被病原微生物污染的器皿：可随时洗涤。用清水冲洗（或浸泡），除容量仪器外， 可用毛刷和肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净，晾干备 用。容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗 2~3 次。
实验室技术操作规范 一、无菌操作要求 食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多试验要求在无菌条件下进行，主要原因：一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。 1.接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 2. 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 3. 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。 4. 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。 5. 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。 6. 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。 7. 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。 8. 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。 二、无菌间使用要求 1. 无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。 2. 无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 3. 无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 4. 处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 5. 在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置。 三、消毒灭菌要求 微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。 1．灭菌前准备 （1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。 （2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。
微生物灭菌操作规程 1.目的：为了规范灭菌法操作，建立本程序。 2.范围：适用于灭菌法操作。 3.责任：化验室负责人、微生物化验员对本标准的实施负责。 4.内容： 目录 4.1灭菌方法 (2) 4.1.1湿热灭菌法 (2) 4.1.2干热灭菌法 (5) 4.1.3辐射灭菌法 (5) 4.1.4气体灭菌法 (7) 4.1.5过滤除菌法 (8) 4.2生物指示剂 (8) 4.2.1制备生物指示剂用微生物的基本要求 (8) 4.2.2生物指示剂的制备 (8) 4.2.3生物指示剂的应用 (9)
凡能杀灭物体中所有活的微生物的作用称为灭菌。灭菌的手段及设备，分别称为灭菌法及灭菌器。确切地讲，灭菌法系指用适当的物理或化学手段将物品中活的微生物灭杀或除去，从而使物品残存活微生物的概率下降至预期的无菌保证水平的方法。最终的物品微生物存活概率，即无菌保证水平不得高于10-6。物品的无菌保证水平与灭菌工艺、灭菌前物品被污染的程度及污染菌的特性相关。已灭菌物品达到的无菌保证水平可通过验证确定。 常用的灭菌方法有湿热灭菌法、干热灭菌法、辐射灭菌法、气体灭菌法和过滤除菌法。可根据被灭菌物品的特性采用一种或多种方法组合灭菌。在药品检验过程中，无论采用何种灭菌方法，都应考虑到原有成分的稳定性和安全性，对灭菌条件除要求之外，还必须保证被灭菌物质成分不被破坏，不影响物品的质量。 4.1灭菌方法 4.1.1湿热灭菌法 本法系指将物品置于灭菌柜内利用高压饱和蒸汽、过热水喷淋等手段使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。湿热灭菌包括煮沸、巴氏消毒、流通蒸汽和高压蒸汽灭菌等。湿热灭菌条件的选择应考虑灭菌物品的热稳定性、热穿透力、微生物污染程度等因素。煮沸、巴氏消毒、流通蒸汽不能有效杀灭细菌孢子，一般可作为不耐热无菌产品的辅助灭菌手段。高压蒸汽灭菌灭菌能力强，为热力灭菌中最有效、应用最广泛的灭菌方法。 4.1.1.1使用范围 药品、容器、培养基、无菌衣、胶塞、敷料、玻璃器材、传染性污物以及其他遇高温和潮湿不发生变化或损坏的物品，均可用本法灭菌。不能用于凡士林等油类和粉剂的灭菌。 4．1.1.2压力蒸汽灭菌器 根据排放冷空气的方式和程度不同，分为下排气式压力蒸汽灭菌器和预真空压力蒸汽灭菌器二大类。 4.1.1.3下排气式压力蒸汽灭菌器 利用重力置换原理，使热蒸汽在灭菌器中从上而下，将冷空气由下排气孔排出，排出的冷空气由饱和蒸汽取代，利用蒸汽释放的潜热使物品达到灭菌。 4.1.1.4预真空压力蒸汽灭菌器
2015 版微生物限度检验操作规程 目的建立微生物限度检查操作规程，规范操作，保证结果的准确性。范围成品、辅料、内包装袋及纯化水的检验。 内容概述：本检验操作规程依据中国药典2015 年版四部《通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》和《通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》进行检查。 微生物计数法 一、计数方法 1．微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 2、计数方法本法包括平皿法、薄膜过滤法。 3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查供试品微生物计数中所使用的 培养基应进行适用性检查。供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。 4、菌种及菌液的制备试验用菌株的传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 袋)，并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验见表 1。 菌液制备按表 1 规定培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含％(ml/ml )聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含%(ml/ml )聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉抱子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8 C,可在24小时内使用。黑曲霉抱子悬液可保存在2-8 C,在验证过的贮存期内使用。 表 1 试验菌液的制备和使用 阴性对照为确认试验条件是否符合要求,应进行对照试验,阴性对照试验应无菌生长。培养基适用 性检查按照表1规定,接种不大于100cfu 的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板,置规定的条件下培养。每一试验菌株平行制备 2 管或 2 个平皿。同时用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在范围内,且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。被检 液体培养基管与对照培养基管比较,试验菌应生长良好。 5、计数方法适用性检查
检验科微生物室室内质量控制流程 一、实验室仪器设备的性能维护 微生物室常用仪器设备主要包括：细菌培养箱、细菌鉴定及药敏测试仪、显微镜、高压灭菌器、冰箱、水浴箱等。这些仪器设备的质量维护对于检验结果的质量保证至关重要。性能维护方法及维护频率参照制造商提供的使用手册进行。如使用手册中未详细注明或实验室自身无法完成，由生产厂家协助解决，每年至少一次。 二、培养基的质量控制 要求对培养基进行两方面的质量控制：无菌试验以及已知菌生长试验。无菌试验一般为随机抽样3-5%，在35℃条件下培养48h，每批培养基至少进行一次无菌试验；已知菌生长试验的前提条件是实验室有足够的已知菌储备，其中包括标准菌株(如ATCC或NCTC标准菌株)及经过准确鉴定的临床分离菌。如果条件允许，提倡使用标准菌株。已知菌生长试验应明确预期结果。每批培养基至少进行一次已知菌生长试验。三、细菌染色的质量控制 在临床细菌学检查过程中，革兰染色和抗酸染色使用频率最高。 1．革兰染色IQC要求：利用标准菌株(金黄色葡萄球菌ATCC25923及大肠埃希菌ATCC25922)或其他已知的革兰阳性菌及革兰阴性菌至少每周进行一次质量验证。 2．抗酸染色：利用已知的抗酸杆菌(AFB)阳性涂片每周或在更新炭酸复红染液时至少进行一次质量验证。 四、细菌鉴定或鉴别常用试验的质量控制 细菌鉴定或鉴别试验的IQC就是利用已知菌或标准菌株(如ATCC或NCTC标准菌株)进行鉴定或鉴别试验相关影响因素的质量监控。应用频率较高的试验IQC每周至少一次，频率较低的试验IQC随标本一同进行。五、微生物药物敏感试验的质量控制 临床常用抗微生物药物敏感试验包括一般β-内酰胺酶测试、超广谱β-内酰胺酶(ELBLs)测试、纸片扩散法药敏试验以及定量药敏试验(即MICs测定法)。 1．一般β-内酰胺酶测试的质量控制：至少每周一次。质控菌株可使用临床分离的已知菌株，但最好使用标准菌株，如淋病奈瑟菌ATCC31426(β-内酰胺酶阳性绿脓杆菌ATCC27853)和淋病奈瑟菌ATCC43069(β-内酰胺酶阴性或金黄色葡萄球菌ATCC25923)。 2．ESBLs测试的质量控制：美国临床实验室标准化协会(CLSI：原NCCLS)目前仅提供了肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌ESBLs的测试标准。其测试标准参照最新的CLSI文件。质量控制随临床测试菌株一同进行。 3．纸片扩散法及MIC测定法药敏试验的质量控制：质控试验条件、质控菌株选择及质控允许范围参照最新的CLSI规定。频率为每周至少一次。 4．某些耐药菌检测的质量控制：一些耐药菌株如高水平氨基糖苷类耐药的肠球菌、苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌以及万古霉素耐药的肠球菌等的IQC具体方法、质
微生物检验操作规程
1. 目的 建立微生物检验标准操作规程, 保证检验操作规范化。 2. 范围 适用于本公司相关的微生物检验活动的全过程。 3. 职责 3.1 微生物检验员负责微生物检验的全过程; 3.2 QC主管负责监督检查本规程的有效实施。 4. 操作规程 4.1 微生物检验玻璃器皿吸管的洗涤 4.1.1 一般的玻璃器皿( 例如培养皿、试管、三角瓶等) , 可用毛刷及洗涤剂洗去灰尘、油垢, 然后用自来水、蒸馏水充分冲洗, 直至玻璃器皿内壁均匀分布一层薄的水膜, 即器壁既不挂水珠也无条纹, 即洗涤达到标准。 4.1.2 玻璃器皿内有污迹不能洗净时, 可浸泡于洗液中, 待器皿中有机物氧化分解后, 取出用自来水、蒸馏水冲洗干净, 备用。 4.1.3 新购的玻璃器皿先用2％盐酸浸泡, 再用用自来水、蒸馏水充分冲洗。 4.2 器皿的包扎 4.2.1 试管: 塞上胶塞, 然后用牛皮纸或报纸把试管头包扎起来。做发酵试验时, 将试管头塞上专用的耐高温PVC试管帽。 4.2.2 三角瓶、抽滤瓶: 将三角瓶( 抽滤瓶) 口塞上胶塞, 然后用牛皮纸把塞头部包起来。
4.2.3 吸管: 将耐高温的移液枪头装盒, 用用牛皮纸或报纸包裹。 4.2.4 平皿: 10个为一组, 用牛皮纸包裹。 4.3消毒和灭菌: 4.3.1 化学灭菌: 此法适用于微生物操作过程中不能加热、紫外线的地方。如人手等。 ( 1) 用75%的乙醇溶液或0.1%新洁尔灭擦拭或浸泡。 ( 2) 一般用1～2%的甲醛液浸泡软管和用具。 ( 3) 一般成品漂白粉的有效成分是25～32% 。使用时配成有效成份的2%溶液洒在地面或容器内, ( 对金属有腐蚀作用) 放置10～15min后冲洗即可。 ( 4) 氯灭菌剂的能力以有效氯表示, 将氯水配制成50～100PPm 的有效氯溶液, 可用于浸泡, 冲洗和表面杀菌。但氯对金属有腐蚀作用。 4.3.2 物理灭菌: 4.3.2.1 干热灭菌: 适用于干燥的玻璃器皿( 吸管、平皿等) 、金属器具( 镊子等) 、固体试液、液状石蜡等。灭菌条件一般选用在160℃干热空气灭菌2h。 ( 1) 器具用牛皮纸或灭菌袋包( 装) 扎, 放入金属容器内。 ( 2) 器具在干燥箱加热前放入, 每个器具之间留有足够的空隙, 使热 空气能畅通。 ( 3) 关闭箱门接通电源, 打开通气孔, 使箱内湿空气能逸出, 至箱内温度达到100℃时关闭。 ( 4) 加热至160℃, 保持2小时。