遗传HEREDITAS(Beijing)19(3):44～481997
用荧光原位杂交技术构建高分辨率的DNA物理图谱钟筱波 Paul F.Fransz J.Hans de Jong Pim Zabel
(荷兰瓦赫宁根农业大学分子生物学系)
High R esolution Physical Mapping by Fluorescence
i n sit u H ybridization
Zhong Xiaobo Paul F.Fransz J.Hans de Jongand Pim Zabel
(Department of Molecular Biology,Wageningen Agricultural University,The Netherlands)
DNA序列在染色体上的定位和分子图谱(molecular map)的构建是克隆目的基因的基础。用常规分子生物学技术构建分子图谱是基于对DNA分子标记(molecular marker),如RFL P、RAPD、AL FP等的遗传分析,从中找出不同DNA序列之间的连锁遗传关系和相关位置。这种分析方法的准确性和图谱的分辨率(resolution)水平将取决于染色体减数分裂时DNA的重组率(meiotic recombination)。但由于重组率在染色体上的分布是不均匀的,Sherman 和Stack(1995)发现靠近着丝点(centromere)的异染色质(heterochromatin)区的DNA重组率要比远离着丝点的同染色质(euchromatin)区低很多。这样就会造成两个分子标记之间的遗传距离(genetic distance)由于在染色体上的位置不同而与真实的物理距离(physical distance)发生偏差。因此,人们需要一些更准确的技术来弥补这种偏差。近年来,随着DNA荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,缩写为FISH)的不断发展,一种更直接的,在染色体甚至DNA纤维(extended DNA fibre)水平上直接构建分子图谱的新方法正不断走向成熟。
DNA荧光原位杂交技术是80年代末才开始发展起来的一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是将DNA探针用特殊修饰的核苷酸分子标记(如biotin-dU TP或digoxigenin-dU TP),然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子藕联的单克隆抗体与探针分子特性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位。FISH技术与其它原位杂交技术相比,除了具有不需要放射性同位素、实验周期短、检测灵敏度高等优点外,还由于它可以用不同的修饰核苷酸分子标记不同的DNA探针,再用不同的荧光素分子检测不同的探针分子,因此,可以在荧光显微镜下在同一张切片上同时观察几种DNA探针的定位,直接得到它们的相关位置和顺序。Ried等(1992)用3种不同标记的核苷酸,以不同的比例混合标记,在人的有丝分裂中期染色体(mitotic metaphase chromosome)上可以同时检测到7个DNA探针。Dauwerse等(1992)已将FISH技术发展到可同时检测12种DNA探针分子。目前,FISH已成为一种最直接分析DNA序列在染色体或DNA分子上排列的分子细胞遗传学技术。它已被广泛地应用于动植物基因组结构(genome organization)的研究和DNA分子物理图谱(physical map)的构建(参见Joos等1994,Jiang等1994,Heiskanen等1996的综述)。
在用FISH技术构建DNA分子图谱时,它的分辨率(resolution)是指两个不同DNA探针能够被检测到的最小距离,也是最关键的技术指标。它将决定分子图谱的准确性和精密程度。在决定FISH分辨率的因素中,最重要的是所使用的靶DNA在染色体或DNA纤维上的浓缩度(condensation),亦即DNA在染色体结构或DNA纤维上的三维空间包裹程度。浓缩度越高,分辨率越低。FISH技术的发展过程也正是分辨率水平由低向高不断进步的历程。
本文将结合对FISH 技术在不同染色体或DNA 纤维切片上的分辨率水平的分析,阐述这项技术在构建高分辨率的分子图谱中的应用前景。
1在中期染色体上的荧光原位杂交
早期的荧光原位杂交技术多以中期染色体作为靶DNA 的载体。一方面它是传统遗传学的基础,另一方面制片技术也比较容易掌握。许多人都曾成功地在中期染色体上用FISH 技术构建了染色体分子图谱。一个典型的例子是Lichter 等(1990)选用了50个人类第11条染色体的cosmid 克隆,在人的中期染色体上进行荧光原位杂交,排列出所有探针在染色体上的顺序。进一步,他们用两个或更多的探针同时进行原位杂交来判断较近的DNA 序列之间的相对关系,由此构建出人类第11条染色体的分子图谱。但他们同时发现,由于使用的中期染色体已是DNA 和蛋白质高度重叠和缠绕后的复合体,如果两个探针之间的距离小到一定程度之后,FISH 技术就不能分辨出它们之间的相互关系。而这个分辨率的水平在人的中期染色体上大约是1～3Mb (百万碱基对)之间。类似的结果在不同的动植物种类中都有报道(Lawrence 等,1990;Trask 等,1992)。然而,对于克隆一个只有几kb 长度的基因来说,1～3Mb 的分辨率水平是远不够的。另外,中期染色体还有一个缺点,由于染色体高度浓缩,对于一些基因组较小的种类,如酵母、A rabidopsis 、番茄、水稻等,在光学显微镜下很难根据每条染色体的结构分辨出单条染色体,这也给构建图谱带来困难。
要提高FISH 技术的分辨率水平,人们很容易想到使用浓缩度低的染色体作为靶DNA 的载体。有人考虑到使用有丝分裂前期染色体(mitotic prophase chromosomes ),Inazawa 等(1994)报道通过同步化处理,可从人的淋巴细胞中得到拉长的前期染色体。在一个360kb 的DNA 分子区域内,用两色FISH 技术在这种前期染色体上能够准确地观察到两个相距175kb 的探针被分离开。但这种染色体切片不容易制备,而所能提高分辨率的能力有限,因此,用这种染色体切片进行荧光原位杂交的报道并不多见。Haaf 和Ward (1994)发展了一项技术,可用离心机械力将中期染色体拉长5～20倍。在这种拉长的中期染色体上进行荧光原位杂交,可将分辨率水平提高到200kb 左右。但利用这种受机械力拉长的中期染色体,其染色体结构可能会受到一定程度的破坏,并且不同区域的染色体拉长的程度也可能不同,会给图谱的准确性带来人为的干扰。
2在减数分裂粗线期染色体上的荧光原位杂交
在分析了有丝分裂和减数分裂所有时期染色体的结构特征和进行高分辨率FISH 的可能性之后,我们发现减数分裂粗线期(pachytene )是最理想的时期(Zhong 等,1996a 和Zhong 等,1996b )。这一时期的染色体已经完成了同源染色体的配对,利用特殊的制片技术,可以分离到单条染色体,其长度通常比相应的中期染色体长10～20倍。而这一时期染色体的形态也十分特殊,着丝点(centromere )和端粒(telomere )结构很容易识别,并且每条染色体的异染色质(heterochromatin )和同染色质(euchromatin )区都有可识别的结构特征。以番茄为例,Ramanna 和Prakken 早在1967年就建立了一套根据粗线期着丝点的位置、短臂和长臂的比例以及异染色质和同染色质的结构特征来识别12条番茄染色体的方法。不久前,我们发展了一种从番茄花药的花粉母细胞中制备粗线期染色体的技术,能够分离到不带细胞质的单条粗线期染色体,并能根据Ramanna 的方法识别出每条染色体,用番茄染色体的端粒重复序列(telomeric repeat )和端粒联接重复序列(telomere -associated repeat )作为探针,在这种染色体上进行两色荧光原位杂交,证实其分辨率能够达到低于100kb 的水平(Zhong 等1996b )。由此可见,以粗线期染色体作为靶DNA 载体,不仅可以在不破坏染色体结构的情况下大大提高FISH 的分辨率,还可弥补中期染色体不能识别单条染色体的缺陷。不过,FISH 在粗线期染色体上的应用还要取决于制片技术的难易程度,对于有些动植物种类,提取性细胞是很困难的。
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3在间期细胞核上的荧光原位杂交
在制备染色体切片时,很容易得到大量的间期细胞核。这些细胞核没有典型的染色体结构,但其染色质在这一时期却比分裂时期的染色体浓缩程度低很多,荧光原位杂交的分辨率也会比染色体高很多。Lawrence 等(1988)首先观察到两个DNA 探针的实际距离与在间期细胞核上的荧光原位杂交信号的距离有一定的关系。Trask 等用一系列的实验证实间期细胞核上的荧光原位杂交可以用于构建高分辨率的分子图谱。通过对从50kb 到1Mb 范围里的DNA 探针序列的间期细胞核荧光原位杂交分析表明DNA 序列在间期细胞核的距离与DNA 分子的直线距离有很强的相关性(Trask 等,1989),两个相距50kb 的DNA 序列能够在间期细胞核中检测到信号分离。用三色间期细胞核荧光原位杂交技术,Trask 等(1992)测定出500kb 范围中三个探针的相关顺序和之间的距离。但DNA 序列在间期细胞核的距离与DNA 分子的直线距离的相关性在超过2Mb 之后相应减弱,这可能与间期细胞核中染色质的三维空间结构有关。尽管染色质上的DNA 结构已比染色体上的浓缩度降低了许多,但它仍保持着细胞中原有的空间结构。这种结构决定了FISH 的分辨率水平只能达到50kb 左右。
4在游离染色质上的荧光原位杂交
要突破FISH 分辨率的限制,须考虑人为地改变染色质的原有空间结构。Heng 等(1992)首先提出,用碱性溶胞剂(alkaline lysis buffer )对处于G 1和G 2期之间的间期细胞核进行处理,释放出游离的染色质丝(free chro 2matin ),这种染色质丝已经失去了原有的细胞空间结构,其DNA 的浓缩度更进一步降低。在对350kb 范围里的5个cosmid 克隆进行FISH 定位之后,两个相距21kb 的克隆能够在游离染色质上完全被分开,杂交信号之间的距离与DNA 的实际距离之间存在良好的线性关系。根据实验统计,每微米游离染色质丝大约相当于80kb 的DNA 分子长度。其FISH 分辨率的水平能接近10kb ,可用于分析1Mb 范围内DNA 序列的位置关系。
5在DNA 纤维上的荧光原位杂交
游离染色质丝尽管已经失去了原有的细胞空间结构,但它仍是DNA 和蛋白质的复合大分子,其染色质的基本结构核小体和组蛋白并没有遭到破坏。在Heng 等人(1992)的思路的基础上,Wiegant 等(1992)、Parra 和Windle (1993)进一步想到用更强的变性剂对染色质丝进行处理,让DNA 分子完全从蛋白质中分离出来,制备出DNA 纤维(extended DNA fibre )。Wiegant 等用一种含高浓度盐和一定量的变性剂(detergent )的碱性缓冲液对间期细胞核进行处理后,得到一种被称为Halo 的DNA 纤维结构围绕在细胞核周围。这是一些环状DNA 分子片段,通常有400-500kb 长,可以用来作为高分辨率的FISH 的靶DNA 。Florijn 等(1995)用这种Halo 切片对400kb 范围内的cosmid contig 进行FISH 图谱定位之后,发现其分辨率水平能达到低于1kb 。Parra 和Windle 使用的技术略有不同,他们将游离的单细胞培养液涂在载玻片上,然后用一种含有SDS 和EDTA 的lysis buffer 溶解细胞5分钟,再将载玻片倾斜至45度角,随着缓冲液的向下流动,直线的DNA 纤维分子便从细胞中拉出。在这种DNA 纤维上进行多色FISH ,能够直接观察到3-5kb 的质粒DNA (plasmid )探针在DNA 分子上的直线排列。这时观察到的荧光杂交信号已不再是单个的点,而是由许多点组成的线。探针分子的长度能够通过对荧光信号长度的测量来推算。并且不同DNA 序列之间的重叠(overlap )和间隔(gap )都能直接在显微镜下看到。在1Mb 的DNA 范围里,FISH 定位的分辨率能够到达1～2kb ,与常规分子生物学的限制性内切酶图谱法(restriction mapping )差不多。但它具有更快速、更直接、更简便的优点。
进一步,Heiskanen 等用脉冲电泳(PFGE )分离大分子DNA ,再从含有大分子DNA 的葡聚糖胶块(agarose blocks )中提出DNA 分子,直接在载玻片上制备DNA 纤维。这种DNA 纤维分子同样适用于FISH 。它暗示从脉冲电泳中分离的50kb 到2Mb 的DNA 大分子,如人造酵母染色体(yeast artificial chromosomes ,缩写为Y AC )DNA 可
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以直接作为FISH 的模板DNA 分子,用于构建DNA 分子图谱。这样将会大大简化图谱构建的过程和加快图谱构建的速度。
在DNA 纤维上进行FISH 在人和动物上发展四年之后,这一技术也被我们成功地引入植物(Fransz 等,1996)。由于植物细胞具有与动物细胞明显的不同特点,如果用单细胞作为制备DNA 纤维的材料,植物细胞的细胞壁将会是一个很大的障碍,为了克服这个困难,我们首先从叶片中提出游离的细胞核,再将这些细胞核涂在载玻片上,通过lysis buffer 的处理,能够得到直线的、平行的DNA 纤维。在这种纤维分子上,
我们能够看到高度重复的核糖体(ribosomal )DNA 的组织结构,能够直接排列和定位cosmid 克隆和噬菌体克隆。图谱的分辨率水平能达到1kb 左右,检测信号的灵敏度低于700bp 。比较各种制备DNA 纤维的方法,无论是人和动物还是植物,所得到的DNA 纤维的分子结构都十分类似,DNA 纤维的展开度(stretching degree )都在3.0～3.5kb/μm 之间(Wiegant 等,1992;Houseal 等,1994;Haaf 和Ward ,1994;Florijn 等,1995;Fransz 等,1996)。这一数值已十分接近Watson 和Crick 建立的DNA 双螺旋结构的理论值2.94kb/μm ,这说明所得到的DNA 纤维很可能已是分离出的没有蛋白质复合的DNA 大分子。
综上所述,由于所使用的靶DNA 切片的染色体或DNA 分子结构的不同,FISH 技术所能达到的分辨率水平有很大的差别。以番茄染色体为例,粗线期染色体的浓缩度比中期染色体要低大约10-15倍,而DNA 纤维比中期染色体低900倍左右。这里我们对各种FISH 技术的特点,包括分辨率水平、可检测DNA 序列的范围、以及优点和缺点进行了总结和比较(见表1)。
高分辨率的DNA 荧光原位杂交技术能够快速准确地得到探针序列之间的顺序、方向和真实的物理距离。在具体应用这一技术时,根据不同染色体和DNA 纤维的结构特征,选择适当的靶DNA 载体是很重要的。根据我们的研究结果认为,如果从性细胞中制备粗线期染色体在技术上可行的话,在这种染色体切片上进行FISH ,可以直接准确地找出与目的基因相关的DNA 探针克隆在染色体特定区域内的定位,确定相距100kb 以上的DNA 序列之间的顺序和相互位置关系。一旦目的基因的范围被缩小到100kb 以後,可以直接在DNA 纤维上进行FISH ,快速准确地构建出这一区域的DNA 物理图谱。把在粗线期染色体和DNA 纤维上的FISH 技术与现有的分子生物学技术相结合,将有效地加速大范围DNA 物理图谱的构建,以及分离和克隆目的基因的进程。
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参 考 文 献
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遗传图谱 通过遗传重组所得到的基因在具体染色体上线性排列图称为遗传连锁图。它是通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率，确定他们的相对距离，一般用厘摩(cM，即每次减数分裂的重组频率为1%)来表示。绘制遗传连锁图的方法有很多，但是在DNA多态性技术未开发时，鉴定的连锁图很少，随着DNA多态性的开发，使得可利用的遗传标志数目迅速扩增。早期使用的多态性标志有RFLP(限制性酶切片段长度多态性)、RAPD(随机引物扩增多态性DNA)、AFLP(扩增片段长度多态性)；80年代后出现的有STR(短串联重复序列，又称微卫星)DNA遗传多态性分析和90年代发展的SNP(单个核苷酸的多态性)分析。 物理图谱 物理图谱是利用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离［碱基对(bp)或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)］的图谱。以人类基因组物理图谱为例，它包括两层含义，一是获得分布于整个基因组30 000个序列标志位点(STS，其定义是染色体定位明确且可用PCR扩增的单拷贝序列)。将获得的目的基因的cDNA克隆，进行测序，确定两端的cDNA序列，约200bp，设计合成引物，并分别利用cDNA和基因组DNA作模板扩增；比较并纯化特异带；利用STS 制备放射性探针与基因组进行原位杂交，使每隔100kb就有一个
标志；二是在此基础上构建覆盖每条染色体的大片段：首先是构建数百kb的YAC(酵母人工染色体)，对YAC进行作图，得到重叠的YAC连续克隆系，被称为低精度物理作图，然后在几十个kb的DNA片段水平上进行，将YAC随机切割后装入粘粒的作图称为高精度物理作图. 因限制性内切酶在DNA链上的切口是以特异序列为基础的,核苷酸序列不同的DNA,经酶切后就会产生不同长度的DNA片段,由此而构成独特的酶切图谱。因此，DNA物理图谱是DNA分子结构的特征之一。DNA是很大的分子,由限制酶产生的用于测序反应的DNA片段只是其中的极小部分,这些片段在DNA链中所处的位置关系是应该首先解决的问题,故DNA物理图谱是顺序测定的基础,也可理解为指导DNA测序的蓝图。广义地说,DNA测序从物理图谱制作开始,它是测序工作的第一步。制作DNA物理图谱的方法有多种,这里选择一种常用的简便方法──标记片段的部分酶解法,来说明图谱制作原理。 用部分酶解法测定DNA物理图谱包括两个基本步骤:
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤：
免疫荧光操作步骤及注意事项 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好
荧光原位杂交技术FISH 1 目的 通过FISH实验检测两条Brd2基因cRNA探针的效价。 2材料与仪器 2.1材料 件为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s；50℃退火45 s；72℃延伸45 s；循环30次； 72℃再延伸8 min。 2) 将所有PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，采用凝胶回收试剂盒回收并纯化PCR产 物，并用微量分光光度计测定其浓度。 3) 进行体外转录反应合成Brd2 cRNA探针，20 μL体外转录反应体系如下：RNase
inhibitor 1μL，10×NTP dig labeling mixture 2μL，10×transcription buffer 2μL，Template DNA 13μL，RNA polymerase 2μL。 4) 37℃水浴孵育2 h，取0.5μL于1%琼脂糖凝胶电泳检测。 5) 加入2μL无RNase污染的Dnase I 37℃水浴孵育15 min来消化模板DNA。 6) 加入EDTA 0.8μL，加入5.6μL NH4Oac终止反应，再加入56μL无水乙醇并混匀，于 -80℃放置20 min。 7) 15000 r/min,4℃离心15 min，弃上清，加入700μL 80%的无水乙醇混匀，15000 r/min,4℃ 离心10 min沉淀RNA。 8) 干燥后用DEPC处理的水50μL溶解RNA。合成的两条探针经1%琼脂糖凝胶电泳鉴 定并用微量分光光度计测定探针浓度，于-80℃保存备用。 3.2荧光原位杂交实验检测探针的效果 1) 正常C57BL/6小鼠用1%戊巴比妥钠深麻后，依次以30 mL 0.01 mol/L DEPC-PBS和 100 mL含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液（PB）行左心室灌注，小心剥离脑组织，于4℃环境下用上述相同固定液进行后固定过夜，后将组织转移浸没于含30%蔗糖的PB溶液中脱水至沉底。 2) 最后取出组织用OTC包埋，冰冻切片机连续切片至需要的层面，切片厚度30 μm。 3) 选取上述脑组织切片于室温条件下经含有2%H2O2的0.1 mol/L DEPC-PB处理10 min 以阻断内源性过氧化物酶，再用0.1mol/L DEPC-PB室温漂洗10 min，接着用含 0.3%Triton X-100的0.1 mol/L DEPC-PB处理20 min，在用乙酰化液处理10 min，后 于0.1mol/L DEPC-PB中清洗2次，每次10 min，后加入预杂交液，60℃预杂交1 h 以封闭非特异结合位点。 4) 分别于两组切片中加入探针并使探针终浓度为1 μg/mL。于60℃杂交炉中恒温孵育 16-20 h，同时设立省略探针的空白对照，以上操作严格在无RNA酶环境下进行。 5) 杂交后组织切片置于wash buffer中60℃浸洗2次，每次20 min，接着切片在RNase buffer中室温孵育5 min，后加入终浓度为20 μg/mL的RNase，37℃作用30 min以消化未结合的cRNA探针。 6) 接下来恒温37℃条件下依次用2×SSC，0. 2×SSC溶液各浸洗切片2次，每次20 min， 再在TS7.5溶液中室温孵育5 min，后置于TBS溶液中室温封闭1 h，加入地高辛抗体（POD-anti-DIG,1:100）室温孵育过夜。
细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min
↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)
荧光原位杂交技术及其应用 摘要：荧光原位杂交技术是一种非常有用的分子细胞遗传学工具，特别是对一些染色体数目异常和复杂染色体异常的诊断，架起了染色体显带技术和分子遗传学之间的桥梁。本文主要就荧光原位杂交技术的发展历程、探针制备和临床应用做一简单的综述。 关键词：FISH；荧光原位杂交；临床应用；产前诊断；肿瘤 Fluorescence in situ hybridization and applications SUN Jingjing,YAN Shouqing (College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062，China) Abstract:FISH is a powerful molecular cytogenetic technique which allows rapid detection of numerical and complex chromosome aberrations on interphase cells and metaphase spreads, bridging the gap between conventional chromosome banding analysis and molecular genetic DNA studies. This review gives a brief overview of the historical developments of FISH techniques and applications in clinic genetic diagnostics. Key words:FISH; Fluorescence in situ hybridization; Clinical applications; Prenatal diagnosis; Tumor DNA荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示DNA序列位置的方法[1]。该技术具有快速、安全、灵敏度高以及探针可长期保存等特点，目前已广泛应用于细胞遗传学、肿瘤生物学、基因定位、基因作图、基因扩增,产前诊断及哺乳动物染色体进化研究等领域。 1 FISH技术的产生 1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获得成功之后，Pardue等同年又以小鼠卫星DNA为模板，利用体外合成的含3H 的RNA为探针成功地与中期染色体标本进行了原位杂交，从而开创了RNA-DNA的同位素原位杂交技术[2]，但是没有得到广泛应用。1974年Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来，提高了基因定位的准确性。1981年，Langer等首次采用生物素标记的核苷酸探针(bio-dUTP)成功地进行了染色体原位杂交，建立了非放射性原位杂交技术(Nonisotopic in situ hybridization)，至此，以荧光标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。1985年这项技术被引进到植物。1986年，Cremer与Licher等分别证实了荧光原位杂交技
方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分 钟使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面， 放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体 抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细 胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。 如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不 同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索， 我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对 照是PBS+荧光标记物。 4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。 5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。 方法三： 1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色 2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌 的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片 3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。1981年Harper 成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH 技术得到了迅速的发展和广泛应用。 1．原理 FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。2．实验流程 FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。 3．特点 原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点:1、荧光试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。 缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。 4．应用 该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。 荧光原位杂交FISH操作规程 一、主要试剂 1变性液20SSC 4mlddH2O 8ml甲酰胺28ml 2PBD液1000ml 20SSC中加入1.25gTween20 二、操作流程 1 硅化玻片切片烤片60过夜 2 脱蜡入水斜置切片空干 3 2SSC洗涤三次每次5min下简写为35 4 0.2M HCl处理室温10接步骤3 5 0.25mg/ml 蛋白酶K处理室温1530接步骤3 6 切片入20梯度酒精脱水各2空干 7 切片入85变性液8 8 迅速入20梯度酒精脱水各2空干 9 杂交液85变性50冰浴10滴加至切片加盖玻片37过夜 10 反应体系中加入等体积的甲酰胺4510
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。 (1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。 (2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。 免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项 一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。 2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。 4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。 6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。 二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。 2、每次试验均需设置以下三种对照： (1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。 三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。 2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey 血清。 5、其余事项同免疫荧光单标操作。 免疫组化双重染色方法和步骤 在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一
免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 （1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡 （2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min （4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。 （6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。 （8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。（11）次日取出切片，室温下复温 30min。 （12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。 （15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 （18）使用荧光显微镜进行观察拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 （1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min （2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min （3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min （5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （6）1%BSA室温封闭30min （7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗 （10）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用 （12）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （13）用抗荧光淬灭剂封片 （14）荧光显微镜下观察采集图像 细胞免疫荧光（悬浮细胞方法一） （1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。
细胞遗传学课程论文 题目：荧光原位杂交技术的发展 及在植物中的应用 姓名：秦冉 学号：11316040 荧光原位杂交技术的发展及在植物中的应用 摘要: 荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,FISH）是20世纪80年代末发展起来的一种非放射性原位杂交技术。该技术因其具有灵敏度高、特异性强、定位准确、快速有效、安全直观等特点而被应用于很多领域。本文简要介绍了荧光原位杂交在染色体制片技术、探针类型及探针标记方法方面的发展，概述了荧光原位杂交技术在基因定位，远缘杂种的鉴定及外源染色质的检测等方面的应用。 关键词：荧光原位杂交技术；染色体制片技术；探针标记方法；基因定位 The development of fluorescence in situ hybridization and its application in plant Abstract: Fluorescence in situ hybridization(FISH) is a non radioactive in situ hybridization technique developed in the late 1980s. Because of its characteristics:high sensitivity, strong specificity, accurate positioning, fast, safe and effective, it can be used in many fields.This paper briefly introduces the development of FISH in plant including the chromosomal technique, probe type and labeling method, then summarizes the application of FISH in gene mapping, identification of the distant hybrid and detection of the alien chromatin, etc. Keywords: fluorescence in situ hybridization; chromosomal technique; probe method; gene mapping 前言 荧光原位杂交技术是20世纪80年代末发展起来的一种非放射性原位杂交技术[1]。其基本原理为：根据核普酸碱基互补配对原则, 使荧光标记的探针序列与靶DNA序列进行杂交, 然后用合适的检测方法将荧光信号检出, 达到基因定位的目的。因其具有灵敏度高、特异性强、定位准确、快速有效、安全直观等特点而被应用于很多领域。自从Rayburn等[2]于1985年首次将原位杂交技术应用于植物染色体研究后，该技术便在植物学研究中得到了广泛的应用。主要是由于以下几方面的原因：①FISH 的灵敏度接近同位素标记探针杂交[3-4]，在安全性，空间分辨率，速度和探针的稳定性等比放射性同位素标记探针杂交更具优越性；②运用不同荧光色素标记的探针可同时检测一个细胞核中2种或更多的核甘酸序列；③DNA 序列能被定位在目标范围从载玻片上分散的中期细胞染色体到悬浮固定保存细胞三维结构的间期核中[5]；④探针标记和荧光试剂从商业上可得，而且使FISH过程直接可靠；⑤荧光显微镜和数字成像系统在过去20 多年中不断改进；⑥特殊种属的全基因组，完整染色体，染色体亚区域或单拷贝序列能在多种探针混合运用情况下出现特异信号；⑦未标记的基因组DNA 通过探针预杂交抑制重复序列，对定位象柯斯质粒这样一类含大插入探针的特定序列是至关重要的。来。FISH技术的程序较复杂，主要流程包括染色体标本的制备，探针的制备、纯化与检测，染色体与探针的变性，原位杂交，杂交后洗脱，杂交信号的检测和放大，荧光显微镜观察、照相。 随着FISH 技术的不断发展，衍生了染色体原位抑制（CISS）技术、间期核FISH、引物原位标记或DNA 合成（PRINS）技术等，并且发展出M-FISH、3D-FISH、Rx-FISH 技术、CGH 以
胞免疫荧光步骤： 1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。 爬片可以在培养皿六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子 具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量） 取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。 爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。 将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。 2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)； 3.PBS漂洗5min； 4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)； 5.PBS漂洗2次，每次5min； 6.1%BSA封闭30min； 7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h； 8.PBS漂洗2次，每次5min； 9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h； 10.PBS漂洗2次，每次5min； 11.5ug/ml DAPI染色2min； 12.抗淬灭封片剂封片。
荧光原位杂交实验（FISH） 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。 1实验方法原理： 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。FISH 的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。 杂交所用的探针大致可以分类三类：1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III 类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-
方案设计诺禾致源最新发表GBS遗传图谱文章 123 微生物基因组测序16S/18S/ITS等扩增子测序细菌基因组 de novo 测序真菌基因组 de novo 测序微生物重测序宏基因组测序动植物基因组测序全基因组survey 全基因组 de novo 测序泛基因组测序变异检测BSA性状定位遗传图谱全基因组关联分析群体进化Hi-C测序人类基因组测序全基因组测序外显子测序目标区域测序单细胞基因组测序建库测序建库测序诺禾致源微信文章精彩阅读 >> 版权所有：北京诺禾致源科技股份有限公司 转录调控测序 真核有参转录组测序 医学转录组测序 真核无参转录组测序 比较转录组与泛转录组测序 原核转录组测序 宏转录组测序 单细胞转录组测序 LncRNA测序 circRNA测序 small RNA测序 ChiP-seq RIP-seq 全基因组甲基化测序图1 亲本间多态性SNP在全基因组及外显子区域的分布 图4 遗传图谱与物理图谱共线性分析 图2 玉米 bin map (横轴表示染色体编号，纵轴表示样本数； 红色表示与亲本Qi319基因型相同，蓝色表示与亲本Ye478相同； 黄色：杂合基因型) 图3 三个环境下的PH性状相关QTL在染色体上的分布GBS遗传图谱代表文献 中国农业科学院作物研究所研究人员携手诺禾致源重测序团队， 采用GBS技术，利用Illumina HiSeq 2500测序平台，对314株高 世代群体（RILs）进行双末端PE125低深度测序（平均测序深度 0.07×），检测群体SNP，并进行遗传标记开发，亲本间多态性 SNP标记分布如右图所示（图1）。 基于该图谱，对玉米3个株型相关的性状进行了定位，并且在3个 环境中定位出了主效QTL。通过这些定位出的QTL，预测到2个候 选基因，为后续进行基因的准确鉴定奠定了基础（图3）。案例1 基于GBS技术的玉米高密度遗传图谱构建和株型相关性状定位 案例西北农林科技大学研究人员与诺禾致源重测序团队合作，采用GBS技术，对枣树F 1群体的145个个体利用Illumina HiSeq PE150平台测序，检测群体SNP，并进行遗传标记开发，构建遗传图谱。本研究共得到12个连锁群，上图标记数为2540个，遗传距离总长为1456.53cM，标记间平均距离为0.88cM。 2 基于GBS技术构建枣树F 1代高密度遗传图谱 本研究通过亲本及子代SNP基因分型，开发bin 标记，基于4183个 bin 标记构建玉米高密度遗传图谱，遗传距离总长为1545.65cM， 标记间平均距离为0.37cM, 平均物理距离为0.51Mb（图2）。 类 别作物类林木类作物类作物类林木类作物类作物类发表时间2016201620152015201420132013发表刊物BMC Genomics Tree Genetics & Genomes Molecular Breeding BMC Genomics G3:Gene Genomes Genetics BMC Genomics Plos Genetics IF 3.8672.1322.1083.8672.913.8676.661策 略GBS GBS GBS GBS GBS GBS GBS link link link link link link link 物 种 玉米[1] 枣树[2] 狼尾草[3] 木薯[4] 苹果[5] 覆盆子[6] 柳枝稷[7]
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。 一、基本原理： 免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 二、应用范围： 其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。 三、基本实验步骤：
1、细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 2、固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5min. 3、通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5min. 4、封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. 5、一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. 6、二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 7、封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 四、注意事项： 1、染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。 2、荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。
荧光原位杂交技术（FISH）常见问答 对于FISH操作来说，那些因素比较重要？ 在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度；各种试剂pH是否符合要求直接关系到FISH的稳定性。 在夏季成功检测的同一探针和样本为什么在冬季就得不到理想的效果？ 发生上述现象最大的可能是FISH操作的环境温度发生了变化导致的。在我国，冬季普遍比夏季寒冷，低的环境温度使FISH得不到良好的杂交效率。此外，探针的保存不当也容易引起荧光素的萃灭而导致效果不佳。因此保证FISH操作中的温度非常重要。 该如何保证FISH操作中的温度？ 最佳的措施是使用一些FISH的专用仪器进行操作。如果是手工操作，首先要对FISH操作过程中可能使用的一些仪器进行温控能力的检查，诸如水浴锅、孵箱，对其中不符合要求的要进行更换（疾病诊断中的探针要求温控精度在1度以内）。其次，要尽可能地保持操作环境温度在20度以上，对于在冬季进行的FISH 操作尤为重要。此外对于需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其进行测温。同时检测的样本最好不能超过4块。操作中的行动一定要迅速。操作者还往往忽视一些小部件的温度，诸如载玻片和盖玻片。特别是在冬季，盖玻片本身温度就低，加之探针的量本就不多（10ul），因此事先没有预热的盖玻片会使得杂交液的温度急剧下降严重地影响了探针和目标DNA的杂交效率。因此对上述小部件的预热也能有效地提高FISH的杂交效果。 使用荧光显微镜观察结果时，最初有清晰而明亮的信号。但随后信号急剧衰减。几分钟后信号就消失了。这是探针本身的质量问题吗？ 在正常情况下，目前的商业化探针即使是杂交后，如果保存适当，荧光信号能保持半年以上。出现上述情况主要的原因是操作观察的过程中或是探针的保存过程中没有采取严格的避光措施。阳光或是强的灯光都会使荧光染料发生急剧的淬灭，从而造成了观察结果的不稳定。因此在操作和观察时，尽可能在暗室中操作。也可以在封片观察时加入一定的antifade（抗淬灭剂）以延缓荧光素的淬灭。 如何配制各种试剂呢？ 强烈建议使用去离子水配制各种所需的试剂。此外，配制后使用pH计检测是否符合要求。配制的各种试剂都要采用超纯级的要求。每次FISH使用新的试剂，旧的试剂最好弃置不用。洗脱液和变性液当天用当天配。 直标型探针和间标型探针有何不同？为什么我们要选择直标型探针？ 所谓的直标型探针是指DNA探针共价连接着荧光素基团；间标型探针则是指DNA探针先与某个半抗原连接，诸如生物素或地高辛，然后半抗原与荧光素基团连接从而形成探针－半抗原－荧光素基团，类似“三明治”的复合物。与间标型探针相比，直标型探针具有低背景、高特异性的特点。随着荧光染料和荧光检测技术的不断发展，直标型探针的灵敏度也不断提高。因而在FISH检测领域，尤其是在疾病分型领域，探针大多采用直标型设计。 我能对同一样本进行多次的FISH操作吗？ 在多数情况下，如果FISH操作没有得到正常的结果，我们可以将探针洗去，然后使用同样的探针进行再次的杂交。如果我们使用的是直标型探针，还可以使用不同探针对同一样本进行反复杂交。针对不同的样本，处理方法略有不同。