主题：GST-pulldown
概述：
GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术，近年来越来越受到广大学者的青睐。
其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白，“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
目的：
体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。
原理：
利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。
步骤：
１.Glutathione琼脂糖珠预处理；
２.GST融合蛋白挂柱：取适GST-融合蛋白与已经处理过的beads置于管中，4℃，摇床孵育过夜；
３.孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4℃，离心,上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上；
４.把转染目的基因的细胞裂解在细胞裂解液里（含蛋白酶抑制剂），最大转速4℃离心，收集上清液；
５.将细胞裂解液上清加入beads；
６.加上SDS上样缓冲液；
７.SDS-PAGE，Western Blot或者质谱仪分析。
流程图：
胶乳微球物理吸附 反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用来设计被动吸附蛋白。磺酸基微球表面含带有负电荷的磺酸基团，pka大约为2，因此在酸性pH保持稳定。醛基微球表面也带有磺酸基团，但能和蛋白行程共价键。羧基微球表面含带负电荷的羧基基团，在pH5.0以上时保持稳定。 带有疏水基团的蛋白的吸附和配位结合，是最简单和直接的标记方法。这种方法中，微球溶液和含目标蛋白的溶液混合，反应后，未结合的游离蛋白通过清洗步骤除去，从而获得胶体蛋白复合物。疏水吸附方法只能用于疏水微球（硫酸盐、羧基、醛基表面修饰的微球）。醛基表面修饰微球是一个特例，其疏水吸附结果取决于后来的共价结合。虽然物理吸附是不依赖pH的，但反应缓冲液的pH对蛋白的结构有非常大的影响，从而影响蛋白吸附到微球上的反应效率。一般，在被吸附蛋白等电点附近pH时，物理吸附效率会很高。 反应步骤： 1. 用反应缓冲液系数蛋白到10mg/ml； 2. 用反应缓冲液系数胶乳微球到1%； 3. 将蛋白溶液加入到胶乳微球溶液中，10ml胶乳中加入1ml蛋白溶液。室温搅拌孵育2hr； 4. 离心或超滤，除去未结合蛋白； 5. 将微球蛋白复合物用储存缓冲液溶解。 注意事项： 1. 最优蛋白标记量影响因素 1）有效比表面积：粒径减小时，比表面积/mg微球值得增加； 2）胶体稳定性：蛋白对胶乳有稳定和去稳定作用； 3）免疫反应：最近标记量由免疫反应需要决定。 2. 胶乳微球中加入蛋白后，快速搅拌混合，利于反应均衡。反应体积是1ml时，可用移液器吸取蛋白加入微球中，并吹打数次。如果反应体积较大时，用烧杯，边搅拌边加入蛋白， 3. 储存缓冲液和反应缓冲液不同时，抗体有脱落的可能； 4. 表面活性剂能使得抗体从胶乳中脱落，所以应避免加入。 微球共价结合抗体方法 一、一步法 1. 准备50mM pH 6.0的reaction buffer，醋酸或MES buffer更合适 2. 用reaction buffer溶解抗体，使其浓度为1mg/mL。 3. 用reaction buffer 悬浮微球，使其浓度为1% w/v 4. 边搅拌边将一倍体积的抗体溶液加入到10倍体积的微球悬液中，室温下持续搅拌20分钟 5. 准备浓度为10mg/ml（52umol/mL）的EDC溶液，用前准备，现配现用。 6. 将计算需求量的EDC溶液加入到上述微球悬液中。(Note 6). 7. 室温下，立即调节pH (Note 7). 8. 移除未结合的蛋白，并将包被微球用storage buffer重悬。(Note 3 and 4) B. 两步法 为了避免EDC将相邻微球之间的蛋白偶联导致微球聚集或者蛋白之间交流，两步法偶联抗体更合适。两步法中，在蛋白加入之前，多余的EDC被移除。两步法中，蛋白也可以使用
《检测生物组织中的糖类》的教学设计 阳春市第一中学何方炎 一、教材分析： 1、教材的地位和作用 新教材把实验安排在学习蛋白质、糖类和脂质等知识内容之前，一方面为接下来的学习各类有机物奠定感性认识基础，另一方面，由于实验内容的设置上注重学生对材料的选择，对检测结果的预期和实验方案的设计，因此有利于培养了学生的实验探究的能力，为以后各章节的探究性实验的顺利开展搭建了一个较高的起点。 2、教学目标 （1）知识： ①尝试用化学试剂检测生物组织中的糖类。 ②推断组织液中有机物的种类和大致含量 （2）能力： ①学习实验探究的方法 ②初步掌握评价和报告实验结果的能力 （3）情感态度价值观：严谨认真合作学习敢于质疑善于反思 3、教学重点难点 重点：检测生物组织中的糖类的原理和方法。 难点：实验所用材料多，试剂种类和使用方法多，课堂容量大。 突破：面对全体学生，做好充分的准备:材料仪器准备，学生的情感和知识准备。课堂上发挥小组长的协助管理作用，合理有序地组织教学。 二、学情分析 1、学生的思维水平、学习能力已经发展到较高阶段，乐于并有能力接受自主探究的学习模式。 2、感兴趣，有实验操作的基础。 3、材料试剂多，任务繁重，合作学习显得尤为重要。 三、教法学法 1、学法：任务驱动，自主探究合作学习，分享交流。 2、教法：组织者，引导者，注意生成性问题的再探究。 四、教学过程 1、实验动员，知识准备 教师：介绍有关实验原理和检测方法（见板书） 学生：讨论交流，合作学习（讨论题见板书） 2、创设情景，任务驱动 提供一种水果组织（苹果），学生自带一样自己感兴趣的组织进行检测。
假设每个同学是一个营养师或检验员……如何准确检测出组织液各含哪种物质？ 你要选择哪些实验器材和试剂？ 3、作出预测设计实验 （1）先预测，再检测。 （2）设计记录表格，记录预测和实测结果。 4、分组探究，自主学习 小组长：组织分工，材料仪器的分配和管理。 组员：对提供的一种组织液和自带的组织用相应试剂进行检测。根据特定的颜色反应尝试分析其中有机物的种类，比较各种有机物的含量。 注意生成性问题的再探究（再探究课题见板书） 教师：不直接解疑，鼓励设计实验进行再探究 5、成果交流，评价反思 实验反思：预测与实测相符？ 小组间的异同？ 存在问题？ 教师公布答案，并作出恰当的评价： （1）实验纪录表格的设计、实验结果和推论 （2）自主学习和合作能力 （3）创新思维和能力 6、拓展延伸，学以致用 讨论： 今天检测的生物材料中有机物的种类，含量一样吗？对你选择食物有什么启发？ 依据课程的基本理念，注重与现实生活的联系，学以致用。 五、教学反思 1、以“自主性、探究性、合作性、完整性”为课堂教学的四个基本维度，以培养学生的科学素养为指导，侧重科学方法教育。 2、注重培养自疑自析的能力，“教为了不教”。 3、发挥小组长的协助作用。 4、试剂用量的差异，影响对实验结果的推断。 5、探究、创新能力的培养与课时的安排矛盾。 板书设计： 检测生物组织中的糖类 一、实验原理（）＋（）（）
1. Dissolve the protein to be modi?ed at a concentration of 1–10 mg/ml in 0.1 M sodium phosphate, pH 7.4. NaCl may be added to this buffer if desired. For the modi? cation of keyhole limpet hemocyanin (KLH; Thermo Fisher) as described by Staros et al., 1986, include 0.9 M NaCl to maintain the solubility of this high-molecular-weight protein.If lower or higher concentrations of the protein are used, adjust the amounts of the other reactants as necessary to maintain the correct molar ratios. 2. Dissolve the molecule to be coupled in the same buffer used in step 1. For small molecules, add them to the reaction in at least a 10-fold molar excess over the amount of protein present. If possible, the molecule may be added directly to the protein solution in the appropriate excess. Alternatively, dissolve the molecule in the buffer at a higher concentration, and then add an aliquot of this stock solution to the protein solution. 3. Add the solution prepared in step 2 to the protein solution to obtain at least a 10-fold molar excess of small molecule to protein. 4. Add EDC (Thermo Fisher) to the above solution to obtain at least a 10-fold molar excess of EDC over the amount of protein present. Alternatively, a 0.05–0.1 M EDC concentrationin the reaction usually works well. Also, add sulfo-NHS (Thermo Fisher) to the reaction to bring its ?nal concentration to 5 mM. To make it easier to add the correct quantity of EDC or sulfo-NHS, higher concentration stock solutions may be prepared if they are dissolved and used immediately. Mix to dissolve. If this ratio of EDC/sulfo-NHS to peptide or protein results in precipitation, scale back the amount of addition until a soluble conjugate is obtained. 5. React for 2 hours at room temperature. 6. Purify the conjugate by gel ?ltration or dialysis using the buffer of choice (for many conjugates 0.01 M sodium phosphate, 0.15 M NaCl, pH 7.4 is appropriate). If some turbidity has formed during the conjugation procedure, it may be removed by centrifugation or ?ltration.
泛素化蛋白检测方法 蛋白质泛素化简介蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76 个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3 酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7 个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48 位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63 位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（DUB ）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域（UBD ）所 识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90 种DUB 酶和20 种UBD ，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3 酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT 结构域的E3 酶和其它含有RING 结构域或RING 样结构域（比如U-box 或PHD 结构域）的E3 酶。这两种E3 酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 蛋白质泛素化的检测方法研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是 如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3 酶是什么？ 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应？对下游
6种方法测定蛋白质含量 [ 文章来源： | 文章作者： | 发布时间：2006-12-25| 字体： [大 中 小] 一、微量凯氏（kjeldahl ）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： nh 2ch 2cooh+3h 2so 4——2co 2+3so 2+4h 2o+nh 3 (1) 2nh 3+h 2so 4——(nh 4)2so 4 (2) (nh 4)2so 4+2naoh ——2h 2o+na 2so 4+2nh 3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（biuret 法） （一）实验原理 双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材
食品中蛋白质的测定方法 蛋白质的测定方法分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量，肽链和折射率测定蛋白质含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定蛋白质含量。但是食品种类很多，食品中蛋白质含量又不同，特别是其他成分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干扰成分很多，因此蛋白质的测定通常利用经典的剀氏定氮法是由样品消化成铵盐蒸馏，用标准酸 液吸收，用标准酸或碱液滴定，由样品中含氮量计算出蛋白质的含量。由于食品中蛋白质含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。 一凯氏定氮法 我们在检验食品中蛋白质时，往往只限于测定总氮量，然后乘以蛋白质核算系数，得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗蛋白质。 (一) 、常量凯氏定氮法 衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数。即可计算该样品的蛋白质含量。 一般食品蛋白质含氮量为l6 ％，即1份氮素相当于6.25 分蛋白质,以此为换算系数6.25 ，不同类的食物其蛋白质的换算系数不同. 如玉米、高梁、荞麦, 肉与肉制品取6.25 ，大米取 5.95 、小麦粉取 5.7, 乳制品取 6.38 、大豆及其制品取5.17 ，动物胶 5.55 。 测定原理： 食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素以氨的形式与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收形成硼酸铵，再用盐酸标准溶液或硫酸标准溶液滴定，根据盐酸消耗量计算出总氮量，再乘以一定的数值即为蛋白质含量，其化学反应式如下。 ⑴消化反应：有机物(含C、N、H、0、P、S等元素)+H2S04 -T(NH4)2SO4+CO0 +S02f +S03+H3PO4+C02 (2) 蒸馏反应：(NH4)2SO4+2NAOH—2NH3T +2H2O+NA2SO4 2NH3+4H3B04 (NH4)2B4O7+5H2O (3) 滴定反应：(NH4)2B4O7+2HCH+5H2O T2NH4CH+4H3BC或(NH4)2B407+H2S04+5H20- (NH4)9SO4+4H2BO2 试剂与仪器： 1、硫酸钾； 2、硫酸铜；
生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验日期实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.1.掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作； 1.2.掌握双缩脲试剂的配制； 1.3.熟悉血清总蛋白的临床意义； 1.4.了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。 二、实验原理 2.1.两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。 2.2.蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。 三、材料与方法： 3.1.实验材料： 3.1.1.实验试剂：①小牛血清；②6.0mol/LNaOH溶液；③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾；④蛋白质标准液（70g/L）；⑤0.9%NaCl；⑥蒸馏水。 3.1.2.实验器材：①试管；②烧杯；③容量瓶；④加样枪；⑤刻度吸管；⑥玻璃棒；⑥1100分光光度计；⑦电子天平；⑧水浴锅。
3.2.实验步骤 四、结果与讨论： 4.1.实验现象： ①选取三支洁净无损的试管，从左往右依次加入0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的小牛血清各0.5ml，分别命名为B试管、S试管和U试管，再分别向三支试管内加入4ml的双缩脲试剂，溶液均成蓝色透明状。
测定次数 1 2 3 平均吸光度 ②将三支试管放入37℃水浴锅中加热20min，取出后，B试管呈淡蓝色，S试管和U 试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。（如图一） 图一水浴后三支试管颜色图二分光计读数 S 0.185 0.184 0.185 0.1847 U 0.152 0.151 0.152 0.1517 结果计算：代入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X蛋白质标准液浓度（g/L)，得出结果：血清总蛋白=57.493g/L。 4.3.结果讨论 经查阅资料得：正常成人血清总蛋白含量为60～80g/L，而小牛血清总蛋白含量比正常成人血清总蛋白含量略低一点，本次结果得出小牛血清总蛋白含量为57.493g/L，符合情况。 4.3.1.成功原因： ①本次试验的试剂混合水浴后出现了预期效果：B试管呈淡蓝色，S试管和U试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。B试管呈淡蓝色是因为B试管中没有发生任何反应，所以呈现双缩脲试剂本来的淡蓝色，而S试管和U试管呈浅紫色是因为试剂中的蛋白质和双缩脲发生了双缩脲反应而呈浅紫色。 管号
荧光微球标记抗体方法及问题分析 很多公司开展了荧光胶乳免疫层析做定量分析及胶乳增强免疫比浊分析项目，关注胶乳标记技术的技术人员越来越多。本人总结了部分胶乳微球标记技术相关主题帖，并加以分类，以便朋友们查阅，希望朋友们继续完善或分享经验。 1. 胶乳大小选择 【求助】免疫胶乳或免疫颗粒（聚苯乙烯）的粒径 免疫胶乳或免疫颗粒（聚苯乙烯）的粒径- 丁香园论坛 【求助】乳胶免疫比浊中的乳胶颗粒大小与抗体 乳胶免疫比浊中的乳胶颗粒大小与抗体- 丁香园论坛 2. 胶乳标记方法 【交流】蛋白如何偶联到聚苯乙烯乳胶颗粒上 蛋白如何偶联到聚苯乙烯乳胶颗粒上- 丁香园论坛 （求助）胶乳标记 （求助）胶乳标记- 丁香园论坛 【求助】抗原或抗体致敏胶乳的缓冲液和pH值 抗原或抗体致敏胶乳的缓冲液和pH值- 丁香园论坛 3. 胶乳标记过程问题 【求助】胶乳偶联出现絮凝 胶乳增强免疫比浊试剂稳定性问题- 丁香园论坛 【求助】胶乳增强免疫比浊中抗体交联的问题 胶乳微球物理吸附 反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用来设计被动吸附蛋白。磺酸基微球表面含带有负电荷的磺酸基团，pka大约为2，因此在酸性pH保持稳定。醛基微球表面也带有磺酸基团，但能和蛋白行程共价键。羧基微球表面含带负电荷的羧基基团，在pH5.0以上时保持稳定。 带有疏水基团的蛋白的吸附和配位结合，是最简单和直接的标记方法。这种方法中，微球溶液和含目标蛋白的溶液混合，反应后，未结合的游离蛋白通过清洗步骤除去，从而获得胶体蛋白复合物。疏水吸附方法只能用于疏水微球（硫酸盐、羧基、醛基表面修饰的微球）。醛
基表面修饰微球是一个特例，其疏水吸附结果取决于后来的共价结合。虽然物理吸附是不依赖pH的，但反应缓冲液的pH对蛋白的结构有非常大的影响，从而影响蛋白吸附到微球上的反应效率。一般，在被吸附蛋白等电点附近pH时，物理吸附效率会很高。 反应步骤： 1. 用反应缓冲液系数蛋白到10mg/ml； 2. 用反应缓冲液系数胶乳微球到1%； 3. 将蛋白溶液加入到胶乳微球溶液中，10ml胶乳中加入1ml蛋白溶液。室温搅拌孵育2hr； 4. 离心或超滤，除去未结合蛋白； 5. 将微球蛋白复合物用储存缓冲液溶解。 注意事项： 1. 最优蛋白标记量影响因素 1）有效比表面积：粒径减小时，比表面积/mg微球值得增加； 2）胶体稳定性：蛋白对胶乳有稳定和去稳定作用； 3）免疫反应：最近标记量由免疫反应需要决定。 2. 胶乳微球中加入蛋白后，快速搅拌混合，利于反应均衡。反应体积是1ml时，可用移液器吸取蛋白加入微球中，并吹打数次。如果反应体积较大时，用烧杯，边搅拌边加入蛋白， 3. 储存缓冲液和反应缓冲液不同时，抗体有脱落的可能； 4. 表面活性剂能使得抗体从胶乳中脱落，所以应避免加入。 微球共价结合抗体方法 一、一步法 1. 准备50mM pH 6.0的reaction buffer，醋酸或MES buffer更合适 2. 用reaction buffer溶解抗体，使其浓度为1mg/mL。 3. 用reaction buffer 悬浮微球，使其浓度为1% w/v 4. 边搅拌边将一倍体积的抗体溶液加入到10倍体积的微球悬液中，室温下持续搅拌20分钟 5. 准备浓度为10mg/ml（52umol/mL）的EDC溶液，用前准备，现配现用。 6. 将计算需求量的EDC溶液加入到上述微球悬液中。(Note 6). 7. 室温下，立即调节pH (Note 7). 8. 移除未结合的蛋白，并将包被微球用storage buffer重悬。(Note 3 and 4) B. 两步法 为了避免EDC将相邻微球之间的蛋白偶联导致微球聚集或者蛋白之间交流，两步法偶联抗体更合适。两步法中，在蛋白加入之前，多余的EDC被移除。两步法中，蛋白也可以使用更高pH的buffer来溶解，从蛋白的稳定性方面和加速蛋白和活化微球之间的交联速度方便考虑，是非常有利的。 B1 简单一步法： 1. 准备50mM pH 6.0的活化buffer，醋酸或MES buffer更合适；用活化buffer 悬浮微球，使其浓度为1% w/v 2. 每ml微球悬液加入20mg的EDC，室温孵育20分钟，然后再次加入20mg/mL的EDC，继续室温孵育20分钟。(Note 7). 3. 离心或超滤，用等体积的包被缓冲液清洗两次微球，最后悬浮在包被缓冲液中。(Note 3). 4. 用包被缓冲液溶解抗体到1mg/mL，包被缓冲液pH7~9，浓度为50mM~100mM。(Note 1)
Bradford法蛋白定量（Bradford Protein Assay ） Bradford Assay is a rapid and accurate method commonly used to determine the total protein concentration of a sample. The assay is based on the observation that the absorbance maximum for an acidic solution of Coomassie Brilliant Blue G-250 shifts from 465 nm to 595 nm when binding to protein occurs. Both hydrophobic and ionic interactions stabilize the anionic form of the dye, causing a visible color change. Within the linear range of the assay (~5-25 mcg/mL), the more protein present, the more Coomassie binds. Reference Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. (1976) 72, 248-254. 考马斯亮蓝染色法(Bradford法)测定蛋白质含量 原理 1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G250与蛋白质结合的原理，迅速、敏感的定量测定蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465nm变为595nm，光吸收增加。蛋白质-染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子，如K+，Na+，Mg2+，(NH4)2SO4，乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX100，SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。 操作 一、标准方法 取含10～100μg蛋白质溶液于小试管中，用双蒸水或缓冲液调体积到0.1mL，然后加入5mL蛋白试剂，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收值。以0.1mL 双蒸水或缓冲液及5mL蛋白试剂作为空白对照。 二、微量蛋白分析法 取含1～10μg蛋白质溶液，用双蒸水调体积到0.8mL，加0.2mL蛋白试剂，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收值，以0.8mL双蒸水及0.2mL蛋白试剂作为空白对照。用不同浓度的蛋白质溶液作标准曲线，以蛋白质浓度为横坐
蛋白质含量测定法（一） 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 五种蛋白质测定方法比较
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（Biuret法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材
《检测生物组织中还原糖、脂肪和蛋白质》教案 一、实验原理 （1）鉴定实验设计的理念： 某些化学试剂 + 生物组织中有关有机化合物产生特定的颜色反应。 （2）具体原理： ①可溶性还原糖+ 斐林试剂→砖红色沉淀。 ②脂肪小颗粒 + 苏丹Ⅲ染液→橘黄色小颗粒。 ③蛋白质 + 双缩脲试剂→紫色反应。 二、目标要求 初步掌握鉴定生物组织中可溶性还原糖、脂肪、蛋白质的基本方法。 三、重点、难点 1.重点 ①初步掌握鉴定生物组织中可溶性还原糖、脂肪、蛋白质的基本方法。 ②通过实验的操作和设计培养学生的动手能力，掌握探索实验设计技巧，从而培养创新思维能力。 2.难点 根据此实验方法、原理，设计实验来鉴定常见食物的成分。 四、实验材料 1.可溶性还原糖的鉴定实验:选择含糖量较高、颜色为白色或近白色的植物组织，以苹果、梨为最好。 2.脂肪的鉴定实验:选择富含脂肪的种子，以花生种子为最好(实验前浸泡3h～4h)。 3.蛋白质的鉴定实验:可用浸泡1d～2d的黄豆种子(或用豆浆、或用鸡蛋蛋白)。 五、仪器、试剂 1.仪器:剪刀,解剖刀,双面刀片,试管,试管架,试管夹,大小烧杯,小量筒,滴管,玻璃漏斗,酒精灯,三脚架,石棉网,火柴,研钵,石英砂,纱布,载玻片,盖玻片,毛笔,吸水纸,显微镜。 2.试剂:①斐林试剂(0.1g/L的NaOH溶液+ 0.05g/mL的CuSO 溶液)；②苏丹 4 Ⅲ染液；③双缩脲试剂；④体积分数为50%的酒精溶液；⑤蒸馏水。 六、方法步骤(演示教学课件) 1.制备试剂。 2.可溶性还原糖的鉴定、方法、步骤。 3.脂肪的鉴定、方法、步骤。 4.蛋白质的鉴定、方法、步骤。 七、教学过程 新课引入：我们在化学中学习过物质的鉴定，其原理是被鉴定的物质与所用的化学试剂要么发生颜色反应，要么产生沉淀，我们生物学上也采用此原理，在生物学中物质鉴定的理念是：某些化学试剂能够使生物组织中的有关有机化合物产生特定的颜色反应。 新课教学：（具体原理） ①可溶性还原糖+ 斐林试剂→砖红色沉淀。（水浴加热） ②脂肪小颗粒 + 苏丹Ⅲ染液→橘黄色小颗粒。（要显微镜观察）
实验七蛋白质含量测定 测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。 [目的要求] 1．掌握测定蛋白质的含量基本方法。 2．了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。 一、染料法 [实验原理] 在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。 该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。 [器材] 吸量管；试管；721型分光光度计 [试剂] 1.标准牛血清白蛋白溶液：配成0.1mg/ml的溶液。 2.待测蛋白质溶液。 3.染料溶液：称取考马斯亮蓝G-250 0.1g溶于95%的酒精50ml，再加入85%的浓磷酸100ml，用水稀释至1000ml,混匀备用。
[操作步骤] 1．标准曲线的绘制： 按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值（A）。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 2．样品测定： 取1ml样品溶液（约含25～250微克蛋白质），加入染料溶液5ml混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。 二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 [实验原理] 在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量
核酸探针与羧基微球偶联 根据Bio-Plex公司的羧基微球偶联探针方案，选取适当编号的羧基微球，用EDC将合成的氨基修饰探针分别偶联到不同标号的羧基微球上制备核酸探针微球，偶联方法如下: 1.将选定编号的梭基微球及2瓶未开封EDC粉末(10mg/瓶)置室温平衡60min。 2.将待偶联的带C12连接臂的氨基修饰核酸探针提前用灭菌ddH2O溶解，至 终浓度为0.1 nmol/μl，高速震荡混匀。 3.羧基微球用涡旋震荡仪高速震荡30秒，然后置超声仪中超声震荡2次，每 次各15秒。 4.用移液器移取100μl微球(Bio-PlexTM 羧基微球）加入1.5ml Eppendorf管中。 5.14000xg离心4min使微球沉淀。 6.小心移除上清液，在每管中加入加入8.5μl 0.1M MES (pH4.5)，涡旋震荡混 匀。 7.每种核酸探针各取1μl(0.1 nmol/μl)加入到对应编号的羧基微球管中。 8.在10 mg/瓶的EDC粉末瓶中加入1 ml 灭菌ddH2O，充分溶解EDC粉末， 新鲜制备浓度为10 mg/ml 的EDC溶液，向每种羧基微球管中加入0.5μl EDC 溶液，立即涡旋震荡混匀。 9.各羧基微球管用铝箔包盖避光，置试管震荡器上缓和震荡(约500rpm )室温孵 育30min。 10.向每管中重复加入0.5μl新鲜制备的10mg/ml浓度的EDC溶液，避光缓和震 荡孵育30min 。 11.向每管中加入1 ml 0.02% Tween 20涡旋震荡混匀。 12.14000xg离心4min。 13.小心移除上清液，再向每管中加入l ml 0.1% SDS，涡旋震荡混匀。 14.16000xg离心4min。 15.小心移除上清液，加入20TE （pH8.0）涡旋震荡混匀。 16.微球计数:用血球计数仪对完成偶联的微球悬液进行计数，每μl微球数不少 于4×104个为宜。 17.偶联完成的微球悬液避光储存于2~10℃，备与验证序列杂交确认偶联反应的 质量。
蛋白质的检测（参考GB/T6432-94） 一、原理 凯氏定氮法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用浓硫酸破坏有机物，使含氮物转化为硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氮溢出，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数 6.25，计算出粗蛋白含量。 二、试剂 （1）硫酸化学纯，含量为98%，无氮； （2）混合催化剂 0.4g硫酸铜，含5个结晶水，6g硫酸钾或硫酸钠，均为化学纯，磨碎混匀； （3）氢氧化钠化学纯，40%水溶液（m/V）； （4）硼酸化学纯，2%水溶液（m/V）； （5）混合指示剂甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为3个月； （6）盐酸标准溶液基准无水碳酸钠法标定； a)0.1mol/l盐酸标准溶液：8.3mL盐酸注入1000mL蒸馏水中。 b)0.02mol/l盐酸标准溶液：1.67mL盐酸注入1000mL蒸馏水中。（7）蔗糖分析纯； （8）硫酸铵分析纯，干燥； （9）硼酸吸收液 1%硼酸水溶液1000mL，加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL，0.1%甲基红乙醇溶液7mL，4%氢氧化钠水溶液，混合，置阴凉处保存期为1个月（全自动程序用）。
三、仪器设备 （1）实验室用样品粉碎机或研钵； （2）分样筛孔径0.45mm（40目）； （3）分析天平感重0.0001g； （4）消煮炉或电炉； （5）滴定管酸式，10、25mL； （6）凯氏烧瓶 250mL； （7）凯氏蒸馏装置常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式； （8）锥形瓶 150、250mL； （9）容量瓶 100mL； （10）消煮管 250mL； （11）定氮仪以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白质测定仪。 四、分析步骤 （一）仲裁法 1.试样的消煮称取试样0.5-1g（含氮量5-80mg）（精确至0.0002g）， 放入凯式烧瓶中，加入6.4g混合催化剂，与试样混合均匀，再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠，将凯式烧瓶置于电炉上加热，开始小火，待样品焦化、泡沫消失后，再加强活力（360-410℃）直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，消化全过程至少2h。 2.氨的蒸馏 （1）常量蒸馏法将试样消煮液冷却，加入60-100mL蒸馏水，摇匀，
一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1.试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。 （2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2.器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 （三）操作方法 1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。 2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。 三、Folin—酚试剂法（Lowry法） （一）实验原理
《检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质》教学设计与反思 课题：《检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质》（高中生物人教版必修一 ） 环节一 ：明确本课学习目标。 1、知识与能力：认识是几种化学试剂和物质颜色反应特征；尝试用化学试剂检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质。培养学生的动手能力观察能力逻辑思维能力和表达能力。 2、 过程与方法：通过分组实验，跟同学分工合作，相互协调团结协力共同探究的精神。让学生学会探究问题的基本方法和程序。 3、 情感态度与价值观：乐于参与学习，认识生物科学的价值，养成质疑、求实、创新及勇于实践的科学精神和态度，认同生命的物质性，了解健康的饮食习惯。培养学生团结分工合作的精神。 二、实验原理：某些化学试剂能够使生物组织中的有关有机化合物产生特定的颜色反应，从而将有关有机化合物鉴定出来。 1．检测生物组织中还原糖、脂肪和蛋白质 实验原理：还原糖 （加热）先浅蓝再棕色最后是 砖红色 脂肪 红色 蛋白质 紫色 （因为有肽键） 环节二：复习准备实验的基本要求 通读实验手册，明白三种物质的检测方法和原理。 环节三：老师讲解 老师：同学们这节课，按我们的计划开始做《检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质》，根据课前制定的实验方案，分15个小组实验。先做验证实验：蛋白质、还原糖、淀粉和脂肪的检测，然后选取老师提供的待测物质探究这些物质里的主要成分，待测物质有豆浆、花生浆、马铃薯匀浆、新鲜猪肝匀浆、苹果汁、雪梨汁、橘子汁，每种物质都要探究主要含有糖类还是含有脂肪还是含有还原糖。同学们同时注意以下几点： 第一、配置菲林试剂的时候要注意用量，配好的斐林试剂不是全部倒入验证还原糖试剂里；为了节约能源，水浴加热的热水，到老师讲台取用已经烧好的热水，再加热。注意颜色的变化过程。 第二、验证脂肪的时候，滴加了A 液后、必须震荡，才能滴加B 液； 第三、注意药品不能随意混用，尤其是滴管是专用的； 第四、先做验证实验，再做探究实验； 第五、实验完成后，废液必须统一倒入指定的废液回收瓶，并清洗好仪器； 第六、必须如实记录实验现象。做切割花生切片的时候不要伤手了。 橘黄色 苏丹Ⅲ染液 苏丹Ⅳ染液 双缩脲试剂 斐林试剂